F A C U L T Y O F S C I E N C E U N I V E R S I T Y O F C O P E N H A G E N

Master’s thesis Corrie Lynne Madsen

Population genetics of red and black squirrels in Denmark: Prospects for conservation.

Academic advisor: Ludovic Orlando and Hans J. Baagøe

Submitted: 17/08/2011

Contents Preface                      3 

General Introduction                    4 

  Conservation genetics                 4 

  Ancient DNA                    6 

  Ancient DNA applications for wildlife conservation          8 

  Sciurus vulgaris in general                12 

  Sciurus vulgaris in Europe                13 

  Sciurus vulgaris in Denmark                16 

This Project                      18 

  Mitochondrial DNA                  19 

    Genome structure                19 

    Maternal inheritance                19 

Recombination                20 

Mutation rate                  20 

  MC1R                      20 

Abstract                      23 

Introduction                      23 

Materials and Methods                  25 

  Samples                    25 

  DNA extractions                  26 

  DNA amplification and sequencing              27 

  Sequence analysis                  28 

Results                       29 

  Cytochrome b variation in Denmark and Eurasia          29 

  Control region variation in Denmark and Eurasia          29 

  1

Phylogeographic structure                32 

Demographic structure                35 

Timing the origin of the different Danish populations        36 

Nuclear DNA                    37 

MC1R                      38 

  Amplification and authenticity of samples          38 

  Sequence variation                38 

Discussion                      40 

Conclusions and Perspectives                 47 

Acknowledgement                    48 

References                      49 

Appendix                      60 

  A. Samples                    60 

  B. Primer PCR Conditions                66 

C. Primer Overview                  68 

D. Summary Statistics                 71 

E. Median Joining Networks                77 

F. ML Trees                    79 

  2

Preface This M.Sc. thesis project came about in connection with “Project Black Squirrel”. The red squirrels (Sciurus vulgaris) have spread through Funen and areas that previously were only inhabited by pure black populations of Sciurus vulgaris are now being invaded by red squirrels (Bille‐Brahe‐Selby pers. Comm. 2011). Pure black populations seem now only present in the south‐western part of Funen (H.J. Baagøe pers. Comm. 2011), which underpins the need for measures to be taken in order to save the black squirrels from admixture with the red S. vulgaris. By translocating black squirrels to Langeland the remaining black population can successfully be isolated from the expanding red populations. Project Black Squirrel was created with the main objectives to 1) gain knowledge about possible genetic differences between the black and red squirrels and therefore 2) evaluate black squirrels from Funen as a separate Evolutionary Significant Unit (ESU) that could be conserved through 3) introduction to Langeland. The current status of Sciurus vulgaris on Funen was discussed by representatives of The Danish Society for Nature Conservation  (DN),  the Nature Agency (Funen department), the Natural History Museum of Denmark (SNM) and the National Environmental Research Institute (DMU) under Aarhus University. All found it useful to investigate the possibility of an in‐depth research project using DNA analysis to clarify the genetic status of the black squirrel prior to translocation of squirrels to Langeland. This Master thesis represents the scientific study of the genetic structure of the Sciurus vulgaris squirrel populations in Denmark. The results provide objective information which forms the basis for future conservation and management decisions regarding the status of the black Sciurus vulgaris in Denmark. This Master thesis therefore consists of a general introduction of subjects relevant to the project followed by an article presenting the results of ancient DNA analysis that clarify the population genetics of red and black squirrels in Denmark and prospects for conservation of the black squirrel. 

  3

http://snm.ku.dk/english/

General Introduction

Conservation genetics Even though the diversity of life forms and species has experienced several major extinctions in the course of Earth history, the ongoing biodiversity crisis resulting from direct (e.g. deforestation, pollution, resource overexploitation) and indirect (e.g. climatic forcing) human activities is announced to lead to dramatic consequences on natural communities, both at local and global scales. While there is virtually no safe taxonomic group, amphibians provide one particularly demonstrative example of the present situation, with many reports of total population extinctions locally(e.g. see Kihansi spray toads in South Africa (Krajick 2006) and continent‐scale waves of extinctions over 250 Central American and Australian species (Wake and Vredenburg 2008). These rapid declines have most probably been driven by the expansion into naive communities of a killer fungus, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), which has been facilitated by the globalization of human communications and activities worldwide (Fischer 2009). Important conservation measures have been undertaken to preserve the group of Amphibians that survived the catastrophic extinction event that eliminated their sister group, the dinosaurs, including population surveys and management, and systematic screening of imported amphibian skins for presence of Bd. The economic consequences for this sole group are huge; yet, amphibians are by no means the only group currently threatened. Deep‐sea fish, for instance, have experienced massive levels of declines over the last decades (Casey and Myers 1998; Devine et al. 2006) and overall, a total number of 19,265 species are currently listed as vulnerable, endangered or critically endangered in the IUCN red list (http://www.iucnredlist.org/apps/redlist/). Most of these will not survive, even in a near future, without human intervention and sustainable management of the remaining populations.  The primary reason leading to extinction is habitat loss, introduced species, overexploitation and pollution (Thuiller 2007). In general these factors are responsible for population contractions into small sizes where they are susceptible to stochastic effects, either environmental, catastrophic, or demographic (Frankham 1995). There are also genetic consequences for small and/or fragmented populations. Globally, the full allelic diversity present in a population is more difficult to maintain with low population sizes, due to the stochastic process of genetic diversity (leading to the random loss or fixation of alleles), challenging the ability to cope with future environmental changes, hence enhancing long‐term extinction rates (Bouzat 2010). On shorter time scales, low effective population sizes potentiate inbreeding (Bouzat 2010), depressing individual fitness (through homozygosity at loci with recessive maladaptive alleles) and resistance to disease and parasites (Lacy 1997). Lower variation decreases resilience, long term adaptability and population growth rates, (Lacy 1997) initiating a negative feedback on population size and thus increasing extinction probabilities (Bouzat 2010).  Earlier, inbreeding was considered to mainly be a problem in 

  4

captive populations, limiting our ability to design sound conservation strategies preserving the full population potential ex situ, but recent studies have shown that inbreeding is just as severe a problem in wild animals in their natural habitat. For instance, Madsen et al.(2004) found that the introduction of new and genetically diverse breeding males into a small and isolated population of adders (Vipera berus) resulted in a dramatic reversal of trends in population growth, from a steady decline to a marked increase. The recognition that genetic diversity plays a crucial role in extinction led to the development of conservation genetics as an independent and integrative field of research. Conservation genetics can be defined as: “the application of genetics to preserve species as dynamic entities capable of coping with environmental change. It encompasses genetic management of small populations, resolution of taxonomic uncertainties, defining management units within species and the use of molecular genetic analysis in forensics and understanding species’ biology” (Frankham et al. 2002). The general aim of conservation genetics is to maintain genetic diversity across the geographic range of species upholding both within and across breed diversity (Meuwissen 2009). The maintenance of several different and diverse populations are generally needed to provide alternatives but some species, such as the Iberian lynx, have been shown to survive major environmental changes (e.g. Last Glacial Maximum, LGM) with virtually no mitochondrial genetic diversity, (Christina Valdiosera, pers. Comm). Reversely, other species, such as montane voles, pocket gophers and saiga antelopes (Hadly et al. 2004; Chan et al. 2006; Campos et al. 2010), have managed to re‐establish or persist in the wild, despite serious recent bottlenecks, with no apparent health defects. Genetically impoverished populations may however face unavoidable threats in the long term. Scottish populations of capercaille Tetras urogallus became extinct around 1790, and in 1835 restocking from Sweden started. Numbers of 20,000 were reached in 1970, but thereafter the populations crashed despite an increase in suitable habitat. The cause for this crash and decline in population size is believed to be due to low genetic variation following founders event (cited in Höglund 2008). These examples suggest individualistic trajectories and sensitivities to similar environmental changes, which result in complex population patterns.  The research field of conservation genetics is relatively new which is evident when considering that the journal “Conservation Genetics” was first established in 2000. The first textbook on the topic was not published until 2002. There has been a great increase in publications in this field over the last 25 years, due to the advances of molecular techniques, as illustrated by figure 1. The field of conservation biology has spanned a wide area and has successfully been used to: e.g. detect population bottlenecks (Table 1); determine population structure for definition of management or evolutionary significant units (ESUs) (Table 1); detecting hybridization (Randi and Lucchini 2002; Barilani 2005) and estimate parentage or relatedness in ex situ breeding programs (Haig et al. 1995; McLean et al. 2008). 

  5

Figure 1 The increase in publications in the field of Conservation Genetics. Annual number of publications in journals in the ISI’s Web of science category “Biodiversity Conservation” with the word “genetic” in the topic. Number of publications in 2011 based on 6½ months of data. (Modified from Primmer 2009)

050

100150200250300350400450500

Publication nu

mbe

r

Year

The present work aims at evaluating the support for undertaking a conservation program for the population of black squirrels from Funen, Denmark. The main originality consists in using ancient DNA methods in order to combine a molecular investigation of individuals currently living in this population together with individuals that have been captured from 1854 to 1981 and stored in museum collections since then. By providing a snapshot of the past diversity of the population, our strategy will reveal how much the population demography has been stable/unstable over the recent past, and if the population has remained isolated or reversely received a significant influx of migrants from other parts of Denmark or mainland Europe. Our work will demonstrate that ancient DNA analyses of historical materials, and more generally of archaeological and paleontological materials, can uncover and supply important information towards the conservation of both populations and species (Leonard 2008). 

Ancient DNA Ancient DNA (aDNA) is DNA (deoxyribonucleic acid) extracted from non‐contemporaneous biological material of various sources, such as teeth, bones, skins, hairs, egg shells and even, coprolithes and sediments. The retrieval of DNA sequences from dead organisms offers a unique perspective on evolutionary biology by providing information from extinct organisms. Such ancient data literally catch evolution red‐handed with major application fields, such as paleovirology, paleoecology, conservation biology, domestication and human evolution (Pääbo et al. 2004). Following the first study that reported a short stretch of mitochondrial DNA sequences from a dried muscle of the quagga, a zebra‐like equid species that became extinct towards the end of the 19th century (Higuchi et al. 1984), a plethora of articles were published claiming to have recovered DNA, millions of years old, from amber (Cano et al 1992), fossil dinosaur bones (Woodward et al 1994) and leaves (Soltis et al. 

  6

1992). Most of the findings reported during this race for the oldest trace of DNA survival in fossils have been, however, demonstrated since then as contamination by‐products (Austin et al. 1997), suggesting that DNA does not survive for millions of years but thousands to hundreds of thousands at maximum (Valdiosera et al. 2006; Heyn et al. 2010), even in the most promising of fossil preservation environments (Mitchell et al. 2005). This is due to post‐mortem damage that start to accumulate in fossils at the very minute following the death of an organism; while in metabolic active tissues, damage is quickly and efficiently repaired by the host repair pathways, after death, DNA undergoes degradation by endogenous nucleases and aspecific hydrolytic reactions, both fragmenting and reducing the number of template molecules preserved (Lindahl 1993; Willerslev & Cooper 2005). In addition, oxidation, hydrolysis and background radiation are responsible for further modifications of the nitrous bases and the sugar‐phosphate backbone of DNA (Hofreiter et al. 2001). Although other types of nucleotidic modifications could be identified, the main modifications consist of base loss through depurination and cytosine deamination (Briggs et al. 2007; Brotherton et al. 2007). The former limits the success of PCR amplification, as the most common classes of DNA polymerase are refractory to abasic sites, while the latter result in so‐called type II nucleotide misincorporations, namely C to T, as deaminated cytosines are chemical analogs of thymines. Hence, post‐mortem DNA damage limits our ability to characterize genuine ancient DNA sequences, through extensive fragmentation, spurious mutation, and reduction of available templates to traces. As a result, multi‐copy DNA sequences are more likely to survive because they occur in larger numbers in each cell and until recently, mitochondrial (mtDNA), and chloroplast DNA (cpDNA) have therefore provided the foundation for many aDNA studies. The discrepancy between the levels of DNA found in the ancient samples compared to contemporary, which is pervasive in the environment, has made it essential to take steps to avoid false positives and contamination of various origins, from the excavation field, the museum collections, the curator to the laboratory itself.  The recognition of the importance of post‐mortem DNA damage, and related contamination problems, led the aDNA community to agree on strict protocols for aDNA studies (Gilbert et al. 2005, Willerslev and Cooper 2005). These protocols include working in clean lab facilities, with positive air‐pressure preventing exogenous traces of DNA to penetrate working areas, which are regularly decontaminated through bleach treatment of bench and material surfaces followed by exposure to UV light. Since these protocols have been implemented in the work with aDNA the number of reliable studies has grown steadily.  

  7

Ancient DNA applications for wildlife conservation Ancient DNA holds tremendous potential for the study of ancient animal and plant populations. Work with aDNA has successfully shown population movements and local replacements back into the late Pleistocene (e.g. for American brown bears and short‐faced bears, Barnes et al. 2002). Ancient DNA also enables a more accurate description of the dynamics of historic population sizes (Ramakrishnan et al. 2005), levels of gene flow (Anderson et al. 2005) and relationships with other populations (Leonard 2008). The understanding of past populations is crucial in order to develop appropriate and long term successful conservation management plans (Leonard 2008). That ancient DNA can address the conservation status of particular populations and help elaborating plans for management, can be illustrated with the study case of the Scandinavian wolf Canis lupus, which originally inhabited major parts of the northern hemisphere (Ellegren et al. 1996). The census size of Scandinavian wolf populations, and their distribution, has experienced a drastic reduction over the last two centuries due to habitat fragmentation and over‐hunting, resulting in an almost complete disappearance from much of its former geographical range in Europe, with less than 1,000 individuals now present in the mountainous areas in Spain, Portugal and Italy (Ellegren et al. 1996). In Sweden, the Scandinavian grey wolf population experienced similar declines in its size and in 1940 the total Swedish population was estimated to comprise of less than 40 individuals. Legal protection was declared in 1966 and at this time the population was estimated to consist of only 10 individuals in the northernmost part of the country (Ellegren et al. 1996). In the early 1970’s the species was thought to be extinct in the whole Scandinavian peninsula, but in the 1980’s a few gray wolves appeared in southern Sweden and Norway, and these individuals seemed to breed successfully every year as the number of wolves seen in the area increased from 1983 and onwards. That the nearest neighboring population of wolves was located approximately 1500 km away led to widespread speculation regarding the sudden appearance of wolves in Sweden and Norway. For instance, the population would not consist of a natural occurrence, but should in fact have originated from Swedish zoos. Sheep breeders, who were of the opinion that the wolves would damage their livelihood, insisted that the population should be eradicated rather than protected. The question of the wolves’ origin, and thereby their status as protected, was investigated using sequence information from the mitochondrial d‐loop and nuclear microsatellite markers (Ellegreen et al. 1996; Vila et al. 2003).  According to these studies, a single pair of animals, a male and a female, founded the whole Swedish wolf population, most likely from an eastern European origin. Interestingly, the wolf population was subject to high levels of inbreeding until 1991, where the appearance of a new Y‐chromosome haplotype in a litter of male siblings suggested that a new male, still originating from an eastern livestock, immigrated to Scandinavia, which led to the establishment of a second breeding pack and the start of exponential population growth in absence of changes in habitat, prey availability, legal protection or the level of illegal hunting. A major concern for the preservation of the grey wolf is the fact that there 

  8

are now 10‐11 breeding packs and an estimated total population size of no more than 90‐100 individuals (Vila et al. 2003). As many of the remaining populations exist as small and isolated groups the risk of loss of genetic variation through inbreeding and genetic drift is present. However, the identification of the origin of the Swedish wolf population indicated the most suitable source from which other individuals could possibly be introduced. Such translocations have successfully rescued small, inbred populations by the contribution of only a small number of immigrants (Vila et al. 2003; Madsen et al. 2004).   The problems associated with a reduced number of founders are commonly faced by captive breeding programs, as well as wild populations. A further complication for captive breeding programs for endangered species is that the founding individuals may originate from a livestock that is already exempt from genetic variation. One example where ancient DNA from historic specimens proved valuable to a captive breeding program is that of the European common hamster (Cricetus cricetus), a species that originated from the lowlands of Central and Eastern Europe and Siberia. This species experienced such a rapid demographic success following the agriculture expansion that it became considered a pest in Eastern Europe. Changes in agricultural practices in the past decades have led to a great reduction in suitable habitat for the common hamster in Western Europe. It is even considered threatened with extinction in different countries including the Netherlands, where the total number of animals is estimated to a few hundred at best and distributed in small isolated populations (Neumann et al. 2004). This has led to a species protection plan that includes protection and restoration of suitable habitat in conjunction with a breeding program. The diversity still present in the different European populations of the common hamster was compared to the diversity that used to characterize these populations in the recent past through museum samples, dating from prior to the status as threatened. A drastic loss of diversity at the MHC locus was found in current Dutch animals where only one of the many alleles historically present had been conserved, suggesting a severe bottleneck had taken place (Smulders et al. 2003). Along with reports of reduced vitality and fertility in Dutch populations there is strong justification for conservation by enhancing genetic diversity by the introduction of new individuals. Since the remaining Western populations are also reduced and under threat, it would be far from ideal to reduce their population size further. However, sub‐species should not be mixed in breeding programs if possible since local adaptive advantages can be lost and the introduction of Eastern population hamsters is quite contentious as the latter have been described as members of a distinct (Neumann and Jansman 2004) or identical subspecies (Smulders et al. 2003). Following Smulders et al. 2003, it should be possible to augment the Dutch population with individuals from Central or Eastern Europe, where they remain numerous and genetically diverse.  Overall, this study made it possible to identify evolutionary units and assess self‐sustainability of currently threatened population essential for population protection (Neumann and Jansman 2004). Employing ancient DNA analyses to identify all possible 

  9

sources of founders could potentially alleviate inbreeding in the small, vulnerable populations. Ancient DNA from museum samples has clearly proven useful for conservation and management of wildlife. The DNA analysis of historic populations of Sciurus vulgaris in Denmark will yield scientific support for concrete conservation and management plans for “Project Black Squirrel”. Genetic appropriateness of re‐introduced or translocated animals to Langeland is of critical importance. Ancient DNA analysis of past populations may assist in the identification of appropriate animals by measuring the overall similarity of the past population to those individuals available to potentially participate in the reintroduction. 

   

  10

Species

Latin

Reference(s)

Identification of population sources Hamster Cricetus cricetus Smulders et al. 2003

American puma Puma concolor Culver et al. 2000

White-headed duck Oxyura leucocephala Munoz-Fuentes et al. 2005

Grizzly bear Ursus arctos Miller and Waits 2003;

Miller et al. 2006

Bearded vultures Gypaetus barbatus Godoy et al. 2004

Ostriches Struthio camelus syriacus Robinson and Matthee 1999

Inferring past demographic declines Laysan ducks Anas laysanensis Coopers et al. 1996

Whooping crane Grus Americana Glenn et al. (1999)

Mauritius kestrel Falco punctatus Groombridge et al. 2000

Sea trout Salma trutta Coughlan et al. 2006

New Zealand snapper Pagrus auratus Hauser et al. 2002

Arctic fox Alopex lagopus Nyström et al. 2006

Common hamster Cricetus cricetus Smulders et al. 2003

Hairy-nosed wombat Lasiorhinus krefftii Taylor et al. 1994

Black-footed ferret Mustela nigripes Wisely et al.2002

Sea otter Enhydra lutris Pertoldi et al 2001

Northern elephant seal Mirounga angustirostris Weber et al. 2000;

Hoelzel et al. 2002

Greater prairie chicken Tympanuchus cupido Bouzat et al. 1998

Identification of management units Brush-tailed rock-wallaby Petrogale penicillata Paplinska et al. 2011

Martino’s vole Dinaromys bogdanovi Krystofek et al. 2007

Greater prairie chickens T. c. pinnatus Palkovacs et al. 2004

Wolverines Gulo gulo Schwartz et al. 2007

Modern lion Panthera leo Barnett et al. 2006

Forest-dwelling caribou Rangifer tarandus caribou Kuhn et al. 2010

Pygmy raccoon Procyon pygmaeus McFadden et al. 2008

Dwarf coati Nasua nelson McFadden et al. 2008

Table 1 Ancient DNA applications for wildlife conservation. Identification of population sources, historic declines in genetic diversity and management units through ancient DNA analysis.

  11

Sciurus vulgaris in general The European red squirrel Sciurus vulgaris Linnaeus, 1758 belongs to the order Rodentia, suborder Sciurognathi, family Sciuridae, subfamily Sciurinae and the earliest record of S. vulgaris is from Hungary and is middle Pleistocene in age (Janossy 1986).  The many variations in coat color and morphology has led to the description of more than 40 sub‐species (revised to 17 sub‐species by Siderowicz 1971), but the validity of these sub‐species is dubious since these morphological differences may relate to environmental conditions (Lurz et al. 2005).  The red squirrel Sciurus vulgaris has a Palaearctic distribution, occurring from the Iberian Peninsula to Japan (Lurz 2005) (figure 2). Globally, the European red squirrel has a large range in the Palaearctic spanning from the United Kingdom, Ireland, Spain and Portugal in the west, through continental Europe, Russia, Mongolia, and northwest and northeast China to the Pacific coast. It is also found on the Pacific islands of Sakhalin (Russia) and Hokkaido (Japan, endemic sub‐species Sciurus vulgaris orienti). 

Figure 2 Geographic range of Sciurus vulgaris. The present distribution of the European red squirrel is shown in red (from Shar et al. 2008).

The European red squirrel is widespread and common over much of its range. In Europe, it is widespread in most areas, with the exception of the Iberian Peninsula (where it is absent from the south‐west) and Britain (where it has almost completely disappeared from the south‐east). Though it is described as common throughout most of its range, there have been well‐documented population declines and range contractions in the United Kingdom, Ireland, Italy and Denmark (Gurnell & Wauters in Mitchell‐Jones et al. 1999). The European red squirrel occurs in boreal coniferous forest consisting mainly of larch, pine and spruce in much of Palaearctic, but in Central and Southern Europe also occurs in broad‐leaved and mixed woodlands (Lurz et al. 2005). Habitat fragmentation as a result of road building and urbanization, together with loss of habitat, can decrease population size because of reduced immigration rates. Local range 

  12

expansions have occurred as a result of translocations and interspecific competition from alien Sciurus carolinensis, the gray squirrel, has caused the loss of the European red squirrels over large areas in Britain (Gurnell and Wauters in Mitchel‐Jones et al. 1999).  

Sciurus vulgaris in Europe Red squirrels have been present in Britain since 7000 – 10000 BP although little is known about their distribution at that time. From late medieval times they are believed to have been widely distributed. In the 18th century, the red squirrel became extinct in Ireland and southern Scotland due to loss of habitat. The squirrels in the Scottish highlands were also nearly driven to extinction in the late 18th and early 19th century due to habitat destruction and perhaps disease (Barratt et al. 1999). Welsh and English populations probably did not reach such low numbers, but there too was a vast habitat destruction and fragmentation, which likely resulted in local extinctions. Red squirrels have been introduced from England to different parts of Scotland approximately 10 times between 1772 and 1872, but introduction from Norway and Sweden has also taken place (Barratt et al. 1999). The Irish population was enlarged with introductions from England between 1815 and 1880 (Barratt 1999). In England thousands of animals were sold at London markets each year from mainland Europe and quite likely some of them escaped or were set free. As a consequence, British red squirrels are now of a mixed stock of European types. The observed recent drastic decline in red squirrels is due to habitat fragmentation and loss and displacement from competition with gray squirrels.The gray squirrel Sciurus carolinensis is a North American species which has been introduced in many countries, but has successfully replaced the native European red squirrel in large parts of Great Britain and northern Italy, where rapid spread of the former coincided with dramatic decline in range of the latter (Bertolino 2008). Conservation management has included the introduction of red squirrels to suitable areas, the enhancement of declining populations and the removal of gray squirrels.   Barratt et al. (1999) assessed the variation within and the differentiation among fragmented UK red squirrel populations and a few mainland European populations. DNA was extracted from either road kills or biopsy punches from the ears of live, trapped animals. In this study, a total of 536 bp of the mitochondrial control region was analyzed for 207 individuals. A large number of haplotypes was found (26) and at a local level in the UK, very few alleles were shared, suggesting that the populations have not experienced recent genetic exchange. The majority of populations sampled contained only 1 or 2 control region alleles and this low diversity could suggest repetitive demographic bottlenecks in the recent past due to habitat fragmentation (Barratt et al. 1999). No regional differentiation was detected and there was no clear geographic pattern in the phylogenetic analysis within Britain (Barratt et al. 1999). Hale et al. (2001b) used museum specimens from the past century to identify the impact of habitat defragmentation on genetic composition of the red squirrel 

  13

populations. Planting of new forest connected forest fragments in northern England to forests in southern Scotland. Using microsatellites Hale et al. (2001b) showed that the defragmentation of the habitat led to a change in the genetic composition of previously isolated populations. The corridor between northern and western populations led to a seemingly one‐way migration from north to west (small forest area to larger area) and genetic diversity in the new, enlarged, southern population was increased. This study showed how quickly animals spread under favorable conditions, but also how human‐made changes such as deforestation has isolated previously large outbreeding populations and how this has changed genetic structure in populations. In 2004, Hale set out to determine the extent to which any population of S. vulgaris in Britain was partially or wholly the product of translocation of squirrels from Mainland Europe. With a total number of 182 museum pelt specimens collected from 1861‐2002, direct evidence for artificial introductions could be demonstrated, with the appearance and expansion of particular haplotypes in the mitochondrial control region. For instance, haplotype H1 was introduced from Sweden, where this haplotype is the dominant type, to Britain where it appeared in 1966. It has since spread to become the dominant haplotype in northeastern England. Eastern British individuals are now 68 % H1 and the majority of remaining eastern populations in England appear to have more similarity to mainland Europe, which indicates that British lineages in this region are being replaced by lineages from recent translocations from mainland Europe (Hale et al. 2004). Similarly, Ogden et al. (2005) assessed the levels of genetic variation in the Welsh population of Sciurus vulgaris after a dramatic decline in red squirrels, which left only 3 viable populations on the island. The conservation of these populations is further complicated by the fact that only 1 of these populations can be isolated effectively from gray squirrels. Using mtDNA control region and microsatellites, Ogden et al. (2005) showed that the spread of gray squirrels led to loss of both nuclear and mitochondrial genetic diversity in S. vulgaris populations. Phylogeographical structure of the Welsh populations showed a candidate source for repopulating the population, which is isolated from gray squirrels. Finnegan et al. (2008) analyzed samples from 101 squirrels from Ireland (97) and England (4) in the hope of determining whether the Irish red squirrel population is distinct from the ones found in Britain despite translocations from Britain. A 395 bp region of mitochondrial DNA control region was examined and majority of sampled haplotypes were British in origin albeit it was impossible to distinguish whether it was the result of translocations or natural colonization. Grill et al. (2009) investigated the genetic differentiation of S. vulgaris across the whole range of the species including 7 of the sub‐species as classified by Lurz et al. (2005). Since no evolutionary divergence was found in previous studies of European squirrels based on mtDNA (Barratt el al. 199; Hale et al. 2004, Finnegan et al. 2008) and microsatellites (Hale et al. 2001b), Grill set out to investigate how many distinct genetic lineages are present in Europe and whether post‐glacial recolonisation took place out of the Mediterranean refugia, as suggested by Hewitt 2001. 

  14

Using mtDNA (control region and cytochrome b) they found that only the lineage from the south Italian region of Calabria (S. v. meridionalis) was significantly differentiated while the rest of the samples clustered in a supported monophyletic clade, with no particular geographical differentiation. Further microsatellite analysis supported the existence of an Iberian group (S. v. infuscatus). Overall, except for Calabria and Iberia, no phylogeographical structure has been found across Europe, in agreement with a model of rapid repopulation from glacial refugia.   The red squirrel S. vulgaris is the only native squirrel in Italy where its presence is only missing on the islands and in the south‐eastern extremity of the Apulia region of Italy. The pelage color varies from light red to dark brown; almost black (Bertolino et al. 2000). Three additional species have been introduced in the country (Bertolino et al. 2000); the gray squirrel, S. carolinensis, introduced into the North of Italy in 1948, 1966 and 1994; the Finlaysons squirrel (C. finlayson) also introduced in the north of Italy within the last 27‐29 years; and the Siberian chipmonk (Eutamias sibiricus) released in north and central Italy (Bertonino et al. 2000).  The red squirrel is now considered endangered in Italy, mainly as a result of habitat fragmentation and the introduction of Sciurus carolinensis. The red squirrel is affected by woodland isolation since they normally do not disperse over open habitats (Bertolino et al. 2000; Hale et al. 2001b). The first introduction in northwestern Italy consisted of two couples of S. carolinensis from Washington DC that have since then managed to reproduce and spread over an area of about 450 km2 (Bertolino et al. 2000). More introductions, successful establishments of these and the continued spread of Sciurus carolinensis has led to the progressive disappearance of the red squirrel, as happened in Great Britain. This is problematic not only because the introduced species is effectively outcompeting the native Sciurus vulgaris, but also because the sub‐species S. v. meridionalis is only present in southwestern Italy, Calabria. This sub‐species, is according to morphology and genetics (Lurz et al. 2005; Grill et al. 2009), a well defined sub‐species and if verified as a separate species, it could be categorized as threatened (cited in Shar et al. 2008). Based on the scenario in Britain the introduction of S. carolinensis in Northern Italy is considered the biggest threat to the native population of red squirrels in Italy. Many studies of Sciurus vulgaris show the problems created by introduced species and the vulnerability of native species.  It also highlights how often the red squirrel has been translocated and re‐introduced and that it presently is difficult to identify the original population. The studies show how human activities influence the distribution and genetic composition of the affected species.  

 

  15

Sciurus vulgaris in Denmark The majority of Denmark was covered by ice 22,000 years BP leaving only parts of western Jutland ice‐free. This area was connected to “Doggerland”, a large area of dry land that stretched from Britain's east coast across to the present coast of the Netherlands and the western coasts of Germany and Denmark. The ice sheet began to retract northeasterly approximately 19,000 years BP and Denmark was clear from all ice around 16,000 years BP. The sea levels were still very low due to the enormous amounts of water still bound to the icecap in the northern hemisphere. This left Denmark connected to a European mainland with the exception of the very northern parts of Jutland (figure 3A). These were separated by water, creating small islands. The low sea levels connecting the British Isles and Denmark to the European mainland was very important for the spread of flora and fauna. Between 11,700 – 9000 years BP the temperature increased and vegetation developed from tundra to first an open birch‐pine forest and then more dense hazel‐dominated woodland. The main wave of immigration is thought to have taken place in the early Preboreal period. The Sciurus vulgaris is believed to have been part of this main wave around 11,000 years BP, but the oldest bone remains of the species only date back to ca. 9500 years BP (Aaris‐Sørensen 2009). Not only do many new species come to Denmark at this time, but also a great many of the animals present, prior to the Preboreal, disappeared from Denmark. This includes polar bears, lemmings, reindeers and polar foxes, when their geographical range moved north/northeast to more suitable habitats (figure 3B). Around 8000 years BP the sea levels rose dramatically and Denmark became isolated from England and Sweden. Denmark was mainly separated into islands, which fragmented the mammal fauna (figure 3C). 

B  C A 

Figure 3 The north western part of Europe (A) approximately 14 000 years BP (B) approximately 10 000 years BP (C) approximately 7 000 years BP. The development of the north western part of Europe as the ice (gray) retracts and resulting in the fragmentation of landmasses. ( From Aaris-Sørensen in Baagøe and Jensen 2007)

After the development of separate islands, a great many species experienced local extinction since populations become isolated and therefore more vulnerable since new recruitment became difficult. This is evident from the local extinctions of bear, elk, badger, polecat and aurochs on Zealand and Funen during this period (Aaris‐Sørensen 2007). The 

  16

habitat and conditions have changed considerable since the S. vulgaris first immigrated. Denmark was then covered by forest but the size and prevalence of wooded areas and their composition has since changed considerably. 

Around 1800, forest covered only approximately 4% of the total area (Asferg 1994). This great reduction of suitable habitat must have influenced the populations of Sciurus vulgaris. Prior to 1900 the knowledge about the distribution of squirrels in Denmark is limited. In Pontoppidans Atlas (1763) squirrels are described to be particularly frequent on Funen and North‐Jutland. Melchior (1834) states that squirrels are present in Jutland, Funen and Zealand, but more details about the distribution are missing. As is the case in Wulff (1881) and Winge (1908) who describe the squirrel as being present on all major parts of Denmark and recently introduced to the island of Lolland. Very few squirrels are thought to have been present in Denmark around the start of 1900, but hereafter an expansion followed to most regions in Denmark.  The only detailed description of distribution of squirrels was written by Raunkiær in 1919 but this dissertation only depicts the distribution on Zealand. Raunkiær concludes that Zealand is divided into two areas after extensive investigation and enquiry. Squirrels were found in a large area in West Zealand and a smaller area north of Copenhagen. The area in West Zealand was considered to be ancient, whereas the area north of Copenhagen was of newer date (Raunkiær 1919). Since then, the distribution of squirrels increased greatly (Holm 1932) and in 1930 they were considered a pest. One kr per squirrel killed was offered in an attempt to limit their numbers and in the years 1933/1934 31,327 kr was paid out for kills. The great spread in numbers is thought to be due to the expansion of new suitable habitat areas, but also the introduction of squirrels from Sweden and Germany. The records of premiums paid out for squirrels in 1933/1934 formed the basis of a detailed description of the distribution of squirrels in Denmark.  On the basis of these records Spärck (1936) concludes that Jutland comprises of two separate populations. A young population formed after introductions in the Mid‐ and North of Jutland and an older population in South‐Jutland. He also reports 2 separate populations in Zealand and a population in the South‐ Southwestern Funen. The squirrel populations north of Copenhagen, Bornholm and Lolland‐Falster are considered to be the result of introductions. The native squirrel population died out on Bornholm and the population found there at present is from animals translocated in 1886 from the Scandinavian sub‐species. Introductions of Swedish individuals are also reported in North‐Jutland. Spärck concludes that the populations found on Funen, West‐Zealand and South‐Jutland are the original populations. The squirrels on Funen are black and up till 1936 no red squirrels had been found on this island. A red squirrel was however introduced at Wedelsborg by the painter Johannes Larsen in 1933 and in 1974 red squirrels was reported to be present on Funen with pure black populations only present in the southernmost Funen (Degn 1974). The population in West‐Zealand comprises of a mixture of squirrels; black, brown and red. In 1936 1/3 of the population was described as primarily black (Spärck 1936). 

  17

Today the squirrel is present in the most of Denmark with the exception of a few islands (Asferg and Madsen 2007). In 1970 the distribution of the different colors of squirrels was mapped (figure 4) based on an extensive review of Sciurus vulgaris past and present distribution in Denmark (Degn 1974). It was clear that the different types of coat color may no longer be separated in isolated populations due to the many animals released (Degn 1974). The many introductions of squirrel not only to Denmark but also the rest of Europe make the separation of populations and sub‐species more uncertain. 

Figure 4 The distribution of the Sciurus vulgaris coat colors found in Funen 1970. Signatures indicate the different colorations found with the dominant to the left and the rarest to the right. Sort = black, brun= brown, rød = red and Ingen bestand= no occurance of Sciurus vulgaris (From Degn 1974)

This project

The aim of this M.Sc. thesis project was to apply DNA sequencing to Sciurus vulgaris in order to address some primary questions about the Funen conservation status and the origin and phylogeographic structure of the Danish squirrels. The samples obtained for the study vary in quality since the majority of this study was based on ancient DNA. Furthermore the recent squirrels incorporated in this study consisted of road kills which possibly were left on the roadside for long periods of time and were frozen and thawed several times before reaching the laboratory. Such conditions contribute to a rather low quality of DNA.  Ancient DNA is commonly associated with PCR and extraction problems such as contamination, spurious sequence polymorphism and fragmentation limiting PCR success. The genetic markers investigated in this study are based upon similar studies previously performed on S. vulgaris populations (Barratt et al. 1999; Hale et al. 2004; Ogden et al. 2005; Trizio et al. 2005; Finnegan et al. 2008). The control region and cytochrome b mitochondrial regions 

  18

have successfully been used to clarify similar questions. As this study also involves red and black individuals the MC1R nuclear marker was also used. 

Mitochondrial DNA The majority of data in this thesis consist of mitochondrial DNA sequences. Eukaryotic organisms have both nuclear (nucDNA) and mitochondrial DNA (mtDNA). There are some fundamental differences between nucDNA and mtDNA. Nuclear DNA is diploid, whereas mtDNA is haploid. Furthermore mtDNA is characterized by maternal inheritance, generally higher mutation rates than nucDNA and a commonly accepted lack of recombination (Ballard and Whitlock 2004). Mitochondrial DNA has played a major role in the study of animal evolution. Approximately 70% of phylogeographic studies involved analysis of mtDNA either primarily or exclusively (Rokas et al. 2003), making mtDNA the marker of choice for phylogenetic and phylogeographic studies. 

Genome structure

Mitochondria are membrane‐enclosed organelles that for one thing are responsible for the majority of ATP (adenosine triphosphate) production. Mitochondrial DNA is located inside mitochondria and a typical somatic cell contains 500‐1000 mitochondria (Rokas et al. 2003). Mitochondrial DNA is found in all eukaryotic cells, with the exception of in mature red blood cells.  The mitogenome is extremely compact compared to the nuclear genome. In humans for instance, the mitochondrial genome consists of 16,569 bp, whereas the nuclear haploid genome consists of around 3,2Gb (Ballard and Whitlock 2004). The mitochondrial DNA mainly exists as a circular molecule and contains genes that support aerobic respiration, and genes coding for transfer and ribosomal RNAs (Rokas et al. 2003). The mammalian mitochondrial genome contains little noncoding DNA, and the two non‐coding regions comprise less than 7% of the entire genome (Larizza et al. 2002). It is extremely compact, contains no introns and genes even overlap. The small size of the mitogenome is due to the fact that most of the around 100 genes controlling synthesis of mammalian mitochondrial proteins have been transferred to the nucleus (Cummins 1998). 

Maternal inheritance Maternal inheritance is considered to be the rule in most organisms (Birky 2001), with the exception of certain bivalve families, where paternal transmission has been observed. In mammals, paternal transmission is prevented during fertilization. Up to 100 paternal mitochondria enter the egg, but upon entrance in the egg cytoplasm, sperm mitochondria are tagged with ubiquitin to ensure selective destruction. Unless the tagging or recognition of paternal recognition fails, the zygote will only contain maternal mitochondria.  Paternal leaking has been observed in invertebrate and hybrid populations of vertebrate species, where the specificity in recognition and tagging is laxed (Rokas et al. 2003). 

  19

Recombination Studies show that recombination does occur in a few animal species such as the nematode Meloidogyne javanica (Lunt and Hyman 1997) and the marine mussel, Mytilus galloprovincialis (Ladoukakis and Zouros 2001), but the consensus view is that no recombination occurs in animal mtDNA (Rokas et al. 2003), in agreement with the general rule of maternal inheritance. This view is also supported by many studies where no recombinant haplotypes have been found, and no recombinant haplotypes have been observed in natural populations of several species.  

Mutation rate

 Mammalian mtDNA has been reported to evolve 5‐10 fold more rapidly than single copy nuclear DNA. Mutations can be single or multiple base pair replacements or modifications (Cummins 1998). The various functional regions of mtDNA also evolve at different rates (Pesole et al. 1999), and hotspots for mutations have been described at different sites of the non‐coding (hypervariable) regions (e.g. in humans, see Stoneking et al. 2000). 

MC1R More than 100 loci have been linked to vertebrate pigmentation (McRobie et al. 2009), but the most studied and well‐known system is that of melanin based pigmentation. Melanin is produced by melanocytes through the process melanogenesis. The regulation and distribution of the different pigment types produced by these specialized cells is in many mammals responsible for the phenotypic variation seen in coat color. Mammalian melanocytes can synthesize two forms of melanin: eumelanin and phaoemelanin. When eumelanin is produced it results in dark brown to black pigment in skin, hair or feathers, whereas the production of phaeomelanin creates red to yellow pigment phenotypes and no synthesis results in albinism (Hoekstra 2006) (Figure 5b) . The production of eumelanin, phaeomelanin and the switch between the two is controlled by the interaction between the extension locus E, which encodes the cell surface protein melanocortin 1 receptor (MC1R) expressed in melanocytes and the agouti locus (A) encoding agouti signaling protein (ASIP) (Nachman et al. 2003). The MC1R is a G‐ protein coupled receptor and the activation of this 7‐ transmembrane domain receptor by the binding of its receptor ligands results in a signaling pathway which ultimately leads to the production of eumelanin or phaeomelanin.  The MC1R is activated by the agonist alpha melanocyte‐stimulating hormone (α‐MSH) and the binding of this ligand activates the eumelanin synthetic pathway via cyclic AMP (cAMP‐ cyclic adenosine monophosphate) (Figure 5a).  Cyclic AMP is thought to affect the enzymatic activity of the enzyme tyrosinase (Tyr). The enzyme Tyr has a catalytic effect in the oxidation of tyrosine to dopaquinone. Dopaquinone is further converted to eumelanin through the eumelanic‐specific enzymes tyrosinase‐related protein 1(Tyrp1) and dopachome tautomerase (Dct), which also are believed to be dependent upon cAMP (Lin and Fischer 

  20

2007). When all three enzymes function eumelanin is produced in the melanocytes, leading to brown‐black pigmentation. If the competing receptor antagonist Agouti‐ASIP binds to MC1R the agonist mediated response is blocked or reduced. The intracellular levels of cAMP are repressed by the aid of the extracellular protein Atrn (Hoekstra 2006). By affecting intracellular levels of cAMP the catalytic effect of the enzymes involved in the eumelanin pathway are affected and the synthesis is switched to phaeomelanin. The synthesis of phaeomelanin depends on the incorporation of cystein which is regulated by xCT (Hoekstra 2006). The interaction between these two proteins is essential in the regulation of melanogenesis and the switch between the production of either eumelanin or phaeomelanin results in the banding pattern seen on most mammalian hair (Figure 5b).  Variation seen in coat color depends on the distribution and relative amounts of these two pigments in the hairs.  The MC1R gene is short consisting only of a single exon of approximately 1000 bp in length. The MC1R and mutations in this has been associated with color changes in many vertebrates such as beach mice, P. polionotus (Hoekstra et al. 2006), rock pocket mice, C. intermedius (Nachman et al. 2003), woolly mammoth, Mammuthus primigenius (Rompler et al. 2006), bananaquit, Coereba flaveola (Theron et al. 2001) and even human hair (Makova and Norton 2005). McRobie et al. 2009 investigated the genetic basis of melanism in the gray squirrel (S. carolinensis) and found 3 coat color variants in the gray squirrel. The wild type gray, a brown‐black and a jet‐black phenotype. The MC1R gene was sequenced for all 3 types. The wildtype was homozygous for the wild type allele E+, the jet black type homozygous for the MC1R – Δ24 EB allele and the brown‐black type heterozygous with E+/EB. The significance of MC1R in coat color variation in so many species makes it an ideal candidate for studying genetic basis of melanism in the black variant of Sciurus vulgaris found on Funen  

  21

Figure 5 Graphic illustrations of the pathways regulating mammalian melanogenesis and phenotypic effects on individual hair pigment and pattern. a) Binding of the agonist α melanocyte-stimulating hormone (αMSH) to MC1R activates the synthesis of the enzyme tyrosinase (Tyr) via cAMP. Cyclic AMP affects the enzymatic activity of Tyr, and the two eumelanic –specific enzymes tyrosinase-related protein 1 (Tyrp1) and dopachrome tautomerase (Dct). If levels of cAMP are high enough to activate all three enzymes eumelanin (brown to black pigment) is deposited in melanosomes. When the antagonist Agouti binds to MC1R with the aid of the extracellular protein Atrn levels of cAMP are repressed. This leads to the production of phaeomelanin (yellow to red pigment) with the aid of Cystine whose uptake is regulated by xCT. b) Overall coat color in mammals is determined by the density and distribution of melanin on the individual hairs. (From Hoekstra 2006)

 

  22

Abstract

The progressive decline in black red squirrel numbers in Funen has led to a conservation and re‐introduction project being established on the Island of Langeland. The red squirrel (S. vulgaris) population in Denmark became almost extinct in recent historical times due to habitat loss. The species has subsequently recovered within a few isolated areas, but non‐Danish individuals have been introduced at several localities. To assess genetic structure, past demographic history and the possibility of a still existing original stock, we analysed 60 specimens from 5 geographically separated areas and genotyped 2 mitochondrial markers, the control region and cytochrome b. Moreover a 808‐829 bp fragment of the MC1R was sequenced for red and black specimens in order to study the possible genetic basis of melanism in the black Sciurus vulgaris. Regarding the structure of Danish populations, the control region was the only informative marker revealing 3 main geographic groups (Jutland, Funen and Zealand). Low levels of nucleotide and haplotype diversity were found in Danish populations, the Funen population having the lowest reported and showing no shared haplotype with any other regions. Our results suggest that the black Funen population should be considered as an Evolutionary Significant Unit (ESU) and the spread of red squirrels to black squirrel habitat warrants the conservation strategy of translocation of black squirrels to Langeland. The incorporation of nuclear markers is recommended in order to ensure that no admixture has taken place in the recent past. The dark coat color in the Funen Sciurus vulgaris did not prove to be associated with the MC1R. 

Introduction Recent habitat changes and human mediated introductions occasionally introduce closely related, but naturally allopatric, species that have not evolved either intrinsic or behavioral barriers to reproduction. Hybridization between indigenous and introduced individuals can have a major impact on the native species, even extinction (Perry et al. 2002). Ancient DNA extracted from historical specimens is therefore essential in order to elucidate the history of a population and to quantify the amount of introgression that has taken place (Leonard 2008). The red squirrel (Sciurus vulgaris) is native to Denmark, and is common in forested areas throughout the Palaearctic region (Gurnell and Wauters 1999). Across its geographical range it has been divided into a number of subspecies primarily based on coat color and morphological variation (Lurz et al. 2005) with Danish populations classified as the introduced S.vulgaris vulgaris on Bornholm and S. vulgaris fuscoater in the rest of Denmark (Asferg 1994, Degn 1973). The species colonized Denmark after the last glacial period approximately 11,000 years BP, and thereafter became widespread, including all major islands (Aaris‐Sørensen 1998). The squirrel populations found in Denmark were separated on the many Islands which Denmark consists of around 8000 BP. Subsequently the Danish squirrel populations became isolated and more vulnerable to deterministic and stochastic factors (Frankham 2005), but also the genetic consequences linked to small and isolated populations (Meuwissen 2009). Little is known about the distribution and frequency of 

  23

Sciurus vulgaris in Denmark until around 1800, when the species is believed to be fairly low in numbers due to habitat loss. Sciurus vulgaris nearly disappeared and the squirrel became extinct on Bornholm and many areas of Denmark, as has been the case with other mammals in Denmark such as the Danish red deer, Cervus elaphus (Nielsen et al. 2008), but also in the British populations of Sciurus vulgaris (Shorten 1954).Thereafter the history is complex. Original populations of Sciurus vulgaris were reported to be present in parts of South Jutland, Funen and West Zealand (Spärck 1936), but introductions of individuals from Sweden and Germany are thought to have mixed with the majority of the original Danish populations. The records of introductions are limited, but at least 13 releases have been registered between 1800 and 1962 (reviewed by Degn 1974). These occur in Jutland, Funen, Zealand, Møn, Lolland and Bornholm and the introduced individuals have managed to spread throughout Denmark (Spärck 1936).While S. vulgaris is not under threat across most of it Eurasian range, in Denmark, there is an unusual presence of a black morph on the island of Funen. This black morph is thought to be the original Danish squirrel, whereas the red squirrels now present in the majority of Denmark, are thought to originate from Germany or Sweden (Spärck 1936; Degn 1974). The genetic structure of the Danish S. vulgaris populations is complicated by the many introductions throughout the country. Once ubiquitous throughout Funen, the black squirrel is now restricted to the southwestern part of Funen. There is evidence of an introduction of a red squirrel to Funen by the painter Johannes Larsen in 1933, but previous to that, the squirrel population on Funen was considered to comprise only of black individuals. The extant small black population of squirrels on Funen display coat color characteristic similar to those described as common previous to the introduction of red squirrels. The original Zealand population (West Zealand) already displayed a mixture of the black morph and color patterns attributed to the continental populations in 1936 (Spärck 1936). The red morph of S. vulgaris has successfully spread through most of the country and areas previously containing only black squirrels now also report that the red morph is present (Bille Brahe Selby  pers. Comm. 2011). The change in coat color phenotype could be the result of interbreeding between indigenous black and introduced squirrels with red pelage through translocations in Denmark. It seems likely that Danish squirrels now represent a mixed genetic stock, although a small population in the south of Funen still may represent the original stock. The distribution and frequency of the black morph is greatly reduced after the introduction of the red Sciurus vulgaris (Degn 1974), but there is no evidence that the red phenotype has managed to invade the few remaining pure black populations in the Southwest of Funen (H.J. Baagøe pers. Comm. 2011). It has been suggested that the black squirrels on Funen may represent an ESU (evolutionary significant unit). If this small population is still unaffected by the red Sciurus vulgaris, this black morph is now under genuine threat of extinction in Denmark and the need for active conservation of the original black squirrel is particularly urgent. A conservation program began in 2009 aimed at conserving the black squirrels through translocation to the island of Langeland, where no squirrels are present today. The translocation of black squirrels into suitable areas was suggested as a conservation 

  24

management strategy not only to promote the recovery of the threatened populations of black squirrels, but also as a re‐introduction of squirrels to Langeland. Translocations have successfully served as the primary component of a Delmarva fox squirrel (Sciurus niger cinereus) recovery program (Lance et al. 2003) and such a conservation strategy seems the most ideal solution to protect, what is probably the last stock of original black squirrels.  

This paper describes the results of mitochondrial sequencing and MC1R genotyping and their immediate use in constructing an applied conservation strategy for the remaining black squirrels on Funen. In this study we examine mtDNA Control Region and Cytochrome b sequence variation from S. vulgaris museum specimens collected prior to and post introduction of red squirrels to Funen to look for direct evidence of the introduction and expansion of non‐indigenous haplotypes in the black Funen population. The present study aimed to investigate the genetic structure of S. vulgaris in Denmark, using sequence data from the mitochondrial (mt)DNA control region and cytochrome b. In this study we analyzed the control region to assess variation within and differentiation among fragmented Danish populations and to determine whether any populations of S. vulgaris in Denmark are the product of translocations of red squirrels from other palaearctic populations. We assess possible historical population declines or expansions, and provide estimates for coalescence times (tmrca). With the mitochondrial data, we describe the phylogenetic relationships among the observed haplotypes and compare them with a number of previously published Sciurus species haplotypes. 

Materials and Methods

Samples

S. vulgaris samples were collected from museum skin specimen (Natural History Museum of Denmark, Naturama and the Natural History Museum), skin specimen from private collections and tissue samples from road kill. The specimens were from 1854 to 2010. A total number of 74 S. vulgaris samples that consisted of either skin (70) or muscle (4) were extracted.  A total of 14 samples never yielded any DNA, despite numerous different extraction and PCR attempts. The 60 samples that gave positive results were divided into 5 regions of Denmark: North Jutland (10), Mid‐Jutland (6), South‐Jutland (13), Funen (33) and Zealand (11) (Figure 6 and Appendix A).  

  25

 

Figure 6 Sampling locations of Sciurus vulgaris. Sampling localities are divided into North, Middle and South Jutland, Funen and Zealand. Each dot represents a sample from which DNA successfully was extracted (red= red coat color, black= black coat color, green = black coat color with red or grey tinge). Each star represents a sample from which no DNA was extracted (red= red coat color, black= black coat color).

DNA extractions

Extraction procedures for all ancient samples were performed in a laboratory dedicated to ancient DNA analysis, respectful of the most stringent criteria for analyzing ancient DNA. Precautionary measures were taken to avoid contamination during extraction. A piece of skin was sampled from the museum specimen using scissors that were sterilized using first a sodium hypochoride solution (6‐14 % active chloride), then a 99% ethanol solution followed by flame sterilization between samples. The skin samples (9 mm2) were digested overnight at 55° C with agitation in 500µl of buffer consisting of 10mM Tris, 10mM NaCl, 5mM CaCl, 2,5mM EDTA,  2% SDS, 10% Prot K solution and 0,26 mmol DTT (Clealands reagent – Dithiothreitol). The digest was further extracted using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) following the manufacturer’s instructions, except that the final elution step was performed at 37º in a heating block for 15 min after addition of the EB buffer. 

All procedures for contemporary samples were performed in a laboratory dedicated to modern DNA analysis. Muscle tissue (4mm2) was sampled using a disposable sterile scalpel 

  26

and the DNA was extracted using a DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN) following the manufacturer’s instructions. 

Mock extractions, consisting of the digestion buffer only, were co‐extracted with the squirrel samples during each extraction session to track potential cross‐contamination between samples. No more than 2 samples were co‐extracted in a single extraction session in order to limit cross‐contamination. 

DNA amplification and sequencing

A series of primers were designed to amplify the control region (Table 8, Appendix B; Figure 15 Appendix C), cytochrome b (Table 9, Appendix B; Figure 14 Appendix C) and MC1R (Table 10, Appendix B; Figure 16 and 17, Appendix C). Primers were designed based on the previously published GenBank sequences (control region: AJ238588; cytochrome b: NC002369; MC1R: EU604830‐ EU604831). All primers were designed with the software Primer3 (Rozen and Skaletsky 2000) in order to amplify short (range: 284bp‐300bp for mtDNA and 96bp‐202bp for nucDNA) overlapping fragments of DNA (Appendix C); when possible, primers were selected to preclude amplification of human orthologous fragments. A 461 bp region of mtDNA control region was amplified using the overlapping primer combinations sv_F675/ sv_R1001, sv_F675/ sv_R1176 and sv_F846/ sv_R1176. A 473 bp region of cyt b was amplified using sv_F14233/ sv_R14573 and sv_F14422/ sv_R14746. In total 798 bp of the MC1R were amplified using a combination of forward and reverse primers (Appendix C). 

The pre‐PCR mix was prepared in a DNA free room in the ancient DNA facilities for all ancient samples. The contemporary samples pre‐PCR mix was prepared in the pre‐PCR facilities of a laboratory dedicated to modern DNA. Each PCR reaction was carried out in a total volume of 25 µl. PCR conditions were as follows: 10X Buffer, 4 mM MgCl2, 1 mg/ml BSA, 1‐2U AmpliTaq Gold, 4 pmol of forward and reverse primer and between 1‐5 µl template DNA. After an initial denaturation at 92°C for 10 min, a total number of 40‐55 cycles of amplification were performed on a thermocycler Applied Biosystems GeneAmp ® PCR System 2700. Each amplification cycle consisted of denaturation at 92° C for 30 s, annealing at 45‐61° C for 30 s, and extension at 72° C for 30‐40s. A final extension reaction was performed at 72° C for 7 min (Table 8‐10, Appendix B for primer PCR conditions). Two independent blanks were carried out for each set of PCR experiments. PCR products were run on gel electrophoresis (agarose 2%) in order to check for the amplification of the targeted MC1R fragment. PCR products were further purified using KNF Laboport Diaphragm Vacuum Pump (N820FTP, N820.3FTP) or gel cut using the E.Z.N.A.® Gel purification  Kit (Omega Bio‐Tek, Inc ) using manufactorers instructions. Purified PCR amplicons were sent to sequence providers (Macrogen Korea and/or Macrogen Europe) for direct Sanger sequencing on both strands. Random PCR amplicons were independently sequenced twice to monitor for sequence quality. 

  27

All samples were analyzed for both mitochondrial markers. A total number of 3 individuals (F51 (Funen), CN5280 (Funen) and CN6080 (S‐Jutland) were analyzed to investigate the DNA quality of the ancient samples by amplifying increasing lengths of nucDNA sequences using combinations of MC1R primers. Furthermore 5 individuals were analyzed for the MC1R, consisting of 2 red squirrels (CN 4147(S‐Jutland), CN 6080 (S‐Jutland)) and 3 black squirrels (CN 110 (Funen); CN 5280 (Funen), F51 (Funen)). These samples were selected as they exhibited the best PCR amplification success on long mitochondrial DNA fragments, suggesting overall good DNA preservation conditions.

Sequence analysis

The correct base call for each peak was ensured by visual inspection of each chromatogram. The sequences were aligned using the Muscle (Edgar 2004) available in the software SEAVIEW (Gouy et al. 2010), and the authentic sequences were deduced from the consensus between the two strands.  As the whole MC1R sequence could not be determined for all the samples, we reconstructed a consensus sequence of the alleles present in red and black squirrels by merging the sequences of the different individuals analyzed within each group, respectively. The sequences for the consensus red S. vulgaris and consensus black S. vulgaris were compared with sequences publically available (Accession Numbers: EU604830‐ EU604831; McRobie et al. 2009) for MC1R in S. carolinensis.   Different partitions of the sequence data were generated as the two gene markers targeted could not be completely covered for all the individuals processed. These consist of a total number of 4 partitions for the mitochondrial control region, including 214‐398 bp of sequence information across 45‐305 individuals; and 2 partitions for the cytochrome b gene, including 298‐447bp of sequence information across 107‐171 individuals. Each partition has been further analyzed through the same analytical pipeline. First, sequences were binned according to their geographic origin and a series of summary statistics were estimated within bins (S, number of polymorphic sites; Hd, gene diversity; pi, nucleotide diversity; D and D*, tajima's D; F*, Fu and Li) as well as across bins (Number of shared haplotypes; Hst; Kst; Kst*; Fst) using DNAsp 5.0 (Librado and Rozas 2009). Median‐joining network were generated using Network (Bandelt et al. 1999). In addition, phylogenetic inference was performed under a Maximum of Likelihood framework using Phyml Online (Guindon et al. 2010; http://www.atgc‐montpellier.fr/phyml/) after the best model of molecular evolution was selected using jModeltest and the Akaike Information Criterion AICc (Posada 2008) and after the sequences were collapsed into haplotypes using the DNA to haplotype collapser and converter option in Fabox (Villesen 2007; http://users‐birc.au.dk/biopv/php/fabox/). A total number of 500 bootstraps were performed in order to assess the robustness of phylogenetic nodes. Lastly, the different partitions were analyzed in BEAST v1.6 (Drummond and Rambaut 2007) using the same mutation models as the ones used for phylogenetic inference and assuming a strict molecular clock uniformally 

  28

distributed from 0.1‐100% mutation/site/MY, which covers the whole range of molecular rates observed in mammals (Nabholz et al. 2008). We took advantage of Bayes Factor to compare two population models, namely one model of constant size over time, and one skyride model allowing for dynamic demographic trajectories over time. The posterior distributions of the time of the Most Recent Common Ancestor (tMRCA) of the whole tree, or a monophyletic clade consisting in the haplotypes observed in Funen, were plotted using Tracer 1.5 (Rambaut and Drummond 2007). BEAST analyses were run for 100,000,000 of generations, with sampling frequencies of 1/1,000, and the first 10,000,000 simulations were discarded as a burn‐in. Correct mixing for all the model parameters was confirmed as ESS values, as recovered from Tracer, were well superior to 200. 

Results

Cytochrome b variation in Denmark and Eurasia

We successfully characterized 298 bp of the cytochrome b for 60 individuals and 447 bp for 44 individuals, resulting in 2 partially overlapping fragments (sites with undetermined sequence were filtered out from the following analyses). The overall level of diversity observed in DK was low compared to the amount of diversity reported for another Sciurus species (S. lis) in Japan (Table 15‐16, Appendix D). While up to 6 haplotypes and 5 polymorphic sites were identified, no diversity was detected in Funen. In addition, haplotypes present in Funen were shared with other populations in Denmark; at a larger geographical scale, the cytochrome b exhibits rather poor power in resolving the phylogeographic structure of European populations, and identifying glacial refugia as has been decribed for other species (Hewitt 2000), suggesting that in spite of having been used successfully for other mammals, including e.g. rodents such as the flying squirrel, Glaucomys (Arbogast 1999) and the long‐tailed vole, Microtus longicaudus (Conroy and Cook 2000), the cytochrome b gene would not carry enough information to distinguish possible population structure within Denmark. 

Control region variation in Denmark and Eurasia

The 4 datasets of the control region resulted in the successful characterization of 398 bp for 48 individuals, 362 bp for 54 individuals, 343 bp for 54 individuals and 214 bp for 57 individuals (sites with undetermined sequence were filtered out from the following analyses). Overall, a maximum of 12 haplotypes and 19 polymorphic sites were identified for the control region. Interestingly, the majority of these, 3 from Funen, have never been reported before. Median joining networks were constructed for all control region datasets (Appendix E).  The network presented on figure 7 shows the genealogical relationship between the 12 Danish haplotypes discovered in the 362bp dataset. This network revealed that Danish haplotypes essentially are divided into 3 groups consisting of Jutland, Funen and Zealand. A total of 3 distinct haplotypes are observed in Funen, one corresponding to the large majority of the specimens (88%), while the two others have been observed in unique individuals (RR56 and CN5280, figure 7). Both exhibit only one mutation to the main Funen 

  29

haplotype and most likely derive from the latter. That all Funen haplotypes cluster in a unique group, distinct and distant at >4 mutations from any other haplotype (figure 8), is evidence of a distinct Funen lineage. Interestingly, no distinction is found between black and reddish/grey individuals in Funen since the latter (F69 and RR7) are grouped with the majority of black Funen squirrels. This suggests that while the Funen haplotypes are unique, the difference is not correlated to coat color. For all CR datasets (table 12‐14, Appendix D), summary statistics across main Danish geographic regions (Funen, Zealand, and South – Central – North Jutland) confirmed that Funen is isolated and does not share any sequence variant with all other geographical areas in Denmark (table 2). In almost all comparisons across pairs of populations, statistically significant values for Hst; Kst; Kst* were observed on permutation tests, suggesting that substantial genetic subdivision among these regions. The only exception consists of North and Mid Jutland populations that appear as not differentiated regardless of the control region dataset considered (Appendix D); therefore, these populations should be considered as a large panmictic (no deviation to neutrality is detected; see below) and connected geographical area. Interestingly, South Jutland and Zealand show substantial levels of genetic differentiation, with statistical significant Hst, Kst and Kst* values, but estimated levels of migration (Nm ; table 14, Appendix D) suggests possible gene flow across the two regions .  

Figure 7 Median Joining Networks of Danish S. vulgaris haplotypes. Network based on the mtDNA control region (362 bp). Circle sizes are proportional to haplotype frequency and each point represents one mutation. Red = N-Jutland, Yellow= M-Jutland, Green = S-Jutland, Black= Funen, Pink= Zealand and Purple= black individuals from West Zealand.

  30

Pop. 1 Pop. 2 Shared

Ht Hst Kst Kst* Fst Nm

Funen

S

Jutland

0

0.43779

***

0.65360

***

0.58959

*** 0.76697 0.15

Funen

NM