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PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

CARRERA DE MICRO BIOLOGÍA INDUSTRIAL

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE

Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN

MANANTIAL TERMOMINERAL EN PAIPA, BOYACÁ

JAVIER ANTONIO GÓMEZ GÓMEZ

TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial

Para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Bogotá, D. C. Julio de 2008

NOTA DE ADVERTENCIA

"La Universidad no se hace responsable

por los conceptos emitidos por sus

alumnos en sus trabajos de tesis. Solo

velará por que no se publique nada

contrario al dogma y a la moral católica y

por que las tesis no contengan ataques

personales contra persona alguna, antes

bien se vea en ellas el anhelo de buscar

la verdad y la justicia".

Artículo 23 de la Resolución No13 de

julio de 1946.





APROBADO

SANDRA BAENA G. Ph. D BALKYS QUEVEDO M. Sc Bióloga Ing. Química Directora Codirectora AURA MARINA PEDROZA Ph. D CATALINA GIRALDO M. Sc Bacterióloga Ing. Proc esos Jurado 1 Jurado 2





APROBADO INGRID SCHULER Ph. D JANETH ARIAS P M. Sc Bióloga Bacterióloga Decana Académica Directora de Carrera

Saber que no se sabe

es una noble intuición.

Pretender saber y no saber

es una enfermedad.

Y el que reconoce la enfermedad

como tal no la sufre.

A Dios y A Mis Abuelitos.

AGRADECIMIENTOS

A la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambienta (USBA) de la

Universidad Javeriana que permitió el desarrollo de este proyecto.

A la Doctora Sandra Baena por su confianza, apoyo, paciencia y

conocimientos aportados para el desarrollo de esta investigación.

A la Ingeniera Balkys Quevedo por las oportunidades que me ha dado en

la vida, por su paciencia, confianza y conocimientos.

A mi Madre y Padre por que siempre me han apoyado y me han

enseñado a ser responsable y una persona con principios e integral. A mi

familia por su amor.

A mis compañeros de USBA Carolina Díaz, Carolina Rubiano, Gina

López, Catalina Carvajal, Natalia Perdomo, Luisa Bernal, Erika García,

Pablo Vega y Habib Yanine por su apoyo y colaboración incondicional y

por hacer mas agradables mis días en el laboratorio.

A mis amigos que siempre han creído en mis capacidades y a quienes

debo los mejores momentos de mi existencia.

A la comunidad Jesuita que me ha educado desde los 5 años y me ha

inculcado el amor a Dios y a sus instituciones y me ha enseñado a ser un

ser humano integral y me ha encaminado hacia el MAGIS Ignaciano.

RESUMEN

Se caracterizó cinética y enzimáticamente la cepa Thermoanaerobacter

italicus USBA 18, bacilo termófilo anaerobio aislado de un manantial

termomineral (5º45’30.69’’N; 73º6’50.61’’W) de Paipa (Boyacá), para

determinar las condiciones óptimas de crecimiento, sustratos degradados

y metabolitos producidos y cuantificar la actividad enzimática amilolítica,

peptinolítica y xilanolítica de este organismo. Las condiciones óptimas de

crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 se evaluaron

teniendo en cuenta tres variables, temperatura, pH y concentración de

NaCl en el medio de cultivo y se determinaron parámetros cinéticos (µx) y

tiempo de duplicación (td) como criterio para la selección de las

condiciones óptimas de crecimiento. En condiciones óptimas de

crecimiento se determinaron las actividades enzimáticas. Se evaluó el

crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en diferentes

sustratos: almidón, pectina, arabinosa, galactosa, glucosa y xilano. Se

realizó seguimiento al sustrato consumido mediante la cuantificación de

azúcares reductores por DNS y se determinaron los metabolitos

producidos en la fermentación de las diferentes fuentes de carbono por

cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC). La temperatura óptima de

crecimiento fluctuó entre 65 y 70ºC, usando glucosa (20 mM) como fuente

de carbono. El pH óptimo de crecimiento fue alrededor de 7.2 y 1% de

NaCl se determinó como la concentración adecuada para el crecimiento

Tiene una actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica considerable y

aplicable a nivel industrial. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

tiene la capacidad de fermentar azúcares como glucosa, galactosa y

xilosa, sin embargo la arabinosa no es utilizada como fuente de energía.

A su vez, la cepa USBA 18 también es capaz de degradar polímeros

complejos como almidón, pectina y xilano. A partir del metabolismo

genera como principal producto final de su fermentación acido láctico.

TABLA DE CONTENIDO

Pagina 1. INTRODUCCIÓN 1 2. MARCO TEORICO 4

2.1. AMBIENTES EXTREMOS 4 2.1.1. Ambientes terrestres no antropogénicos 5 2.1.1.1. Manantiales termales 6 2.1.1.2. Géiseres 7

2.1.1.3. Solfataras, fumarolas y mofetes 8 2.1.2. Ambientes marinos y subterráneos 9 2.1.3. Ambientes Antropogénicos, ambientes temporales y ambientes con micronichos termales 9 2.2. MICROORGANISMOS DE AMBIENTES EXTREMOS 10 2.2.1. Microorganismos barófilos 11

2.2.2. Microorganismos alcalófilos 11 2.2.3. Microorganismos acidófilos 11 2.2.4. Microorganismos halófilos 11 2.2.5. Microorganismos psicrófilos 12

2.3. MICROORGANISMOS TERMÓFILOS 13 2.3.1. Taxonomía de los microorganismos termófilos 15 2.3.2. Mecanismos de supervivencia a altas temperaturas 17 2.3. Género Thermoanaerobacter 28 2.3.1. Thermoanaerobacter italicus 31 2.3.1.1. Hábitat de Thermoanaerobacter italicus en Colombia 32 2.3.1.1.1. Manantial termomineral PP-10 (pozo Hotel Lanceros) 32 2.3.2. Metabolismo del género Thermoanaerobacter 33

2.3.2.1. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas 33 2.3.2.2. Ruta de las pentosas fosfato 35 2.3.2.3. Enzimas amilolíticas 36 2.3.2.4. Enzimas xilanolíticas 39

2.3.2.5. Enzimas pectinolíticas 41 3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 44 4. OBJETIVOS 46 4.1. OBJETIVO GENERAL 46

4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS 46 5. MATERIALES Y METODOS 47 5.1. Microorganismo 47 5.2. Medio de cultivo y condiciones de cultivo 48

5.2.1. Medio de cultivo mínimo de crecimiento 48

Pagina

5.3. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento 49 5.3.1. Temperatura óptima de crecimiento 49 5.3.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento 50 5.3.3. pH óptimo de crecimiento 50

5.4. Determinación de actividades enzimáticas 50 5.4.1. Determinación de actividad amilolítica 51 5.4.1.1. Determinación de temperatura óptima de actividad amilolítica 52 5.4.2. Determinación de actividad pectinolítica 52 5.4.3. Determinación de actividad xilanolítica 52

5.5. Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos 53 5.5.1. Seguimiento al consumo de sustrato 53 5.5.2. Determinación de metabolitos producidos por HPLC 54 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 55

6.1. Morfología Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 55 6.2. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento 56 6.2.1. Temperatura óptima de crecimiento 57 6.2.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento 58

6.2.3. pH óptimo de crecimiento 59 6.3. Determinación de Actividades enzimáticas 60 6.3.1. Actividad amilolítica 61 6.3.1.1. Temperatura óptima de actividad amilolítica 63 6.3.2. Actividad pectinolítica 64 6.3.3. Actividad xilanolítica 64 6.4. Crecimiento en diferentes sustratos 65 6.4.1. Determinación de metabolitos producidos por HPLC 68 7. CONCLUSIONES 74 8. RECOMENDACIONES 76 9. BIBLIOGRAFIA 77 10. ANEXOS 88 ANEXO 1. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA DETERMINACIÓN DE PESO SECO BACTERIANO 88 ANEXO 2. DETERMINACION DE ACTIVIDAD AMILOLITICA 92 ANEXO 3. DETERMINACION DE ACTIVIDAD PECTINOLITICA 97 ANEXO 4. DETERMINACION DE ACTIVIDAD XILANOLITICA 102

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Terrazas de Mammoth, manantial termal. Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming, EUA 6

Figura 2. Géiser el Viejo Fiel, Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming, EUA 8

Figura 3. Fumarola del cráter del volcan Mutnovskaja. Republica Checa 9

Figura 4. Clasificación de los microorganismos basada en los rangos óptimos de temperatura 14

Figura 5. Lípidos de Archaea y en bacterias 27

Figura 6. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas 35

Figura 7. Hidrólisis enzimática de almidón hasta glucosa y accionar de las enzimas Amilolíticas 37

Figura 8. Estructura del xilano 40

Figura 9. Microfotográfica de contraste de fase de Thermoanaerobacter italicus USBA 18 55

Figura 10. Cinética de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en condiciones óptimas de crecimiento 56

Figura 11. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 58

Figura 12. Determinación de la concentración de NaCl óptima de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 59

Figura 13. Determinación del pH óptimo de crecimiento para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 60

Figura 14. Actividad amilolítica de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 a diferentes temperaturas 63

Figura 15. Actividades enzimáticas producidas por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 65

Figura 16. Consumo de sustrato con respecto al tiempo por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 68

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Parámetros físicos y químicos de los fluidos hidrotermales, agua de mar y agua dulce 7

Tabla 2. Algunos productos biotecnológicos y aplicaciones de los extremófilos 12

Tabla 3. Algunos ejemplos de Bacterias termófilas 15

Tabla 4. Géneros del Orden Clostridiales 19

Tabla 5. Principales características del MTM Pozo Hotel Lanceros 47

Tabla 6. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con diferentes fuentes de carbono a las 120 h de fermentación 69

Tabla 7. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus USBA 18 con diferentes concentraciones de extracto de levadura y peptona a las 120 h de fermentación 70

Tabla 8. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con KNO3 como fuente inorgánica de nitrógeno y solución de vitaminas de Balch a las 120 h de fermentación 71

Tabla 9. Principales Características de algunas especies del género Thermoanaerobacter 73

1

1. INTRODUCCIÓN

El estudio, identificación y caracterización de microorganismos aislados de

ambientes extremos hace parte del entendimiento de la diversidad

microbiana de este tipo de ambientes, con el fin de determinar las

características particulares que permiten a los organismos sobrevivir en

condiciones extremas y comprender el papel desempeñado por los

microorganismos en sus hábitats naturales. Los microorganismos

extremófilos se caracterizan por habitar en ambientes en los cuales las

condiciones físicas son críticas con respecto a las condiciones “normales”

(temperaturas altas o muy bajas, valores de pH extremadamente ácidos ó

básicos, ausencia de oxígeno, salinidad, presión, entre otras), sin embargo,

estos microorganismos tienen la capacidad de sobrevivir y reproducirse bajo

estas condiciones.

Dentro del grupo de los organismos extremófilos se encuentran los

termófilos, los cuales están adaptados para crecer óptimamente a

temperaturas altas (60°C a 110°C). Estos microorgan ismos han sido aislados

a partir de fuentes termales marinas y terrestres, áreas volcánicas, fumarolas

negras, sistemas hidrotermales marinos, reservorios de petróleo, entre otros

hábitats naturales, pero también se han aislado a partir de ambientes

antropogénicos como el compost, materia orgánica en descomposición y

aguas residuales de procesos industriales.

Las investigaciones sobre este tipo de microorganismos, así como de todos

los extremófilos ha generado grandes expectativas y ha tomado gran

importancia desde hace dos décadas, debido a que pueden ser utilizados en

aplicaciones biotecnológicas, ya que sus enzimas y su actividad metabólica

en general se desarrollan a altas temperaturas y por ende son estables a

estas. Desafortunadamente, en la actualidad, solo una pequeña parte de la

2

diversidad microbiana de ambientes extremófilos ha sido estudiada a nivel

mundial, de ahí que sea un campo atractivo para el desarrollo de nuevas

investigaciones.

Investigaciones desarrolladas en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología

Ambiental (USBA) demostraron la presencia de poblaciones microbianas

termofilicas en manantiales termominerales (MTM) en la región de Paipa,

Boyacá, con la identificación de microorganismos sulfato reductores,

tiosulfato reductores, reductores de hierro férrico, reductores de nitrato y

principalmente microorganismos fermentativos. Se han identificado nuevas

especies de bacterias sulfato-reductoras termófilas pertenecientes al género

Desulfomicrobium y se ha propuesto una nueva especie llamada

Desulfomicrobium thermophilum. Del mismo modo se encontró una marcada

dominancia de organismos del filum Firmicutes y especialmente de miembros

del genero Thermoanaerobacter identificados por medio de análisis

fenotípicos y moleculares del gen 16S rRNA. A partir de estos estudios se

seleccionó la cepa Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 aislada del

manantial termomineral P4 - pozo Hotel Lanceros en Paipa, Boyacá.

El conocer más a fondo estos microorganismos puede llevar al desarrollo de

moléculas y metabolitos de aplicación industrial y biotecnológica, partiendo

de la premisa que si el microorganismo productor resiste condiciones

extremas, las moléculas y metabolitos que produce tendrán esta misma

capacidad. Es por esto que se tiene un amplio interés científico con respecto

a estos microorganismos y sus posibles usos en una extensa variedad de

industrias.

En este trabajo, se realizó la caracterización cinética y enzimática de la cepa

Thermoanaerobacter italicus USBA 18 (98% de similitud con

Thermoanaerobacter italicus), teniendo en cuenta condiciones de

3

temperatura, pH y concentración de NaCl. A su vez, se realizó un análisis

enzimático en diferentes sustratos y la identificación de los metabolitos

producidos.

4

2. MARCO TEÓRICO

2.1. AMBIENTES EXTREMOS

Todo tipo de vida en la Tierra, así como la distribución de los organismos

está claramente influenciada por una gran variedad de factores abióticos, de

allí que la distribución de sus integrantes esté relacionada con la capacidad

que tengan estos para adaptarse, soportar y permanecer estable dentro de

su ambiente, bajo unas condiciones determinadas.

Los microorganismos, así como cualquier organismo tienen que ser estables

bajo las condiciones de su entorno para llevar a cabo su reproducción y

asegurar su supervivencia. Es por esto que la limitación de nutrientes y la

tolerancia ambiental regulan o excluyen la existencia de microorganismos en

diferentes ambientes (Atlas y Bartha, 2002).

Un ambiente extremo es definido como lo opuesto a un ambiente normal, es

decir que posee condiciones significativamente diferentes a aquellas

denominadas “normales” para uno o varios de los parámetros que

caracterizan el medio. Un ambiente normal, generalmente tiene una

temperatura entre 4 y 40 °C, pH entre 5 y 8.5, sali nidad oscilante entre la

salinidad del agua dulce (< 100 mg/l) y aquella del agua de mar (~ 35000

mg/L), presión cercana a la atmosférica (1 Atm) y una composición

atmosférica similar a la atmósfera terrestre (N2 78.03%, O2 20.99%, Ar 0.94%

y 0.04% de otros gases).

Existen muchos ambientes alrededor del mundo que son considerados como

extremos. Se encuentran en áreas geotermales con altas temperaturas,

regiones polares con temperaturas alrededor del punto de congelación del

5

agua, profundidades de los océanos con presiones muy altas y manantiales

ácidos ó alcalinos con pH bajos o altos respectivamente (Vorgias y

Antranikian, 2004).

Considerando las limitaciones con respecto a los requerimientos

ambientales, los microorganismos extremófilos son capaces de explotar

diversos hábitats en la tierra y en el mar (Burgess et al., 2007). Por esta

razón es que este tipo de organismos pueden ser encontrados en diferentes

ambientes que suministren las condiciones mínimas para su supervivencia y

reproducción.

Según Burgess et al (2007) los ambientes de temperaturas altas pueden ser

agrupados en diferentes clases.

2.1.1. Ambientes terrestres no antropogénicos

Dentro de este grupo de ambientes se encuentran los manantiales calientes

(manantiales termominerales) géiseres, solfataras y depósitos de lodos, los

cuales están distribuidos en las regiones que presentan actividad volcánica

alrededor del mundo, donde se incluye Islandia, el oeste de Norteamérica,

Nueva Zelanda, Japón, la región este de Rusia y demás zonas que hacen

parte del anillo de fuego del Pacífico. El Parque Nacional de Yellowstone al

norte de EUA presenta la mayor concentración de actividad geotérmica en la

Tierra y es el lugar donde se han desarrollado gran parte de los estudios de

biodiversidad de ambientes termófilos. En Colombia se han desarrollado

varios estudios para caracterizar geoquímicamente algunos sistemas

geotérmicos en Paipa (Boyacá) (Alfaro, 2002) y estudiar la diversidad

microbiana de estos ambientes termominerales relacionados con actividad

volcánica (Baena y Roldan, 2005).

6

2.1.1.1. Manantiales termales.

El agua que emerge con una temperatura por encima de la temperatura del

cuerpo humano (36.7°C) es definida como manantial t ermal. Los manantiales

termales (figura 1) son manifestaciones superficiales de un gran sistema

hidrotermal y son de gran importancia a nivel de la energía geotermal y en la

exploración mineral. Contienen depósitos de oro, plata, cobre y otros

elementos pueden ser originados en estos ambientes (Burgess et al., 2007).

Los sistemas geotermales están presentes en muchos lugares de la Tierra y

no necesariamente están relacionados con la actividad volcánica. Esta agua

caliente usualmente muestra altas concentraciones de muchos elementos y

pueden ser altamente supersaturadas con respecto a una variedad de

minerales (Tabla 1) (Fernández-Turial et al., 2005).

Figura 1. Terrazas de Mammoth, manantial termal. Parque Nacional de

Yellowstone, Wyoming, EUA. (Fuente: McCall., 2005).

7

Tabla 1. Resumen de parámetros físicos y químicos de los fluidos

hidrotermales, agua de mar y agua dulce

Característica Profundidad marina (mmol/kg)

Agua de mar (mmol/kg)

Terrestre (mmol/kg)

Agua dulce (mmol/kg)

Temperatura (°C) 50-400 2-28 50-~96 2-28 pH 3-6 8 1-10 6-9 H2S 1.1-41 0 0-0.09 0 H2 0.14-0.52 0 2.3-22 x 10-6 0 CO2 3.7-285 2.5 0.3-7.0 0.25-7.9 CH4 <0.005-2.4 0 7- x 10-6 0 NH4

+ 0.01-5.6 0 0-1 Variable SO4

2- 0-4.2 30 0.16-40 0.019-6.3 Fe 0.013-16.5 0.4 x 10-6 0.-0.6 0.72 x 10-3 Mg 0 53 0-0.172 0.0079-3.16 Ca 2.1-109 10 0-0.235 0.05-3.16 K 1.2-79 10 0.07-1.95 0.007-0.19 Mn 0.012-7.1 10-6 0.05-3.4 x 10-3 0.15 x 10-3 Na 38-926 500 0.04-19.8 0.025-2.5

Fuente: Reysenbach et al., 2002.

2.1.1.2. Géiseres

Cuando el agua caliente no puede circular libremente debajo de la superficie,

tiene que salir intermitentemente por la presión generada que se acumula. El

fenómeno de géiser (figura 2) ocurre en casos extremos, en el cual el agua y

la corriente de vapor brotan hacia la superficie intermitentemente formando

fuentes donde el agua alcanza grandes alturas (McCall, 2005).

8

Figura 2. Géiser el Viejo Fiel, Parque Nacional de Yellowstone, Wyoming,

EUA. (Fuente: www.yellowstone.net).

2.1.1.3. Solfataras, fumarolas y mofetes.

Son aberturas de ventilación que permiten el escape de vapor y agua

caliente. El vapor que escapa por estas aberturas puede mezclarse con

gases sulfurosos y depositar azufre cuando emerge a la superficie. En el

lugar donde el dióxido de azufre y el sulfuro de hidrogeno son emitidos, se

presentan anillos con depósitos amarillos de azufre en la superficie. Las

aberturas donde este tipo de emisiones ocurren son llamadas solfataras y

fumarolas. Las aberturas que son fuentes de gases tóxicos son llamadas

mofetes. Además de dióxido de carbono y gases sulfurosos, gases inertes

como el nitrógeno y el argón pueden ser emitidos, estos gases son

indetectables y en muchos casos peligrosos. El principal gas emitido de estos

respiraderos es el dióxido de carbono que puede ser letal en altas

concentraciones (McCall, 2005).

9

Figura 3. Fumarola del cráter del volcan Mutnovskaja. Republica Checa

(Fuente: www.kamcatka.cz/files/km17.jpg)

2.1.2. Ambientes marinos y subterráneos

Los ambientes marinos están compuestos generalmente por fuentes

hidrotermales en las profundidades del mar y chimeneas subterráneas

(fumarolas negras) (Burgess et al., 2007). Los sistemas hidrotermales

marinos generalmente contienen una alta concentración de sales (~ 3%) y

exhiben un pH ligeramente acido o alcalino (pH 5 a 8.5) (Stetter, 1999).

Dentro de los ambientes subterráneos se incluyen los reservorios de

petróleo, las lagunas calientes y los acuíferos geotermales (Burgess et al.,

2007).

2.1.3. Ambientes Antropogénicos, ambientes temporal es y ambientes

con micronichos termales.

Los ambientes antropogénicos generalmente están compuestos por pilas de

compost, aguas hervidas de procesos industriales y efluentes de las plantas

10

de producción. Los ambientes temporales y con micronichos termales se

encuentran por ejemplo, en cuerpos de animales muertos, en pilas de

compost y estiércol y en materiales orgánicos en descomposición (Burgess et

al., 2007).

2.2. MICROORGANISMOS DE AMBIENTES EXTREMOS

En la Tierra existen una gran diversidad de ecosistemas y cada uno de ellos

posee una serie de características propias que los microorganismos

presentes en este toleran. Sin embargo existen ambientes en los cuales las

condiciones son extremas y por ende, las poblaciones encontradas dentro de

estos poseen límites mayores de tolerancia comparados con los parámetros

de un ambiente normal (Atlas y Bartha, 2002).

Los microorganismos que son capaces de sobrevivir y crecer óptimamente a

temperaturas por debajo de 10°C y por encima de 40° C, a un pH menor de 5

y mayor a 8, a presiones mayores a 1 Atm y a concentraciones de sales de

más de 30 g/L son definidos como extremófilos (Vorgias & Antranikian,

2004).

Los microorganismos extremófilos dependiendo de la condición extrema bajo

la cual estén sometidos, constituyen varios grupos fisiológicos conocidos

como barófilos, alcalófilos, acidófilos, halófilos, psicrófilos, termófilos e

hipertermófilos (Lowe et al., 1993).

Desde un punto de vista comercial, las enzimas de los extremófilos tienen

gran importancia. El uso de este tipo de microorganismos en los procesos

industriales ha generado una gran expectativa a nivel biotecnológico e

industrial, debido a que cada uno de estos grupos tiene características únicas

que pueden ser explotadas con el fin de generar biomoleculas de importancia

11

en la industria (Horikoshi, 2007). La tabla 2 muestra algunas aplicaciones

obtenidas como resultado del trabajo con microorganismos extremófilos.

2.2.1. Microorganismos barófilos

Son organismos que viven óptimamente a presiones hidroestáticas altas

(Horikoshi, 2007), generalmente son encontrados en el fondo del mar o en

reservorios de petróleo.

2.2.2. Microorganismos alcalófilos

Son organismos que crecen a valores de pH altos, están ampliamente

distribuidos a través del mundo y requieren ambientes alcalinos y la

presencia de iones de sodio para su desarrollo. Se han encontrado en

manantiales ricos en carbonato y en suelos alcalinos que usualmente tienen

pH de 10 ó mayores (Vorgias & Antranikian, 2004).

2.2.3. Microorganismos acidófilos

Son organismos que requieren de medios ácidos para crecer con un pH

óptimo de 3 o menor (Horikoshi, 2007). Los campos solfataricos son los

biotipos comunes donde los microorganismos que prefieren las altas

temperaturas y condiciones ácidas para vivir (Vorgias & Antranikian, 2004).

2.2.4. Microorganismos halófilos

Son capaces de crecer óptimamente a concentraciones de NaCl por encima

de la concentración promedio del agua de mar (> 0.6M de NaCl). Los

halófilos han sido principalmente aislados de lagos salinos como el Gran

12

Lago Salino (Big Salt Lake) en Utah (salinidad > 2.6M) (Vorgias &

Antranikian, 2004).

Tabla 2. Algunos productos biotecnológicos y aplicaciones de los

extremófilos

Extremófilos Producto Aplicaciones

Tratamiento de desechos Acidófilos Oxidadotes de azufre Extracción de metales y desulfuración

Proteasas, celulasas, lipasas, amilasas y pululanasas

Detergentes

Elastasas y queratinasas

Productos para la caída del cabello

Xilanasas Blanqueamiento de papel

Alcalófilos

Ciclodextrinas Productos alimenticios, químicos, cosméticos y farmacéuticos

Lípidos Liposomas para la extracción de drogas y cosméticos

Solutos compatibles Proteínas y Protectantes celulares

Halófilos

Ácido γ-linoleico y β-caroteno

Alimentos saludables, suplementos dietarios, colorantes alimenticios

Fosfatasa alcalina Biología molecular Proteasas, lipasas, celulasas y amilasas

Detergentes Psicrófilos

Ácidos grasos poliinsaturados

Aditivos alimenticios y suplementos dietarios

Termófilos DNA polimerasa Amplificación de DNA por PCR

Proteasas, lipasas y pululanasas

Detergentes

Amilasas Panadería y cervecería

Hipertermófilos

Xilanasas Blanqueamiento de papel

Fuente: Horikoshi, 2007.

2.2.5. Microorganismos psicrófilos

Son organismos que tienen una temperatura óptima de crecimiento de 15°C

o menor y una máxima temperatura de 20°C (Horikoshi , 2007).

13

2.3. MICROORGANISMOS TERMÓFILOS

Los microorganismos han sido encontrados en casi todos los lugares

explorados hasta el momento, desde las fuentes hidrotermales en las

profundidades de los océanos hasta en la helada Antártica y en las

profundidades de la litosfera terrestre, bajo ambientes que representan

rangos extremos a nivel de condiciones físicas y químicas que a pesar de

todo, permiten la sobrevivencia celular. Los microorganismos conocidos

como extremófilos representan la adaptación más radical que les permite

sobrevivir y crecer bajo estas condiciones (Robb et al., 2008).

Los organismos termófilos e hipertermófilos pertenecen a los dominios

Archaea y Bacteria. Estos organismos pueden ser clasificados de acuerdo a

su temperatura óptima de crecimiento de la siguiente manera: mesófilos (Top

20-45°C), termófilos (T op 45-80°C) e hipertermófilos (T op > 80°C) (Figura 4).

Además, teniendo en cuenta las temperaturas máximas y mínimas de

crecimiento, los termófilos pueden ser subdivididos en termótolerantes que

crecen óptimamente a temperatura mesófilica, pero tienen un crecimiento

máximo a temperaturas mayores a 50°C; termófilos (T op 50-70°C) y termófilos

extremos (Top >70°C) (Burgess et al., 2007). Algunos ejemplos de estos

microorganismos se presentan en la tabla 3.

Metabólicamente, los microorganismos termófilos e hipertermófilos pueden

ser anoxigénicos y oxigénicos, fotoautótrofos, fotoheterótrofos,

quimiolitoautótrofos ó quimiorganótrofos (heterótrofos). Su diversidad

metabólica está reflejada en la diversidad de hábitats que ocupan, donde la

luz y la amplia cantidad de compuestos orgánicos e inorgánicos asociados a

los sistemas hidrotermales pueden servir como fuente de energía

(Reysenbach et al., 2002).

14

90°C Lagunas Calientes 80°C 70°C Pasteurización 60°C 50°C

Ter

móf

ilos

40°C Cuerpo Humano 30°C 20°C

Mes

ófilo

s

10°C Refrigeración 0°C -10°C

Psi

cróf

ilos

Congelación (-20°C)

Figura 4. Clasificación de los microorganismos basada en los rangos

óptimos de temperatura (Fuente: McArthur, 2006).

Gran parte de los microorganismos termófilos e hipertermófilos son

anaerobios ya que en la mayoría de los ambientes donde se encuentran

estos organismos, la solubilidad del oxígeno decrece con el aumento de la

temperatura y por esta razón los ambientes hidrotermales se encuentran en

microaerofilia o en anaerobiosis (Edwars et al., 1990).

15

Tabla 3. Algunos ejemplos de Bacterias termófilas

Especie Ubicación

Temperatura (optima; °C)

Rango de pH (optimo)

Metabolismo

Referencia. Desulfurobacterium thermolithotrophum

Fuente hidrotermal en el fondo del mar

40-75 (70)

4.4-7.5 (6)

C l´Haridon et al. (1998)

Thermothrix azorensis Fuente termal, Isla de San Miguel, Azores

60-87 (76-78)

6-8.5 (7-7.5)

C Odintsova et al. (1996)

Spirochaeta thermophila Fuente termal, Isla Raoul, Archipiélago de Kermadec. Nueva Zelanda

40-73 (66-68)

5.9-7.7 (7.5)

O Aksenova et al. (1992)

Thermonema rissuanum Fuente termal marina , Bahía de Nápoles, Italia

35-65 (60)

5.5-9.5 (7-7.5)

O Tenreiro et al. (1997)

Deferribacter thermophilus

Agua de un campo de producción petrolera, Mar del Norte

50-65 (60)

5-8 (6.5)

M Greene et al. (1997)

Rhodothermus marinus Fuente termal marina, Islandia

54-77 (65)

nd (7)

O Alfredsson et al. (1988)

thermodesulfobacterium commune

Fuente termal, Parque Nacional de Yellowstone

50-80 (70)

6-8 (7)

O M

Zeikus et al. (1983)

Dictyoglomus thermophilum

Fuente termal, Japón 51-80 (73-78)

5.4-8.9 (7)

O Saiki et al. (1985)

Rhodothermus obamensis Fuente termal marina, Bahía de Tachibana, Japón

50-85 (80)

5.5-9 (7)

O Sako et al. (1996)

O, organótrofo, M, Mixótrofo; nd, no determinado.


2.3.1. Taxonomía de los microorganismos termófilos

Dentro del dominio Archaea se pueden encontrar microorganismos

pertenecientes a los reinos Euryarchaeota y Crenarchaeota. Todos los

miembros de Crenarchaeota son organismos termófilos e hipertermófilos,

16

que han sido aislados de una gran variedad de ambientes extremos

(Rubiano, 2006). A Crenarchaeota pertenecen los siguientes géneros:

Acidilobus, Staphylothermus, Ignicoccus, Desulfurococcus, Thermosphaera,

Sulfophobococcus, Stetteria, Thermodiscus, Pyrodictium, Hyperthermus,

Pyrolobus, Stygiolobus, Sulfurisphaera, Acidianus, Thermofilum,

Thermoproteus, Pyrobaculum, Thermocladium, Caldvirga (Wagner y Wiegel,

2008). Al reino Euryarchaeota pertenecen los siguientes géneros:

Thermoplasma, Methanocaldococcus, Methanotorris, Thermococcus,

Pyrococcus, Palaeococcus, Archeoglobus, Geoglobus, Ferroglobus,

Methanopyrus, Methanothermus, Methanobacterium, Methanothermobacter,

Methanothermococcus, Methanosarcina, Methanomethylovorans,

Methermicoccus, Methanothrix, Methanoculleus (Wagner y Wiegel, 2008).

Los órdenes donde se encuentran distribuidos los microorganismos

termófilos anaerobios del dominio Bacteria son: Acidithiobacillales,

Chromatiales, Burkholderiales, Bacteroidales, Spirochaetales,

Halanaerobiales, Thermolithobacterales, Natranaerobiales,

Thermoanaerobacteriales, Clostridiales (Tabla 4), Bacillales, Desulfurellales,

Nautiliales, Campylobacterales, Deferribacterales, Thermodesulfobacteriales,

Desulfovibrionales, Syntrophobacterales, Dictyoglomales, Anaerolinaeles,

Caldilineales, Chloroflexales, Sphaerobacterales, Thermomicrobiales,

Aquificales, Thermotogales, compuestos por géneros como,

Thermithiobacillus, Thermochromatium, Thermothrix, Thiobacter,

Acetomicrobium, Anaerophaga, Spirochaeta, Halothermothrix,

Thermolithobacter, Natranaerobius, Coprothermobacter, Gelria, Moorella,

Thermacetogenium, Mahella, Thermoanaerobacterium, Thermoanaerobacter,

Thermosediminibacter, aldanaerobacter, hermovenabulum,

Tepidanaerobacter, Ammonifex, Thermanaeromonas, Thermhydrogenium,

Thermosinus, Desulfotomaculum, Pelotomaculum, Carboxydothermus,

Thermincola,Desulfotomaculum thermosapovorans, Anaerobaculum,

17

Syntrophothermus, Thermanaerovibrio, Carboxydocella,Anaerobranca,

Thermosyntropha, Caldicellulosiruptor, ThermovirgaAnaerobaculum

thermoterrenum, Heliobacterium, Alkaliphilus, Clostridium, Tepidibacter,

Caloramator, Garciella, Caminicella, Caloranaerobacter,Thermobrachium,

Thermohalobacter, Tepidimicrobium, Anoxybacillus, Bacillus, Geobacillus,

Vulcanibacillus, Desulfurella, Hippea, Nautilia, Lebetimonas, Caminibacter,

Hydrogenimonas, Deferribacter, Flexistipes, Caldithrix, Thermodesulfatator,

Thermodesulfobacterium, Desulfothermus, Desulfacinum,

Thermodesulforhabdus, Thermodesulfovibrio, Oceanithermus,

Vulcanithermus, Thermodesulfobium, Dictyoglomus, Anaerolinea, Caldilinea,

Roseiflexus, Chloroflexus, Heliothrix, Sphaerobacter, Thermomicrobium,

Hydrogenivirga, Aquifex, Desulfurobacterium, Balnearium, Thermovibrio,

Hydrogenothermus, Sulfurihydrogenibium, Persephonella, Geotoga,

Marinitoga, Petrotoga, Thermosipho, Thermotoga, Fervidobacterium (Wagner

y Wiegel, 2008).

2.3.2. Mecanismos de supervivencia a altas temperat uras

La habilidad de los microorganismos (hiper) termófilos para vivir en altas

temperaturas está basada en el metabolismo, la estructura y la función

celular de sus componentes, los cuales tienen que ser resistentes a las altas

temperaturas (Stetter, 1999).

Los organismos llamados extremófilos, muestran una multitud de diferentes

adaptaciones para sobrevivir en sus particulares ambientes. Uno de los

mecanismos de adaptación que los termófilos poseen es una membrana que

mantiene la integridad celular a altas temperaturas. La membrana

citoplasmática juega un rol crucial en estas adaptaciones. La función de la

membrana citoplasmática es crear una barrera entre el citoplasma y el

ambiente extracelular, esta membrana es impermeable para los iones y para

18

la mayoría de moléculas pequeñas y está involucrada en el transporte de

proteínas controlando la composición iónica del citoplasma, además la

membrana mantiene el gradiente de protones y el potencial eléctrico a través

de la membrana. La energía almacenada del gradiente electroquímico de

proteínas puede ser utilizada para llevar la energía requerida para los

procesos como el transporte de sustratos, movilidad, entre otros. En

resumen, la membrana citoplasmática es importante para el mantenimiento

óptimo de las condiciones intracelulares y para el transporte eficiente de

energía (Albers et al., 2006).

En los microorganismos termófilos, la membrana celular tiene un alto

porcentaje de ácidos grasos insaturados con elevados puntos de fusión en

comparación a los lípidos encontrados en las membranas de los

microorganismos mesófilos. Los microorganismos ajustan la composición de

ácidos grasos y lípidos dependiendo de la temperatura a la cual crecen; al

aumentar la temperatura incrementa la proporción de ácidos grasos

insaturados. Esta característica le confiere a la membrana celular gran

flexibilidad y estabilidad térmica (Pedroza, 2001).

Los componentes celulares como los lípidos, ácidos nucleicos y proteínas

son completamente termosensibles. Los lípidos de membrana de la bacteria

hipertermófila T. maritima contiene un lípido éter glicerol, ácido 15,16-dimetil-

30-gliceroloxi-triacontanediocico a diferencia de los lípidos de ester

conocidos en mesófilos, esto significa un incremento en la estabilidad de la

membrana frente a la hidrólisis a altas temperaturas. En contraste, la

membrana en Archaea contiene lípidos de éter derivados del difitanil-glicerol

o del dímero di (bifitanil)-diglicerol, que les da una resistencia remarcable

contra la hidrólisis a altas temperaturas y pH ácidos (Stetter, 1999).

19

Tabla 4. Géneros del Orden Clostridiales

Especie

Ubicación Morfología Temperatura (óptima; °C)

Rango de pH (óptimo) Metabolismo

Donador de electrones

Aceptor de electrones Comentarios Referencia

Caloramator fervidus Fuente termal, Nueva Zelanda

Bacilos; 2-3 µm de largo; Móviles; Esporas esféricas

37-80 (68)

5.5-9 (7-7.5)

O Extracto de levadura; triptona; piruvato; glucosa; xilano; almidón; maltosa

Orgánicos Principales productos de la fermentación; acetato, H2, CO2

Patel et al. (1987)

Desulfotomaculum alkaliphilum

Mezcla de estiércol vacas / cerdos, Región de Moscú, Rusia

Bacilos curvos; 3-3.5 µm de largo; no móviles; endosporas

25-58 (50-55)

8-9.15 (8.6-8.7)

M H2; acetato; formato; etanol; lactato; piruvato

SO42-

SO32-

S2O32-

Requiere carbonato para crecer

Pikuta et al. (2000)

Desulfotomaculum nigrificans

Bacilos; 3-6 µm de largo; móviles; endosporas

40-60 (55)

nd (7.3)

M H2 + acetato; piruvato; lactato; etanol

SO42-

SO32-

S2O32-

Originalmente descrito como Clostridium nigrificans

Starkey et al. (1937)

Desulfotomaculum putei

2.7 Km. bajo tierra, Cuenca taylorsville, Virginia

Bacilos ovalados; móvil; esporas

40-60 (64)

6-7.9 (7-7.9)

M H2; acetato; formato; etanol; metanol; lactato; glucosa

SO42-

SO32-

S2O32-

No requiere aceptor de electrones cuando crece en glucosa

Liu et al (1997)

Desulfotomaculum luciae

2.7 Km. bajo tierra, Cuenca taylorsville, Virginia

Bacilos; 1-3 µm; móviles; endosporas

40-60 (nd)

6.3-7.8 (nd)

M H2; acetato; formato; etanol; lactato

SO42-

S2O32-

No requiere aceptor de electrones cuando crece en piruvato o lactato

Liu et al (1997)

Desulfotomaculum thermocisternum

Reserva de petróleo, 2.6 km bajo lecho marino, Mar del Norte

Bacilo recto; solo o en parejas; 2-5.2 µm; móviles; endosporas

41-75 (62)

6.2-8.9 (6.7)

M H2; acetato; piruvato; propionato; butirato; varios ácidos grasos

SO42-

SO32-

S2O32-

requiere biotina como factor de crecimiento

Nilsen et al. (1996)

20

Tabla 4. Continuación

Especie


Rango de pH

(óptimo) Metabolismo



Desulfotomaculum thermosapovorans

Compost, mezcla de cascos de arroz y maní

Bacilos rectos o ligeramente curvos; 5-8 µm; móviles; esporas

35-60 (50) nd (7.2-7.5)

M H2; formato; butirato; valerato; ácidos grasos; ácidos orgánicos; alcoholes

SO42-

SO32-

S2O32-

Requiere vitaminas para crecer

Fardeau et al. (1995)

Thermobrachium celere

Fuentes termales y calidas, Norte y Suramérica, Europa, África y Nueva Zelanda.

Bacilos; 1.5-14 µm de largo; móviles

37-75 (62-66)

5-9.7 (8)

O Extracto de levadura; glucosa; sucrosa; fructosa; galactosa; maltosa

Orgánicos Productos de fermentación: CO2, H2, acetato, formato y etanol

Engle et al. (1996)

Carboxydothermus hydrogenoformans

Pantano termal, Isla de Kunashir, Kuriles

Bacilos ligeramente curvos; 1.3-2.4 µm de largo; móviles

40-78 (70-72)

6.4-7.7 (6.8-7)

C H2O CO Se forma H2 y CO2

Svetlichny et al. (1991)

Thermoanaerobacter siderophilus

Fuente termal, Volcán Karymky, Rusia

Bacilos rectos o curvos; 3.5-9 µm; a veces en cadenas; móviles; endosporas

39-78 (69-71)

4.8-8.2 (6.3-6.5)

C M

H2; almidón; peptona; extracto de levadura; extracto de carne; glicerol; piruvato; azucares

Fe3+ Slobodkin et al. (1999)

Thermoanaerobacter wiegelii

Fuente termal, Jardines Gubernamentales, Rotorua, Nueva Zelanda

Bacilos; 4-10 µm; endosporas terminales

38-78 (65-68)

5.5-7.2 (6.8)

O Varios sacáridos (mono-, di-, poli-)

Orgánicos Metabolitos producidos: etanol, lactato, acetato, CO2, H2

Cook et al. (1996)

21


Especie





Thermoanaerobacter brockii


Bacilos sencillos o en cadenas; a veces filamentosos; no móviles; no esporoformador

40-80 (70)

5.5-9.5 (7.5)

O Almidón; maltosa; glucosa; lactosa; sucrosa; celobiosa

Orgánicos Zeikus et al. (1979), Lee et al. (1993)

Thermoanaerobacter ethanolicus


Bacilos; 4-8 µm; filamentosa

37-78 (69)

4.4-9.8 (5.8-8.5)

O Hexosas; almidón

Orgánicos Etanol, CO2; lactato y acetato como productos finales

Wiegel and Ljungdahl (1981)

Thermoanaerobacter italicus

Fuente termal, Norte de Italia

Bacilos; 2-6 µm; cadenas de hasta 50 µm; esporas terminales

45-78 (70)

nd (7)

O M

varios azucares; almidón; glicogeno; inulina; pectina; xilano

S2O32-

Sulfato ferroso

Productos de fermentación principales: etanol, acetato y lactato

Kozianowski et al. (1997)

Thermoanaerobacter mathranii

Fuente termal, Islandia

Bacilos móviles con esporas terminales

50-75 (70-75)

4.7-8.8 (7)

O varios azucares; glicogeno; xilano

Orgánicos Producto final; etanol

Larsen et al. (1997)

Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricos

Fabrica de azúcar de remolacha, Utah y Wioming, Planta de aguas residuales, Georgia

Bacilos solos o en cadenas; 2-13 µm; móviles; esporas

37-78 (67-69)

5.5-9.2 (6.9-7.5)

O M

Triptofano; peptona; extracto de levadura; varios azucares

S2O32-

SO32-

Producto final: metanol

Wiegel et al. (1979), Lee et al. (1993)

Thermoanaerobacter acetigenum

Fuente termal, Islandia

Bacilos solos o en cadenas; 3.6-5.9 µm; no móvil

50-78 (65-68)

5.2-8.5 (7)

O Varios azucares; almidón; xilano

Orgánicos Acetato; CO2; H2; Etanol; acido isobutirico como productos finales

Nielsen et al. (1993)

22


Especie


Rango de pH

(óptimo) Metabolismo



Thermoanaerobacter berrensis

Salina, Francia Bacilos; móvil; Gram negativo; 3-8 µm.

45-70 (65)

5.5-8.2 (7)

O Azucares; manitol; glicerol; N-acetilglucosamina; almidón; piruvato; tripticasa

Orgánicos Halófilo, Concentración optima de sal 5% (2-15%)

Cayol et al. (2000)

Thermoanaerovibrio velox

Tapete de cianobacterias, Kamchatka, Rusia

Bacilos curvos; 2.5-5 µm; móviles

45-70 (60-65)

4.5-8 (7.3)

O M

H2; glucosa; fructosa; manosa; N-acetil-D-glucosamina; arginina; serina; peptona; extracto de levadura

S0, orgánicos Productos de fermentación; acetato; lactato; H2; CO2; Etanol

Zavarzina et al. (2000)

Thermoanaerovibrio acidaminovorans

Digestor metanogénico

Bacilos curvos; móviles

40-58 (55)

6.5-8.1 (nd)

O aminoácidos orgánicos Acetato y propionato como producto de fermentación

Guangsheng et al. (1992); Baena et al. (1999)

Thermoanaerobacterium xylanolyticum


Bacilos rectos; < 2 µm; filamentoso; móviles

55-75 (60)

4-7.6 (5.5-6.5)

O Xilano; pectina; poligalacturonasa; varios azucares; almidón

orgánicos Etanol; H2; CO2; lactato; acetato como productos finales de fermentación

Lee et al. (1993)

Thermoanaerobacterium ferrireducens

Fuente termal, Parque Nacional de Yellowstone y Nueva Zelanda

Bacilos de rectos a curvos; móviles; esporas terminales

50-74 (65)

5.5-7.6 (6-6.2)

M Glicerol; lactato; propanodiol; glicerato; piruvato; extracto de levadura; H2; glucosa; fructosa; manosa

Fe(III); acido 9,10-antraquinona-2,6disulfonico, fumarato

Células cubiertas por una capa densa

Slobodkin et al. (1997b)

23


Especie





Moorella glycerini Fuente termal, Parque Nacional de Yellowstone

Bacilos; 3-6.5 µm de largo; móviles; endosporas

43-65 (58)

5.9-7.8 (6.3-6.5)

O Glicerol; glucosa; fructosa; manosa; extracto de levadura; varios ácidos orgánicos

Fumarato; succinato; S2O3

2-

Acetato como producto de fermentación

Slobodkin el al (1997a)

Thermicanus aegypticus

Suelo oxico, Egipto

Bacilos; de 0.5-2.5 µm; móviles

37-65 (55-60)

5.5-7.7 (6.5-7)

O Varios azucares; ácidos orgánicos bajo condiciones oxigenicas

Orgánicos Microaerofilico; productos de fermentación; acetato; succinato; etanol; formato; lactato; H2

Gossner et al. (1999)

Ammonifex degensii Fuente termal neutral

Bacilos; móviles

57-77 (70)

5-8 (7.5)

C O

H2, formato NO3-

SO42-

S0

Reduce NO3- a NH3,

capaz de fermentar piruvato

Huber et al.(1996)

Anaerobranca horikoshii


bacilos; 8-20 µm de largo; móviles

30-66 (57)

6.5-10.3 (8.5)

O Extracto de levadura; fumarato

Orgánicos Usa fumarato solo en presencia de extracto de levadura

Engle et al. (1995)

Caldocellulosiruptor saccharollyticus

Fuente termal, Taupo, Nueva Zelanda

Bacilos; solos o en pares; 3-4 µm de largo

45-80 (70)

5.5-8 (7)

O Varios azucares; celulosa, glicogeno; pectina

Orgánicos productos de la fermentación: acetato y lactato

Rainey et al. (1994)

Caldocellulosiruptor kristjanssonii

Fuente termal ligeramente alcalina, Islandia

Bacilos; solos, en parejas o en cortas cadenas

50-82 (78)

5.8-8 (7)

O Celobiosa; dextrina; pectina; almidón; xilano; xilosa

Orgánicos anaerobio estricto; productos finales de fermentación son acido acético, H2, CO2

Bredholt et al. (1999)

24


Especie





Anaerobaculum thermoterrenum

Agua de producción de una reserva de petróleo

Bacilos rectos o ligeramente curvos; no móviles

28-60 (55)

5.5-8.6 (7-7.6)

O Ácidos orgánicos; almidón; glutamato; azucares; extracto de proteínas; pectina

Orgánicos Rees et al. (1997)

Coprothermobacter platensis

Reactor metanogénico; tratamiento de aguas residuales ricas en proteínas

Bacilos rectos; no móviles; pleomorficos

35-65 (55)

4.3-8.3 (7)

M Gelatina; caseína; albúmina bovina; extracto de levadura; peptonas; azucares; almidón

S2O32- anaerobio estricto Etchebehere

et al. (1998)

Coprothermobacter leptostartum

Estiércol de vaca bacilos delgados largos

nd (60)

nd (7.5)

O Extracto de levadura; triptona; glucosa; maltosa; xilosa

Orgánicos Anaerobio estricto Toda et al. (1987)

Carboxydobrachiumm pacificum

Fuente hidrotermal en la profundidad marina; Okinawa

Bacilos rectos; 4-10 µm de largo; no moviles

50-80 (70)

5.8-7.6 (6.8-7.2)

M O

CO; almidón; peptona; extracto de levadura; celobiosa; glucosa; galactosa; fru8ctosa; piruvato

H2O, Orgánicos

Capaz de usar CO como única fuente de energía

Sokolova et al. (2001)

25


Especie





Syntrophothermus lipocalidus

Fangos anaeróbicos

Bacilos ligeramente curvos; ligeramente móviles

45-60 (55)

5.8-7.5 (6.5-7)

M Crotonato; butirato; ácidos grasos de cadena recta (C4-C10; isobutirato

S2O32- Crece en co cultivo

con Methanobacterium thermoautotrophicum; anaerobio estricto

Sekiguchi et al. (2000)

C, quimiolitoautotrofo; O, organotrofo; M, mixotrofo; nd, no determinado.


26

La principal diferencia entre los tipos de lípidos bacteriales y de archaea es

su composición y la unión de la cadena del grupo acil hidrofóbico con el

extremo del grupo polar (figura 5). Por lo tanto, en los lípidos bacteriales dos

cadenas acil de ácidos grasos están unidos al glicerol vía enlaces éster, en

los lípidos de archaea cadenas fitanil están unidas vía enlaces éter al glicerol

u otros alcoholes como el nonitol. Los fosfolípidos bacteriales están

organizados en bicapas en las cuales las cadenas carbonatadas están

directamente hacia el interior de la membrana. Las halobacterias y la mayoría

de archaea contienen lípidos que consisten en lípidos diéter de C20, estos

lípidos forman bicapas en forma similar como los esterolípidos. Sin embargo,

las membranas que abarcan tetraéteres lipídicos están distribuidos dentro de

los termófilos extremos y acidófilos, estos lípidos tienen cadenas acil

isoprenoides de C40 con dos grupos polares y pueden extenderse por toda la

membrana para formar monocapas con la consistencia de una bicapa lipídica

normal (Albers y Driessen, 2008).

Una de las características esenciales de la membrana es que necesita estar

en un estado líquido cristalino para poder ser funcional (Albers y Driessen,

2008). Esta característica se ve influenciada en las altas temperaturas, ya

que entre mayor sea la temperatura esta capacidad de la membrana se va

perdiendo. Para mantener este estado líquido cristalino, las bacterias

termófilas incrementan el tamaño de la cadena acil lipídica, la proporción de

ramificaciones iso y anteiso y/o grado de saturación de las cadenas acil

(Albers et al., 2006).

27

Figura 5. Lípidos de Archaea y en bacterias. (A) Las cadenas acil están conectadas al grupo polar por enlace éster.

(B) Monocapa lipídica en un termócidofilico (archaea). Las cadena acil están conectadas al grupo polar por enlaces

éter. (Fuente: Albers et al., 2006).

Enlace ester

Enlace eter

28

2.3. Género Thermoanaerobacter

El nombre Thermoanaerobacter fue usado para describir la primera bacteria

termófila anaerobia (bacilo Gram positivo), no formadora de esporas que

produce etanol y lactato como producto final de la fermentación de azúcares

(Wiegel y Ljungdahl, 1981). Desde su descubrimiento hace ya dos décadas

hasta el día de hoy, se han venido realizando investigaciones para

profundizar en los conocimientos acerca de estos organismos, ya que su

entendimiento total puede ser muy valioso en el campo industrial y

biotecnológico, gracias a que este tipo de microorganismos puede ser una

excelente fuente de enzimas termoestables (Wynter et al, 1996).

Este grupo de microorganismos pertenece a la familia Thermoanaerobiaceae

del dominio Bacteria (Posada et al., 2004). En la actualidad, al género

Thermoanaerobacter pertenecen 17 especies validadas y 5 subespecies: T.

acetoethylicus (Ben-Bassat y Zeikus, 1983; Rainey y Stackebrandt, 1993), T.

brockii (Zeikus et al., 1979; Lee et al., 1993; Cayol et al., 1995), T. brockii

subsp brockii (Lee et al., 1993), T. brockii subsp finni (Schmid et al., 1986;

Cayol et al., 1995), T. brockii subsp lactiethylicus (Cayol et al., 1995), T.

ethanolicus (Wiegel y Ljungdahl, 1981), T. finnii (Schmid et al., 1986), T.

italicus (Kozianowski et al., 1997), T. kivui (Leigh y Wolfe, 1983; Collins et al.,

1994) T. mathranii (Larsen et al., 1997; Carlier et al., 2006), T. mathranii

subsp alimentarius (Carlier et al., 2006), T. mathranii subsp mathranii (Larsen

et al., 1997), T. pseudethanolicus (Onyenwoke et al., 2007), T. siderophilus

(Slobodkin et al., 1999), T. subterraneus (Fardeau et al., 2000), T.

sulfurigignens (Lee et al., 2007), T. sulfurophilus (Bonch-Osmolovskaya et al.,

1997), T. tengcongensis (Xue et al., 2001), T. thermocopriae (Jin et al.,1988;

Collins et al., 1994), T. thermohydrosulfuricus (Lee et al., 1993), T. wiegelii

(Cook et al., 1996), T. yonseiensis (Kim et al., 2001).

29

Las especies de este género tienen características comunes como, su

temperatura óptima de crecimiento entre 60 y 70°C, hábitats donde se

encuentran (manantiales termominerales, fumarolas, suelos y sedimentos

calientes y en diversos ambientes termales y volcánicos) morfología (bacilos)

y rutas metabólicas para la obtención de energía (glucólisis), sin embargo las

especies de este género difieren en la reacción a la coloración de Gram

(Gram positivos y Gram negativas), rangos de pH óptimo para el crecimiento

(entre 4·0 y 8·0), movilidad, formación de esporas, metabolismo del azufre y

tamaño de célula (Jain y Zeikus, 1992).

Las bacterias pertenecientes al género Thermoanaerobacter pueden utilizar

las hexosas, disacáridos y polisacáridos y varias pentosas como la xilosa y

ribosa como sustratos (Avci y Dönmez, 2005). Se cree que esta capacidad

para degradar tantos sustratos se dio por la exposición del microorganismo

en su ambiente natural a carbohidratos derivados de algas termofílicas y

derivados de biomasa bacteriana (polisacáridos estructurales de microflora

fotosintética) o por polisacáridos estructurales vegetales que ocasionalmente

caen en estos ambientes por desplazamiento físico (Jain y Zeikus, 1992). De

ahí que este amplio rango de carbohidratos que utiliza este grupo de

bacterias sea importante en la conversión de sustratos complejos

procedentes de material vegetal en productos de interés industrial (Larsen et

al., 1997).

Se han venido realizando investigaciones con el objetivo de conocer mejor la

actividad enzimática de las especies de este género y de este modo darles

una aplicación a nivel biotecnológico e industrial. De hecho, si este tipo de

microorganismos degrada una gran variedad de sustratos (Tabla 9), es

debido a que presentan una maquinaria enzimática completa que les confiere

esta capacidad, en consecuencia el estudio de estos microorganismos y sus

enzimas es de primordial interés.

30

Se ha aislado dextranasa de especies de Thermoanaerobacter de aguas

geotermales en Australia, enzima de gran importancia en la producción y

purificación de azúcares (Wynter et al., 1996). Se ha reportado actividad

amilolítica (ciclomaltodextrinas), xilanolítica, celulolítica y pululanolítica en

especies de Thermoanaerobacter, enzimas primordiales en industrias

farmacéuticas, textiles, cosmética y alimenticia (Lowe et al., 1993; Wynter et

al., 1996; Tardioli et al., 2006). Se ha demostrado también actividad

pectinolítica, con el aislamiento de la pectato-liasa de Thermoanaerobacter

italicus, una enzima implicada en la industria alimenticia (Extracción de jugos

de frutas y producción de vino) (Kozianowski et al., 1997). Se purificó la

alcohol deshidrogenasa de Thermoanaerobacter mathranii (Findrick et al.,

2005). Se ha aislado y caracterizado una esterasa termoestable de

Thermoanaerobacter tengcongensis (Zhang et al., 2003).

A partir de especies de Thermoanaerobacter se han modificado enzimas

como las ciclodextringlicosiltransferasas que catalizan la formación de

ciclodextrinas a partir de almidón y polímeros de glucosa unidos por enlaces

α(1-4) vía una reacción de transglicosilación. Las ciclodextrinas tienen una

gran variedad de usos y aplicaciones en la industria alimenticia, farmacéutica

y cosmética (Alcalde et al., 1999). Thermoanaerobacter wiegelii produce

propionato como producto final de su fermentación a partir de xilosa (Cook et

al., 1996). Thermoanaerobacter mathranii produce L-arabinosa isomerasa,

una enzima implicada en la producción de D-tagatosa a partir de D-

galactosa. La D-tagatosa tiene un mercado muy grande a nivel alimenticio ya

que es un potente endulzante que es comparado con la fructosa, que tiene

propiedades dietéticas ya que es baja en calorías (Jørgensen et al., 2004).

También, la mayoría de especies del género como Thermoanaerobacter

mathranii, Thermoanarobacter ethanolicus y Thermoanaerobacter

thermohydrosulfuricus producen etanol. Este tipo de propiedad genera una

gran expectativa a nivel mundial, ya que la producción de etanol puede ser

31

usada en bio-combustibles que generan un impacto ambiental menor en

comparación a los combustibles fósiles (derivados del petróleo) produciendo

un menor efecto en la polución del aire, por tanto reduce el impacto en la

capa de ozono (Avci y Dönmez, 2006).

Además, el amplio rango de carbohidratos utilizados por este grupo de

bacterias es importante en la conversión de sustratos complejos como

material vegetal (lignocelulósico) en etanol. El material lignocelulósico está

compuesto por una fracción de hemicelulosa que tiene un contenido alto de

pentosas (xilosa) que no es metabolizado por los microorganismos utilizados

convencionalmente en la producción de etanol como Saccharomyces

cerevisiae y por tanto genera ventajas frente a los procesos convencionales

(Larsen et al., 1997).

2.3.1. Thermoanaerobacter italicus

La cepa tipo de esta especie fue aislada por Kozianowski y su grupo de

investigadores de la Universidad de Hamburgo en Alemania en 1997, de una

fuente termal en Italia.

Taxonómicamente se encuentra dentro del filum Firmicutes, clase Clostridia,

orden Thermoanaerobacteriales, familia Thermoanarobacteriacea, genero

Thermoanaerobacter, especie T. italicus.

Es un bacilo Gram negativo, no móvil, formador de espora, quimiorganótrofo

(heterótrofo) que mide 0.4 a 0.75 µm de ancho por 2 a 6 µm de largo,

termófilo y anaerobio estricto. Su temperatura óptima de crecimiento es 70°C

y el crecimiento ocurre entre 45°C y 78°C. El pH óp timo es alrededor de 7.0 y

concentraciones mayores a 1% (p/v) de NaCl no afectan el crecimiento. El

crecimiento es totalmente inhibido por 10 µg/ml de los antibióticos

32

cefalosporina, eritromicina, kanamicina o rifampicina (Kozianowski et al.,

1997).

Thermoanaerobacter italicus es capaz de fermentar un gran número de

azucares (amigdalina, arabinosa, celobiosa, esculina, fructosa, galactosa,

glucosa, lactosa, maltosa, manosa, melecitosa, melibiosa, rafinosa, sacarosa,

trealosa y xilosa) y polímeros como almidón, glicógeno, inulina, pectina y

xilano. La celulosa no es utilizada y la gelatina no es hidrolizada por esta

bacteria (tabla 9).

La tasa de crecimiento (µx) con glucosa como sustrato es de 0.33 h-1 con un

tiempo de duplicación (td) de 2.1 h. Con pectina como sustrato la tasa de

crecimiento es de 0.23 h-1 y un td de 3 h. Los productos formados después de

15 h en glucosa 0.5% (p/v) son etanol (26.6 mM), lactato (12.4 mM), acetato

(2.2 mM), succinato (0.3 mM), H2 y CO2 (Kozianowski et al., 1997).

2.3.1.1. Hábitat de Thermoanaerobacter italicus en Colombia

En los manantiales termominerales de Paipa se evidenció la presencia de

cepas fermentativas pertenecientes en su mayoría a la especie

Thermoanaerobacter italicus. La cepa USBA 18 fue aislada de un manantial

termomineral (pozo Hotel Lanceros) en Paipa departamento de Boyacá

2.3.1.1.1. Manantial termomineral PP-10 (pozo Hotel Lanceros)

Se encuentra en la margen noroccidental del parqueadero de visitantes del

Hotel Lanceros ubicado en el municipio de Paipa, Boyacá. Está localizado a

5º45’30.69’’N; 73º6’50.61’’W, a 2500 msnm. La temperatura promedio es de

64°C (tabla 5) (Alfaro, 2002).

33

El agua termal emerge a la superficie a través de una tubería de 4 pulgadas

de diámetro. Está rodeado por un área de 16 m2 delimitada por un muro de

70 cm de altura y cercada con una malla gruesa de 1.2 m de altura,

impidiendo el acceso de personas y la llegada de basuras que puedan

contaminar el agua. El yacimiento tiene una profundidad aproximada de 35

cm (Pachon y Posada, 2003).

2.3.2. Metabolismo del género Thermoanaerobacter

En general, las especies de Thermoanaerobacter presentan un metabolismo

heterofermentativo. Este grupo de bacterias metaboliza las hexosas

(glucosa) por medio de la ruta de Embden – Meyerhof – Parmas (EMB) más

conocida como glicólisis y la mayoría de los productos finales de la

fermentación de las hexosas son formados a partir de piruvato por medio de

estas tres rutas: (i) ruta del lactato dependiente de pH, activada por fructosa-

1,6-difosfato lactato dehidrogenasa; (ii) una ruta de acetato via acetatokinasa;

y (iii) la ruta de etanol vía alcohol dehidrogenasa unida a NADP dependiente

de ATP (Cook et al., 1996).

Las pentosas como la xilosa son fermentadas por medio de la ruta de las

pentosas fosfato hasta etanol, acetato, lactato, CO2 y H2 con fructosa-6-

fosfato, gliceraldehido-3-fosfato y piruvato como intermediarios (Ahring et al.,

1999).

2.3.2.1. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas

También conocida como glicólisis, es la vía más común en los organismos

sacaroliticos, indistintamente si viven en condiciones aerobias o anaerobias.

En resumen, la glicólisis consiste en la ruptura de la glucosa en dos

moléculas de piruvato con la formación de ATP y NADH+H+. En condiciones

34

de anaerobiosis los productos finales de la fermentación como el lactato y el

etanol son tomados en el citoplasma a partir del piruvato y NADH+H+

(Koolman y Roehm, 2005). En la glicólisis están involucradas diez enzimas,

tres de ellas catalizan reacciones irreversibles y siete enzimas que catalizan

reacciones reversibles que a su vez pueden ser usadas en dirección reversa

para la gluconeogénesis (Schönheit, 2008). Por ende la glicólisis implica diez

pasos individuales, incluyendo tres isomerizaciones y cuatro transferencias

de fosfato y únicamente una reacción de óxido – reducción (Figura 6).

Inicialmente la glucosa es fosforilada a glucosa-6-fosfato con consumo de

ATP. La glucosa-6-fosfato es isomerizada a fructosa-6-fosfato por una

fosfoglucosa isomerasa. Usando ATP se realiza de nuevo una fosforilacion

pasando de fructosa-6-fosfato a fructosa-1,6-difosfato por una enzima

conocida como fosfofructoquinasa. La molécula generada anteriormente es

cortada por una aldolasa y se forman dos moléculas de tres carbonos:

gliceraldehido-3-fosfato y dihidroxiacetona-3-fosfato. El gliceraldehido-3-

fosfato es oxidado hasta 1.3-bifosfoglicerato por medio de una gliceraldehido-

3-fosfato dehidrogenasa dependiente de NADH. La molécula producida es

convertida a 3-fosfoglicerato por una fosfoglicerato quinasa. Paso seguido, se

da una isomerizacion para formar 2-fosfoglicerato catalizada por medio de

fosfoglicerato mutasas. Una enolasa cataliza la eliminación de agua del 2-

fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato. En el último paso, una piruvato quinasa

cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato hasta piruvato. La ruta de

Embden-Meyerhof-Parmas genera un rendimiento de dos moles de ATP por

mol de glucosa (Koolman y Roehm, 2005; Schönheit, 2008).

35

Figura 6. Ruta de Embden-Meyerhof-Parmas. GLK , glucoquinasa; PGI,

fosfoglucosa isomerasa; PFK, fosfofructoquinasa; GAPN, gliceraldehido-3-

fosfato dehidrogenasa no fosforilativa; PK, piruvato quinasa; G-6-P, glucosa-

6-fosfato; F-6-P, fructosa-6-fosfato; F-1,6-BP, fructosa-1,6-bifosfato; DHAP,

dihidroxiacetona fosfato; GAP, gliceraldehido-3-fosfato; 3-PG, 3-

fosfoglicerato; 2-PG, 2-fosfoglicerato; PEP, fosfoenol piruvato. (Fuente:

Schönheit, 2008).

2.3.2.2. Ruta de las pentosas fosfato

La ruta de las pentosas fosfato o también conocida como la ruta de las

hexosas monofosfato, es una vía metabólica alternativa para la degradación

de glucosa o para metabolizar las pentosas (moléculas de 5 carbonos) que

se inicia con glucosa-6-fosfato y en la cual es necesario dos precursores

importantes: NADP, para la biosíntesis de ácidos grasos e isoprenoides y

ribosa-5-fosfato esencial en la biosíntesis de nucleótidos.

La ruta está dividida en dos partes: una oxidativa y una regenerativa. En un

segmento de la parte oxidativa, la glucosa-6-fosfato es convertida en

Glucosa

G-6-P

F-6-P

F-1,6-BP

DHAP

GAP 3-PG 2-PG PEP

Piruvato

+

CO2

Acetato

GLK

PGI

PFK GAPN

PK

36

ribulosa-5-fosfato con la formación de una molécula de CO2 y dos

NADPH+H+.

La parte oxidativa de la ruta de las pentosa fosfato inicia con la oxidación de

la glucosa-6-fosfato por medio de una 6-fosfato dehidrogenasa formando 6-

fosfoglucanolactona. Una hidrolasa rompe la lactona generando la exposición

del grupo carboxilo de la molécula generando 6-fosfogluconato. El último

segmento de la parte oxidativa, es llevada a cabo por la fosfogluconato

dehidrogenasa que libera el grupo carboxilo de la molécula como CO2 y a su

vez oxida el grupo hidroxilo del carbono 3 produciendo ribulosa-5-fosfato, que

es isomerizada a ribosa-5-fosfato.

Dependiendo del estado metabólico de la célula, esta puede entrar en la

parte regenerativa de la vía, en la cual las pentosas fosfato se convierten en

hexosas fosfatos y pasar a ser degradadas en la glicólisis (Koolman y

Roehm, 2005).

2.3.2.3. Enzimas amilolíticas

El almidón, así como otros polímeros requieren de una combinación de

enzimas para su hidrólisis completa (Haki y Rakshir, 2003). Las amilasas son

enzimas que hidrolizan las moléculas de almidón, para obtener diversos

productos incluyendo la dextrina y progresivamente polímeros más pequeños

compuestos por unidades de glucosa (Lévêque et al., 2000).

La industria del almidón, es una de las mayores consumidoras de enzimas

para la hidrólisis y modificación de este material de origen vegetal y se

calcula que las enzimas hidrolíticas del almidón comprenden el 30% del

consumo mundial de enzimas (Haki y Rakshir, 2003).

37

La producción de dextrinas a partir de almidón es un proceso que conlleva 2

pasos en los cuales se ven envueltas las enzimas amilolíticas (α-amilasas, α-

glucosidasa, y pululanasas) que tienen diferentes formas de acción sobre el

almidón. El primer paso (licuefacción) convierte la suspensión concentrada

de almidón en una solución de dextrinas solubles que tienen diferentes

grados de polimerización. Durante el segundo paso (sacarificación) esas

dextrinas son hidrolizadas hasta glucosa (figura 7) (Lévêque et al., 2000).

Figura 7. Hidrólisis enzimática de almidón hasta glucosa y accionar de las

enzimas Amilolíticas. A: α-amilasa; G: glucosidasa; D: pululanasa; o:

residuos de α-D-glucosa no reducidos; ●; residuos de α-D-glucosa reducidos

(Fuente: Lévêque et al., 2000).

Sacarificación

Licuefacción

Glucosa

Almidón

38

Las enzimas amilolíticas están clasificadas de acuerdo con su forma de

acción, en endo y exo enzimas, la α-amilasa (familia de las glicosido-

hidrolasas) es una endo enzima (1,4- α-D-glucan, 4-glucanohidrolasa) que

hidroliza los enlaces (α-1,4) en lugares aleatorios formando oligosacaridos

lineales o ramificados y están clasificadas en dos categorías dependiendo del

momento del proceso donde hidrolicen el almidón; las α-amilasas de

licuefacción hidrolizan del 30 al 40% del almidón y las α-amilasas de

sacarificación hidrolizan del 60 al 70 %, el resto son exo enzimas que atacan

el sustrato desde una terminación no reducida produciendo oligo o

monosacáridos (Haki y Rakshir, 2003; Lévêque et al., 2000).

Las α-amilasas termoestables han sido aisladas durante mucho tiempo a

partir de Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens y B. licheniformis y se han

encontrado un sinnúmero de aplicaciones comerciales por su estabilidad

inherente (Lévêque et al., 2000). Industrialmente las amilasas son usadas en

la producción de edulcorantes para alimentos, se utilizan hidrolizados de

almidón como aditivos en la fabricación de dulces, alimentos de conserva o

congelados; estos jarabes pueden contener maltosa o glucosa (después de

la sacarificación) o fructosa (después de una isomerización) (Rubiano, 2006).

A su vez, este tipo de enzimas de origen bacteriano son usadas en las

industrias de fabricación de papel y de textiles, basándose en la utilidad de

las dextrinas producidas a partir del almidón como agentes cohesivos. En la

industria textil se utiliza un recubrimiento de almidón para evitar que la fibra

se retuerza y aumente su peso durante el tejido; sin embargo, para el

subsiguiente procesamiento de la tela, el almidón tiene que ser

completamente removido, así las amilasas son empleadas para remover el

almidón de la tela. En la industria papelera estas enzimas son utilizadas para

producir almidón ligeramente hidrolizado que se emplea como recubrimiento

adhesivo del papel imprenta (Glazer, 1998).

39

2.3.2.4. Enzimas xilanolíticas

El xilano es el mayor polímero estructural en las células vegetales y es el

segundo polisacárido más abundante en la naturaleza, siendo

aproximadamente una tercera parte de todo el carbono orgánico renovable

en la Tierra.

Las xilanasas son glicosidasas (O-glicosidohidrolasas) que catalizan la

hidrólisis de enlaces 1,4-β-D-xilosídicos del xilano. Su nombre es endo-1,4-β-

xilanasa, pero comúnmente se utilizan sinónimos entre los cuales se incluyen

xilanasas, endoxilanasas, 1,4-β-D-xilano-xilanohidrolasa, endo-1,4-β-D-

xilanasas, β-1,4-xilanasas y β-xilanasas. Debido a la heterogeneidad y

complejidad de la molécula de xilano, se requiere de un grupo de enzimas

activas para hidrolizar completamente el xilano y producir xilosa. Las endo-

1,4-β-D-xilanasas rompen el esqueleto de la molécula en sitios al azar, β-D-

xilosidasas cortan monómeros de xilosa a partir de terminales no reducidos

de oligómeros xilo y xilobiosa, mientras que la eliminación de los grupos

secundarios es catalizada por α-L-arabinofuranosidasas, α-D-glucuronidasas,

acetilxilano esterasas, ácido ferúlico esterasas y ρ-ácido cumárico esterasa

(Collins et al., 2005) (figura 8). En efecto, sistemas completos de enzimas

xilanolíticas, han sido encontrados generalmente en hongos, actinomycetes y

Bacteria siendo los productores mas significativos Aspergilli, Trichodermi,

Streptomycetes, Phanerochaetes, Chytridiomycetes, Ruminococci,

Fibrobacteres, Clostridia y Bacilli (Collins et al., 2005).

Un gran número de xilanasas termofílicas e hipertermofílas producidas por

microorganismos han sido aisladas de diferentes fuentes, incluyendo campos

solfatáricos terrestres y marinos, fuentes termales y de desechos orgánicos

en descomposición. La mayoría de las xilanasas encontradas en termófilos

pertenecen a las familias 10 y 11 (glicosido hidrolasas) (Collins et al., 2005).

40

Estas xilanasas han sido aisladas de varios organismos termófilos e

hipertermófilos, en donde se incluye Thermotoga sp., Caldicellulosiruptor sp.,

Rhodothermus marinus, Geobacillus stearothermophilus, Thermoascus

aurantiacus y Clostridium thermocellum (Collins et al., 2005).

Figura 8. (a) Estructura del xilano y los sitios que son atacados por las

enzimas xilanolíticas. El esqueleto de la molécula esta compuesto por

residuos de xilosa unidos por enlaces β-1,4. Ac., grupo acetil; α-araf., α-

arabinofuranosa; α-4-O-Me-GlcUA., acido α-4-O-metilglucoronico; pcou.,

acido ρ-cumarico; fer., acido ferulico. (b) Hidrólisis de xilo-oligosacaridos por

β-xilosidasa (Fuente: Collins et al., 2005).

Las xilanasas tienen aplicaciones potenciales en una gran variedad de

industrias. En la industria cervecera sirve para incrementar filterabilidad del

mosto y reducir la turbidez del producto final; en la extracción de café y en la

acetilxilano

esterasa

β-D-xilosidas a

α-L-arabinofuranosidasa

Endo -1,4-β-xilanasa α-D-glucoronidasa

p-acido cumarico ó ferulico esterasa

acetilxilano

esterasa

41

preparación de café soluble; en la industria de detergentes; en la producción

de polisacáridos farmacologicamente activos para ser usados como agentes

antimicrobiales o antioxidantes; en la producción de glicosidos alkil para ser

usados como surfactantes (Collins et al., 2005).

2.3.2.5. Enzimas pectinolíticas

La pectina es básicamente un heteropolisacárido ramificado consistente en

una cadena principal de (1,4)-α-D-poligalacturónato, que está parcialmente

esterificada (Kozianowski et al., 1997). Las sustancias pectinolíticas están

clasificadas como galacturonanos (polímero de ácido galacturónico),

ramnogalacturonanos (una mezcla de polímeros de ramnosa y ácido

galacturónico), arabinanos (polímeros de arabinosa), galactanos (polímeros

de galactosa), y arabinogalactanos (mezcla de polímeros de arabinosa y

galactosa) (Whitaker, 1984).

Dentro de las enzimas pectinolíticas se incluyen las pectina metilesterasas,

poligalacturonasa y las pectato liasas, todas con especificidad hacia el acido

metil D-galacturónico y las unidades de ramnogalacturonanos del ácido D-

galacturonico; las α-L-arabinofuranosidasa y las endo arabanasas que

actúan sobre los arabinanos (Whitaker, 1984).

La pectina metilesterasa (pectilhidrolasa) es también conocida como

pectinesterasa, pectasa y pectina metoxilasa. La función de la pectina

metilesterasa es remover los grupos metoxilo de la pectina metilada. Esta

enzima es una esterasa de ácido carboxílico y pertenece al grupo de las

hidrolasas (figura 9a) (Whitaker, 1984).

42

La poligalacturonasa [poli(1,4-α-D-galacturonido) glicanohidrolasa] hidrolisa

los enlaces α(1-4) entre las unidades de ácido D-galacturónico (figura 9b)

(Whitaker, 1984).

La pectato liasa [poli(1,4-α-D-galacturonido) liasa] rompe el enlace glicosídico

por la eliminación en trans del hidrógeno de los carbonos en posición C4 y

C5 de la porción agliconica del sustrato (Whitaker, 1984).

Figura 9. Acción de las enzimas pectinolíticas. (a) Acción de pectina

metilesterasa; (b) acción de la poligalacturonasa; (c) acción de la pectato

liasa (Fuente: Whitaker, 1984).

43

Las bacterias pectinolíticas han sido aisladas de una amplia variedad de

hábitats como árboles, lagos, suelo, rumen y en el tracto intestinal de

humanos. La degradación de pectina por bacterias termofílicas ha sido

reportada para Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, Clostridium

thermocellum, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, Clostridium

thermosaccharolyticum, Geobacillus stearothermophilus y Desulfurococcus

amylolyticus (Kozianowski et al., 1997).

La degradación enzimática de la pectina es ampliamente aplicada en

procesos tecnológicos en alimentos. En la extracción de jugo de fruta y en el

proceso de elaboración de vino, las enzimas pectinolíticas son usadas para

incrementar la producción de jugo, reducir la viscosidad, mejorar la

extracción del color de las cáscaras de la fruta y macerar la fruta al igual que

los tejidos vegetales (Kozianowski et al., 1997).

44

3. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

La evolución de los procesos productivos a nivel industrial, el avance

científico y tecnológico que se ha venido dando durante las últimas décadas,

ha llevado a que las nuevas investigaciones se enfoquen en la producción y

purificación de enzimas, con el fin de reducir costos y optimizar los procesos

industriales, y de este modo generar tecnologías y procesos aplicables a

nivel industrial y biotecnológico. Los microorganismos termófilos se

presentan como una excelente opción, como fuente de enzimas

termoresistentes de gran valor debido a que reducen los riesgos de

contaminación y además la solubilidad de sustratos poliméricos y las tasas

de difusión aumentan cuando las temperaturas del proceso son elevadas

(Kozianowski et al. 1997).

Este trabajo se sustenta en investigaciones realizadas por la Unidad de

Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA), en los cuales se aislaron

microorganismos termófilos anaerobios de un manantial termomineral en

Paipa, Boyacá. Las cepas aisladas fueron identificadas y los análisis

realizados mostraron que las cepas aisladas pertenecen a la familia

Thermoanaerobiaceae del dominio Bacteria, género Thermoanaerobacter.

Además, se encontró que presentan una similitud del 98% con

Thermoanaerobacter italicus y Thermoanaerobacter mathranii (Posada et al.,

2004). Es importante resaltar que existe una alta similitud filogenética entre

T. italicus y T. mathranii, aunque a nivel fenotípico existen diferencias entre

estas especies. Este proyecto es una continuación de la investigación

descrita anteriormente, con el fin no solo de complementar y verificar los

resultados obtenidos sino de conocer el metabolismo de este

microorganismo. Es importante destacar, que estudios de diversidad

microbiana en ambientes extremos han reportado un gran potencial

biotecnológico de los microorganismos que habitan en estos ambientes. Por

45

tal razón, aunque esta cepa se encontraba aislada e identificada, este

estudio permitió caracterizar a Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

para explorar su potencial en investigaciones futuras a nivel industrial.

La importancia del conocimiento adquirido se encuentra en la capacidad que

posee este microorganismo para producir metabolitos como el ácido láctico

durante procesos de fermentación, relevante en la industria alimenticia y en

la producción de plásticos biodegrables, áreas que cada vez adquieren

mayor importancia a nivel internacional debido al impacto favorable frente al

ambiente.

46

4. OBJETIVOS

4.1. OBJETIVO GENERAL

Caracterizar cinética y enzimáticamente Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18, aislada de un manantial termomineral en Paipa, Boyacá.

4.2. OBJETIVOS ESPECíFICOS

4.2.1. Determinar las condiciones óptimas de crecimiento (Temperatura, pH,

salinidad) de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18.

4.2.2. Evaluar cuantitativamente la actividad amilolítica, pectinolítica y

xilanolítica de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18.

4.2.3. Evaluar la cinética de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18, en diferentes sustratos y cuantificar los metabolitos producidos a

partir de fermentación discontinua.

47

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Este estudio se llevó a cabo en el laboratorio de la Unidad de Saneamiento y

Biotecnología Ambiental (USBA) del Departamento de Biología de la

Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.1. Microorganismo.

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, se encuentra en la colección de

microorganismos del Departamento de Biología de la Pontificia Universidad

Javeriana bajo el número PUJ-M-BIO-USBA-18 (P4-4). Esta cepa fue aislada

de un manantial termomineral (MTM) localizado en Paipa en el departamento

de Boyacá (5º 45' 30,69” N, 73º 6' 50,61” W; 2500 msnm) (PP-10 Pozo Hotel

Lanceros) (Alfaro, 2002; Posada et al., 2004). Las principales características

de este MTM se encuentran en la tabla 5.

Tabla 5. Principales características del MTM Pozo Hotel Lanceros.

Pozo Hotel Lanceros (P-4) Temperatura (ºC) 63,4

Conductividad (µS/cm) 42500,0 pH 7,2

PARAMETRO

Sólidos disueltos (mg/L) 41096,0 Físico Hipertermal CLASIFICACIÓN

Composición Química Sulfatada sódica Ingeominas PP-10 NOMENCLATURA

USBA P-4

Fuente: Alfaro, 2002.

Por análisis fenotípicos y genotípicos se conoce que la cepa USBA 18

pertenece al género Thermoanaerobacter, y con base en el análisis de la

secuencia del 16S rDNA se observa una similitud del 98% y 97% con

48

Thermoanaerobacter italicus y Thermoanaerobacter mathranii,

respectivamente.

5.2. Medio de cultivo y condiciones de cultivo

Las técnicas de Hungate (Hungate, 1969) se usaron para llevar a cabo este

estudio. El medio básico contenía (l-1): 1.0 g de NH4Cl; 0.3 g de K2HPO4; 0.3

g de KH2PO4; 23.0 g de NaCl; 0.1 g de CaCl2; 0.1 g de KCl; 0.5 g de c; 0.5 g

de extracto de levadura; 10.0 ml de solución de oligonutrientes de Balch

(Balch et al., 1979); 1.0 ml de resazurina 0.1%. El pH del medio se ajustó a

7.0 ± 0.1 con NaOH 0.1N. El medio se llevó a ebullición hasta obtener una

atmósfera libre de O2 y se enfrió a temperatura ambiente. Alícuotas (4.3 ml)

de medio se distribuyeron dentro de tubos Hungate bajo condiciones libres

de O2 por la adición de N2 gaseoso. Posteriormente la fase gaseosa se

sustituyó con N2/CO2 (80:20) (Baena et al., 1999). El medio se esterilizó a 15

psi durante 20 minutos. Una vez autoclavados los tubos Hungate que

contenían el Medio Básico (MB) se adicionaron 0.05 ml de Na2S al 2% (v/v)

para asegurar las condiciones de anaerobiosis y 0.05 ml de NaHCO3 al 10%

(v/v) para mantener el pH del medio. Las fuentes de carbono fueron

adicionadas a cada tubo a partir de soluciones stock estériles y preparadas

bajo condiciones de anaerobiosis (Rubiano, 2006). Posteriormente, el medio

fue inoculado con 10% (v/v) del preinóculo de bacteria y llevado a incubación.

5.2.1. Medio de cultivo mínimo de crecimiento

Se evaluaron diferentes concentraciones de extracto de levadura (0.25, 0.5,

1.0, 2.0 g/l) y peptona (0.25, 0.5, 1.0 g/l) como fuente de nitrógeno orgánico

en el medio básico (MB) de cultivo. A su vez se cambió la fuente inorgánica

de nitrógeno (NH4Cl) por KNO3 1.0 g/l y se evaluó una serie con la adición de

vitaminas de Balch sin extracto de levadura (Balch et al., 1979). Lo anterior

49

con el fin de determinar los requisitos mínimos de crecimiento y determinar la

influencia de estas variables en la producción de metabolitos.

Thermoanaerobacter italicus USBA 18 fue subcultivada dos veces sucesivas

por triplicado bajo las mismas condiciones experimentales y se tomaron

muestras de los tiempos 0 y 120 h de fermentación. Las muestras fueron

procesadas y analizadas por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia

(HPLC) (ver numeral 5.5.2.).

5.3. Determinación de condiciones óptimas de crecim iento

Con el fin de conocer las condiciones óptimas de crecimiento,

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 fue subcultivada dos veces

sucesivas bajo las mismas condiciones experimentales y por triplicado en

tubos Hungate y se realizó un seguimiento del microorganismo por densidad

óptica (DO) a 580nm y verificación microscópica del crecimiento de este en el

medio líquido utilizando el microscopio de contraste de fase (Nikon: Eclipse

50i). Los valores obtenidos de absorbancia a 580 nm fueron transformados a

concentración (µg de biomasa seca/ml) por medio de la curva patrón de peso

seco (Anexo 1). Los parámetros evaluados para determinar las condiciones

óptimas de crecimiento fueron: temperatura, pH y concentración NaCl.

5.3.1. Temperatura óptima de crecimiento

Los experimentos fueron realizados en tubos Hungate con MB suplementado

con glucosa (20 mM). Las temperaturas analizadas fueron de 55°C a 80°C y

se evaluaron en intervalos de 5°C. El proceso se re alizó durante 24 horas,

haciendo lecturas de DO580nm cada 2 horas por triplicado en el

espectrofotómetro (Jenway 6400), cuantificando la biomasa (µg de biomasa

seca/ml) por peso seco. Se determinaron parámetros cinéticos como criterio

para la selección de la temperatura óptima.

50

5.3.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento

Las concentraciones de sales evaluadas fueron entre 0% y 8% (p/v), en

intervalos de 1% (p/v). Las pruebas fueron realizadas con MB suplementado

con glucosa a una concentración final 20 mM. La concentración de NaCl del

medio fue modificada hasta obtener la concentración deseada. El cultivo se

llevó a cabo a la temperatura óptima durante 24 horas y se realizó lecturas

de DO580nm por triplicado cada dos horas, cuantificando la biomasa (µg de

biomasa seca/ml) por peso seco. Se determinaron parámetros cinéticos

como criterio para la selección de la concentración óptima de crecimiento.

5.3.3. pH óptimo de crecimiento.

Los valores de pH analizados se encuentran entre 3.2 y 8.8 (3.2, 4.9, 6.2,

6.5, 6.95, 7.2, 8.1, 8.5, 8.8). El pH del medio se ajustó hasta obtener el valor

de pH a analizar y antes de inocular no se adicionó NaHCO3 al 10% para

evitar que el pH de medio se estabilizara. El microorganismo se incubó a la

temperatura óptima de crecimiento, en MB con 1% (p/v) de NaCl y 20 mM de

glucosa durante 24 horas y se realizaron lecturas de DO580nm por triplicado

cada dos horas, cuantificando la biomasa (µg de biomasa seca/ml) por peso

seco. Se determinaron parámetros cinéticos como criterio para la selección

del pH óptimo de crecimiento.

5.4. Determinación de actividades enzimáticas

Teniendo en cuenta las condiciones óptimas determinadas anteriormente, se

realizó un cultivo por triplicado para evaluar las actividades enzimáticas. Para

la cuantificación de las diferentes actividades enzimáticas se tomaron

muestras de MB inoculado a las 0, 4, 8, 12, 24, 28, 32, 36, 42, 44 y 48 horas

por triplicado.

51

Se realizaron curvas de crecimiento con las diferentes fuentes de carbono

(Almidón 2.0 %; Xilano 8.0 g/l (Xilano de abedul 4.0 g/l; Xilano de avena de

escanda 4.0 g/l); Pectina 2.0 %) a las condiciones óptimas de crecimiento,

previamente determinadas (65°C; 1% de NaCl; pH: 7.2 ) y se obtuvieron

extractos crudos por centrifugación (5000 rpm; 4°C; 15 min) de las horas de

muestreo, los cuales fueron utilizados para realizar las diferentes actividades

enzimáticas.

5.4.1. Determinación de actividad amilolítica

Se tomó 1.0 ml de extracto crudo correspondiente a cada una de las horas

de fermentación y se mezcló con 1.0 ml de almidón 1% p/v en buffer fosfato

0.1 M (Anexo 2). La mezcla fue incubada durante 30 minutos a 65°C. La

reacción fue frenada con hielo durante 5 minutos. Posteriormente las

muestras fueron centrifugadas (5000 rpm; 4°C; 10 mi n). Los azúcares

reductores del sobrenadante fueron cuantificados por medio de la técnica del

ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) (Miller, 1959) y leídos a 540 nm en el

espectrofotómetro (Jenway 6400), utilizando como blanco de la prueba 0.25

mL de DNS + 2.75 mL de agua destilada. La curva patrón se realizó usando

soluciones a diferentes concentraciones de glucosa (0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 1.7,

2.0 g/L) (Matiz et al., 2006; Rubiano, 2006). Los resultados de esta prueba

fueron reportados en unidades amilolíticas (UA/l), las cuales se definieron

como la cantidad de enzima que libera una µmol de azúcares reductores de

glucosa por minuto, bajo las condiciones de la prueba.

52

5.4.1.1. Determinación de temperatura óptima de act ividad amilolítica

Se determinó la temperatura óptima de actividad obteniendo muestras de MB

inoculado y suplementado con almidón al 2.0 % a las 0, 24, 48 y 120 horas

de fermentación por triplicado. Se obtuvieron extractos crudos por

centrifugación (5000 rpm; 4°C; 15 min) de las muest ras y posteriormente se

realizó la determinación de la actividad enzimática a las diferentes

temperaturas evaluadas (55, 60, 65, 70 y 75ºC). Los azúcares reductores se

cuantificaron por DNS (Miller, 1959). Los resultados de la prueba fueron

reportados en unidades Amilolíticas (UA/l).

5.4.2. Determinación de actividad pectinolítica

La actividad de las enzimas pectinolíticas fue cuantificada por el seguimiento

del aumento de azúcares reductores. La mezcla de reacción estaba

compuesta por 1.0 ml pectina 1% (p/v) en buffer fosfato y 1.0 ml de extracto

enzimático (extracto crudo) (Anexo 3). Se incubó a 65°C por 30 minutos. La

reacción fue frenada con hielo durante 5 minutos. Posteriormente las

muestras fueron centrifugadas (5000 rpm; 4°C; 10 mi n) para separar la

pectina no hidrolizada. Los azúcares reductores fueron cuantificados por

medio de la técnica de DNS (Miller, 1959). Se utilizó como patrón ácido D-

galacturónico y la unidad de actividad (UP/l) se definió como la cantidad de

enzima requerida para producir 1 µmol de azúcares reductores equivalentes

a ácido D-galacturónico por minuto bajo las condiciones de la prueba

(Kozianoswski et al., 1997).

5.4.3. Determinación de actividad xilanolítica

La actividad xilanolítica fue determinada con el extracto crudo, se incubó 1.0

ml de solución de xilano 1% (p/v) en buffer fosfato (0.5 % de Xilano de abedul

53

y 0.5 % de Xilano de avena de escanda) y 1.0 ml de extracto crudo a 65°C

por 30 minutos (Anexo 4). La mezcla de reacción fue clarificada por

centrifugación y los azúcares reductores fueron determinados por DNS

(Miller, 1959) usando xilosa como patrón. Una unidad de actividad (UX/l) se

definió como la cantidad de enzima requerida para producir 1 µmol de

azúcares reductores equivalentes a xilosa por minuto bajo las condiciones de

la prueba (Kozianowski et al., 1997; Chauhan et al., 2006).

5.5. Evaluación de crecimiento en diferentes sustra tos

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 fue subcultivada dos veces

sucesivas bajo las mismas condiciones experimentales (65ºC, pH 7.2, 1%

(p/v) de NaCl). Se evaluaron los sustratos almidón y pectina a una

concentración de 2% p/v. Arabinosa, galactosa y glucosa a concentración de

20 mM y xilano 8 g/l (4 g/l de xilano de abedul y 4 g/l de xilano de avena de

escanda). Se evaluó el crecimiento de la bacteria por la presencia de turbidez

(formación de biomasa) en el medio de cultivo y por verificación microscópica

del crecimiento del microorganismo en el medio líquido.

5.5.1. Seguimiento al consumo de sustrato

Se realizó seguimiento al sustrato consumido mediante la cuantificación de

azúcares reductores durante la fermentación discontinua, manteniendo las

condiciones óptimas de crecimiento. Se tomaron muestras de medio básico

(MB) inoculado con las diferentes fuentes de carbono a diferentes tiempos de

fermentación (0, 4, 8, 12, 16, 20, 24 y 48 horas) por triplicado. Las muestras

fueron separadas por centrifugación (5000 rpm; 4°C; 20 min) y el

sobrenadante utilizado para la cuantificación de azúcares reductores por

DNS (Miller, 1959). Se realizaron lecturas en el espectrofotómetro (Jenway

6400) a una longitud de onda de 540 nm.

54

5.5.2. Determinación de metabolitos producidos por HPLC

La determinación de metabolitos producidos de la fermentación discontinua

de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en diferentes sustratos se

cuantificó por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) utilizando un

cromatógrafo Shimadzu Prominence LC-20AT, equipado con un

automuestreador (Shimadzu SIL-20), una columna Restek Ultra Aqueous

C18 (5 µm x 150 x 4.6 mm) y un detector de arreglo de diodos (Shimadzu

SPP-M20A). Alícuotas de 10 µL libres de células y partículas suspendidas

fueron inyectadas a la columna que se mantuvo estable a 35ºC. Una solución

de H2PO4 0.05% pH 2.5 fue usada como fase móvil a un flujo de 0.5 ml/min.

55

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Morfología Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 es un bacilo delgado móvil, se

dispone solo, en parejas o cadenas de hasta 5 células. El tamaño de la célula

es de 3 a 6 µm de largo x 0.3 a 0.45 µm de ancho. Después de 12 horas de

incubación las células se agrupan en cadenas alcanzando una longitud de 25

µm aproximadamente. Este bacilo termófilo anaerobio presenta reacción

positiva a la coloración de Gram y forma esporas esféricas terminales (figura

9).

Figura 9. Microfotográfica de contraste de fase de Thermoanaerobacter

italicus USBA 18 tomada a las 24 horas de cultivo en medio básico

suplementado con glucosa 20 mM.

Morfológicamente, la cepa USBA 18 es similar a Thermoanaerobacter

italicus, aunque difieren en su reacción frente a la coloración de Gram, ya

que la cepa USBA 18 es Gram positiva y Thermoanaerobacter italicus Gram

negativa (Kozianowski et al., 1997). Las dos cepas forman esporas circulares

56

terminales y las células se disponen solas, en pares o en cadenas (Tabla 9).

El tamaño celular entre T. italicus y la cepa USBA 18 es diferente ya que T.

italicus mide 2 a 6 µm de largo x 0.4 a 0.75 µm de ancho.

6.2. Determinación de condiciones óptimas de crecim iento

Se determinaron las condiciones óptimas de crecimiento de

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, teniendo en cuenta temperatura

de crecimiento, pH y concentración de NaCl del medio de cultivo. La

temperatura óptima de crecimiento para esta cepa se presentó entre 65°C y

70°C, a pH de 7,2 y 1% (p/v) de NaCl en el medio de cultivo. En estas

condiciones de cultivo, la bacteria presentó una velocidad específica de

crecimiento (µx) de 0.3045 h-1, con un tiempo de duplicación (td) de 2.276 h

(figura 10).

0

2550

75

100125

150

175

200225

250

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26

Tiempo (horas)

Bio

mas

a (u

g/m

l)

Figura 10. Cinética de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18 en condiciones óptimas de crecimiento (65°C ; pH 7.2; 1% de

NaCl).

57

Es importante aclarar que las condiciones óptimas encontradas para la cepa

USBA 18 están influenciadas por las características físicas y químicas

encontradas en el lugar de su aislamiento (Pozo hotel Lanceros), que

presenta una temperatura promedio de 64°C, un pH de 7.2 (tabla 5) y una

concentración de NaCl de 41 g/l (4.1% p/v) (Alfaro, 2002; Pachon y Posada,

2003). Únicamente, existe una diferencia marcada en la concentración de

NaCl encontrada en el lugar de su aislamiento y la reportada como óptima

para la cepa USBA 18 en este trabajo.

La bibliografía reporta para Thermoanaerobacter italicus usando glucosa

como fuente de carbono a 70°C un tiempo de duplicac ión (td) de 2.1 h con

una velocidad específica de crecimiento (µx) de 0.33 h-1 (Kozianowski et al.,

1997). La cepa USBA 18 y Thermoanaerobacter italicus se diferencian en su

tiempo de duplicación con glucosa como fuente de carbono en 0.16 h.

6.2.1. Temperatura óptima de crecimiento

Se evaluó el crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en

un rango de temperatura entre 50°C y 75°C. El creci miento fluctuó entre

55°C y 70°C (figura 11) y se determinó como tempera tura óptima el intervalo

comprendido entre 65°C y 70°C (tabla 7), aunque par a todos los

procedimientos experimentales la temperatura utilizada fue de 65°C. Las

condiciones usadas para realizar estas cinéticas fueron: pH 7.2 y 23 g/l (2.3%

(p/v)) de NaCl.

La temperatura óptima de crecimiento encontrada por Kozianowski (1997) y

su grupo de investigación para Thermoanaerobacter italicus fue de 70°C, una

temperatura similar a la encontrada para la cepa USBA 18 (65°C a 70°C).

Las cepas difieren en los rangos de temperatura a la cual crecen ya que en

T. italicus (Kozianowski et al., 1997) el crecimiento ocurre entre 45°C y 78°C,

58

un rango de temperatura mayor que el encontrado en el marco de esta

investigación (50°C a 75°C).

Con este resultado se confirma que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA

18 es un microorganismo termófilo estricto, ya que es incapaz de crecer a

temperaturas inferiores a los 50°C. Del mismo modo, se ratifica que la cepa

USBA 18 no crece a temperaturas mayores a 80°C, lo que indica que no es

un microorganismo hipertermófilo.

Figura 11. Determinación de la temperatura óptima de crecimiento para

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18.

6.2.2. Concentración de NaCl óptima de crecimiento

Las concentraciones de NaCl evaluadas para determinar la concentración

óptima fueron entre 0% y 8% (p/v) y se concluyó que la concentración óptima

de NaCl para el crecimiento de la cepa USBA 18 es de 1% (p/v). El

crecimiento se presentó entre 0% y 6%. Concentraciones mayores a 6% de

NaCl inhiben el crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

(figura 12). La determinación de estas cinéticas de crecimiento se realizó en

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

50 55 60 65 70 75

T (ºC)

ux (

h-1

)

59

medio básico termofílico (MB) suplementado con 20 mM de glucosa y a

65°C.

Los resultados obtenidos en este estudio son similares a los reportados por

Kozianowski y col. (1997), quienes encontraron que concentraciones

mayores a 1% (p/v) de NaCl no afecta el crecimiento celular. Aunque se

determinó en este trabajo que concentraciones mayores a 6% (p/v) de NaCl

inhiben el crecimiento y que en ausencia de NaCl se presenta crecimiento de

la cepa USBA 18. Lo anterior conlleva a concluir que la cepa USBA 18 no es

una bacteria halófila ya que en ausencia de NaCl presenta crecimiento y a

concentraciones por encima de 6% (p/v) de NaCl no se genera crecimiento

Figura 12. Determinación de la concentración de NaCl óptima de crecimiento

para Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18.

6.2.3. pH óptimo de crecimiento

Los valores de pH evaluados para determinar el óptimo de crecimiento

fluctuaron entre 3.2 y 8.8. Se resalta que en todo este rango se presentó

crecimiento (figura 13); se determinó que el pH óptimo de crecimiento es 7.2

0,000

0,050

0,100

0,150

0,200

0,250

0,300

0% 1% 2% 3% 4% 5% 6% 7% 8%

NaCl

µx (

h-1

)

60

con una velocidad específica de crecimiento de 0.305 h-1 y un tiempo de

duplicación de 2.276 h. Las cinéticas de crecimiento se realizaron utilizando

1% de NaCl (p/v) a 65°C.

La bibliografía reporta que el pH óptimo de crecimiento oscila alrededor de 7

(Kozianowski et al., 1997), un valor muy similar al encontrado en el desarrollo

de esta investigación.

Figura 13. Determinación del pH óptimo de crecimiento para


6.3. Determinación de Actividades enzimáticas

Se evaluaron las actividades amilolítica, xilanolítica y pectinolítica (65°C x 30

min), enfrentando el extracto enzimático (obtenido por centrifugación) a una

solución stock buffer fosfato de la fuente de carbono y se cuantificaron los

azúcares reductores producidos en la reacción por DNS. Se determinó que

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica,

pectinolítica y xilanolítica cuantitativa.

0.15

0.18

0.21

0.24

0.27

0.30

0.33

0.36

3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9

pH

ux (

h-1

)

61

La capacidad de degradar estos polímeros de origen vegetal se debe

posiblemente a la exposición del microorganismo en su ambiente natural a

carbohidratos derivados de algas termófilas y derivados de biomasa

bacteriana ó por polisacáridos estructurales vegetales que ocasionalmente

caen en estos ambientes por desplazamiento físico (Jain y Zeikus, 1992). Lo

cual se ha evidenciado durante los muestreos, ya que el manantial

termomineral PP-10 “Pozo Hotel Lanceros” se encuentra resguardado de

visitantes y la entrada de materia orgánica exógena es muy baja,

ocasionalmente se encuentran en el pozo hojas ó ramas provenientes de la

vegetación cercana. La existencia de organismos en este yacimiento es

evidente, continuamente se observa la presencia de algas y lodo en la zona

circundante al punto de emanación (Pachon y Posada, 2003).

Teniendo en cuenta que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

presenta actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica cuantitativa, se debe

profundizar sobre su actividad y sus enzimas con el fin de determinar

utilidades a nivel biotecnológico e industrial debido a que estos tres

polímeros de origen vegetal son altamente empleados en la industrial, para la

producción de alcoholes, monómeros (azúcares), ácidos orgánicos y una

infinidad de productos y finalidades.

6.3.1. Actividad amilolítica

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presentó actividad amilolítica

cuantitativa. A las 120 horas de fermentación, la cepa exhibió la mayor

actividad amilolítica obteniéndose un valor 409.9 UA/l con un pH inicial de 7.2

(figura 14 y 15), indicando que durante el proceso fermentativo, el cultivo

aumenta su actividad enzimática con el tiempo. Es importante resaltar que en

el intervalo comprendido entre los tiempos 0 y 12 h de cultivo no se exhibe

una actividad amilolítica considerable, de las 12 h a las 120 h es donde se

62

presenta la mayor actividad y la actividad amilolítica obtenida a las 120 h fue

casi el doble de la presentada a las 48 h.

La actividad amilolítica presentada por Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18 es apreciable, teniendo en cuenta que el hábitat natural de este

microorganismo es pobre en fuentes de carbono complejas como el almidón.

Del mismo modo, al comparar con datos reportados de actividad enzimática

presentada por microorganismos termófilos anaerobios aislados en

yacimientos termales como en el caso de Thermococcus hydrothermalis que

tiene 289 UA/l (Legin et al., 1998), el resultado obtenido para esta cepa es

alto teniendo en cuenta que la actividad amilolítica fue de 409.9 UA/l.

En estudios previos realizados en el Manantial termomineral (MTM) “Pozo

Hotel Lanceros” se reportaron actividades amilolíticas de

Thermoanaerobacter spp. de mínimo 563.8 UA/l y máximo 905.6 UA/l a 120

h de fermentacion (Posada et al., 2004), comparando estos valores con los

encontrados en el marco de este estudio, se observa que la actividad

enzimática reportada para la cepa USBA 18 es menor a las encontradas por

Posada y col (2004).

Lo descrito por Kozianowski y su grupo de investigación en 1997 para

Thermoanaerobacter italicus es que este microorganismo presenta un total

de 510 UA/l, un valor más cercano al encontrado durante el desarrollo de

esta investigación para la cepa USBA 18.

El uso de enzimas termoestables en procesos que involucren la

transformación de almidón ofrece mayores ventajas con respecto al uso de

enzimas aisladas de microorganismos mesófilos debido a que este

compuesto es más soluble a altas temperaturas, lo cual hace preferible la

63

implementación de procesos termofílicos que requieran amilasas

termoactivas y termoestables (Pachon y Posada, 2003).

6.3.1.1. Temperatura óptima de actividad amilolític a

Se determinó la temperatura óptima de actividad amilolítica para

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. La actividad amilolítica se

presenta mejor en el intervalo comprendido entre 60°C y 65°C, aunque a

60°C la actividad amilolítica a las 120 h de fermen tación fue de 415.9 UA/l,

un valor mayor que el obtenido a 65°C (409.9 UA/l). Cabe aclarar que la

actividad amilolítica se presentó en todo el rango evaluado (55°C – 75°C),

pero obteniéndose actividad amilolítica menor a la presentada a 60-65°C

(figura 14).

0255075

100125150175200225250275300325350375400425450

0 24 48 72 96 120 144

Tiempo (h)

UA

55°C

60°C

65°C

70°C

75°C

Figura 14. Actividad amilolítica de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA

18 a diferentes temperaturas.

64

6.3.2. Actividad pectinolítica

Se estableció que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta

actividad pectinolítica, la cual fue cuantificada a través del tiempo. A las 120

h de cultivo, la cepa exhibió una actividad pectinolítica de 264.9 UP/l siendo

el valor más alto obtenido durante la fermentación (figura 15). Se observó un

aumento de 140.2 UP/l desde el inicio de la fermentación hasta las 120 h de

cultivo.

La degradación de pectina por bacterias termofílicas se ha encontrado en

especies de los géneros Clostridium, Thermoanaerobacterium,

Thermoanaerobacter, Bacillus, Desulfurococcus. Se ha reportado actividad

pectinolítica de Thermoanaerobacter italicus a partir de la caracterización y

purificación de dos pectato liasas y el valor obtenido por Kozianowski y su

grupo colaborador (1997) fue de 200 UP/l, comparando el valor obtenido con

el de la cepa USBA 18, se puede evidenciar que es mayor en

aproximadamente 65 UP/l, estableciendo que Thermoanaerobacter italicus

cepa USBA 18 tiene una actividad pectinolítica importante que podría ser

explotada en el campo biotecnológico e industrial y que existe una diferencia

con respecto a la actividad pectinolítica entre Thermoanaerobacter italicus y

la cepa USBA 18.

6.3.3. Actividad xilanolítica

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presentó actividad xilanolítica, la

mayor actividad enzimática se presentó a las 24 h de cultivo obteniéndose un

valor de 215.9 UX/l, después de las 24 h de fermentación la actividad

enzimática comenzó a decrecer hasta 148.2 UX/l a las 48 h (figura 15).

65

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Tiempo (h)

Uni

dade

s de

Act

ivid

ad/l

UA/l

UP/l

UX/l

Figura 15. Actividades enzimáticas producidas por Thermoanaerobacter

italicus cepa USBA 18. Reacción enzimática a 65°C x 30 min.

La temperatura utilizada para realizar la reacción enzimática (65°C) indicó

que las enzimas generadas por el microorganismo para degradar el xilano

son estables y activas a temperaturas termofílicas, lo que genera ventajas a

nivel productivo sobre las enzimas utilizadas industrialmente que

generalmente provienen de microorganismos mesófilos y que por tanto son

activas a temperaturas cercanas a la mesófilica (20°C hasta 40°C) (Demirjian

et al., 2001).

6.4. Crecimiento en diferentes sustratos

Se realizó seguimiento al sustrato consumido mediante la cuantificación de

azúcares reductores por DNS en diferentes tiempos de crecimiento y se

determinaron los metabolitos producidos en la fermentación de las diferentes

66

fuentes de carbono por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en

fase reversa.

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene la capacidad de fermentar

azúcares como glucosa, galactosa y xilosa, sin embargo, la arabinosa no es

utilizada como fuente de energía (característica no compartida con

Thermoanaerobacter italicus la cual sí presenta crecimiento y degradación de

esta pentosa), observando así diferencias a nivel fenotípico con la cepa

aislada por Kozianowski y col (1997) (Tabla 9). A su vez, la cepa USBA 18

también es capaz de degradar polímeros complejos como almidón, pectina y

xilano (figura 16).

Es importante resaltar que la figura 16 muestra el consumo de sustrato. En

los casos de consumo de almidón y xilano, lo que se observa es un aumento

con respecto al tiempo, esto se debe a que al degradarse el polímero

aumenta la cantidad de azúcares reductores, mostrando de forma indirecta el

consumo de sustrato.

La cepa USBA 18 exhibe un metabolismo fermentativo, teniendo mayor

afinidad por las hexosas como la glucosa y la galactosa y en una proporción

menor por las pentosas como la xilosa; la pentosa arabinosa no es

degradada. La degradación de las hexosas y los polímeros de glucosa

posiblemente (almidón y pectina) la realiza utilizando la vía clásica de

Embden Meyerhof Parmas (EMP) utilizando la fructosa-6-fosfato o la

glucosa-6-fosfato como precursores metabólicos (Schönheit, 2008) hasta

llegar a formar dos moléculas de piruvato (ácido pirúvico) que puede ser

convertido en diferentes productos entre los cuales se incluyen alcohol etilico

(etanol), ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, ácido butírico, alcohol

bulitico, alcohol isopropilico, ácido propiónico, ácido fórmico y otros

componentes (McArthur, 2006).

67

Las pentosas (polímero de xilano) son degradadas por medio de la ruta de

las pentosas fosfato, teniendo la molécula de cinco carbonos fosforilada

como precursora de la vía, y generando de este modo dos opciones

metabólicas para la degradación y la subsiguiente formación de los productos

metabólicos; la pentosa fosfato puede ser hidrolizada hasta una triosa fosfato

y convertirse en piruvato, o la pentosa puede entrar en la parte regenerativa

de la vía, en la cual las pentosas fosfato se convierten en hexosas fosfatos y

pasan a ser degradadas en la glicólisis (EMP) (Koolman y Roehm, 2005).

La capacidad de degradación de polímeros complejos de origen vegetal que

presenta Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, hacen de este

microorganismo atractivo para procesos industriales, ya que exhibe los

complejos enzimáticos necesarios para la hidrólisis de moléculas complejas

hasta glucosa con la formación principalmente de acido láctico y de sustratos

más complejos como el almidón, la pectina y el xilano también con una

producción mayor de ácido láctico.

68

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Tiempo (h)

Sus

trato

(g/

L)

Galactosa

Arabinosa

Glucosa

Almidon

Xilano

Figura 16. Consumo de sustrato con respecto al tiempo por parte de


6.4.1. Determinación de metabolitos producidos por HPLC

Los productos finales de la fermentación de Thermoanaerobacter italicus

fueron analizados por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), los

resultados obtenidos se muestran en las tabla 6, 7 y 8. Es importante resaltar

que el metabolito producido en mayor concentración fue ácido láctico (19.7

mM) utilizando glucosa como fuente de carbono, aunque se generaron otro

tipo de productos en el bioproceso como ácido acético (12.8 mM) con

almidón como sustrato y ácido fórmico, málico, succínico, propiónico y etanol

pero en menores concentraciones (tabla 6).

Con respecto a las variaciones realizadas al medio de cultivo, se determinó

que la concentración adecuada de extracto de levadura para la producción

de ácido láctico se encuentra en el rango comprendido entre 0.5 g/l y 1.0 g/l

69

Tabla 6. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus

cepa USBA 18 con diferentes fuentes de carbono a las 120 h de

fermentación (65ºC; pH 7.2).

Productos Formados (mM)

Sustrato Ácido Fórmico

Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético

Ácido succínico Etanol

Ácido Propiónico

Glucosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,4 19,7 11,6 0,0 0,0 2,6 Arabinosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Galactosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,9 14,2 9,2 0,8 0,0 2,8 Pectina(20g/l)+YE(0,5g/l) 3,3 0,0 0,6 0,0 1,2 0,5 0,6 Xilano(8g/L)+YE(0,5g/l) 0,0 1,1 4,8 6,0 0,0 0,0 0,0 Almidón(20g/l)+YE(0,5g/l) 0,5 1,5 17,0 12,9 1,9 0,2 1,6

YE, extracto de levadura. Se uso como control de la prueba (MB + YE (0.5

g/l)) y a los valores obtenidos se le restó el control.

obteniéndose valores de 19.7 mM y 19.5 mM respectivamente. Si la fuente

de nitrógeno orgánico (extracto de levadura) es sustituida por peptona se

obtiene que la concentración apropiada para la producción de ácido láctico

es de 0.5 g/l proporcionando 20.2 mM de este ácido orgánico y pequeñas

trazas de ácido acético (2.1 mM) (tabla 7). El cambio de la fuente de

nitrógeno inorgánica (NH4Cl por KNO3) influye notablemente en la producción

de los metabolitos evaluados ya que con la adición de KNO3 se produce en

menor proporción ácido láctico (7.6 mM) y ácido acético (4.8 mM) con

respecto a los valores obtenidos a partir de la fermentación de la glucosa o

del almidón. La adición de la solución de vitaminas de Balch por extracto de

levadura no suple por completo los requerimientos celulares a nivel de fuente

de nitrógeno debido a que se produce en menor proporción los metabolitos

analizados (0.3 mM de ácido málico, 10.3 mM de ácido láctico, 6.1 mM de

ácido acético, 1.1 mM de acido succínico y 0.8 mM de ácido propiónico)

(tabla 8). Lo anterior lleva a concluir que Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18 necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de

los ácidos orgánicos analizados, en especial para la producción de ácido

láctico, indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona.

70


USBA 18 con diferentes concentraciones de extracto de levadura y peptona a

las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).



Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético


Ácido Propiónico

MB+Glu(20mM)+YE(0,25g/l) 0,0 0,0 12,3 1,3 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,4 19,7 11,6 0,0 0,0 2,6 MB+Glu(20mM)+YE(1g/l) 0,0 0,0 19,5 0,4 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+YE(2g/l) 0,0 0,0 14,3 0,0 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(0,25g/l) 0,0 0,0 3,8 1,9 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(0,5g/l) 0,0 0,0 20,2 2,1 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(1g/l) 0,0 0,0 17,3 0,6 0,0 0,0 0,0

MB, medio básico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; PEP, peptona. Se

uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) – fuente orgánica de

nitrógeno) y a los valores obtenidos se le restó el control.

Thermoanaerobacter italicus produce como metabolitos finales de la

fermentación de glucosa, etanol (26.6 mM), lactato (12.4 mM), acetato (2.2

mM), succinato (0.3mM), H2 y CO2 (Kozianowski et al., 1997). A diferencia de

T. italicus, la cepa USBA 18 no genera etanol como producto final del

metabolismo de la glucosa y produce en mayor proporción lactato y acetato y

en menores proporciones ácido fórmico, ácido málico y ácido propiónico

(tabla 9). Se observó producción de etanol en muy bajas concentraciones

utilizando como fuentes de carbono pectina (0.5 mM de etanol) y almidón

(0.2 mM de etanol), generando de esta forma diferencias notables a nivel

metabólico y cinético entre Thermoanaerobacter italicus y la cepa USBA 18.

Desde el punto de vista biotecnológico es importante resaltar la producción

de los metabolitos generados por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA

18, ya que se observó que el producto final de la fermentación que se

presentó en mayor concentración fue ácido láctico y ácido acético y la

relevancia que se le puede dar a estos productos a nivel industrial. Se ha

71

determinado por bibliografía que Bacillus thermoamylovorans produce 22.2

mM de ácido láctico a partir de glucosa 30 mM a las 72 h de fermentación a

50°C (Combet-Blanc et al., 1995) y que este microorganismo tiene un

elevado potencial biotecnológico para la producción de ácido láctico a partir

de azúcares y sustratos de origen vegetal (Combet-Blanc et al., 1999).


cepa USBA 18 con KNO3 como fuente inorgánica de nitrógeno y solución de

vitaminas de Balch a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).



Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético


Ácido Propiónico

MB+Glu(20mM)-YE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)-YE+Vit 0,0 0,3 10,3 6,1 1,1 0,0 0,8

MB+Glu(20mM)+YE+KNO3 0,0 0,0 7,6 4,8 0,0 0,0 0,0

MB+Glu(20mM)-YE+KNO3 0,0 0,0 0,0 2,7 0,0 0,0 0,0 MB, medio basico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; Vit, solucion de

vitaminas de Balch. Se uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) y a

los valores obtenidos se le restó el control.

El acido láctico ha sido usado durante mucho tiempo en la industria del cuero

como acidulante; es usado en la terminación de textiles y de la lana; también

es usado para aplicaciones menores como en la producción de resinas,

impresión litográfica y textil, en adhesivos y en la formulación de detergentes

(5 a 10% del consumo total de ácido láctico); además, tiene numerosas

aplicaciones farmacéuticas y cosméticas ya que muchas de las

formulaciones contienen este ácido orgánico, lactato de sodio y de calcio y

acil lactatos. El lactato de calcio es usado para tratar las deficiencias de este

mineral, los lactatos son adicionados a muchos productos cosméticos como

humectantes, emulsificantes y estabilizantes, a su vez estos han sido

promovidos como productos para el cuidado de la piel (mejoran la textura y

apariencia de la piel) y el etil lactato es el ingrediente activo en las

72

preparaciones anti acné (Rogers et al., 2006). Del mismo modo, existen

aplicaciones importantes a nivel médico para los polilactátidos preparados a

partir de dímeros láctidos. Estos polímeros son usados para procedimientos

que requieren sutura quirúrgica, placas de hueso, entre otras que generan

interés ya que son biocompatibles y biodegradables. El acido láctico también,

es usado como una alternativa ecológica para la producción de bioplasticos

generando una alternativa amigable con el medio ambiente y se presenta

como uno de los productos biotecnológicos más importantes y con mayor

potencial (Romaní et al., 2008).

73

Tabla 9. Principales Características de algunas especies del género Thermoanaerobacter.

Características

Thermoanaerobacter italicus (Kozianowski et al., 1997)

Thermoanaerobacter mathranii (Larsen et al., 1997)

Thermoanaerobacter brockii (Zeikus et al., 1979)

Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel y Ljungdahl, 1981)

Thermoanaerobacter finnii (Schmid et al., 1986)

Thermoanaerobacter italicus Cepa

USBA 18 esporas + + + - + + Coloración de Gram - Variable + variable variable + Movilidad - + + + + + Tº óptima de crecimiento 70ºC 70ºC 68ºC 69ºC 65ºC 65ºC a 70°C Fuente de energía Gelatina - n.r. n.r. + n.r. n.d Celulosa - - - - n.r. n.d Galactosa + - n.r. n.r. n.r. + Glucosa + + + + + + Pectina + - - + n.r. + Almidón + n.r. + + n.r. + Xilano + + + + n.r. + Arabinosa + + n.r. n.r. n.r. - Metabolitos finales Etanol + + + + + - Lactato + + + + + + Acetato + + + + + + Butirato - - - - - -

n.r.: No reportado n.d: No determinado

74

7. CONCLUSIONES.

7.1. Se realizó la caracterización cinética y enzimática de

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, determinándose que la cepa

USBA 18 presenta diferencias a nivel fenotípico con Thermoanaerobacter

italicus (Kozianowski et al., 1997). Dentro de las diferencias más

importantes encontradas en el marco de este estudio, se resalta la no

producción de etanol como producto final de la fermentación por parte de

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, la formación de ácido láctico

como el producto predominante de su metabolismo y la no utilización de

arabinosa como fuente de carbono. Todo lo anterior indica que

posiblemente la cepa USBA 18 sea una nueva subespecie del género

Thermoanaerobacter.

7.2. Se determinó que la cepa utilizada para realizar el estudio es

termófila; ya que crece adecuadamente a temperaturas superiores a 50°C

y que no es hipertermófila debido a que a temperaturas mayores de 75°C

su crecimiento se ve afectado. También se concluye que para su

crecimiento óptimo es necesario tener un pH del medio cercano a la

neutralidad y que su crecimiento no se ve inhibido por la presencia de

NaCl, porque presenta crecimiento tanto en ausencia como en presencia

de NaCl.

7.3. Se concluyó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de

metabolitos finales, en especial para la producción de ácido láctico,

indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona. El cambio

de la fuente de nitrógeno inorgánico (NH4Cl por KNO3) influye

notablemente en la producción de los metabolitos finales de su

fermentación. La adición de solución de vitaminas de Balch por extracto

de levadura no suple por completo los requerimientos celulares para la

producción de los metabolitos evaluados en este trabajo.

75

7.4. Se determinó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18

presenta actividad amilolítica (409.9 UA/l), pectinolíca (264.9 UP/l) y

xilanolítica (215.9 UX/l) cuantitativa. Las tres actividades presentadas por

este microorganismo son significativas y se cree que podrían ser

potencialmente utilizadas a nivel biotecnológico y en una gran variedad de

industrias. Se debe resaltar que la actividad que se presentó en mayor

proporción fue la amilolítica.

7.5. Se estableció Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene un

metabolismo fermentativo y que puede utilizar algunas hexosas y

pentosas como fuente energética, del mismo modo se determinó que la

bacteria analizada tiene la capacidad de hidrolizar polímeros complejos

hasta compuestos más simples de gran valor comercial y biotecnológico,

como el ácido láctico, que actualmente genera mucho interés debido a

que puede ser convertido en polímeros biodegradables.

76

8. RECOMENDACIONES

8.1. Evaluar en futuros estudios concentraciones de glucosa diferentes a

la usada en este estudio, con el fin de determinar la concentración óptima

de este azúcar que permita una mayor producción de metabolitos finales y

especialmente la producción de ácido láctico.

8.2. Analizar fuentes alternativas de carbono para la producción de

metabolitos finales de la fermentación, en especial ácido láctico, que sean

económicas y que generen rendimientos apreciables a nivel industrial.

Además de profundizar y evaluar más fuentes de carbono, para realizar

una caracterización más precisa de Thermoanaerobacter italicus cepa

USBA 18 y generar resultados que puedan evidenciar diferencias o

similitudes a nivel fenotípico entre la cepa USBA 18 y

Thermoanaerobacter italicus.

8.3. Determinar el pH óptimo para la actividad amilolítica producida por

Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, ya que la bibliografía reporta

que la actividad enzimática está influenciada por el pH al cual se realice.

8.4. Evaluar la capacidad de la cepa para realizar respiración anaerobia

en presencia de tiosulfato como aceptor final de electrones y la influencia

de este en la producción de metabolitos finales.

8.5. Escalar el proceso de fermentación con el fin de obtener una mayor

producción de metabolitos finales que puedan generar interés a nivel

industrial.

77

9. BIBLIOGRAFÍA

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thermosulfurogenes, and Clostridium thermohydrosulfuricum E100-69 as

Thermoanaerobacter brockii comb. nov., Thermoanaerobacterium

thermosulfurigenes comb. nov., and Thermoanaerobacter

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88

10. ANEXOS

ANEXO 1. ESTABLECIMIENTO DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓ N

PARA DETERMINACIÓN DE PESO SECO BACTERIANO

1. Primer lavado lavado

1.1. Centrifugar durante 10 minutos a 4000 rpm a 4ºC un volumen de

medio de cultivo en fase exponencial (de 1 a 1.5 L), lavándolo con

solución salina 0.85% o con tampón fosfato 0.1M pH 7.0.

El objetivo de lavar las células es eliminar del medio de cultivo una gran

cantidad de sales o extracto de levadura que pueden quedar en el

precipitado y falsear los resultados. Además en el cultivo anaerobio se

elimina la resarurina. Para dejar la suspensión homogénea esta se debe

pasar por el vortex y no deben quedar agregados.

1.2. Una vez finalizada la centrifugación, descartar delicadamente el

sobrenadante en un vaso de precipitado. Suspender en conjunto de

precipitados (de los diferentes tubos de centrifuga) en 200 ml de tampón

fosfato 0.1M pH 7.0.

1.3. Centrifugar de nuevo, teniendo en cuenta las mismas precauciones

anteriores durante 10 minutos a 4ºC y 7000 rpm.

2. Segundo lavado

2.1. Recuperar los precipitados y suspenderlos en 200 ml de solución

salina 0.85% y centrifugar de nuevo a las mismas condiciones.

89

Después del segundo lavado, las células son puestas en suspensión

homogénea en 100 ml de solución salina 0.85% y colocadas

inmediatamente en hielo para evitar lisis bacteriana.

2.2. Dividir esta suspensión madre (SM) en dos fracciones alrededor de

50 ml cada una.

2.3. Seguir el esquema de peso seco.

2.4. Tomar una de estas fracciones (1/100e), esta servirá para conocer la

DO teórica de SM.

3. Secado de células

De la otra fracción de la SM, tomar 10 o 20 ml (replicas) cuidando de

homogenizar previamente. Luego disponerlas en capsulas de porcelana

previamente secadas al horno y pesadas. Llevar las capsulas al horno a

105ºC durante 4 horas, luego pesar estas capsulas habiéndolas dejado

enfriar previamente en campana de desecación. Volver a pesar cada

media hora hasta que se obtenga peso constante.

4. Diluciones de la suspensión madre (SM)

4.1. Para determinar las diluciones es necesario conocer el valor teórico

de la DO de la SM. Una vez se conoce la DO de la SM se realiza una

primera dilución de esta fracción (1/x), teniendo en cuenta que la DO

teórica de esta dilución debe estar entre 1 y 2. Esta nueva dilución que se

denominara suspensión de trabajo (ST) será utilizada para hacer la serie

de diluciones de 1/10 en 1/10 (en solución salina 0.85%) a las cuales se

les medirá la DO580.

90

Tabla 1. Diluciones de la suspensión de trabajo (ST).

Dilución 1/10 2/10 3/10 4/10 5/10 6/10 7/10 8/10 9/10

ST (µl) 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Solución

Salina (µl) 900 800 700 600 500 400 300 200 100

Vf (µl) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000

4.2. Estas diluciones se preparan en tubos eppendorf y se leen en el

espectrofotómetro a 580 nm, utilizando Solución salina 0.85% como

blanco de la prueba. Normalmente los valores mas concentrados

(diluciones 5/10 a 9/10) no ofrecen buenos resultados ya que a estas

concentraciones se pierde la linealidad en la grafica y por eso se hace un

segundo conjunto de diluciones mas finas.

Tabla 2. Diluciones de la suspensión de trabajo (ST) más finas.

Dilución 1/25 1/20 3/20 5/20

ST (µl) 40 50 150 250

Solución

Salina (µl) 960 950 850 750

Vf (µl) 1000 1000 1000 1000

4.3. Una vez se tengan suficientes puntos se traza la curva Diluciones vs

DO580 mn. Se calcula la ecuación y el valor importante aquí es la

pendiente

4.4. Cuando se haya establecido el peso seco de las bacterias en las

capsulas, se calcula el peso seco de bacterias/ml de SM. Una vez

calculado el peso seco para la ST, se calcula para cada dilución el peso

seco correspondiente. Se convierten las diluciones en concentración: µg

de bacterias peso seco/ml.

91

4.5. Se grafica peso seco (µg/ml) vs DO580 y de la ecuación de la recta se

calcula la pendiente.

92

ANEXO 2. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD AMILOLÍTICA

1. Preparación del buffer fosfato 0.1 M

Preparar cada fosfato por separado de la siguiente forma: pesar 14.2g de

Na2HPO4 y disolver en 200 ml de agua destilada; pesar 12 g de NaH2PO4

y dilsolver en 200 ml de agua destilada, posteriormente mezclar, ajustar

pH= 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000 ml con agua destilada en balón

volumétrico.

2. Preparación de almidón al 1 % p/v en buffer fosf ato 0.1M

Pesar 1g de almidón hidrosoluble y disolver lentamente en 50 ml de buffer

fosfato 0.1M (solución tampón), calentar la solución en horno microondas

por un minuto, ajustar pH = 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer

fosfato 0.1M en balón volumétrico.

3. Reacción enzimática con almidón al 1 % p/v en bu ffer fosfato 0.1 M

3.1. Centrifugar la muestra (5000 rpm, 4°C, 10 min) , separar el extracto

crudo y depositar en un tubo eppendorf limpio.

3.2. Realizar el protocolo descrito en la tabla 1.

3.3. A partir del sobrenadante obtenido tomar 0,25 ml y transferir a los

tubos de ensayo que contienen 0,25 ml de DNS (Miller, 1959). Continuar

con el protocolo que se describe en la Tabla 2.

3.4. Los resultados de esta prueba deben ser reportados en Unidades

Amilolíticas (UA/l), definida como la cantidad de enzima que libera una

µmol de azucares reductores de glucosa por minuto, bajo las condiciones

de la prueba. Debe tener en cuenta que antes que cualquier cosa debe

realizar una curva patrón con de glucosa.

93

Tabla 1. Reacción enzimática con almidón al 1 % p/v en buffer fosfato

0.1 M

Reactivo Réplica 1 Réplica 2 Réplica 3

Almidón al 1 % (p/v) en Buffer

fosfato 0.1 M 1 ml 1 ml 1 ml

Extracto crudo 1 ml 1 ml 1 ml

Incubar las muestras por 30 minutos mínimo a la temperatura que desea

evaluar. Frenar la reacción depositando los tubos en hielo por cinco

minutos.

Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar el almidón no

hidrolizado en la reacción.

Tabla 2. Cuantificación de actividad amilolítica.

Reactivo Blanco Répica 1 Réplica 2 Réplica 3

Sobrenadante de la

técnica enzimática (ml) - 0.25 0.25 0.25

Agua (ml) 0.25 - - -

Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25

Llevar a ebullición por 5 minutos y frenar reacción colocando los tubos en

hielo

Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5

Protejer los tubos de la luz y realice las lecturas en espectrofotómetro a

540 nm. Ajustando el cero de absorbancia con el blanco de la prueba

4. Elaboración de una curva de calibración de gluco sa

4.1. Preparación de una solución stock de glucosa 2 g/l

Pesar 2 g de glucosa anhidra en balanza analítica. Disolver en 500 ml de

agua destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml. Homogenizar y

94

completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con la fecha de

preparación y la persona responsable.

4.2. Preparación de las soluciones de concentración conocida 0.5 –

2.0 g/l

Emplear la primera ley de la volumetría. Utilizar la fórmula 1.

Fórmula 1.

Preparar 6 soluciones con un volumen final de 2 ml, como lo muestra la

tabla 3.

4.3. Determinación de glucosa por DNS

A partir de cada una de las soluciones de concentración conocidas

deposite 0.25 ml en cada uno de los tubos de ensayo y siga el protocolo

descrito en la tabla 4. En lo posible procesar las muestras por triplicado.

Tabla 3. Preparación de las soluciones de glucosa.

Concentración (g/L)

Volumen de la solución

stock de glucosa 2 g/l

(ml)

Volumen de agua

destilada (ml)

0,5 0,5 1,5

0,7 0,7 1,3

1,0 1,0 1,0

1,5 1,5 0,5

1,7 1,7 0,3

2,0 2,0 0,0

Ci X Vi = Cf X Vf

95

4.4. Resultados

4.4.1. Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de

onda (λ) de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de

absorbancia con el blanco de la prueba.

4.4.2. Registrar los resultados obtenidos en la tabla 5.

4.4.3 Haciendo uso de la calculadora o de sistemas operativos como

Excel haga la regresión lineal de los datos de absorbancia en función de

la concentración y determine la ecuación de la línea recta así como su

respectivo coeficiente de determinación (R2). Recuerde que valores

menores a 0.9 en el R2 no son permitidos para curvas patrones o de

calibración y por ende debe revisar el reactivo o la manipulación de sus

diluciones.

Tabla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de glucosa.

Concentración (g/L) Reactivo Blanco

0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0

Glucosa (ml) - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Agua (ml) 0,25 - - - - - -

DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Calentar los tubos de ensayo por 5 minutos y posteriormente detenga la

reacción por la inmersión de los tubos en hielo durante 5 minutos.

Agua

destilada (m) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

Realizar las determinaciones de absorbancia a una longitud de onda (λ)

de 540 nm en el espectrofotómetro, ajustando el cero de absorbancia con

el blanco de la prueba.

96

Tabla 5. Resultados de la curva patrón de glucosa.

Absorbancia a 540 nm. Concentración (g/L)

R1 R2 R3

0,5

0,7

1,0

1,5

1,7

2,0

97

ANEXO 3. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD PECTINOLÍTICA






volumétrico.

2. Preparación de pectina al 1 % p/v en buffer fosf ato 0.1M

Pesar 1g de pectina y disolver lentamente en 50 ml de buffer fosfato 0.1M

(solución tampón), calentar la solución en horno microondas por un

minuto, ajustar pH = 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer fosfato 0.1M

en balón volumétrico.

3. Reacción enzimática con pectina al 1 % p/v en bu ffer fosfato 0.1 M




Tabla 1. Reacción enzimática con pectina al 1 % p/v en buffer fosfato

0.1 M


Pecina al 1 % (p/v) en Buffer





minutos.

Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar la pectina no

hidrolizada en la reacción.

98





Pectinolíticas (UP/l), definida como la cantidad de enzima que libera una

µmol de azucares reductores equivalentes a ácido D-galacturónico por

minuto, bajo las condiciones de la prueba. Debe tener en cuenta que

antes que cualquier cosa debe realizar una curva patrón con ácido D-

galacturónico.

Tabla 2. Cuantificación de actividad pectinolítica.


Sobrenadante de la


Agua (ml) 0.25 - - -

Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25


hielo

Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5



4. Elaboración de una curva de calibración de ácido D-galacturónico

4.1. Preparación de una solución stock de ácido D-g alacturónico 2 g/l

Pesar 2 g de ácido D-galacturónico en balanza analítica. Disolver en 500

ml de agua destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml.

Homogenizar y completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con

la fecha de preparación y la persona responsable.

99


2.0 g/l


Formula 1.


tabla 3.

4.3. Determinación de ácido D-galacturónico por DNS




Tabla 3. Preparación de las soluciones de ácido D-galacturónico.

Concentración (g/L)

Volumen de la solución

stock de ácido D-

galacturónico 2 g/l (ml)

Volumen de agua

destilada (ml)

0,5 0,5 1,5

0,7 0,7 1,3

1,0 1,0 1,0

1,5 1,5 0,5

1,7 1,7 0,3

2,0 2,0 0,0

Ci X Vi = Cf X Vf

100

4.4. Resultados











diluciones.

Tabla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de ácido D-

galacturónico.


0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0

ácido D-

galacturónico

(ml)

- 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Agua (ml) 0,25 - - - - - -

DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25



Agua

destilada (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5




101

Tabla 5. Resultados de la curva patrón de ácido D-galacturónico.


R1 R2 R3

0,5

0,7

1,0

1,5

1,7

2,0

102

ANEXO 4. DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD XILANOLÍTICA






volumétrico.

2. Preparación de xilano al 1 % p/v en buffer fosfa to 0.1M

Pesar 0.5g de xilano de abedul y 0.5g de xilano de avena de escanda y

disolver lentamente en 50 ml de buffer fosfato 0.1M (solución tampón),

calentar la solución en horno microondas por un minuto, ajustar pH = 7.0

+/- 2.0 y enrasar a 100 ml con buffer fosfato 0.1M en balón volumétrico.

3. Reacción enzimática con xilano al 1 % p/v en buf fer fosfato 0.1 M








Xilanolíticas (UX/l), definida como la cantidad de enzima requerida para

producir una µmol de azucares reductores equivalentes a xilosa por

minuto, bajo las condiciones de la prueba. Debe tener en cuenta que

antes que cualquier cosa debe realizar una curva patrón con xilosa.

103

Tabla 1. Reacción enzimática con xilano al 1 % p/v en buffer fosfato

0.1 M.


xilano al 1 % (p/v) en Buffer





minutos.

Centrifugar (5000 rpm, 4°C, 15 min) para separar el xilano no

hidrolizada en la reacción.

Tabla 2. Cuantificación de actividad xilanolítica.


Sobrenadante de la


Agua (ml) 0.25 - - -

Reactivo DNS (ml) 0.25 0.25 0.25 0.25


hielo

Agua (ml) 2.5 2.5 2.5 2.5



4. Elaboración de una curva de calibración de xilos a

4.1. Preparación de una solución stock de xilosa 2 g/l

104

Pesar 2 g de xilosa en balanza analítica. Disolver en 500 ml de agua

destilada utilizando un balón volumétrico de 1000 ml. Homogenizar y

completar hasta 1000 mL con agua destilada. Rotular con la fecha de

preparación y la persona responsable.


2.0 g/l


Fórmula 1.


tabla 3.

4.3. Determinación de xilosa por DNS




Ci X Vi = Cf X Vf

105

Tabla 3. Preparación de las soluciones de xilosa.

Concentración (g/L) Volumen de la solución

stock de xilosa (ml)

Volumen de agua

destilada (ml)

0,5 0,5 1,5

0,7 0,7 1,3

1,0 1,0 1,0

1,5 1,5 0,5

1,7 1,7 0,3

2,0 2,0 0,0

4.4. Resultados











diluciones.

T

106

abla 4. Metodología para la elaboración de la curva patrón de xilosa.


0,5 0,7 1,0 1,5 1,7 2,0

xilosa - 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25

Agua (ml) 0,25 - - - - - -

DNS (ml) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25



Agua

destilada (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5




Tabla 5. Resultados de la curva patrón de xilosa.


R1 R2 R3

0,5

0,7

1,0

1,5

1,7

2,0

107

CARACTERIZACIÓN CINÉTICA Y ENZIMÁTICA DE Thermoanaerobacter italicus CEPA USBA 18 AISLADA DE UN MANANTIAL TERMOMINERAL E N PAIPA,

BOYACÁ Javier Gómez, Sandra Baena, Balkys Quevedo.

RESUMEN

Se caracterizó cinética y enzimáticamente la cepa Thermoanaerobacter italicus USBA 18, bacilo termófilo anaerobio aislado de un manantial termomineral (5º45’30.69’’N; 73º6’50.61’’W) de Paipa (Boyacá), para determinar las condiciones óptimas de crecimiento, sustratos degradados y metabolitos producidos y cuantificar la actividad enzimática amilolítica, peptinolítica y xilanolítica de este organismo. La temperatura óptima de crecimiento fluctuó entre 65 y 70ºC, usando glucosa (20 mM) como fuente de carbono. El pH óptimo de crecimiento fue alrededor de 7.2 y 1% de NaCl se determinó como la concentración adecuada para el crecimiento Tiene una actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica considerable y aplicable a nivel industrial. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene la capacidad de fermentar azúcares como glucosa, galactosa y xilosa, sin embargo la arabinosa no es utilizada como fuente de energía. A su vez, la cepa USBA 18 también es capaz de degradar polímeros complejos como almidón, pectina y xilano. A partir del metabolismo genera como principal producto final de su fermentación acido láctico. Palabras claves: Anaerobio, manantial termomineral, termófiloThermoanaerobacter italicus. INTRODUCCIÓN El estudio, identificación y caracterización de microorganismos aislados de ambientes extremos hace parte del entendimiento de la diversidad microbiana de este tipo de ambientes, con el fin de determinar las características particulares que permiten a los organismos sobrevivir en condiciones extremas y comprender el papel desempeñado por los microorganismos en sus hábitats naturales. Los microorganismos extremófilos se caracterizan por habitar en ambientes en los cuales las condiciones físicas son críticas con respecto a las condiciones “normales” (temperaturas altas o muy bajas, valores de pH extremadamente ácidos ó básicos, ausencia de oxígeno, salinidad, presión, entre otras), sin embargo, estos microorganismos tienen la capacidad de sobrevivir y reproducirse bajo estas condiciones. Investigaciones desarrolladas en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental (USBA) demostraron la presencia de poblaciones microbianas termofilicas en manantiales termominerales (MTM) en la región de Paipa, Boyacá, con la identificación de microorganismos sulfato reductores, tiosulfato reductores, reductores de hierro

férrico, reductores de nitrato y principalmente microorganismos fermentativos. Se han identificado nuevas especies de bacterias sulfato-reductoras termófilas pertenecientes al género Desulfomicrobium y se ha propuesto una nueva especie llamada Desulfomicrobium thermophilum. Del mismo modo se encontró una marcada dominancia de organismos del filum Firmicutes y especialmente de miembros del genero Thermoanaerobacter identificados por medio de análisis fenotípicos y moleculares del gen 16S rRNA. A partir de estos estudios se seleccionó la cepa Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 aislada del manantial termomineral P4 - pozo Hotel Lanceros en Paipa, Boyacá. METODOLOGÍA Microoganismo. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, se encuentra en la colección de microorganismos del Departamento de Biología de la Pontificia Universidad Javeriana bajo el número PUJ-M-BIO-USBA-18 (P4-4). Esta cepa fue aislada de un manantial termomineral (MTM) localizado en Paipa en el departamento de Boyacá (5º 45' 30,69” N, 73º 6' 50,61” W; 2500 msnm) (PP-10 Pozo Hotel Lanceros) (Alfaro, 2002; Posada et al., 2004). Por análisis fenotípicos y genotípicos se conoce que

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la cepa USBA 18 pertenece al género Thermoanaerobacter, y con base en el análisis de la secuencia del 16S rDNA se observa una similitud del 98% y 97% con Thermoanaerobacter italicus y Thermoanaerobacter mathranii, respectivamente. Medio de cultivo y condiciones de cultivo. Las técnicas de Hungate (Hungate, 1969) se usaron para llevar a cabo este estudio. El medio básico contenía (l-1): 1.0 g de NH4Cl; 0.3 g de K2HPO4; 0.3 g de KH2PO4; 23.0 g de NaCl; 0.1 g de CaCl2; 0.1 g de KCl; 0.5 g de c; 0.5 g de extracto de levadura; 10.0 ml de solución de oligonutrientes de Balch (Balch et al., 1979); 1.0 ml de resazurina 0.1%. El pH del medio se ajustó a 7.0 ± 0.1 con NaOH 0.1N. El medio se llevó a ebullición hasta obtener una atmósfera libre de O2 y se enfrió a temperatura ambiente. Alícuotas (4.3 ml) de medio se distribuyeron dentro de tubos Hungate bajo condiciones libres de O2 por la adición de N2 gaseoso. Posteriormente la fase gaseosa se sustituyó con N2/CO2 (80:20) (Baena et al., 1999). El medio se esterilizó a 15 psi durante 20 minutos. Una vez autoclavados los tubos Hungate que contenían el Medio Básico (MB) se adicionaron 0.05 ml de Na2S al 2% (v/v) para asegurar las condiciones de anaerobiosis y 0.05 ml de NaHCO3 al 10% (v/v) para mantener el pH del medio. Las fuentes de carbono fueron adicionadas a cada tubo a partir de soluciones stock estériles y preparadas bajo condiciones de anaerobiosis (Rubiano, 2006). Posteriormente, el medio fue inoculado con 10% (v/v) del preinóculo de bacteria y llevado a incubación. Medio de cultivo mínimo de crecimiento. Se evaluaron diferentes concentraciones de extracto de levadura (0.25, 0.5, 1.0, 2.0 g/l) y peptona (0.25, 0.5, 1.0 g/l) como fuente de nitrógeno orgánico en el medio básico (MB) de cultivo. A su vez se cambió la fuente inorgánica de nitrógeno (NH4Cl) por KNO3 1.0 g/l y se evaluó una serie con la adición de vitaminas de Balch sin extracto de levadura (Balch et al., 1979). Thermoanaerobacter italicus USBA 18 fue subcultivada dos veces sucesivas

por triplicado bajo las mismas condiciones experimentales y se tomaron muestras de los tiempos 0 y 120 h de fermentación. Las muestras fueron procesadas y analizadas por Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC). Determinación de condiciones óptimas de crecimiento. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 fue subcultivada dos veces sucesivas bajo las mismas condiciones experimentales y por triplicado en tubos Hungate y se realizó un seguimiento del microorganismo por densidad óptica (DO) a 580nm y verificación microscópica del crecimiento de este en el medio líquido utilizando el microscopio de contraste de fase (Nikon: Eclipse 50i). Los valores obtenidos de absorbancia a 580 nm fueron transformados a concentración (µg de biomasa seca/ml) por medio de la curva patrón de peso seco. Los parámetros evaluados para determinar las condiciones óptimas de crecimiento fueron: temperatura, pH y concentración NaCl. Determinación de actividades enzimáticas. La determinación de actividades enzimáticas se realizó a partir de curvas de crecimiento con las diferentes fuentes de carbono (almidón 2%; pectina 2% y xilano 8g/L (xilano de abedul 4.0 g/L; xilano de avena de escanda 4.0 g/L) a las condiciones óptimas determinadas previamente y se obtuvieron extractos crudos por centrifugación de las horas de muestreo, los cuales fueron enfrentados a una solución de la fuente de carbono al 1% p/v en buffer fosfato 0.1M. La mezcla fue incubada durante 30 minutos a 65ºC, posteriormente clarificada por centrifugación y los azucares reductores fueron determinados por la técnica del ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) (Miller., 1959). Una unidad de actividad se definió como la cantidad de enzima requerida para producir una µmol de azúcar reductor por minuto (Kozianowski et al., 1997; Chauhan et al., 2006). Evaluación de crecimiento en diferentes sustratos y determinación de metabolitos producidos por HPLC. Se evaluó el crecimiento de

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Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 en diferentes sustratos. Los sustratos utilizados como fuente de carbono fueron: almidón y pectina a una concentración del 2% p/v; arabinosa, galactosa y glucosa a una concentración de 20 mM y xilano 8 g/L. Se realizó seguimiento al sustrato consumido mediante la cuantificación de azucares reductores por DNS a las diferentes horas de muestreo y se determinaron los metabolitos producidos en la fermentación de las diferentes fuentes de carbono por cromatografía liquida de alta eficiencia (HPLC) en fase reversa utilizando un cromatógrafo Shimadzu Prominence LC-20AT, equipado con un automuestreador (Shimadzu SIL-20), una columna Restek Ultra Aqueous C18 (5 µm x 150 x 4.6 mm) y un detector de arreglo de diodos (Shimadzu SPP-M20A) con H2PO4 0.05% pH 2.5 como fase móvil. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Morfología Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 es un bacilo delgado móvil, se dispone solo, en parejas o cadenas de hasta 5 células. El tamaño de la célula es de 3 a 6 µm de largo x 0.3 a 0.45 µm de ancho. Después de 12 horas de incubación las células se agrupan en cadenas alcanzando una longitud de 25 µm aproximadamente. Este bacilo termófilo anaerobio presenta reacción positiva a la coloración de Gram y forma esporas esféricas terminales (figura 1). Morfológicamente, la cepa USBA 18 es similar a Thermoanaerobacter italicus, aunque difieren en su reacción frente a la coloración de Gram, ya que la cepa USBA 18 es Gram positiva y Thermoanaerobacter italicus Gram negativa (Kozianowski et al., 1997). Las dos cepas forman esporas circulares terminales y las células se disponen solas, en pares o en cadenas (Tabla 4). El tamaño celular entre T. italicus y la cepa USBA 18 es diferente ya que T. italicus mide 2 a 6 µm de largo x 0.4 a 0.75 µm de ancho. Determinación de condiciones óptimas de crecimiento. Se determinaron las condiciones óptimas

de crecimiento de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, teniendo en cuenta temperatura de crecimiento, pH y concentración de NaCl del medio de cultivo. La temperatura óptima de crecimiento para esta cepa se presentó entre 65°C y 70°C, a pH de 7,2 y 1% (p/v) de NaCl en el medio de cultivo. En estas condiciones de cultivo, la bacteria presentó una velocidad específica de crecimiento (µx) de 0.3045 h-1, con un tiempo de duplicación (td) de 2.276 h.

Figura 1. Microfotográfica de contraste de fase de Thermoanaerobacter italicus USBA 18 tomada a las 24 horas de cultivo en medio básico suplementado con glucosa 20 mM. Es importante aclarar que las condiciones óptimas encontradas para la cepa USBA 18 están influenciadas por las características físicas y químicas encontradas en el lugar de su aislamiento (Pozo hotel Lanceros), que presenta una temperatura promedio de 64°C, un pH de 7.2 y una concentración de NaCl de 41 g/l (4.1% p/v) (Alfaro, 2002; Pachon y Posada, 2003). Únicamente, existe una diferencia marcada en la concentración de NaCl encontrada en el lugar de su aislamiento y la reportada como óptima para la cepa USBA 18 en este trabajo. La bibliografía reporta para Thermoanaerobacter italicus usando glucosa como fuente de carbono a 70°C un tiempo de duplicación (td) de 2.1 h con una velocidad específica de crecimiento (µx) de 0.33 h-1 (Kozianowski et al., 1997). La cepa USBA 18 y Thermoanaerobacter italicus se diferencian en su tiempo de duplicación con glucosa como fuente de carbono en 0.16 h. Determinación de Actividades enzimáticas. Se evaluaron las

110

actividades amilolítica, xilanolítica y pectinolítica (65°C x 30 min), enfrentando el extracto enzimático (obtenido por centrifugación) a una solución stock buffer fosfato de la fuente de carbono y se cuantificaron los azúcares reductores producidos en la reacción por DNS. Se determinó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica (410 UA/l), pectinolítica (265 UP/l) y xilanolítica (216 UX/l) cuantitativa (figura 2). La capacidad de degradar estos polímeros de origen vegetal se debe posiblemente a la exposición del microorganismo en su ambiente natural a carbohidratos derivados de algas termófilas y derivados de biomasa bacteriana ó por polisacáridos estructurales vegetales que ocasionalmente caen en estos ambientes por desplazamiento físico (Jain y Zeikus, 1992). Lo cual se ha evidenciado durante los muestreos, ya que el manantial termomineral PP-10 “Pozo Hotel Lanceros” se encuentra resguardado de visitantes y la entrada de materia orgánica exógena es muy baja, ocasionalmente se encuentran en el pozo hojas ó ramas provenientes de la vegetación cercana. La existencia de organismos en este yacimiento es evidente, continuamente se observa la presencia de algas y lodo en la zona circundante al punto de emanación (Pachon y Posada, 2003). Teniendo en cuenta que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica, pectinolítica y xilanolítica cuantitativa, se debe profundizar sobre su actividad y sus enzimas con el fin de determinar utilidades a nivel biotecnológico e industrial debido a que estos tres polímeros de origen vegetal son altamente empleados en la industrial, para la producción de alcoholes, monómeros (azúcares), ácidos orgánicos y una infinidad de productos y finalidades. Crecimiento en diferentes sustratos y determinación de metabolitos producidos por HPLC. Se realizó seguimiento al sustrato consumido

mediante la cuantificación de azúcares reductores por DNS en diferentes tiempos de crecimiento y se determinaron los metabolitos producidos en la fermentación de las diferentes fuentes de carbono por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) en fase reversa. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene la capacidad de fermentar azúcares como glucosa, galactosa y xilosa, sin embargo, la arabinosa no es utilizada como fuente de energía (característica no compartida con Thermoanaerobacter italicus la cual sí presenta crecimiento y degradación de esta pentosa), observando así diferencias a nivel fenotípico con la cepa aislada por Kozianowski y col (1997) (Tabla 4). A su vez, la cepa USBA 18 también es capaz de degradar polímeros complejos como almidón, pectina y xilano (figura 3).

0

50

100

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200

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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130

Tiempo (h)

Uni

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s de

Act

ivid

ad/l

UA/l

UP/l

UX/l

Figura 2. Actividades enzimáticas producidas por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Reacción enzimática a 65°C x 30 min. Es importante resaltar que la figura 3 muestra el consumo de sustrato. En los casos de consumo de almidón y xilano, lo que se observa es un aumento con respecto al tiempo, esto se debe a que al degradarse el polímero aumenta la cantidad de azúcares reductores, mostrando de forma indirecta el consumo de sustrato. La cepa USBA 18 exhibe un metabolismo fermentativo, teniendo mayor afinidad por las hexosas como la glucosa y la galactosa y en una proporción menor por las pentosas como la xilosa; la pentosa arabinosa no es degradada. La degradación de las hexosas y los polímeros de glucosa posiblemente (almidón y pectina) la realiza utilizando la vía clásica de Embden Meyerhof Parmas (EMP) utilizando la fructosa-6-fosfato o la glucosa-6-fosfato como precursores

111

metabólicos (Schönheit, 2008) hasta llegar a formar dos moléculas de piruvato (ácido pirúvico) que puede ser convertido en diferentes productos entre los cuales se incluyen alcohol etilico (etanol), ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, ácido butírico, alcohol bulitico, alcohol isopropilico, ácido propiónico, ácido fórmico y otros componentes (McArthur, 2006). Las pentosas (polímero de xilano) son degradadas por medio de la ruta de las pentosas fosfato, teniendo la molécula de cinco carbonos fosforilada como precursora de la vía, y generando de este modo dos opciones metabólicas para la degradación y la subsiguiente formación de los productos metabólicos; la pentosa fosfato puede ser hidrolizada hasta una triosa fosfato y convertirse en piruvato, o la pentosa puede entrar en la parte regenerativa de la vía, en la cual las pentosas fosfato se convierten en hexosas fosfatos y pasan a ser degradadas en la glicólisis (EMP) (Koolman y Roehm, 2005). La capacidad de degradación de polímeros complejos de origen vegetal que presenta Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, hacen de este microorganismo atractivo para procesos industriales, ya que exhibe los complejos enzimáticos necesarios para la hidrólisis de moléculas complejas hasta glucosa con la formación principalmente de acido láctico y de sustratos más complejos como el almidón, la pectina y el xilano también con una producción mayor de ácido láctico.

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Tiempo (h)

Sus

trato

(g/L

) Galactosa

Arabinosa

Glucosa

Almidon

Xilano

Figura 3. Consumo de sustrato con respecto al tiempo por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18. Los productos finales de la fermentación de Thermoanaerobacter italicus fueron

analizados por cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), los resultados obtenidos se muestran en las tabla 1,2 y 3. Es importante resaltar que el metabolito producido en mayor concentración fue ácido láctico (19.7 mM) utilizando glucosa como fuente de carbono, aunque se generaron otro tipo de productos en el bioproceso como ácido acético (12.8 mM) con almidón como sustrato y ácido fórmico, málico, succínico, propiónico y etanol pero en menores concentraciones (tabla 1). Con respecto a las variaciones realizadas al medio de cultivo, se determinó que la concentración adecuada de extracto de levadura para la producción de ácido láctico se encuentra en el rango comprendido entre 0.5 g/l y 1.0 g/l obteniéndose valores de 19.7 mM y 19.5 mM respectivamente. Si la fuente de nitrógeno orgánico (extracto de levadura) es sustituida por peptona se obtiene que la concentración apropiada para la producción de ácido láctico es de 0.5 g/l proporcionando 20.2 mM de este ácido orgánico y pequeñas trazas de ácido acético (2.1 mM) (tabla 2). El cambio de la fuente de nitrógeno inorgánica (NH4Cl por KNO3) influye notablemente en la producción de los metabolitos evaluados ya que con la adición de KNO3 se produce en menor proporción ácido láctico (7.6 mM) y ácido acético (4.8 mM) con respecto a los valores obtenidos a partir de la fermentación de la glucosa o del almidón. La adición de la solución de vitaminas de Balch por extracto de levadura no suple por completo los requerimientos celulares a nivel de fuente de nitrógeno debido a que se produce en menor proporción los metabolitos analizados (0.3 mM de ácido málico, 10.3 mM de ácido láctico, 6.1 mM de ácido acético, 1.1 mM de acido succínico y 0.8 mM de ácido propiónico) (tabla 3). Lo anterior lleva a concluir que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de los ácidos orgánicos analizados, en especial para la producción de ácido láctico, indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona.

112

Tabla 1. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con diferentes fuentes de carbono a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).



Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético


Ácido Propiónico

Glucosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,4 19,7 11,6 0,0 0,0 2,6 Arabinosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Galactosa(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,9 14,2 9,2 0,8 0,0 2,8 Pectina(20g/l)+YE(0,5g/l) 3,3 0,0 0,6 0,0 1,2 0,5 0,6 Xilano(8g/L)+YE(0,5g/l) 0,0 1,1 4,8 6,0 0,0 0,0 0,0 Almidón(20g/l)+YE(0,5g/l) 0,5 1,5 17,0 12,9 1,9 0,2 1,6

YE, extracto de levadura. Se uso como control de la prueba (MB + YE (0.5 g/l)) y a los valores obtenidos se le restó el control. Thermoanaerobacter italicus produce como metabolitos finales de la fermentación de glucosa, etanol (26.6 mM), lactato (12.4 mM), acetato (2.2 mM), succinato (0.3mM), H2 y CO2 (Kozianowski et al., 1997). A diferencia de T. italicus, la cepa USBA 18 no genera etanol como producto final del metabolismo de la glucosa y produce en mayor proporción lactato y acetato y en menores proporciones ácido fórmico, ácido málico y ácido propiónico (tabla 4). Se observó producción de etanol en muy bajas concentraciones utilizando como fuentes de carbono pectina (0.5 mM de etanol) y almidón (0.2 mM de etanol), generando de esta forma diferencias notables a nivel metabólico y cinético entre Thermoanaerobacter italicus y la cepa USBA 18. Desde el punto de vista biotecnológico es importante resaltar la producción de los metabolitos generados por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, ya que se observó que el producto final de la fermentación que se presentó en mayor concentración fue ácido láctico y ácido acético y la relevancia que se le puede dar a estos productos a nivel industrial. Se ha determinado por bibliografía que Bacillus thermoamylovorans produce 22.2 mM de ácido láctico a partir de glucosa 30 mM a las 72 h de fermentación a 50°C (Combet-Blanc et al., 1995) y que este microorganismo tiene un elevado potencial biotecnológico para la producción de ácido láctico a partir de azúcares y sustratos de origen vegetal (Combet-Blanc et al., 1999).

El acido láctico ha sido usado durante mucho tiempo en la industria del cuero como acidulante; es usado en la terminación de textiles y de la lana; también es usado para aplicaciones menores como en la producción de resinas, impresión litográfica y textil, en adhesivos y en la formulación de detergentes (5 a 10% del consumo total de ácido láctico); además, tiene numerosas aplicaciones farmacéuticas y cosméticas ya que muchas de las formulaciones contienen este ácido orgánico, lactato de sodio y de calcio y acil lactatos. El lactato de calcio es usado para tratar las deficiencias de este mineral, los lactatos son adicionados a muchos productos cosméticos como humectantes, emulsificantes y estabilizantes, a su vez estos han sido promovidos como productos para el cuidado de la piel (mejoran la textura y apariencia de la piel) y el etil lactato es el ingrediente activo en las preparaciones anti acné (Rogers et al., 2006). Del mismo modo, existen aplicaciones importantes a nivel médico para los polilactátidos preparados a partir de dímeros láctidos. Estos polímeros son usados para procedimientos que requieren sutura quirúrgica, placas de hueso, entre otras que generan interés ya que son biocompatibles y biodegradables. El acido láctico también, es usado como una alternativa ecológica para la producción de bioplasticos generando una alternativa amigable con el medio ambiente y se presenta como uno de los productos biotecnológicos más importantes y con mayor potencial (Romaní et al., 2008).

113

Tabla 2. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus USBA 18 con diferentes concentraciones de extracto de levadura y peptona a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).



Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético


Ácido Propiónico

MB+Glu(20mM)+YE(0,25g/l) 0,0 0,0 12,3 1,3 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+YE(0,5g/l) 0,5 0,4 19,7 11,6 0,0 0,0 2,6 MB+Glu(20mM)+YE(1g/l) 0,0 0,0 19,5 0,4 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+YE(2g/l) 0,0 0,0 14,3 0,0 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(0,25g/l) 0,0 0,0 3,8 1,9 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(0,5g/l) 0,0 0,0 20,2 2,1 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)+PEP(1g/l) 0,0 0,0 17,3 0,6 0,0 0,0 0,0

MB, medio básico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; PEP, peptona. Se uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) – fuente orgánica de nitrógeno) y a los valores obtenidos se le restó el control. Tabla 8. Productos metabólicos producidos por Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 con KNO3 como fuente inorgánica de nitrógeno y solución de vitaminas de Balch a las 120 h de fermentación (65ºC; pH 7.2).



Ácido málico

Ácido láctico

Ácido acético


Ácido Propiónico

MB+Glu(20mM)-YE 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 MB+Glu(20mM)-YE+Vit 0,0 0,3 10,3 6,1 1,1 0,0 0,8

MB+Glu(20mM)+YE+KNO3 0,0 0,0 7,6 4,8 0,0 0,0 0,0

MB+Glu(20mM)-YE+KNO3 0,0 0,0 0,0 2,7 0,0 0,0 0,0 MB, medio basico; Glu, glucosa; YE, extracto de levadura; Vit, solucion de vitaminas de Balch. Se uso como control de la prueba (MB + Glu (20mM) y a los valores obtenidos se le restó el control. CONCLUSIONES Se realizó la caracterización cinética y enzimática de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, determinándose que la cepa USBA 18 presenta diferencias a nivel fenotípico con Thermoanaerobacter italicus (Kozianowski et al., 1997). Dentro de las diferencias más importantes encontradas en el marco de este estudio, se resalta la no producción de etanol como producto final de la fermentación por parte de Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18, la formación de ácido láctico como el producto predominante de su metabolismo y la no utilización de arabinosa como fuente de carbono. Todo lo anterior indica que posiblemente la cepa USBA 18 sea una nueva subespecie del género Thermoanaerobacter a su vez, se determinó que la cepa utilizada para realizar el estudio es termófila; ya que crece adecuadamente a temperaturas superiores a 50°C y que no es hipertermófila debido a que a

temperaturas mayores de 75°C su crecimiento se ve afectado. También se concluye que para su crecimiento óptimo es necesario tener un pH del medio cercano a la neutralidad y que su crecimiento no se ve inhibido por la presencia de NaCl, porque presenta crecimiento tanto en ausencia como en presencia de NaCl. . Se concluyó que Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 necesita de una fuente orgánica de nitrógeno para la producción de metabolitos finales, en especial para la producción de ácido láctico, indistintamente si se trata de extracto de levadura o peptona. El cambio de la fuente de nitrógeno inorgánico (NH4Cl por KNO3) influye notablemente en la producción de los metabolitos finales de su fermentación. La adición de solución de vitaminas de Balch por extracto de levadura no suple por completo los requerimientos celulares para la producción de los metabolitos evaluados en este trabajo. Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 presenta actividad amilolítica

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Tabla 4. Principales Características de algunas especies del género Thermoanaerobacter.

Características

Thermoanaerobacter italicus (Kozianowski et al., 1997)

Thermoanaerobacter mathranii (Larsen et al., 1997)

Thermoanaerobacter brockii (Zeikus et al., 1979)

Thermoanaerobacter ethanolicus (Wiegel y Ljungdahl, 1981)

Thermoanaerobacter finnii (Schmid et al., 1986)

Thermoanaerobacter italicus Cepa

USBA 18

esporas + + + - + + Coloración de Gram - Variable + variable variable + Movilidad - + + + + +

Tº óptima de crecimiento 70ºC 70ºC 68ºC 69ºC 65ºC 65ºC a 70°C Fuente de energía Gelatina - n.r. n.r. + n.r. n.d Celulosa - - - - n.r. n.d Galactosa + - n.r. n.r. n.r. + Glucosa + + + + + + Pectina + - - + n.r. + Almidón + n.r. + + n.r. + Xilano + + + + n.r. + Arabinosa + + n.r. n.r. n.r. - Metabolitos finales Etanol + + + + + - Lactato + + + + + + Acetato + + + + + +

Butirato - - - - - - n.r.: No reportado n.d: No determinado

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(409.9 UA/l), pectinolíca (264.9 UP/l) y xilanolítica (215.9 UX/l) cuantitativa. Las tres actividades presentadas por este microorganismo son significativas y se cree que podrían ser potencialmente utilizadas a nivel biotecnológico y en una gran variedad de industrias. Se debe resaltar que la actividad que se presentó en mayor proporción fue la amilolítica ademas, Se estableció Thermoanaerobacter italicus cepa USBA 18 tiene un metabolismo fermentativo y que puede utilizar algunas hexosas y pentosas como fuente energética, del mismo modo se determinó que la bacteria analizada tiene la capacidad de hidrolizar polímeros complejos hasta compuestos más simples de gran valor comercial y biotecnológico, como el ácido láctico, que actualmente genera mucho interés debido a que puede ser convertido en polímeros biodegradables. BIBLIOGRAFÍA Alfaro, C. 2002. Geoquímica del sistema geotérmico de Paipa. Ingeominas. Bogota D.C. Baena, S., Fardeau, M. L., Ollivier, B., Labat, M., Thomas, P., García, J. L., Patel, K. C. 1999. Aminomonas paucivorans gen. Nov., sp. Nov., a mesophilic, anaerobic, amino-acid-utilizing bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 49: 975 – 982. Balch, W., Fox , G., Magrum, R., Wolfe, R. 1979. Methanogens: Re-evaluation of a unique biological group. Microbiol Rev. 43: 260 – 296. Chauhan, S., Choudhury, B., Singh, S., Ghosh, P. 2006. Application of Xylanase enzyme of Bacillus coagulans as a prebleaching agent on non-woody pulps. Process Biochemistry. 41: 226-231. Combet-Blanc, Y., Dieng, M. C., Kergoat, P. Y. 1999. Effect of organic complex compounds on Bacillus thermoamylovorans growth and glucose fermentation. Applied and environmental microbiology. 65: 4582–4585. Combet-Blanc, Y., Kalamba, K. K., Kergoat, P. Y. 1995. Effect of pH on

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