Polimerase Chain Reaction (PCR).ppt
-
Upload
shahran-kumar -
Category
Documents
-
view
72 -
download
1
description
Transcript of Polimerase Chain Reaction (PCR).ppt
Polimerase Chain Reaction (PCR)Polimerase Chain Reaction (PCR)
Tahun 1985, Kary Mullis, CaliforniaTahun 1985, Kary Mullis, CaliforniaMetode untuk meng-amplifikasi (melipat Metode untuk meng-amplifikasi (melipat
gandakan) fragment DNA (Gen) gandakan) fragment DNA (Gen) Dibutuhkan :Dibutuhkan :
DNA atau RNADNA atau RNAOligonucleotidprimer (PRIMER)Oligonucleotidprimer (PRIMER)Enzym Enzym Taq-Taq-PolimerasePolimeraseCampuran dari 4 Basa Nukleotida Campuran dari 4 Basa Nukleotida
(d’NTPs)(d’NTPs)10 x Reactions Buffer10 x Reactions Buffer
Larutan MgClLarutan MgCl22
Alat : Thermal CyclerAlat : Thermal Cycler
Prinsip : perobahan temperatur secara Prinsip : perobahan temperatur secara otomatis dengan waktu yang telah otomatis dengan waktu yang telah ditentukanditentukan
Dapat diatur (Program)Dapat diatur (Program)Contoh : 95 °C------ DenaturasiContoh : 95 °C------ Denaturasi
55 °C------ Hybridisasi 55 °C------ Hybridisasi (Annealing)(Annealing)72 °C------ Synthese DNA 72 °C------ Synthese DNA (Extension) (Extension)
Lama reaksi, bervariasi tergantung panjang Lama reaksi, bervariasi tergantung panjang fragment DNA (2 min. : < 1000 Nukleotida)fragment DNA (2 min. : < 1000 Nukleotida)
DNADNA
DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan)DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan)DNA menjadi “template” atau “matrix” untuk DNA menjadi “template” atau “matrix” untuk
proses amplifikasiproses amplifikasiSense : 5’- ATG(Start) -GGT-TCT-GTT-Sense : 5’- ATG(Start) -GGT-TCT-GTT-
GCT-GCT-TGG-TAA(Stop)- 3’GCT-GCT-TGG-TAA(Stop)- 3’Antisense : 3’ - TAC-CCA-AGA-CAA-CGA-Antisense : 3’ - TAC-CCA-AGA-CAA-CGA-
CGA-ACC-ATT- 5 ‘CGA-ACC-ATT- 5 ‘Exon dan/atau Intron dapat berfungsi Exon dan/atau Intron dapat berfungsi
sebagai Matrix untuk amplifikasisebagai Matrix untuk amplifikasi
RNARNA
Single strand (Uracil pengganti Thymin)Single strand (Uracil pengganti Thymin) Transkripsi dari DNA mRNATranskripsi dari DNA mRNA Mengandung informasi genetik dari Exon Mengandung informasi genetik dari Exon Dengan Enzym Reverse Transkriptase Dengan Enzym Reverse Transkriptase
diperoleh DNA dari RNAdiperoleh DNA dari RNA cDNAcDNA Reaksi PCR nya disebut RT-PCRReaksi PCR nya disebut RT-PCR
Taq-PolimeraseTaq-Polimerase
Klenow - DNA Polymerase dari E.ColiKlenow - DNA Polymerase dari E.Coli1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri 1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri
Thermus aquaticusThermus aquaticusHybridisasi dan Polimerisasi berlangsung Hybridisasi dan Polimerisasi berlangsung
pada temp. 50-70 °C pada temp. 50-70 °C Perhatikan : Buffer yang digunakan Perhatikan : Buffer yang digunakan
(10 x RB) dan diperlukan MgCl(10 x RB) dan diperlukan MgCl2 2
PrimerPrimer
Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron atau Exon) : 20 – 30 bpatau Exon) : 20 – 30 bp
Prinsip : merupakan complementare dari Prinsip : merupakan complementare dari kedua strand DNA (Forward Primer dan kedua strand DNA (Forward Primer dan Reverse Primer).Reverse Primer).
Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang baru dan seterusnya berfungsi sebagai baru dan seterusnya berfungsi sebagai matrix untuk siklus berikutnya.matrix untuk siklus berikutnya.
Penentu bagi fragment DNA yang akan Penentu bagi fragment DNA yang akan diamplifikasi diamplifikasi
PCR Product (Amplifikat)PCR Product (Amplifikat)
Gel-elektrophorese (Agarose) Gel-elektrophorese (Agarose) Southern Blot (Hybridisasi dengan Southern Blot (Hybridisasi dengan
Sonde DNA spesifik)Sonde DNA spesifik)Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie
Luminescense = ECL)Luminescense = ECL)Denaturating Gradient Gel Denaturating Gradient Gel
Electrophorese (DGGE) atau Pulse Electrophorese (DGGE) atau Pulse Field Gel Electrophorese (PFGE) Field Gel Electrophorese (PFGE)
Enzym Restriksi : Restriction Enzym Restriksi : Restriction EndonucleaseEndonuclease
Sequence analysis (DNA Sequencing)Sequence analysis (DNA Sequencing)
Aplikasi teknologi DNAAplikasi teknologi DNA
INFEKSI SALURAN CERNA :Membedakan jenis : pathogen – non
pathogen (Eschericia coli)Untuk bakteri yang sulit dikultur oleh
karena memerlukan syarat tertentu (Campylobacter)
Membedakan jenis bakteri dari toxin yang diproduksinya (E. coli dan Shigela sp.)
Subklas bakteri : Campylobacter, Helicobacter
Mengidentifikasi jenis Rotavirus (A, B, C)
Aplikasi teknologi DNAAplikasi teknologi DNA
Mycobacterium tuberculosis :Membedakan jenis atypic, dengan
mikroskop hal ini tidak mungkinKultur : waktu yang lama dan bakteri harus
banyak (terutama untuk sensitivity test)Diagnose cepat dibutuhkan, mis. pada
penderita AIDS.Ditemui jenis yang multi drug resistant
(MDR)Diagnosa dengan PCR dan Hybridisasi
(contoh : dot-blot)
Produk dari gen untuk therapy dan prophylaxis :
ErythropoietinInsulinHormon pertumbuhanFaktor pembekuan darah VIIIPlasminogen aktivatorVaksin Hepatitis B
Penerapan Teknologi Gen/DNA dalam Therapy
Aplikasi gen dalam Forensik• Sebelum teknologi DNA diterapkan (1978)
biasanya digunakan protein, misalnya antigen gol.darah, HLA, dll.
• 1985 : DNA Polymorphismus.
• Nov.1987 : DNA sebagai barang bukti di pengadilan di Inggris.
• Sampai akhir 80-an : lebih dari 1000 perkara dibantu oleh bukti-bukti DNA
• Juga dapat menentukan Paternity
• Profil DNA tiap individu berbeda