8/22/2019 Plant Physiol. 1988 Mohabir 1222 8

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P l a n t P h y s i o l . ( 1 9 8 8 ) 8 8 , 1 2 2 2 - 1 2 2 80 0 3 2 - 0 8 8 9 / 8 8 / 8 8 / 1 2 2 2 / 0 7 / $ 0 1 . 0 0 / 0

E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n S t a r c h S y n t h e s i s i n P o t a t o T u b e rT i s s u e a n d i n A m y l o p l a s t s

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n F e b r u a r y 1 8 , 1 9 8 8 a n d i n r e v i s e d f o r m J u l y 2 5 , 1 9 8 8GANGARAM M O H A B I R ' A ND P H I L I P J O H N *D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r a l B o t a n y , S c h o o l o f P l a n t S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f R e a d i n g ,R e a d i n g RG6 2 A S , U n i t e d K i n g d o m

ABSTRACTA s h a r p t e m p e r a t u r e o p t i m u m i s o b s e r v e d a t 2 1 . 5 C w h e n t h e i n c o r -p o r a t i o n o f [ " 4 C l s u c r o s e i n t o s t a r c h i s m e a s u r e d w i t h d i s c s c u t f r o md e v e l o p i n g t u b e r s o f p o t a t o ( S o l a n u m t u b e r o s u m L . c v D e s i r e e ) . B yc o n t r a s t , i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s o v e r t h e r a n g e 9 t o 3 1 C o n l y e n h a n c er e l e a s e o f ' 4 C t o r e s p i r a t o r y C O 2 a n d i n c o r p o r a t i o n o f ' 4 C i n t o t h e e t h a n o l -

s o l u b l e f r a c t i o n . B y c o m p a r i s o n , s t a r c h s y n t h e s i s i n d i s c s f r o m d e v e l o p i n gc o r m s o f c o c o y a m ( C o l o c a s i a e s c u l e n t a L . S c h o t t ) i s i n c r e a s e d b y r a i s i n gt h e t e m p e r a t u r e f r o m 1 5 t o 3 5 C . T h e s i g n i f i c a n c e o f a r e l a t i v e l y l o wt e m p e r a t u r e o p t i m u m f o r s t a r c h s y n t h e s i s i n p o t a t o i s d i s c u s s e d i nr e l a t i o n t o t h e y i e l d l i m i t a t i o n s i m p o s e d b y c o n t i n u o u s l y h i g h s o i l t e m -p e r a t u r e s . A m y l o p l a s t s i s o l a t e d f r o m p r o t o p l a s t s p r e p a r e d f r o m d e v e l -o p i n g p o t a t o t u b e r s c o n t a i n a c t i v i t i e s o f a l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e , NAD-d e p e n d e n t g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e , f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s -p h o s p h a t a s e , a n d p h o s p h o g l u c o m u t a s e i n a d d i t i o n t o A D P - g l u c o s e - p y -r o p h o s p h o r y l a s e , s t a r c h p h o s p h o r y l a s e a n d s t a r c h s y n t h a s e . C e l l - f r e ea m y l o p l a s t s r e l e a s e d b y t h i n l y s l i c i n g d e v e l o p i n g p o t a t o t u b e r s s y n t h e s i z es t a r c h f r o m I ' 4 C l t r i o s e - p h o s p h a t e g e n e r a t e d f r o m [ ' 4 C j f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s -p h o s p h a t e i n t h e r e a c t i o n m e d i u m . T h i s s t a r c h s y n t h e s i s i s i n h i b i t e d b ya d d i t i o n o f 1 0 m i l l i m o l a r i n o r g a n i c p h o s p h a t e a n d r e q u i r e s a m y l o p l a s ti n t e g r i t y , s u g g e s t i n g t h e o p e r a t i o n o f a t r i o s e - p h o s p h a t e / i n o r g a n i c p h o s -p h a t e e x c h a n g e c a r r i e r a t t h e a m y l o p l a s t m e m b r a n e . T h e t e m p e r a t u r eo p t i m u m a t 2 1 . 5 C o b s e r v e d w i t h t i s s u e d i s c s i s n o t o b s e r v e d w i t ha m y l o p l a s t s .

T h e y i e l d o f p o t a t o e s i n t h e warm t r o p i c s i s l i m i t e d b y t h ec o n t i n u o u s l y h i g h s o i l t e m p e r a t u r e s ( 1 ) . G r o w t h o f t h e p o t a t ot u b e r i s c l o s e l y l i n k e d t o s t a r c h s y n t h e s i s , a n d p h y s i o l o g i c a ls t u d i e s w i t h w h o l e t u b e r s s t i l l a t t a c h e d t o t h e p a r e n t p l a n t h a v ei n d i c a t e d t h a t h i g h e r t e m p e r a t u r e s c o u l d r e d u c e y i e l d s b y i n h i b -i t i n g s t a r c h s y n t h e s i s i n t h e t u b e r ( 1 7 , 2 4 , 2 8 , 3 3 ) . H o w e v e r ,i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s o f t h e s e s t u d i e s h a s b e e n c o m p l i c a t e db y t h e p o s s i b l e i n f l u e n c e o f a t e m p e r a t u r e - d e p e n d e n t r e d i s t r i -b u t i o n o f p l a n t g r o w t h r e g u l a t o r s , e s p e c i a l l y g i b b e r e l l i n ( 1 7 , 2 8 ) ,a n d t h e s e n s i t i v i t y o f s t a r c h s y n t h e s i s p e r s e t o h i g h e r t e m p e r a -t u r e s h a s r e m a i n e d u n k n o w n . T h u s , t h e p r e s e n t w o r k w a s c a r r i e do u t t o d e t e r m i n e t h e t e m p e r a t u r e o p t i m u m f o r s t a r c h s y n t h e s i si n e x c i s e d p o t a t o t u b e r t i s s u e s u p p l i e d w i t h s u c r o s e a n d i n c e l l -f r e e a m y l o p l a s t s s u p p l i e d w i t h t r i o s e - P .

MATERIALS AND METHODSP l a n t M a t e r i a l . D e v e l o p i n g p o t a t o ( S o l a n u m t u b e r o s u m L . )t u b e r s ( w e i g h i n g 2 0 - 3 0 g ) o f t h e m a i n c r o p c u l t i v a r , D e s i r e e ,' R e c i p i e n t o f a C o m m o n w e a l t h A c a d e m i c S t a f f S c h o l a r s h i p .

w e r e t a k e n f r o m p l a n t s g r o w n i n R e a d i n g , e i t h e r i n t h e o p e ng r o u n d d u r i n g t h e s u m m e r o r i n a g l a s s h o u s e w i t h s u p p l e m e n -t a r y h e a t i n g ( 1 5 - 2 0 C ) a n d l i g h t i n g ( 1 3 h d a y l e n g t h ) d u r i n gw i n t e r . D e v e l o p i n g c o r m s o f c o c o y a m ( C o l o c a s i a e s c u l e n t a L .S c h o t t ) w e r e t a k e n f r o m p l a n t s g r o w n u n d e r n a t u r a l l i g h t i n g i na h e a t e d g l a s s h o u s e . T u b e r s a n d c o r m s w e r e w a s h e d , s u r f a c es t e r i l i z e d , a n d p e e l e d b e f o r e u s e . I n t h e g l a s s h o u s e s , p l a n t s w e r eg r o w n i n p o t t i n g c o m p o s t c o n t a i n e d i n I 0 - L p o l y t h e n e t u b s a n dw a t e r e d d a i l y .P r e p a r a t i o n o f D i s c s a n d M e a s u r e m e n t o f S u c r o s e U p t a k e i n t oD i f f e r e n t F r a c t i o n s . P o t a t o t u b e r s o r c o c o y a m c o r m s w e r e s l i c e dt o 1 mm t h i c k n e s s , a n d d i s c s 4 mm i n d i a m e t e r w e r e c u t f r o mt h e s e s l i c e s u n d e r a medium c o n t a i n i n g 5 mM DTT a n d 3 3 mMP E G - 4 0 0 0 . T h e d i s c s w e r e w a s h e d t w i c e i n f r e s h m e d i u m b e f o r e1 4 d i s c s ( c o n t a i n i n g a b o u t 1 0 mg s t a r c h ) w e r e a d d e d t o e a c h 1 0 -mL v i a l . T h e i n c u b a t i o n m e d i u m ( 0 . 5 mL p e r v i a l ) c o n t a i n e d 5m M D T T , 3 3 mm P E G - 4 0 0 0 , 2 5 m M b i s - t r i s - H C l ( b i s [ 2 - h y d r o x -y e t h y l ] i m i n o t r i s [ h y d r o x y m e t h y l ] m e t h a n e ) ( p H 6 . 5 ) , 2 5 m M K C l ,a n d 1 5 0 mm [ U - ' 4 C ] s u c r o s e ( s p e c i f i c a c t i v i t y 1 4 8 B q / f m o l ) . T h ev i a l s w e r e s e a l e d w i t h s u b a s e a l c a p s . When t h e 1 4 C 0 2 r e l e a s e d b yr e s p i r a t i o n w a s m e a s u r e d , t h e s u b a s e a l c a p s w e r e f i t t e d w i t hp a p e r f i l t e r s ( s u p p l i e d b y G i l s o n f o r t h e i r 5 mL a u t o m a t i c p i -p e t t e s ) w h i c h c o n t a i n e d 2 0 0 , A L o f 3% ( w / v ) KOH. When t h et e m p e r a t u r e w a s v a r i e d , t h e v i a l s w e r e p l a c e d o n a c o p p e r t e m -p e r a t u r e - g r a d i e n t b a r , o n e e n d o f w h i c h w a s h e a t e d t o 7 0 C a n dt h e o t h e r c o o l e d t o O C . C l e a r p l a s t i c s e p a r a t e d t h e b a r i n t o an u m b e r o f z o n e s , t h e t e m p e r a t u r e s o f w h i c h w e r e m o n i t o r e dc o n t i n u o u s l y . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 7 h , i n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C i n t ot h e a p p a r e n t f r e e s p a c e ( a p o p l a s t ) , C 0 2 , t h e e t h a n o l - s o l u b l ef r a c t i o n a n d s t a r c h w a s m e a s u r e d b y m o d i f i c a t i o n s o f p r o c e d u r e sd e s c r i b e d b y B h u l l a r a n d J e n n e r ( 2 ) a s f o l l o w s :A f t e r i n c u b a t i o n t h e s u s p e n s i o n m e d i u m w a s t r a n s f e r r e d t oc l e a n v i a l s w h i c h w e r e c a p p e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e s u b a s e a l a n dK O H - c o n t a i n i n g f i l t e r . T h e s e v i a l s w e r e i n c u b a t e d a t 8 0 C , w i t hs h a k i n g , f o r 1 0 m i n a f t e r a n a d d i t i o n o f 5 0 , A L o f 0 . 1 N H C I v i aa s y r i n g e h a d b e e n m a d e t o r e l e a s e d i s s o l v e d 1 4 C O 2 . T h e v i a l sw e r e c o o l e d a n d t h e f i l t e r s a d d e d d i r e c t l y t o s c i n t i l l a t i o n v i a l s f o rc o u n t i n g . T h e d i s c s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h 5 mL p o r t i o n s o fi c e - c o l d w a t e r f o r 3 0 s t o r e m o v e a d h e r i n g s u c r o s e . T h e 1 4 C o ft h e a p p a r e n t f r e e s p a c e w a s c o l l e c t e d b y s h a k i n g t h e d i s c s t w i c ei n s u c c e s s i v e 5 mL p o r t i o n s o f i c e - c o l d w a t e r f o r 3 0 m i n e a c ht i m e . One mL a l i q u o t s o f t h e p o o l e d w a s h e s w e r e t a k e n f o rc o u n t i n g .D i s c s t h en w e r e r i n s e d w i t h t h r e e s u c c e s s i v e 5 mL p o r t i o n s o fi c e - c o l d w a t e r b e f o r e b e i n g t r a n s f e r r e d t o 1 mL p o r t i o n s o f 8 0 %( v / v ) e t h a n o l m a i n t a i n e d a t 8 0 C . A f t e r 2 0 m i n t h e e t h a n o l w a sr e m o v e d a n d t h e e x t r a c t i o n p r o c e s s w a s r e p e a t e d t w i c e . T h ee x t r a c t s w e r e p o o l e d a n d t h e 1 4 C c o n t e n t o f t h e e t h a n o l - s o l u b l ef r a c t i o n c o u n t e d . F o l l o w i n g e t h a n o l e x t r a c t i o n , t h e d i s c s w e r ea u t o c l a v e d w i t h 2 mL o f w a t e r f o r 2 h a t 1 2 1C t o g e l a t i n i z e t h es t a r c h . When c o o l , t h e s t a r c h w a s e x t r a c t e d w i t h p e r c h l o r i c a c i d ,

1 2 2 2

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TEMPERATURE RESPONSE OF STARCH S Y N T H E S I S I N POTATOp r e c i p i t a t e d w i t h i o d i n e , a n d r e p r e c i p i t a t e d , a l l e s s e n t i a l l y a sd e s c r i b e d b y B h u l l a r a n d J e n n e r ( 2 ) . T h e s t a r c h t h e n w a s h y d r o -l y z e d i n 0 . 5 m L o f 1 N H C l a t 1 0 0 C f o r 3 0 m i n , n e u t r a l i z e dw i t h 1 N NaOH, a n d m a d e u p t o 2 m L w i t h H20 b e f o r e a d d i n gt o t h e s c i n t i l l a t i o n v i a l f o r c o u n t i n g . T h e t o t a l s t a r c h c o n t e n t o ft h e p e r c h l o r i c a c i d e x t r a c t o f a s a m p l e o f d i s c s w a s d e t e r m i n e du s i n g t h e a n t h r o n e r e a g e n t ( 4 ) . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d o n a m gt o t a l s t a r c h b a s i s , w h i c h i s c o n v e r t i b l e t o g f r e s h w e i g h t a s s u m i n g1 8 % o f p o t a t o t u b e r f r e s h w e i g h t i s s t a r c h ( 1 4 ) .P r e p a r a t i o n o f A m y l o p l a s t s f r o m P r o t o p l a s t s . T w o - m m - t h i c ks l i c e s o f p o t a t o t u b e r w e r e r i n s e d f o r 5 m i n u n d e r r u n n i n g w a t e r ,a n d t h e n p l a s m o l y s e d i n 1 0 0 m L o f 0 . 6 M s o r b i t o l s h a k e n g e n t l ya t 5 C f o r 1 h . P l a s m o l y s e d t i s s u e w a s t h e n a d d e d t o a s t e r i l eP e t r i d i s h o f 9 cm d i a m e t e r , t h e b o t t o m o f w h i c h w a s c o v e r edw i t h a 5 mm t h i c k l a y e r o f 1 % ( v / v ) a g a r c o n t a i n i n g 5% ( w / v )i n s o l u b l e PVP ( P o l y c l a r A T ) . T h e d i g e s t i o n m e d i u m ( 2 5 mL p e rP e t r i d i s h ) c o n t a i n e d 0 . 4 5 M s o r b i t o l , 1 0 mM C a C l 2 , 1 0 m M K C I ,1 0 0 u n i t s / m L p e n i c i l l i n , 5 0 g g / m L s t r e p t o m y c i n , 1 % ( w / v )c e l l u l a s e ( O n o z u k a R - 1 0 ) , 0 . 1 % ( w / v ) p e c t o l y a s e Y - 2 3 ( R . W .U n w i n & C o . L t d . H e r t f o r d s h i r e , U . K . ) a n d 2 5 mM Mes-NaOH( p H 5 . 5 ) . I n c u b a t i o n a n d s u b s e q u e n t m a n i p u l a t i o n o f t h e p r o -t o p l a s t s w a s c a r r i e d o u t i n d a r k n e s s o r w i t h a g r e e n s a f e l i g h t a sn o r m a l l i g h t a p p e a r e d t o r e d u c e p r o t o p l a s t s t a b i l i t y . F o l l o w i n g1 2 h i n c u b a t i o n a t 2 5 C w i t h g e n t l e s h a k i n g o n a n o r b i t a l s h a k e r ,t h e d i g e s t e d m a t e r i a l w a s f i l t e r e d c o n s e c u t i v e l y t h r o u g h n y l o ns i e v e s o f 3 0 0 a n d 1 8 0 , u m m e s h , a n d t h e p r o t o p l a s t s a l l o w e d t os e t t l e f o r 5 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s p i p e t t e d t o w a s t e a n d t h ep r o t o p l a s t s r e s u s p e n d e d i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 4 5 M s o r b i t o l ,1 0 mm C a C l 2 , 1 0 mM K C I , 2 m M d i s o d i u m E D T A , a n d 5 0 mMT r i s C l ( p H 8 . 0 ) . P r o t o p l a s t s w e r e a l l o w e d t o s e t t l e , a n d a f t e r 5m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e s u p e r n a t a n t w a s a g a i n d i s c a r d e d .T h e w a s h e d p r o t o p l a s t s w e r e r e s u s p e n d e d i n a m i n i m a l v o l u m eo f r e s u s p e n s i o n m e d i u m d e s c r i b e d a b o v e a n d a d d e d t o a t e s tt u b e c o n t a i n i n g 5 m L o f r e s u s p e n s i o n m e d i u m t o w h i c h 2 0 %( w / v ) N y c o d e n z ( N y e g a a r d & C o . , O s l o , N o r w a y ) , 1 mg/mLB S A , a n d 5 mm DTT h a d b e e n a d d e d . T h e f i n a l s o r b i t o l c o n c e n -t r a t i o n w a s r e d u c e d t o 0 . 1 6 M t o a l l o w f o r t h e o s m o t i c e f f e c t o fN y c o d e n z . A f t e r 3 0 m i n a t 4 C , t h e p r o t o p l a s t s r e m a i n e d s u s -p e n d e d i n t h e 2 0 % N y c o d e n z , b u t t h e l a r g e s t a r c h g r a i n s h a ds e t t l e d t o t h e b o t t o m . L e s s d e n s e c o n t a m i n a n t s r e m a i n e d a b o v et h e N y c o d e n z a n d w e r e p i p e t t e d t o w a s t e . F o u r m L o f t h ep r o t o p l a s t s u s p e n s i o n w a s r e m o v e d a n d d i l u t e d w i t h 5 m L o fr e s u s p e n s i o n m e d i u m t o g i v e a p r o t o p l a s t c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t1 0 6 p r o t o p l a s t s / m L .T h e p u r i f i e d p r o t o p l a s t s w e r e l y s e d b y d r a w i n g t h e s u s p e n s i o nt h r o u g h a 6 4 u m n y l o n m e s h s e c u r e d a t t h e e n d o f a s y r i n g e ,a n d t h e l y s a t e m i x e d i m m e d i a t e l y w i t h 1 m L o f i n s o l u b l e PVPt h a t h a d b ee n p r e e q u i l i b r a t e d o v e r n i g h t w i t h w a t e r . T h e l y s a t et h e n w a s a d d e d t o a l a y e r o f r e s u s p e n s i o n m e d i u m d e s c r i b e da b o v e c o n t a i n i n g 2 0 % N y c o d e n z a n d w a s a l l o w e d t o s e t t l e f o r3 0 m i n a t 4 C . T h e t o p l a y e r w a s p i p e t t e d o f f a n d t e r m e d t h ee x t r a a m y l o p l a s t f r a c t i o n , a n d t h e b o t t o m l a y e r was t e r m e d t h ea m y l o p l a s t f r a c t i o n . F o r a n a l y s i s o f m a r k e r e n z y m e s a l l f r a c t i o n sw e r e t r e a t e d w i t h 0 . 1 % ( w / v ) T r i t o n X - 1 0 0 a n d p a s s e d t h r o u g h5 m L c o l u m n s o f p r e e q u i L i b r a t e d S e p h a d e z G - 2 5 .P r e p a r a t i o n o f C e l l - F r e e A m y l o p l a s t s . A l l o p e r a t i o n s w e r ec a r r i e d o u t a t 0 t o 4 C . T h e p o t a t o t u b e r s w e r e s l i c e d i n t o a 9cm d i a m e t e r P e t r i d i s h e q u i p p e d w i t h a p l a s t i c c o v e r i n t o w h i c ha s t a i n l e s s s t e e l r a z o r b l a d e w a s s e t a t a n a n g l e , s o t h a t s l i c e sa b o u t 1 mm t h i c k p a s s e d i m m e d i a t e l y i n t o 2 5 mL o f c o l l e c t i o nm e d i u m i n t h e d i s h ( 8 ) . T h e b o t t o m o f t h e P e t r i d i s h was l i n e dw i t h a 5 mm t h i c k l a y e r o f 1 % ( w / v ) a g a r c o n t a i n i n g 5% ( w / v )i n s o l u b l e P V P . T h e c o l l e c t i o n m e d i u m c o n t a i n e d 0 . 3 3 M s o r b i t o l ,2 . 5 m M M g C l 2 , 2 . 5 mm M n C l 2 , 5 mm d i s o d i u m E D T A , 2 m g /mL B S A , 5 mm D T T , 5 mm K C I , 5 mm N a C l , 0 . 1 mM K H 2 P O 4 ,a n d 1 0 0 mm g l y c y l g l y c i n e ( p H 7 . 8 ) . T h e s l i c e s w e r e r e m o v e d ,a n d t h e s u s p e n s i o n w a s a l l o w e d t o s t a n d f o r 5 m i n . T h e u p p e r

l a y e r s o f a b o ut 2 5 m L w e r e p i p e t t e d o f f a n d a l l o w e d t o s t a n d f o r1 h i n a 5 0 m L g l a s s t u b e o f 2 3 mm i n t e r n a l d i a m e t e r . T h e c l e a rt o p h a l f w a s c a r e f u l l y r e m o v e d a n d 1 0 m L o f t h e r e m a i n d e r( e x c l u d i n g a n y o f t h e g r a n u l e s a t t h e b o t t o m o f t h e t u b e ) w a sr e t a i n e d a n d t e r m e d t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s u s p e n s i o n .E n z y m e A s s a y s . T h e v o l u m e o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e f o r e a c ha s s a y w a s 1 mL u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . G i v e n b e l o w a r e i n c u -b a t i o n t e m p e r a t u r e s a n d a n y f e a t u r e s o f t h e p r o c e d u r e a n d t h er e a c t i o n m i x t u r e s t h a t d i f f e r e d e s s e n t i a l l y f r o m t h o s e i n t h er e f e r e n c e s c i t e d :A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( 1 9 ) , 2 0 C ; n i t r i t e r e d u c t a s e ( 1 3 ) , 3 0 C ;p h o s p h o g l u c o m u t a s e ( 1 9 ) , 2 0 C , 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o -g e n a s e o m i t t e d ; s t a r c h p h o s p h o r y l a s e ( 2 5 ) , 3 0 C ; A D P - G l c p y -r o p h o s p h o r y l a s e a n d U D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e ( 3 1 ) , 3 0 C ,a s s a y e d n o n r a d i o a c t i v e l y , g l u c o s e - 1 - P p r o d u c e d w a s a s s a y e d u s -i n g a c o u p l e d e n z y m e s y s t e m a f t e r s t o p p i n g t h e r e a c t i o n a s i nL e v i a n d P r e i s s ( 1 8 ) ; f r u c t o s e - 1 , 6 - b i p h o s p h a t a s e ( p r o c e d u r e A o fR e f . 3 0 ) , 2 0 C ; N A D - d e p e n d e n t g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e d e -h y d r o g e n a s e ( 1 1 ) , 2 0 C , 5 , m o l DTT r e p l a c e d c y s t e i n e a n dg l u t a t h i o n e ; s o l u b l e s t a r c h s y n t h a s e ( 1 0 ) 3 0 C , 1 0 0 mm g l y c y l g l y -c i n e a s b u f f e r , DTT r e p l a c e d GSH a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o fA D P - G l c i n c r e a s e d t o 2 m M , A DP p r o d u c e d w a s a s s a y e d e n z y -m a t i c a l l y ( 2 6 ) ; s u c r o s e s y n t h a s e a n d i n v e r t a s e ( 3 2 ) 3 0 C , 5 m MDTT r e p l a c e d m e r c a p t o e t h a n o l ; a l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e ( 9 ) ,3 0 0 C .T h e l i n e a r i t y o f t h e a s s a y s w i t h r e s p e c t t o t i m e a n d e x t r a c tc o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d u s i n g a c r u d e e x t r a c t p r e p a r e d a t4 0 C a s f o l l o w s : A p e e l e d p o t a t o t u b e r w a s h o m o g e n i z e d i n am e d i u m ( 0 . 5 mL p e r g f r e s h w e i g h t t u b e r ) c o n t a i n i n g 5 m MD T T , 1 mg/mL B S A , 0 . 1 g / m L i n s o l u b l e PVP ( P o l y c l a r A T ) ,a n d 0 . 5 M T r i s - C l ( p H 7 . 5 ) . T h e s u p e r n a t a n t a f t e r c e n t r i f u g a t i o na t 5 0 O O g f o r 3 0 m i n w a s p a s s e d t h r o u g h a 5 mL c o l u m n o fS e p h a d e x G - 2 5 e q u i l i b r a t e d w i t h h o m o g e n i z a t i o n m e d i u m f r o mw h i c h t h e i n s o l u b l e PVP h a d b e e n o m i t t e d .S t a r c h S y n t h e s i s b y C e l l - F r e e A m y l o p l a s t s . T h e r e a c t i o n c o n -d i t i o n s w e r e b a s e d o n t h o s e p r e v i o u s l y u s e d ( 1 2 ) t o d e m o n s t r a t es t a r c h s y n t h e s i s i n c h l o r o p l a s t s f r o m e x o g e n o u s t r i o s e - P . To 0 . 2mL o f a c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s u s p e n s i o n ( 0 . 0 2 - 0 . 0 4 m g s t a r c h ,d e t e r m i n e d a s i n R e f . 4 ) w e r e a d d e d , i n 5 0 , u L , 0 . 7 5 u n i t f r u c t o s e -1 , 6 - b i s p h o s p h a t e a l d o l a s e , 2 5 u n i t s t r i o s e - P i s o m e r a s e ( b o t h e n -z y m e s d e s a l t e d b y p a s s a g e t h r o u g h S e p h a d e x G - 2 5 ) , 0 . 2 5 M m o lo x a l o a c e t a t e , 0 . 2 5 n m o l f r u c t o s e - 2 , 6 - b i s p h o s p h a t e , 2 5 n m o lp h o s p h o g l y c e r i c a c i d a n d , 1 6 A m o l s o r b i t o l . T h e o x a l o a c e t a t ew a s a d d e d t o h e l p o x i d i z e r e d u c e d p y r i d i n e n u c l e o t i d e t h a t w o u l db e g e n e r a t e d i f t h e ATP r e q u i r e d f o r A D P - G l c s y n t h e s i s wasc o u p l e d t o t h e o x i d a t i o n o f g l y c e r a l d e h y d e - 3 - P t o p h o s p h o g l y -c e r i c a c i d . R e a c t i o n w a s s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f 1 . 5 mM [ U -' 4 C ] f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s P ( 1 2 . 2 k B q / A m o l ) , i n c u b a t i o n was c o n t i n -u e d f o r 9 0 m i n w i t h u n i f o r m s h a k i n g ( 1 0 s t r o k e s / m i n ( j u s ts u f f i c i e n t t o p r e v e n t p a r t i c u l a t e m a t e r i a l s e t t l i n g i n t h e r e a c t i o nv e s s e l s , a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 2 5 mL o fi c e - c o l d 2 N H C l . C o m m e r c i a l p o t a t o s t a r c h ( 1 0 m g ) was a d d e dt o a s s i s t t h e p r e c i p i t a t i o n o f t h e l a b e l e d s t a r c h . T h e p r e c i p i t a t e ds t a r c h w a s w a s h e d b y r e s u s p e n s i o n i n 1 . 0 mL o f 1 N H C I a n dc e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 , 0 0 0 g f o r 3 0 s ) r e p e a t e d t w i c e . F i n a l l y , t h ep e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 0 . 5 mL o f 2 N H C l a n d h e a t e d a t 1 0 0 Cf o r 3 0 m i n . T h e s o l u t i o n o f h y d r o l y z e d s t a r c h was t h e n t r a n s -f e r r e d t o s c i n t i l l a t i o n v i a l s f o l l o w e d b y t wo s u c c e s s i v e r i n s e s w i t h0 . 7 5 mL o f 0 . 5 N NaOH.When A D P - G l c w a s t h e s u b s t r a t e , 5 0 u L , c o n t a i n i n g 0 . 2 5g m o l A D P - [ U - ' 4 C ] G l c ( 4 . 6 2 5 K B q / g m o l ) , 6 . 3 , m o l p o t a s s i u ma c e t a t e , a n d 1 6 , m o l s o r b i t o l , w e r e a d d e d t o 2 0 0 , L o f t h e c e l l -f r e e a m y l o p l a s t s u s p e n s i o n ( 0 . 0 2 - 0 . 0 4 mg s t a r c h ) , a n d s t a r c hs y n t h e s i s w a s d e t e r m i n e d a s a b o v e .C o u n t i n g o f R a d i o a c t i v i t y . S a m p l e s w e r e made u p t o 2 m L ,a n d w h e r e n e c e s s a r y made a l k a l i n e w i t h N a O H b e f o r e a d d i t i o no f 1 0 mL o f s c i n t i l l a n t ( E c o s c i n t , N a t i o n a l D i a g n o s t i c s , A y l e s -b u r y , U . K . ) . Q u e n c h c u r v e s w e r e c o n s t r u c t e d a n d a l l s a m p l e s

1 2 2 3

8/22/2019 Plant Physiol. 1988 Mohabir 1222 8

3/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 8 , 1 9 8 8w e r e l e f t i n t h e d a r k f o r 2 4 h p r i o r t o c o u n t i n g t o a l l o w c h e m i -l u m i n e s c e n c e t o d e c a y .

RESULTSS y n t h e s i s o f S t a r c h b y T i s s u e D i s c s . T h e d i s c s c u t f r o md e v e l o p i n g p o t a t o t u b e r s i n c o r p o r a t e d " 1 C f r o m s u c r o s e i n t o a ne t h a n o l - s o l u b l e f r a c t i o n a n d i n t o s t a r c h a t c o n s t a n t r a t e s f o r 7 h ,w i t h a n i n i t i a l l a g p e r i o d o f n e a r l y 1 h i n t h e c a s e o f s t a r c h ( F i g .1 ) . B y c o n t r a s t , w h e n d i s c s f r o m d o r m a n t t u b e r s w e r e u s e d a s ac o n t r o l t i s s u e ( F i g . 1 ) , i n c o r p o r a t i o n o f ' 4 C i n t o t h e e t h a n o l -s o l u b l e f r a c t i o n d i d n o t c o n t i n u e a f t e r t h e f i r s t h o u r , a n d i n c o r -p o r a t i o n i n t o s t a r c h p r o c e e d e d a t a r a t e a b o u t 5 % o f t h a t o b -s e r v e d w i t h d i s c s c u t f r o m d e v e l o p i n g t u b e r s . T h e r e l a t i v e l y s l o wi n c o r p o r a t i o n o f l a b e l i n t o s t a r c h b y t h e d i s c s f r o m d o r m a n tt u b e r s may b e a t t r i b u t a b l e t o a s l o w t u r n o v e r o f s t a r c h t h a t c a no c c u r i n m a t u r e t u b e r s ( 1 4 ) . A t 2 1 C t h e r a t e o f s u c r o s e i n c o r -p o r a t i o n i n t o s t a r c h b y d i s c s f r o m d e v e l o p i n g t u b e r s i s e q u i v a l e n tt o a d a i l y g r o w t h r a t e o f 0 . 0 1 4 g f r e s h w e i g h t / g t u b e r f r e s h w e i g h t .

1 0( a )8- c

o 0 6

cU(b

u

U o 4

-6E 2(0

0 4 0Ec(bc 3 00

a200UCQ 1 0

0 0 2 4 6 8TIME ( h )F I G . 1 . T i m e - c o u r s e o f i n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C f r o m s u c r o s e i n t o ( a )s t a r c h a n d ( b ) t h e e t h a n o l - s o l u b l e f r a c t i o n s o f d i s c s c u t f r o m d e v e l o p i n gt u b e r s ( c l o s e d s y m b o l s ) a n d d o r m a n t t u b e r s ( o p e n s y m b o l s ) o f p o t a t o .T h e t e m p e r a t u r e w a s 2 0 C a n d s u c r o s e w a s s u p p l i e d a t 1 0 0 m M .

- cQ 2 . 7 ru 2 , 5UAU , 5 Iu 1 . 2 -v no 1 . 0 _Ec%t-OCc I0

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A . A5.5' 2

0 . 6 _0 . 4 10 . 2 L I I I3 . 2 3 . 3 3 . 4 3 . 5

, x 1 0 0 03 . 6

F I G . 2 . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n t h e i n c o r p o r a t i o n o f " 1 C f r o m s u c r o s ei n t o v a r i o u s f r a c t i o n s p r e p a r e d f r o m d i s c s o f p o t a t o t u b e r s ( s o l i d l i n e s )a n d i n t o t h e s t a r c h f r a c t i o n o f d i s c s o f c o c o y a m c o r m s ( b r o k e n l i n e ) .C O 2 e v o l v e d ( A ) , s t a r c h ( 0 ) , a p p a r e n t f r e e s p a c e ( A ) , e t h a n o l - s o l u b l ef r a c t i o n ( 0 ) .T h i s v a l u e i s c o m p a r a b l e t o t h e a v e r a g e v a l u e f o r t h e r e c o r d e dr a t e o f t u b e r g r o w t h ( 7 ) .A p r e v i o u s s t u d y ( 2 1 ) o f t h e i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l e d s u g a r sb y t u b e r t i s s u e d i s c s o v e r a s i m i l a r t i m e p e r i o d a n d w i t h s i m i l a rs u c r o s e c o n c e n t r a t i o n s g a v e r a t e s o f s u c r o s e u p t a k e o f t h e s a m eo r d e r a s t h o s e o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t w or k , b u t i n c o r p o r a t i o ni n t o s t a r c h w a s r e l a t i v e l y p o o r w i t h e t h a n o l - i n s o l u b l e " ' C /e t h a n o l - s o l u b l e " 1 C r a t i o s o f a b o u t 0 . 0 5 , w h i c h d e c r e a s e d w i t ht i m e ( 2 1 ) . B y c o m p a r i s o n , t h e s e r a t i o s i n t h e p r e s e n t w o r k w e r ea b o u t 0 . 2 a n d r e m a i n e d c o n s t a n t w i t h t i m e ( F i g . 1 ) . A p o s s i b l ee x p l a n a t i o n f o r t h e r e l a t i v e l y l o w i n c o r p o r a t i o n o f s u c r o s e i n t os t a r c h i n t h e p r e v i o u s w o r k ( 2 1 ) i s t h a t t h e 0 . 1 M g l y c e r o l p r e s e n ti n t h e u p t a k e m e d i u m a s o s m o t i c u m w a s c o n v e r t e d t o s t a r c h i np r e f e r e n c e t o t h e l a b e l e d s u c r o s e s u p p l i e d . I t i s k n o w n ( 2 0 ) t h a ts u s p e n s i o n c u l t u r e c e l l s o f s o y a b e a n r e a d i l y c o n v e r t g l y c e r o l t os t a r c h .When t h e t e m p e r a t u r e o f t h e u p t a k e m e d i u m w a s v a r i e d f r o m9 t o 3 1 C , s t a r c h s y n t h e s i s s h o w e d a s h a r p o p t i m u m a t a b o u t2 1 C ( m e a n o f 1 0 e x p e r i m e n t s , 2 1 . 5 C 0 . 5 ) . I n c o r p o r a t i o n o fl a b e l i n t o t h e e t h a n o l - s o l u b l e f r a c t i o n s h o w e d l o w e r s e n s i t i v i t yt o t e m p e r a t u r e w i t h l i t t l e d e c l i n e a b o v e a b r o a d o p t i m u m f r o m1 7 t o 2 5 C . B y c o n t r a s t , i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l i n t o t h e a p o p l a s t i cf r a c t i o n a n d r e l e a s e o f l a b e l a s C O 2 b o t h i n c r e a s e d a s t h e t e m -p e r a t u r e w a s r a i s e d . T h e s e e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a r e i l l u s t r a t e di n t h e f o r m o f c o n v e n t i o n a l A r r h e n i u s p l o t s ( F i g . 2 ) .I n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e s h a r p b r e a k i n t h e A r r h e n i u s p l o t

*

1 2 2 4 MOHABIR AND JOHN

- - u - I- v

1 % 4 % ' I , *0*

4 k

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TEMPER A TURE RESPONSE O F STA RCH SYNTHESIS I N POTATOT a b l e I . A c t i v i t i e s o f M a r k e r E n z y m e s a n d E n z y m e s o f C a r bo h y d r at e M e t a b o l i s m i n L y s a t e s o f P o t a t oT u b e r P r o t o p l a s t s

L y s a t e s w e r e p r e p a r e d a n d f r a c t i o n a t e d a s d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . " V a l u e s a r e m e a n s o f a tl e a s t 3 e x p e r i m e n t s S E . P e r c e n t a g e a c t i v i t i e s i n a m y l o p l a s t f r a c t i o n h a v e b e e n c o r r e c t e d i n e a c h e x p e r i m e n tf o r c o n t a m i n a t i o n a c c o r d i n g t o K l e i n ( 1 9 8 6 ) u s i n g a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e a s c y t o s o l i c m a r k e r .P e r c e n t a g e o f A c t i v i t y o f P e r c e n t a g eU n f r a c t i o n a t e d L y s a t e A c t i v i t i e s i nA c t i v i t y i n R e c o v e r e d i n A m y l o p l a s t F r a c t i o nE n z y m e U n f r a c t i o n a t e dL y s a t e A m y l o p l a s t A m y l o p l a s t C o r r e c t e d f o r

f r a c t i o n p l u s C y n t o s i a t o l ie x t r a a m y l o p l a s t C o n t a m i n a t i o nn m o l / m i n / m L - l y s a t e

A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e 2 5 1 3 . 6 6 . 2 2 . 7 9 7 1 4U D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e 3 1 6 1 7 9 7 1 . 5 1 0 9 2 1 0 . 9 0 . 2S u c r o s e s y n t h a s e 1 5 7 2 3 4 . 7 1 . 7 1 0 6 1 4 - 1 . 4 0 . 4A l k a l i n e i n v e r t a s e 6 5 2 8 5 . 6 2 . 8 1 0 1 1 1 - 0 . 9 0 . 3P h o s p h o g l u c o m u t a s e 1 0 7 5 8 1 7 3 1 0 7 2 0 1 4 5F r u - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t a s e 1 . 8 0 . 7 1 8 3 . 4 1 0 3 2 1 1 4 . 4 4 . 9N A D - G l y c e r a l d e h y d e - 3 - P d e h y d r o g e n a s e 3 . 5 3 . 1 2 3 2 . 7 1 0 2 1 9 2 1 . 4 6 . 6A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 1 3 5 . 2 2 6 6 1 2 7 1 1 3 0 . 5 5 . 2A D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e 1 1 1 . 4 3 3 1 . 3 1 0 5 1 4 3 2 . 1 3 . 5S t a r c h p h o s p h o r y l a s e 6 . 0 3 . 7 3 0 7 . 1 1 1 0 1 7 2 9 . 3 4 . 8S o l u b l e s t a r c h s y n t h a s e 6 . 4 2 . 8 3 4 5 . 1 9 9 1 4 3 1 . 9 6 . 2

T a b l e I I . L a t e n c y o f M a r k e r E n z y m e A c t i v i t i e s i n A m y l o p l a s t s I s o l a t e df r o m P r o t o p l a s t sE n z y m e s w e r e a s s a y e d i n t h e p r es e n c e o r a b s e n c e o f 0 . 1 % T r i t o n X -

1 0 0 w h i c h w a s u s e d t o l y s e t h e a m y l o p l a s t s . T h e d i f f e r e n c e i n a c t i v i t yb e t w e e n t h e l y s e d a n d u n l y s e d s a m p l e s e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e o f t h el y s e d i s t e r m e d l a t e n c y .

A c t i v i t yE n z y m e s L a t e n c yU n l y s e d L y s e dn m o l / m i n / m L %a m y l o p l a s t s u s p e n s i o n

E x p e r i m e n t 1A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 1 6 . 5 2 2 . 5 2 7E x p e r i m e n t 2A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 3 3 . 3 4 5 . 8 2 7N i t r i t e r e d u c t a s e 3 2 . 4 3 9 . 4 1 8A D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e 0 . 2 3 0 . 2 7 1 6S o l u b l e s t a r c h s y n t h a s e 1 . 5 6 1 . 8 6 1 6E x p e r i m e n t 3A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 2 5 3 5 2 9N i t r i t e r e d u c t a s e 1 9 . 5 2 6 2 5

w a s a f e a t u r e o f s t a r c h s y n t h e s i s i n d i s c s o f s t o r a g e t i s s u e i ng e n e r a l , we r e p e a t e d t h e e x p e r i m e n t w i t h d i s c s c u t f r o m c o r m so f t h e cocoyam, a crop a d a p t e d t o t h e warm humid t r o p i c s . Ass h o w n i n F i g u r e 2 , t h e r a t e o f s t a r c h s y n t h e s i s w i t h d i s c s o fc o c o y a m s h o w e d a c o n t i n u o u s i n c r e a s e a s t h e t e m p e r a t u r e w a sr a i s e d f r o m 1 5 t o 3 5 C . T h u s , i t i s c o n c l u d e d t h a t t h e b r e a k i nt h e A r r h e n i u s p l o t w i t h p o t a t o d i s c s ( F i g . 2 ) i s r el a t ed t o t h ep a r t i c u l a r t e m p e r a t u r e r e q u i r e m e n t s o f s t a r c h s y n t h e s i s i n p o t a t ot u b e r s .Tw o o f t h e e n z y m e s i n v o l v e d i n s t a r c h s y n t h e s i s i n p o t a t ot u b e r s , A D P - G l c - p y r o p h o s p h o r y l a s e a n d s t a r c h s y n t h a s e , h a v eb e e n s h o w n p r e v i o u s l y t o h a v e t e m p e r a t u r e o p t i m a i n v i t r o a b o v e3 5 C ( 6 , 1 5 ) . We h a v e c o n f i r m e d t h at s t ar c h s y n t h a s e f r o m t h ep o t a t o t u b e r s u s e d i n t h e p r e s e n t work s h o w s a s t r i c t l y l i n e a rresponse t o t e m p e r a t u r e ( A r r h e n i u s p l o t ) ove r t h e range 1 2 t o3 7 C when a s s a y e d i n v i t r o as d e s c r i b e d i n " M a t e r i a l s a nd M et h-o d s " ( d a t a n o t s h o w n ) .E n z y m e s o f t h e A m y l o p l a s t s . I n o r d e r t o l o c a t e t h e b i o c h e m -

T a b l e I I I . L a t e n c y o f Enzyme A c t i v i t i e s i n C e l l - f r e e A m y l o p l a s t sA m y l o p l as t s w e r e i s o l a t e d f r o m s l i c e d p o t a t o t i s s u e . L a t e n c y w a s

d e t e r m i n e d f o r v a r i o u s e n z y m e s a s d e s c r i b e d i n T a b l e I I .A c t i v i t yE n z y m e L a t e n c yU n l y s e d L y s e d

n m o l / m i n / m La m y l o p l a s t %s u s p e n s i o n

E x p e r i m e n t 1A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 7 . 5 1 6 5 3A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e 2 3 . 0 2 0

E x p e r i m e n t 2A l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e 2 . 4 5 . 4 5 6S o l u b l e s t a r c h s y n t h a s e 0 . 0 6 0 . 1 2 5 0A D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e 0 . 1 3 0 . 3 3 6 1S t a r c h p h o s p h o r y l a s e 0 . 3 3 0 . 6 4 5N A D - G l y c e r a l d e h y d e - 3 - P d e h y dr o g e n a s e 9 . 4 1 2 . 3 2 3A l c o h o l d e h y d r o g e n a s e 1 6 . 7 1 6U D P - G l c p y r o p h o s p h o r y l a s e 2 1 7 2 1 3

i c a l s t e p ( s ) r e s p o n s i b l e f o r l i m i t i n g s t a r c h s y n t h e s i s a t t e m p e r a -t u r e s > 2 1 . 5 0 C , we h a v e e x a m i n e d s t a r c h s y n t h e s i s i n a m y l o p l a s t si s o l a t e d f r o m d e v e l o p i n g p o t a t o t u b e r s .T h e f o r m i n w h i c h a s s i m i l a t e i s t a k e n u p b y a m y l o p l a s t s h a sn o t b e e n i d e n t i f i e d , a l t h o u g h t h e r e a r e i n d i c a t i o n s t h a t a m y l o -p l a s t s r e s e m b l e c h l o r o p l a s t s i n t a k i n g u p a s s i m i l a t e i n t h e f o r mo f t r i o s e - P i n e x c h a n g e f o r P i ( 1 9 ) . A s a p r e l i m i n a r y t o o u r s t u d i e so f s t a r c h s y n t h e s i s i n i s o l a t e d p o t a t o t u b e r a m y l o p l a s t s , we h a v ed e t e r m i n e d i f t h e y a r e e n z y m a t i c a l l y e q u i p p e d f o r t h e c o n v e r s i o no f t r i o s e - P t o s t a r c h . I n o u r d e te r m i n a t i o n o f t h e e n z y m e com-p l e m e n t o f p o t a t o t u b e r a m y l o p l a s t s , we h a v e i s o l a t e d t h e m f r o ml y s e d p r o t o p l a s t s a n d f o l l o w e d t h e e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s o fM a c D o n a l d a n d a p R e e s ( 1 9 ) , who w o r k e d w i t h a m y l o p l a s t s o fs u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s o y b e a n , a n d E c h e v e r r i a e t a l . ( 5 ) , whow o r k e d w i t h a m y l o p l a s t s f r o m d e v e l o p i n g m a i z e e n d o s p e r m .P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t s t a r c h g r a n u l e s r e -l e a s e d f r o m l y s e d p r o t o p l a s t s s e d i m e n t e d t h r o u g h a l a y e r o fs u s p e n s i o n me d i um c o n t a i n i n g 20% ( w / v ) N y c o d e n z a t 1 g .When t h i s r a p i d l y s e d i m e n t i n g f r a c t i o n w a s a s s a y e d f o r e n z y m e s

1 2 2 5

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MOHABIR AND JOHN

4,

: L-U -0E%- oc0.1-0a

C-

0 " l03 0 6 0 9 0T I M E ( m i n )

P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 8 , 1 9 8 8

0 . 0 1 0 . 0 2 0 0 3 0 . 0 4A m y l o p l a s t s (mg s t a r c h )F I G . 3 . S y n t h e s i s o f s t a r c h b y c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s o b t a i n e d f r o m p o t a t o t u b e r . T h e t e m p e r a t u r e w a s 2 1 C . a , T i m e - c o u r s e w i t h 0 . 0 3 mg s t a r c h

p r e s e n t ; b , e f f e c t o f a m y l o p l a s t c o n c e n t r a t i o n , r e a c t i o n t i m e o f 9 0 m i n .T a b l e I V . E f f e c t o f A m y l o p l a s t L y s i s o n t h e I n c o r p o r a t i o n o f 4 C i n t o S t a r c h

T h e " 4 C l a b e l e d s u b s t r a t e s w e r e s u p p l i e d t o c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s w h i c h w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f0 . 1 % ( v / v ) T r i t o n X - 1 0 0 o r t h e c o n c e n t r a t i o n o f s o r b i t o l w a s r e d u c e d t o 6 5 mm t o g i v e a h y p o t o n i c m e d i u m .T h e t e m p e r a t u r e w a s 2 1 C . V a l u e s a r e m e a n s o f d u p l i c a t e s a m p l e s .T r e a t m e n t R a d i o l a b e l e d CInoprtdPercent o fT r e a t m e n t S u b s t r a t e " 4 C I n c o r p o r a t e d C o n t r o l

n m o l h e x o s e e q / m g a m y l o p l a s t s t a r c hE x p e r i m e n t 1C o n t r o l F r u - 1 , 6 - b i s P 1 . 9 4 1 0 0+ T r i t o n X - 1 0 0 F r u - 1 , 6 - b i s P 0 . 3 6 1 9H y p o t o n i c m e d i u m F r u - 1 , 6 - b i s P 0 . 4 8 2 5E x p e r i m e n t 2C o n t r o l F r u - 1 , 6 - b i s P 2 . 4 0 1 0 0+ T r i t o n X - 1 0 0 F r u - 1 , 6 - b i s P 0 . 3 8 1 6H y p o t o n i c m e d i u m F r u - 1 , 6 - b i s P 0 . 4 5 1 9E x p e r i m e n t 3C o n t r o l F r u - 1 , 6 - b i s P 2 . 8 5 1 0 0+ T r i t o n X - 1 0 0 F r u - 1 , 6 - b i s P 0 . 4 4 1 5C o n t r o l A D P - G l c 1 7 . 7 1 0 0+ T r i t o n X - 1 0 0 A D P - G l c 4 2 . 2 2 4 0

c h a r a c t e r i s t i c o f t h e a m y l o p l a s t i c a n d c y t o s o l i c c e l l c o m p a r t -ments ( T a b l e I ) , i t w a s f o u n d t o b e r e l a t i v e l y e n r i c h e d i n amy-l o p l a s t i c enzy m es a n d r e l a t i v e l y l a c k i n g i n c y t o s o l i c enzymes.T h u s , t h e e n z y m e s d i r e c t l y i n v o l v e d i n s t a r c h m e t a b o l i s m , ADP-G l c - p y r o p h o s p h o r y l a s e , s t a r c h p h o s p h o r y l a s e a n d s t a r c h syn-t h a s e w e r e w e l l r e p r e s e n t e d i n t h e r a p i d l y s e d i m e n t i n g f r a c t i o n ,w h i l e a l k a l i n e i n v e r t a s e a n d t h e e n z y m e s o f sucrose m e t a b o l i s m ,U D P - G l c - p y r o p h o s p h o r y l a s e a n d sucrose s y n t h a s e , r e m a i n e dl a r g e l y a b o v e t h e l a y e r o f 20% N y c o d e n z . I n T a b l e I we h a v ec o r r e c t e d f o r c o n t a m i n a t i o n o f t h e a m y l o p l a s t s b y c y t o s o l i cenzy m es a c c o r d i n g t o K l e i n ( 1 6 ) u s i n g a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e a sc y t o s o l i c m a r k e r ( 2 7 ) . T h i s p r o c e d u r e g i v e s a d i s t r i b u t i o n o fa b o u t 30% f o r t h e t h r e e a m y l o p l a s t m a r k e r e n z y m e s i n t h er a p i d l y s e d i m e n t i n g f r a c t i o n ( T a b l e I ) . From t h i s v a l u e we i n f e rt h a t t h i s f r a c t i o n c o n t a i n s s o m e 30% o f t h e t o t a l a m y l o p l a s tc o n t e n t o f t h e p r o t o p l a s t s , a n d we t e r m i t t h e a m y l o p l a s t f r a c t i o n .

T h e s a m e p r o c e d u r e a p p l i e d t o p h o s p h o g l u c o m u t a s e , f r u c t o s e -1 , 6 - b i s p h o s p h a t a s e , a n d g l y c e r a l d e h y d e - 3 - P d e h y d r o g e n a s e ( c h o -s e n a s r e p r e s e n t a t i v e e n z y m e s o f t h e p a t h w a y l e a d i n g f r o m t r i o s e -P t o g l u c o s e - l - P ) s h o w t h a t t h e a m y l o p l a s t f r a c t i o n c o n t a i n ssome 1 4 t o 21% o f t h e i r a c t i v i t y i n t h e p r o t o p l a s t s ( T a b l e I ) .T h e r e f o r e , t h e y ar e l i k e l y t o b e components o f t h e a m y l o p l a s ts t r o m a a s w e l l as b e i n g r e p r e s e n t e d i n t h e c y t o s o l . T h e p e r c e n t a g ed i s t r i b u t i o n o f a l k a l i n e p y r o p h o s p h a t a s e ( T a b l e I ) i n d i c a t e s t h a ti t i s l o c a t e d i n t h e a m y l o p l a s t ( 1 9 ) .Th e e n z y m e s , p h o s p h o g l u c o m u t a s e , f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a -t a s e , a n d N A D - d e p e n d e n t g l y c e r a l d e h y d e - 3 - P d e h y d r o g e n a s e ,h a v e n o t b e e n f o u n d i n o t h e r p l a n t c e l l o r g a n e l l e s s u c h asm i t o c h o n d r i a a n d p e r o x i s o m e s ( 2 7 ) . M o r e o v e r , t h e s e o r g a n e l l e sar e u n l i k e l y t o h a v e p e n e t r a t e d a l a y e r o f 20% N y c o d e n z a t 1 g .T h e r e f o r e , we h a v e n o t b e e n c o n c e r n e d t o d e t e r m i n e t h e pr e s e nceo f t h e s e o r g a n e l l e s i n t h e a m y l o p l a s t a n d e x t r a a m y l o p l a s tf r a c t i o n s .

1 2 2 6-u

L-

0V Ia 'E

C _

0 *

t -w0EC

C

* . 2 .c00 ~0 .

- 4 L

8/22/2019 Plant Physiol. 1988 Mohabir 1222 8

6/7

TEMPERATURE RESPONSE O F STA RCH SYNTHESIS I N POTATOT a b l e V . E f f e c t o f P i o n t h e I n c o r p o r a t i o n o f " 1 C T r i o s e - P i n t o S t a r c hb y C e l l - f r e e A m y l o p l a s t sP o t a s s i u m d i h y d r o g e n p h o s p h a t e ( p H 7 . 8 ) w a s a d d e d a s i n d i c a t e d a t1 0 m m . T h e t e m p e r a t u r e w a s 2 1 C . V a l u e s a r e m e a n s o f d u p l i c a t es a m p l e s .E x p e r i m e n t A d d i t i o n s " 4 C I n c o r p o r a t i o n P e r c e n t o fxperimentd d i t i o n s " ' C ~ C o n t r o l

n m o l F r u e q / m ga m y l o p l a s ts t a r c h

I C o n t r o l 4 . 0 5 1 0 0P i 2 . 7 0 6 72 C o n t r o l 2 . 2 5 1 0 0P i 1 . 8 0 8 0

T a b l e V I . E f f e c t o f T e m p e r a t u r e o n t h e I n c o r p o r a t i o n o f 1 4 C i n t oS t a r c h b y C e l l - f r e e A m y l o p l a s t sV a l u e s a r e m e a n s o f d u p l i c a t e s a m p l e s .

1 4 C I n c o r p o r a t e dT e m p e r a t u r e E x p e r i m e n t 1 E x p e r i m e n t 2 E x p e r i m e n t 3O C n m o l F r u e q / m g a m y l o p l a s t s t a r c h1 1 1 . 5 0 1 . 9 5 1 . 1 12 1 1 . 9 5 2 . 7 0 1 . 5 03 1 3 . 1 5 3 . 2 5 2 . 7 0

T h e s e d i m e n t a t i o n o f t h e a m y l o p l a s t e n z y m e s i n t o t h e l a y e ro f 20% N y c o d e n z s u g g e s t e d t h a t t h e y w er e a s s o c i a t e d w i t h t h ed e n s e , r a p i d l y s e d i m e n t i n g s t a r c h g r a n u l e s . I n o r d e r t o d e m o n -s t r a t e t h a t t h e s e e n z y m e s w er e c o n t a i ne d w i th i n t h e a m y l o p l a s tm e m b r a n e , we d e t e r m i n e d t h e l a t e n c y o f t h e s e e n z y m e s a sr e v e a l e d b y t h e s t i m u l a t i o n o f t h e i r a c t i v i t y w h e n t h e p h y s i o l o g -i c a l b a r r i e r o f t h e a m y l o p l a s t m e m b r a n e ( s ) i s d e s t r o y e d b y t h ea d d i t i o n o f t h e d e t e r g e n t T r i t o n X - 1 0 0 ( 5 , 1 9 ) . S t i m u l a t i o nd e p e n d s u p o n t h e i n a b i l i t y o f s u b s t r a t e a n d / o r coenzymes, a d d e dt o t h e s u s p e n s i o n m e d i u m , t o r e a c h t h e e n z y m e l o c a t e d w i t h i nt h e a m y l o p l a s t m e m b r a n e ( s ) . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n T a b l e I Is h o w t h a t 1 6 t o 29% s t i m u l a t i o n w a s o b t a i n e d o n a d d i t i o n o fT r i t o n X - 1 0 0 . T h u s , we e s t i m a t e t h a t a b o u t o n e - f i f t h o f t h ea m y l o p l a s t s r e m a i n e d i n t a c t d u r i n g t h e a s s a y s . S i m i l a r d e t e r m i -n a t i o n s h a d r e v e a l e d 44% o f t h e a m y l o p l a s t s t o b e i n t a c t ( s t a r c hs y n t h a s e a s i n d i c a t o r ) i n a n u n f r a c t i o n a t e d l y s a t e o f p r o t o p l a s t so f c u l t u r e d s o y b e a n c e l l s ( 1 9 ) , a n d 47 % ( n i t r i t e r e d u c t a s e a si n d i c a t o r ) a n d 66 % ( A D P - G l c - p y r o p h o s p h o r y l a s e a s i n d i c a t o r )o f t h e a m y l o p l a s t s i s o l a t e d f r o m d e v e l o p i n g m a i z e e n d o s p e r m t ob e i n t a c t ( 5 ) .T h e f r a g i l i t y o f a m y l o p l a s t s c o n t a i n i n g l a r g e s t a r c h g r a n u l e sh a d b e e n n o t e d p r e v i o u s l y ( 5 , 1 9 , 2 3 ) . F o r t h e p r e s e n t p u r p o s e ,r e t e n t i o n o f a m y l o p l a s t i n t a c t n e s s a n d b i o s y n t h e t i c c a p a b i l i t yw e r e o f g r e a t e r i m p o r t a n c e t h a n f r e e d o m f r o m c o n t a m i n a t i o nb y e x t r a a m y l o p l a s t enzymes. T h e r e f o r e , i n s u b s e q u e n t e x p e r i -m e n t s , we u s e d a m y l o p l a s t s r e l e a s e d b y s l i c i n g t h i n l y d e v e l o p i n gp o t a t o t u b e r s . T h e m o r e r a p i d l y s e d i m e n t i n g a m y l o p l a s t s w e r er e j e c t e d , a n d t h o s e t h a t s e d i m e n t e d b e t w e e n 5 a n d 6 0 m i n w e r eu s ed w i t h ou t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . T h e s e we t e r m c e l l - f r e e a m y -l o p l a s t s . T h e p e r c e n t a g e i n t a c t n e s s o f t h e s e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s( T a b l e I I I ) w a s a t l e a s t t w i c e t h a t o f t h e a m y l o p l a s t s i s o l a t e d f r o mt h e p r o t o p l a s t s . A c t i v i t i e s o f t h e e n z y m e s l i k e l y t o b e c o n f i n e dt o a m y l o p l a s t s w e r e a p p r o x i m a t e l y d o u b l e d b y t h e a d d i t i o n o fT r i t o n X - 1 0 0 t o t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s , w h e r e a s a c t i v i t i e s o ft h e e n z y m e s o f c y t o s o l i c o r i g i n w e r e u n a f f e c t e d b y t h e T r i t o n X -1 0 0 t r e a t m e n t . A c t i v i t y o f g l y c e r a l d e h y d e - 3 - P d e h y d r o g e n a s e ,p r o b a b l y p r e s e n t i n b o t h c e l l c o m p a r t m e n t s , s h o w e d a n i n t e r -m e d i a t e l a t e n c y ( T a b l e I I I ) . When t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s w e r et r e a t e d w i t h t r y p s i n e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d ( 1 9 ) i n o r d e r t oi n a c t i v a t e a m y l o p l a s t e n z y m e s t h a t h a d e s c a p e d f r o m b r o k e n

a m y l o p l a s t s b e f o r e t h e a d d i t i o n o f T r i t o n , n o c o n s i s t e n t i m p r o v e -m e n t i n t h e p e r c e n t a g e l a t e n c y w a s o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) .S t a r c h S y n t h e s i s b y C e l l - f r e e A m y l o p l a s t s . A d e m o n s t r a t i o no f t r i o s e - P u p t a k e i n t o t h e p o t a t o a m y l o p l a s t s w a s p r e c l u d e d b yt h e d i f f i c u l t y o f r e t a i n i n g a m y l o p l a s t i n t e g r i t y w h e n a m y l o p l a s t sa r e s e p a r a t e d f r o m t h e s u s p e n d i n g m e d i u m . H o w e v e r , h a v i n ge s t a b l i s h e d t h a t t h e p o t a t o a m y l o p l a s t s , l i k e t h o s e o f s o y b e a ns u s p e n s i o n c u l t u r e c e l l s ( 1 9 ) w e r e e n z y m a t i c a l l y e q u i p p e d t oc o n v e r t t r i o s e - P t o s t a r c h , w e s u p p l i e d t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t sw i t h " ' C ] t r i o s e - P a n d m e a s u r e d t h e i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l i n t os t a r c h . T h e [ ( " C ] t r i o s e - P w a s g e n e r a t e d i n t h e r e a c t i o n m i x t u r ef r o m [ " C ] f r u c t o s e - 1 , 6 - b i s P b y t h e a c t i v i t y o f e x c e s s a l d o l a s e . I no r d e r t o i n h i b i t a c t i v i t y o f c y t o s o l i c f r u c t o s e - l , 6 - b i s p h o s p h a t a s e ,f r u c t o s e - 2 , 6 - b i s P w a s a d d e d . E n z y m i c a s s a y s b y t h e m e t h o d s o fB e r g m e y e r ( 2 2 ) r e v e a l e d t h a t u n d e r t h e c o n d i t i o n s e m p l o y e d f o rs t a r c h s y n t h e s i s t h e l e v e l s o f t r i o s e - P ( p r e d o m i n a n t l y a s d i h y -d r o x y a c e t o n e - P ) a n d f r u c t o s e - l 1 , 6 - b i s P w e r e m a i n t a i n e d a t a b o u t0 . 6 a n d 0 . 8 mm, r e s p e c t i v e l y , d u r i n g t h e i n c u b a t i o n p e r i o d .T h e f o r m a t i o n o f s t a r c h b y t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s w a s c o n -s t a n t w i t h t i m e a f t e r a n i n i t i a l l a g p e r i o d ( F i g . 3 a ) , a n d t h ea m o u n t o f s t a r c h f o r m e d w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e c o n c e n t r a t i o no f a m y l o p l a s t s ( F i g . 3 b ) . When t h e a m y l o p l a s t s w e r e l y s e d , e i t h e rb y t h e a d d i t i o n o f T r i t o n X - 1 0 0 t o t h e r e a c t i o n m e d i u m o r b yt h e o m i s s i o n o f o s m o t i c u m , s t a r c h s y n t h e s i s w a s r ed u c e d b ya b o u t 8 0 % ( T a b l e I V ) . T h e r e f o r e , t h e m a j o r p a r t o f t h e s t a r c hs y n t h e s i z e d d e p e n d e d o n a m y l o p l a s t i n t a c t n e s s . I n a g r e e m e n tw i t h t h i s i n t e r p r e t a t i o n , s t a r c h s y n t h e s i s w i t h [ " ' C ] A D P - G l c a ss u b s t r a t e w a s s t i m u l a t e d b y a m y l o p l a s t l y s i s ( T a b l e I V ) . I f t r i o s e -P e n t e r s a m y l o p l a s t s i n e x c h a n g e f o r P i , t h e n t h e a d d i t i o n o f P it o t h e s u s p e n d i n g m e d i u m w o u l d b e e x p e c t e d t o i n h i b i t t r i o s e - Pu p t a k e a n d t h u s s l o w s t a r c h s y n t h e s i s . T h i s e f f e c t i s s h o w n i nT a b l e V w h e r e t h e a d d i t i o n o f 1 0 m M P i h a s r e s u l t e d i n as i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n t h e r a t e o f s t a r c h s y n t h e s i s .When m e a s u r e d a t 2 1 C , t h e r a t e o f s t a r c h s y n t h e s i s e x p r e s s e do n a mg t o t a l s t a r c h b a s i s b y t h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s w a s s i m i l a rt o t h e r a t e o b s e r v e d w i t h t h e p o t a t o t i s s u e d i s c s .H a v i n g e s t a b l i s h e d t h a t s t a r c h s y n t h e s i s i n t h e c e l l - f r e e a m y -l o p l a s t s w a s q u a l i t a t i v e l y a n d q u a n t i t a t i v e l y r e p r e s e n t a t i v e o ft h a t o b s e r v e d i n t i s s u e d i s c s , t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e w a se x a m i n e d . T h e r e s u l t s ( T a b l e V I ) s h o w t h a t s t a r c h s y n t h e s i s b yt h e c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s w a s i n c r e a s e d b y t e m p e r a t u r e i n c r e -m e n t s f r o m 1 1 t o 2 1 C a n d f r o m 2 1 t o 3 1 C . T h u s , t h e i n h i b i t i o no b s e r v e d w i t h t i s s u e d i s c s a t t e m p e r a t u r e s > 2 1 . 5 C w a s n o to b s e r v e d w i t h c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s .

DISCUSSIONT h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n o f a s h a r p t e m p e r a t u r e o p t i m u m a t2 1 . 5 C f o r s t a r c h s y n t h e s i s i n p o t a t o t u b e r t i s s u e i s i n g o o da g r e e m e n t w i t h B u r t o n ' s c o n c l u s i o n ( 3 ) t h a t t h e o p t i m u m t e m -p e r a t u r e f o r t u b e r g r o w t h w i t h a d e q u a t e l i g h t i s 2 2 C . A t e m p e r -a t u r e o p t i m u m a t 2 1 . 5 C a l s o h e l p s t o e x p l a i n a v a r i e t y o fp r e v i o u s f i n d i n g s w h i c h w e r e m a d e w i t h w h o l e t u b e r s : r e d u c e d

q u a n t i t y o f s t a r c h g r a n u l e s p e r c e l l w h e n s o i l t e m p e r a t u r e s w e r er a i s e d f r o m t h e r a n g e 7 t o 1 0 C t o t h e r a n g e 2 4 t o 2 7 C ( 3 3 ) ;r e d u c e d t u b e r y i e l d s a n d s t a r c h c o n t e n t s w h e n s o i l t e m p e r a t u r e sw e r e r a i s e d f r o m 2 0 t o 32C ( 2 4 ) ; r e d u c e d p a r t i t i o n i n g o f a s s i m -i l a t e f r o m s u g a r s t o s t a r c h when t u b e r t e m p e r a t u r e s w e r e r a i s e df r o m 1 6 t o 2 8 C ( 2 8 ) a n d f r o m 2 0 t o 3 0 C ( 1 7 ) ; a n d i n c r e a s e dy i e l d s w h e n maximum s o i l t e m p e r a t u r e s w e r e r e d u c e d f r o m 3 0t o 2 3 C ( 1 ) . I t w i l l b e o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e w h e t h e r a n y o f t h eh e a t - t o l e r a n t v a r i e t i e s s h o w a t e m p e r a t u r e o p t i m u m f o r s t a r c hs y n t h e s i s h i g h e r t h a n t h a t f o u n d i n D e s i r e e .T h e p r e s e n t f i n d i n g t h a t c e l l - f r e e a m y l o p l a s t s s h o w n o d e c l i n ei n t h e r a t e o f s t a r c h s y n t h e s i s w h e n t h e t e m p e r a t u r e i s r a i s e df r o m 2 1 t o 3 1C s u g g e s t s t h a t a s s i m i l a t e t r a n s p o r t i n t o t h ea m y l o p l a s t a n d s u b s e q u e n t s t e p s i n s t a r c h b i o s y n t h e s i s a r e n o tr e s p o n s i b l e f o r t h e i n h i b i t i o n o f s t a r c h s y n t h e s i s o b s e r v e d w h e n

1 2 2 7

8/22/2019 Plant Physiol. 1988 Mohabir 1222 8

7/7

P l a n t P h y s i o l . V o l . 8 8 , 1 9 8 8t h e t e m p e r a t u r e o f t h e t i s s u e i s r a i s e d above 2 1C. However, thisc o nc l u s i o n r e m a i n s t e n t a t i v e u n t i l more i s known about starchs y n t h e s i s i n i s o l a t e d a m y l o p l a s t s a n d a b o u t t h e time course ofi n h i b i t i o n a t t h e h i g h e r t e m p e r a t u r e s . We n o t e that in the devel-o p i n g w h ea t e n d o s p e r m i n h i b i t i o n of s ta rch s y n t h e s i s by tem-p e r a t u r e s a b o v e t h e o p t i m u m o f 30C i s a t t r i b u t a b l e to thes e n s i t i v i t y o f s t a r c h s y n t h a s e t o a p r e t r e a t m e n t a t hightempera-t u r e ( 2 9 ) . I t w i l l b e o f i n t e r e s t t o determine whether enzymes ofs t a r c h s y n t h e s i s s h o w l o w e r a c t i v i t i e s when i s o l a t e d from potatot u b e r s p r e t r e a t e d a t t e m p e r a t u r e s >21.5 0C .T h e P i - s e n s i t i v e i n c o r p o r a t i o n o f 14 C from t r i o s e - P to starcht h a t we o b s e r v e d w i t h t h e i n t a c t , c e l l - f r e e amyloplasts providesa d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e on t he amyloplast mem-b r a n e o f a t r i o s e - P / P i e x c h a n g e c a r r i e r r e s e m bli ng that ofchlo-r o p l a s t s . H o w e v e r , t h e amyloplasts will need to be purifiedf u r t h e r b e f o r e we c a n e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t 14C from thef r u c t o s e - 1 , 6 - b i s P s u p p l i e d e n t e r e d the a m ylo pla s t s as a metabo-l i t e o t h e r t h a n t r i o s e - P .

I n p h y s i o l o g i c a l t e r m s , t h e potato plant i s s i n k - l i m i t e d , andt h e d r i v i n g f o r c e f o r t u b e r e nla rge m e nt appears to be starchs y n t h e s i s ( 1 4 ) . T h e r e f o r e , t h e i d e n t i f i c a t i o n of a temperatureo p t i m u m a t 2 1 . 5 0 C f o r t u b e r s t a r c h s y n t h e s i s has obvious impli-c a t i o n s f o r t h e p r o d u c t i v i t y o f t h e p o t a t o where soil temperaturesar e h i g h .

A c k n o w l e d g m e n t - W e ar e g r a t e f u l t o D r . T. Ramanujam of theCTCRI,India,f o r s u p p l y i n g t h e cocoyam corms a n d f o r h i s a s s i s t a n c e with the experiments.

LITERATURE CITED1 . AWAN A B 1 9 6 4 I n f l u e n c e o f m u l c h on s o i l moisture, soil temperatureandy i e l d o f p o t a t o e s . Am P o t a t o J 4 1 : 3 3 7 - 3 3 92 . BHULLAR S S , CF JENNER 1986 E f f e c t o f temperature onthe conversion

sugar t o s t a r c h i n t h e d e v e l o p i n g wheat e n d o s p e r m . Aust J Plant Physiol 13:6 0 5 - 6 1 53 . B U R T O N WG 1 9 8 1 C h a l l e n g e s f o r s t r e s s p h y s i o l o g y in potato.AmPotatoJ58:3 - 1 44 . C L E G G KM 1 9 5 6 Th e a p p l i c a t i o n o f t he anthrone reagent to theestimations t a r c h i n c e r e a l s . J S c i F o o d A g r i c 7: 40-445 . ECHEVERRIA E , C B O Y E R , KC L I U , J SHANNON 1985 Isolation ofamyloplastsf r o m d e v e l o p i n g m a i z e endosperm. Plant Physiol 77: 513-519

6 . FRYDMAN R B , CE C A R D I N I 1966 Studies on the biosynthesis ofstarch.I s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t h e s o l u b l e a d e n o s i n e diphosphate glucose: starchg l u c o s y l t r a n s f e r a s e o f S o l a n u m tuberosum. Arch Biochem Biophys 116:9-1 87 . GRAY D 1 9 7 3 The growth of i n d i v i d u a l tub er s. Potato Res16:80-848 . GROB K , P MATILE 1 9 7 9 Vacuolar l o c a l i z a t i o n of glucosinolates inhorseradishr o o t c e l l s . P l a n t S c i L e t t 1 4 : 3 2 7 - 3 3 59 . G R O S S P , T AP R E E S 1 9 8 6 A l k a l i n e in organ ic pyrophosphatase and starchs y n t h e s i s i n a m y l o p l a s t s . Planta 167: 140-145

1 0 . HAWKER J S , J L O S B U N D , J P R E I S S 1 9 7 2 U n p r i m e d s t a r c h s y n t h e s i s b y s o l u b l eA D P - G l c - s t a r c h g l u c o s y l t r a n s f e r a s e f r o m p o t a t o t u b e r s . P h y t o c h e m i s t r y 1 1 :1 2 8 7 - 1 2 9 31 1 . H E B E R U , NG P O N , M H E B E R 1 9 6 3 L o c a l i z a t i o n o f c a r b o x y d i s m u t a s e a n dt n o s e p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e i n c h l o r o p l a s t s . P l a n t P h y s i o l 3 8 : 3 5 5 - 3 6 01 2 . H E L D T HW, C J C H O N , D M A R O N D E , A H E R O L D , Z S S T A N K O V I C , DA W A L K E R ,A K R A M I N E R , MR K I R K , U H E B E R 1 9 7 7 R o l e o f o r t h o p h o s p h a t e a n d o t h e rf a c t o r s i n t h e r e g u l a t i o n o f s t a r c h f o r m a t i o n i n l e a v e s a n d i s o l a t e d c h l o r o -p l a s t s . P l a n t P h y s i o l 5 9 : 1 1 4 6 - 1 1 5 51 3 . H U C K E L S B Y D P , MJ D A L L I N G , R H HAGEMAN 1 9 7 2 S o m e p r o p e r t i e s o f t w of o r m s o f n i t r i t e r e d u c t a s e f r o m c o r n ( Z e a m a y s L . ) P l a n t a 1 0 4 : 2 2 0 - 2 3 31 4 . J E N N E R CF 1 9 8 2 S t o r a g e o f s t a r c h . I n E n c y c l o p e d i a o f P l a n t P h y s i o l o g y ( N e wS e r i e s ) V o l 1 3 A . S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n p p 7 0 0 - 7 4 71 5 . K E N N E D Y MGH, FA I S H E R W O O D 1 9 7 5 T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n a d e n o s i n ed i p h o s p h a t e g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e f r o m S o l a n u m t u b e r o s u m . P h y t o -c h e m i s t r y 1 4 : 1 1 1 - 1 1 21 6 . K L E I N U 1 9 8 6 C o m p a r t m e n t a t i o n o f g l y c o l y s i s a n d o x i d a t i v e p e n t o s e p h o s -p h a t e p a t h w a y i n C h l a m y d o m o n a s r e i n h a r d i i . P l a n t a 1 6 7 : 8 1 - 8 61 7 . K R A u s s A , H M A R S C H N E R 1 9 8 4 G r o w t h r a t e a n d c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m o ft u b e r s e x p o s e d t o h i g h t e m p e r a t u r e s . P o t a t o R e s 2 7 : 2 9 7 - 3 0 31 8 . L E V I C , J P R E I S S 1 9 7 8 A m y l o p e c t i n d e g r a d a t i o n i n p e a c h l o r o p l a s t e x t r a c t s .P l a n t P h y s i o l 6 : 2 1 8 - 2 2 01 9 . MACDONALD F D , T A P R E E S 1 9 8 3 E n z y m i c p r o p e r t i e s o f a m y l o p l a s t s f r o ms u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s o y a b e a n . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 7 5 5 : 8 1 - 8 92 0 . MACDONALD F D , T A P R E E S 1 9 8 3 L a b e l l i n g o f c a r b o h y d r a t e s b y1 4 C g l y c e r o ls u p p l i e d t o s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s o y a b e a n . P h y t o c h e m i s t r y 2 2 : 1 1 4 1 - 1 1 4 32 1 . M A R E s D J , H M A R S C H N E R 1 9 8 0 A s s i m i l a t e c o n v e r s i o n i n p o t a t o t u b e r s i nr e l a t i o n t o s t a r c h d e p o s i t i o n a n d c e l l g r o w t h . B er D t s c h B o t G e s 9 3 : 2 9 9 -3 1 32 2 . M I C H A L G 1 9 8 4 D - F r u c t o s e - 1 , 6 - b i s p h o s p h a t e , d i h y d r o x y a c e t o n e p h o s p h a t ea n d D - g l y c e r a l d e h y d e - 3 - P h o s p h a t e . I n M e t h o d s o f E n z y m a t i c A n a l y s i s , H UB e r g m e y e r , e d , E d 3 , V o l 6 . V e r l a g GmbH, W e i n h e i m , p p 3 4 2 - 35 02 3 . M O O R E T S , H B E E V E R S 1 9 7 4 I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f o r g a n e l l e s f r o ms o y a b e a n s u s p e n s i o n c u l t u r e s . P l a n t P h y s i o l 5 3 : 2 6 1 - 2 6 52 4 . N A K A S E K O K , K Y O S H I D A , M Y O S H I D A 1 9 7 0 P h y s i o - e c o l o g i c a l s t u d i e s i np o t a t o e s . I V . I n f l u e n c e o f s o i l t e m p e r a t u r e o n g r o wt h a n d y i e l d . M e m F a cA g r i c H o k k a i d o U n i v 7 : 2 8 7 - 2 9 32 5 . O K I T A TW , E G R E E N B E R G , DN K U H N , J P R E I S S 1 9 7 9 S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o no f t h e s t a r c h d e g r a d a t i v e a n d b i o s y n t h e t i c e n z y m e s o f s p i n a c h l e a v e s . P l a n tP h y s i o l 6 4 : 1 8 7 - 1 9 22 6 . P O N T I s H G , LF L E L O I R 1 9 6 3 M e a s u r e m e n t s o f U D P - e n z y m e s y s t e m s . M e t h o d sB i o c h e m A n a l 1 0 : 1 0 7 - 1 3 62 7 . Q U A I L CA 1 9 7 9 P l a n t c e l l f r a c t i o n a t i o n . Annu R e v P l a n t P h y s i o l 3 0 : 4 2 5 - 4 8 42 8 . R A N D E N I G , K C A E S A R 1 9 8 6 E f f e c t o f s o i l t e m p e r a t u r e o n t h e c a r b o h y d r a t es t a t u s i n t h e p o t a t o p l a n t ( S . t u b e r o s u m L . ) . J A g r o n C r o p S c i 1 5 6 : 2 1 7 - 2 2 42 9 . R I J V E N A H G C 1 9 8 6 H e a t i n a c t i v a t i o n o f s t a r c h s y n t h a s e i n w h e a t e n d o s p e r mt i s s u e . P l a n t P h y s i o l 8 1 :4 4 8 - 4 5 33 0 . R O S A L 1 9 8 1 T h e r a p i d a c t i v a t i o n i n v i t r o o f t h e c h l o r o p l a s t f r u c t o s e - 1 , 6 -b i p h o s p h a t a s e f o l l o w e d u s i n g a n e w a s s a y p r o c e d u r e . F E B S L e t t 1 3 4 : 1 5 1 -1 5 4

3 1 . S O W O K I N O S J R , J P R E I S S 1 9 8 2 P y r o ph o s p h or y l a s es i n S o l a n u m t u b e r o s u m L .I I I . P u r i f i c a t i o n , p h y s i c a l a n d c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f A D P - G l c p y r o p h o s -p h o r y l a s e i n p o t a t o e s . P l a n t P h y s i o l 6 9 : 1 4 5 9 - 1 4 6 63 2 . S O W O K I N O S J R , EC L U L A I , J A K N O P E R 1 9 8 5 T ra n sl u ce nt t i s s u e d e f e c t s i nS o l a n u m t u b e r o s u m L . I . A l t e r a t i o n s i n a m y l o p l a s t m e m b r a n e i n t e g r i t y ,e n z y m e a c t i v i t i e s , s u g a r s , a n d s t a r c h c o n t e n t . P l a n t P h y s i o l 7 8 : 4 8 9 - 4 9 43 3 . Y A M A G U C H I M , H T I M M , AR S P U R R 1 9 6 4 E f f e c t o f s o i l t e m p e r a t u r e o n g r o w t ha n d n u t r i t i o n o f p o t a t o p l a n t s a n d t u b e r i z a t i o n , c o mp o s i t io n a n d p e r i d e r ms t r u c t u r e o f t u b e r s . P r o c A m S o c H o r t i c S c i 8 4 : 4 1 2 - 4 2 3

1 2 2 8 MOHABIR AND JOHN