Pioneering off-gel methodology for protein quantification using a dual channel (Cy3, Cy5)

Laser Induced Fluorescence detector and nanoESI-Qq-FT-ICR ECD-MS/MS

1 Chimie Organique et Macromoléculaire, UMR CNRS 8009, Protéomique, Modifications Post-traductionnelles et Glycobiologie, IFR 147, USTL, 59655

Villeneuve d'Ascq Cedex, France

2 Dionex, Voisins-le-Bretonneux, France

3 Picometrics, Toulouse, France

Caroline Tokarski,1 Claude Netter,2 Jocelyne Tahar,3 Christian Rolando1

Détection LIF double canal

2 détecteurs à fluorescence laser induite ensérie, équipés de filtres(Zetalif Evolution, Picometrics, Toulouse)

Séparation des protéines sur colonne Monolith PS-DVB d.i. 200 µm (Dionex)Séparation des peptides sur colonne PepMap C18 d.i. 75 µm (Dionex)

Développement d’un nouveau type de détecteur LIF, permettant une détectionsynchrone des deux colorants(Zetalif Discovery, Picometrics, Toulouse)

Décalage constant de l’échelle de temps entre les deux canaux, dû au capillaire de connexion entre les deux détecteurs (10 cm)

Zetalif Discovery

Sortie nano-colonne Détection dans le

capillaire

laser diode 532 nm optimisé pour la détection du Cy3laser Helium-Neon 633 nm optimisé pour la détection du Cy5

Montage colinéaire

Lentille sphérique

saphir

Photodiode proche du collimateur pour la mesureeffective de la puissance

du rayonnement laser

sensibilité et linéarité du détecteur LIF

1 attomole injectée détectée avec un bon rapport signal/bruit (estimation S/N= 13)

Cy3 dye from GE Healthcare

l’intensité de la fluorescence estlineaire sur 4 ordres de magnitude

=> Les 2 canaux ont un comportement similaire

=> la sensibilité du LIF esttrès supérieure à celle de la spectrométrie de masse (# deux ordres de grandeur)

Fluoprobes

Evaluation des colorants maleimide

GE HealthCare

Cy3 vs Cy5 : liaison ethyléniquesupplémentaire dans le colorant Cy5

Colorants Fluoprobes vs colorants GE Healthcare : un groupe CH2 en moins

détection nanoESI-Qq-FT-ICR MS en mode positif pour les deux

colorants en dépit de la présencedes groupes sulfonate

(détection peu sensible en mode négatif)

Détection LIF des colorants maleimide

Décalage en rétention dû à la séparation des colorants sur la

colonne chromatographique

100 fmol injected

Injections d’un mix Cy3 / Cy5

Emission du Cy3 sur le canal Cy5

Cross-labeling des tests et des contrôles par Cy3/Cy5 pour la validation et la quantification

Colorants et conditions de marquage

Paramètres usuels pour le marquage « à saturation » :

- Réduction des protéines : 0.4 nmol Tris-(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) par µg de protéineTampon Tris-HCl pH= 7.5, 1 h, 37°C - Marquage des protéines : 0.8 nmol de fluorophore par µg de protéine fraîchementdissout dans le DMF anhydre, 30 min , 37°C

Paramètres optimisés pour le marquage à saturation :

- Réduction des protéines : 0.8 nmol Tris-(2-carboxyethyl) phosphine chlorhydrate (TCEP) par µg de protéineTampon Tris-HCl pH= 7.5, 4 h, 37°C- Marquage des protéines : 1.4 nmol de fluorophore par µg de protéine fraîchementdissout dans le DMF anhydre, 12 h, 37°C

Dessalage sur colonne de gel filtration (éliminatio n du fluorophore en excès):Evaluation des conditions d’élution (eau, ammonium bicarbonate 50 mM pH=7.0,

ammonium phosphate 50 mM pH=7.0, …)

Conditions d’élution optimisées: dessalage sur HiTrap (Sephadex G-25 Superfine, limite d’exclusion 5000), eau désionisée, 10 min

Evaluation: réduction des protéines / paramètres du marquage (quantité, durée …)+ pour peptides: étape de marquage avant ou après d igestion

Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF αααα-lactalbumine marquée par Cy3 / Cy5

α-lactalbumine marquée Cy3

# 8 Cy3

M+H+

m/z # 14 kDaM+2H+

2M+H+

# 8 Cy5

α-lactalbumine(100 fmol)

α-lactalbumine marquée Cy5

La protéine native n’est plus détectéeSeules les protéines marquées sont détectées

Détection en mode positif, en dépit des groupessulfonate présents dans les molécules de colorant

(importance de la matrice acide)

Evaluation du marquage pour 4 protéines:- Cytochrome C (# 12 kDa, 2 cystéines)- α-Lactalbumine (# 14 kDa, 8 cystéines)- Lysozyme (# 16 kDa, 9 cystéines)- Ovalbumine (# 42 kDa, 6 cystéines)

Evaluation du marquage: analyse MALDI-TOF digests αααα-lactalbumine marquée Cy3 / Cy5

Les 8 cystéines sont détectées avec l’incrément en masse correspondant aux tags Cy3 et Cy5

Aucune cystéine libre détectée, tous les peptides sont marqués Cy(MASCOT avec database SwissProt)

Quantification des peptides marqués en détection LIF

Digest α-lactalbumine marquée Cy3 et Cy5

100 fmol injected

100 fmol injected

Quantification des peptides avec le logiciel Chromeleon

Pourquoi les surfaces/hauteurs des pics de peptides issus d’uneprotéine unique sont-elles différentes?

Digest α-lactalbumin marquée Cy5

(100 fmol injectées)

Identification des peptides marqués détectés en LIF

GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (36–77)+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495

ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5GRAVY: -0.379

paramètre d’hydrophobicité GRAVY indiqué pour le peptide non marqué

Digest α-lactalbumine marquée Cy5

(100 fmol injectées)

Identification des peptides marqués détectés en LIF

CEVFR (25–29) + 1 Cy5GRAVY: 0.300

GYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (36–77)+ 1 Cy5, GRAVY: -0.495

FLDDDLTDDIMCVK (99-112 ) + 1 Cy5GRAVY: 0.100

ALCSEKLDQWLCEK (128 - 141) + 2 Cy5GRAVY: -0.379

IWCK (78-81) + 1 Cy5GRAVY: 0.550

LDQWLCEK (134–141) + 1 Cy5GRAVY: -0.650

IWCKDDQNPHSSNICNISCDK + 3 Cy5ou

DDQNPHSSNICNISCDKFLDDDLTDDIMCVK+ 3 Cy5 (1clivage manqué)

(candidats potentiels)

CEVFRELKDLK (25-35) + 1 Cy5, GRAVY: -0.518

DLKGYGGVSLPEWVCTTFHTSGYDTQAIVQNNDSTEYGLFQINNK (33–77) + 1 Cy5GRAVY: -0.542

DDQNPHSSNICNISCDK (82-98) + 2 Cy5, GRAVY: -1.271

L’aire du pic dépend du nombre de cystéines marquées dans la séquence

paramètre d’hydrophobicité GRAVY indiqué pour le peptide non marqué

Analyse On-line des peptides marqués: spectre MS/MS identification d’un peptide marqué avec 2 fluorophor es

y32++Cy3

A L Ccy3 S E K L D Q W L Ccy3 E Ky3

2+ +Cy3

y42++Cy3

y42+ +Cy3

y52++Cy3

y52+ +Cy3

y62++Cy3

y72++Cy3

y62+ +Cy3

y72+ +Cy3

y82++Cy3

y82+ +Cy3

y92+

+Cy3

y92+ +Cy3

y112++Cy3

y112+ +Cy3

y32+ +Cy3

y3++Cy3

y4++Cy3

y42+ +Cy3

y5++Cy3

y52+ +Cy3

b82+ +Cy3

b82++Cy3

b92+ +Cy3

b92++Cy3

b102++Cy3

b102+ +Cy3

b112+

+Cy3

b112+ +Cy3

b32+ +Cy3

b3++Cy3

b5++Cy3

b52+ +Cy3

b6++Cy3

b62+ +Cy3

b7++Cy3

b72+ +Cy3

b8++Cy3

b82+ +Cy3

*

* fluorophore avec un résidu sulfure provenant de la cystéine

spectre MS/MS montrant les ions b et y

avec tag Cy3

les cystéines marquéessont stables dans les

conditions CID MS/MS

Analyse On-line des peptides marqués

le process d’élimination à partir du peptide marqué conduit à un ion

monochargé * spécifique (observésur spectres resultant des ions

M+2H+, M+3H+…)

*

*

F L D D D L T D D I M Ccy3 V K Ky12

2++Cy3

y102+ +Cy3

y52+ +Cy3

y62+ +Cy3

y72+ +Cy3

y82+ +Cy3

y92+ +Cy3

y112++Cy3

y42+ +Cy3

y42+ +Cy5

y52+ +Cy3

F L D D D L T D D I M Ccy5 V K K

y42++Cy5

y52+

+Cy5 y52+ +Cy5

y62++Cy5

y62+ +Cy5

y72+

+Cy5

y72+ +Cy5

y82++Cy5

y82+ +Cy5

y92++Cy5

y92+ +Cy5

y102++Cy5

y102++Cy5

y112+ +Cy5

y112++Cy5

y122++Cy5

y132++Cy5

y122++Cy5

y132+ +Cy5

y4++Cy5

y4+ +Cy5

y42+ +Cy3

y42+

+Cy3

y52++Cy3

y62++Cy3 y7

2++Cy3y8

2+

+Cy3

y92++Cy3

y102++Cy3y11

2++Cy3

y122++Cy3

y132++Cy3

y132++Cy3

y4++Cy3 y5

++Cy3

Détection spécifiquedes peptides marqués:

Extraction des chromatogrammes

correspondant aux signaux contenantl’ion spécifique *

m/z 773.2343 / 799.2516

pour les peptides marquésrespectivement avec Fluoprobes Cy3 / Cy5

m/z 787.2499 */ 813.2672 *

pour les peptides marquésrespectivement avec

GE Healthcare Cy3 */ Cy5 *

Analyse On-line des peptides marqués

Proportions injectées:Digest α-lactalbumine

marquée avec Cy3/Cy5 : 1/2

*

*

Identification des peptides marqués du mélange d’ α-lactalbuminemarquée Cy3- and Cy5- (logiciel MASCOT, database SwissProt)

les peptides marqués avec 1 ou 2 Cy sont identifiés

Quantification des protéines marquées en détection LIF

α-Lactalbumine marquée Cy3 et Cy5

5 fmol injected

la quantification est facilitée du fait qu’un pic représente une protéine

Possibilité d’analyse de mélanges biologiques complexes

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time [min]0

1

2

3

6x10Intens.

EIC 1161.9±0.25 +All MS

884.6575

929.7042

956.5961

997.1275

1032.8932 1076.2994

1130.0473

1161.8829

1196.35681229.7753

1283.7066

1327.7272

+MS, 10.1-10.3min #(165-169)

0

2

4

6

5x10Intens.

800 900 1000 1100 1200 1300 m/z

+MS, 10.1-10.3min #(165-169), Deconvoluted (maximum entropy)

0

2

4

6

5x10Intens.

13000 14000 15000 16000 17000 18000 19000 m/z

Quantification des protéines marquées en détection LIF

All the cysteins are labeled

TIC of α-lactalbuminSaturation labeling with Cy3

MS spectrum

Deconvoluted spectrum

1301.28044

1338.12848

1431.61123

1471.64005

1590.35317

1634.823671789.01884

1839.420621884.22112

2044.46471

+MS, 0.9-4.6min #(5-17)

0.0

0.5

1.0

1.5

5x10Intens.

1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 m/z

1195.91999

1306.00754

1386.51936

1436.31013

1476.74164

1596.01462

1640.59600

1685.073081795.13851

1847.185751890.19451

+MS, 5.5-14.0min #(20-48)

0

1

2

3

4

5

4x10Intens.

1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 m/z

α-Lactalbuminemarquée Cy3

Pic detecté : 14824.4338

10+ ion

1486.45107

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10Intens.

1486

10+ion

1651.17141

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.04x10

Intens.

1652

9+ion

Déconvolutionprotéine:

14850.4106

14850.41061Mr (h)

0

1

2

3

4

5

4x10Intens.

14860

Analyse On-line des protéines marquées Cy3 et Cy5

Détermination de la masse moléculaire précise de la protéine avec 1 Cy-

v

α-Lactalbuminemarquée Cy5

1483.44338

1483.532281483.64330

+MS, 5.5-14.0min #(20-48)

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

1483.4 1483.5 1483.6 1483.7 1483.8 1483.9 m/z

Optimisation des paramètres du mode ECD : diminution du courant cathodique de façon à éviter l’échauffement de la cellule ICR, et augmentation de l’electronemission gate

On-line Electron Capture Dissociation

Diminution courant cathode => 1.5 AAugmentation electron emission time => pulse: 0.01 sSelection Ion => ici par exemple m/z = 941.7263

941.72632

1020.28715

1112.94849

1157.58799

1224.04117

1376.68904

1412.52450

+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)

0

1

2

3

4

5

4x10

900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z

13+12+ 11+

10+

9+

spectre ECD

Zoom 1 Zoom 2

Cytochrome C10 pmol injectées

On-line Electron Capture Dissociation

1128.88976

1142.03849

1157.58799

1179.59257

1186.584001210.73670

1219.63994

+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

4x10

1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 m/z

c104

10+

c10110+

z697+.

z919+.z39

4+.

c103

10+

z616+.

c93

9+

z838+.

z10410+.

z828+.

z949+.

z848+.

c848+

c959+ z95

9+.

z858+.

c96

9+

c555+

z747+. c76

7+

z767+. c67

6+

z989+.

1246.82620

1261.48426 1284.675081295.65537

1308.82207 1323.81302

1336.00506

1360.34900

+MS2(941.79999), 23.3-29.3min #(207-261)

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

1240 1260 1280 1300 1320 1340 1360 m/z

c898+

z1009+.

z787+.

c1019+

c1029+

c595+ z56

5+.c48

4+

z817+.

z938+.

z696+.

c837+

c726+

c847+c96

8+

c978+

z978+.

z595+.

c877+

z988+.

Zoom 2

Zoom 1

Conclusion

Résumé :Nouvelle méthode off-gel très sensible, combinant quantification et identification des protéinesConditions de marquage optimiséesDétection spécifique des peptides / protéines marquéesLinéaire sur 4 ordres de grandeurOptimisation top down on line en mode ECDCompatible avec les logiciels MS (Mascot etc)

Perspectives :Poursuite de l’évaluation du protocoleTests sur échantillon réels (protéines extraites de plasma humain, par ex. analyse différentielle de l’Apolipoprotéine A)