Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

9
Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA Lee Hunt 1 , Lewis N. Mills 2 , Christophe Pical 3 , Calum P. Leckie 4 , Fiona L. Aitken 1 , Joachim Kopka 5 , Bernd Mueller-Roeber 6 , Martin R. McAinsh 2 , Alistair M. Hetherington 2 and Julie E. Gray 1, 1 Department of Molecular Biology and Biotechnology, University of Shef®eld, Western Bank, Shef®eld S10 2TN, UK, 2 Department of Biological Sciences, University of Lancaster, Lancaster LA1 4YQ, UK, 3 Department of Plant Biochemistry, Centre for Chemistry and Chemical Engineering, Lund University, PO Box 124, SE-221 00 Lund, Sweden, 4 Department of Physiological Science, School of Medicine, University of Newcastle Upon Tyne, Newcastle Upon Tyne NE2 4HH, Tyne & Wear, UK, 5 Max Planck-Institut fu È r Molekulare P¯anzenphysiologie, 14424 Potsdam, Germany, and 6 Abteilung, Molekularbiologie, Institut fu È r Biochemie und Biologie, Universita È t Potsdam, Karl-Liebknecht-Strasse 25, Haus 20, D-14476 Golm/Potsdam, Germany Received 22 October 2002; revised 11 December 2002; accepted 7 January 2003. For correspondence (fax 44 114 272 8697; e-mail j.e.gray@shef®eld.ac.uk). Summary The calcium-releasing second messenger inositol 1,4,5-trisphosphate is involved in the regulation of sto- matal aperture by ABA. In other signalling pathways, inositol 1,4,5-trisphosphate is generated by the action of phospholipase C. We have studied the importance of phospholipase C in guard cell ABA-signalling pathways. Immunolocalisation of a calcium-activated phospholipase C con®rmed the presence of phospho- lipase C in tobacco guard cells. Transgenic tobacco plants with considerably reduced levels of phospholi- pase C in their guard cells were only partially able to regulate their stomatal apertures in response to ABA. These results suggest that phospholipase C is involved in the ampli®cation of the calcium signal respon- sible for reductions in stomatal aperture in response to ABA. As full ABA-induced inhibition of stomatal opening was not observed, our results support a role for the action of other calcium-releasing second messengers in the guard cell ABA-signalling pathway. It is not known whether these different calcium- releasing second messengers act in the same or parallel ABA-signalling pathways. Keywords: guard cell, calcium, abscisic acid, inositol 1,4,5-trisphosphate. Introduction Stomata on the leaf surface regulate the uptake of CO 2 for photosynthesis and loss of water via transpiration. Envir- onmental signals control the aperture of the stomatal pore by activating guard cell-signalling pathways that result in alterations to guard cell turgor (Blatt, 2000a; Schroeder et al., 2001). One of the best understood of these pathways is the abscisic acid (ABA)-signalling pathway. ABA builds up in the leaves during drought causing stomatal closure, and this enables the plant to conserve its existing supplies of water. The control of stomatal aperture by ABA involves altera- tions in guard cell turgor, membrane traf®cking, cytoske- letal reorganisation, sugar and organic acid metabolism and changes in gene expression (Hetherington, 2001). One of the key intermediaries involved in some, but not all, ABA guard cell-signalling pathways is an increase in cytosolic free calcium concentration ([Ca 2 ] cyt ) (Blatt, 2000b; McAinsh et al., 1990; Schroeder and Hagiwara, 1990). Detailed investigations have shown that ABA-induced ele- vations in guard cell [Ca 2 ] cyt exhibit marked spatial and temporal patterns (Gilroy et al., 1991; McAinsh et al., 1992, 1995) including oscillations (Allen et al., 2000; Staxen et al., 1999). Work from Schroeder's laboratory has demonstrated that the pattern of [Ca 2 ] cyt oscillations controls the nature of the guard cell response to ABA (Allen et al., 2000; 2001; Evans et al., 2001). In order to understand guard cell ABA signalling, it is necessary to understand how ABA generates these precise The Plant Journal (2003) 34, 47±55 ß 2003 Blackwell Publishing Ltd 47

Transcript of Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

Page 1: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

������������ �� �� ��� ��� �� ������� �� ������������ � �� ���

� � ���� ���� �� ����� � �������� �����!� �� � �� ��"�#� $���� �� ���"��� %������ &��"�'�

���� � ���()���*� ������ )� ������� � �������� �� ������+��� ��� % �� ,� -���������������� � � ��� �� �� �� �� ������ ��� ��������� � ������ �� ������ ���� ������ � ��� � !� �"����������� � �� ���� �������� ��������� � #�������� #������� #$� %&'� �"�(��������� � ) �� ������������ *���� �� *�������� �� *������ +�������� #�� ���������� ), �- ��%�

�+.��� �� #��� �/����%��������� � )���� ���� ������� ��� � �������� ��������� � !�/���� � �� ��� !�/���� � �� ��

!+� %00� �� 1 ����� �"�2��- ) ���.3������ ��4 � � ��� ��� )5�6������ ���� �%%�% )������ 7������ ��8$9��� ��� � ��� ��9� ���� 3������ ��4 � �������� �� �� ���� ���������4 � )������ "�� .#��9�����.������� �2�

0��� ��� �.�%%:8 7 �;)������ 7�����

�������� �� ����� � �� ������� �� �������� � �� ������� � ������� � ����� ������������ ���� � �� ��� !"#�� �$���% &���'���(�)��*�%������+,�

. �����

/� ����� �(������+ ����� ����+� �������� ��#�'(������������ �� ��0��0� �� �� �+ ������ �� ���(

����� ���� � �� ���� 1� ���� ��+������+ ��������� �������� ��#�'(������������ �� +����� �� �� ������

�� ������������ � 2 ��0 �� ��� �� ��������� �� ������������ �� + ��� ��� ���(��+������+

��������� 1�� �������������� �� � ����� �(����0��� ������������ ���3��� �� ����� �� �������(

����� �� ������� + ��� ����� /����+��� ������� ������ ���� ����������� �� �� �0�� �� ���������(

��� �� ���� + ��� ���� �� ���� ��������� ��� �� �+ ��� ���� �������� ���� �� �� ������ �� ����

/�� �� ��� � ++�� ���� ������������ �� ��0��0� �� �� �����3������ �� �� ����� � ��+��� �����(

���� ��� �� ������ �� �������� ���� � �� ������ �� ���� �� � �� ���(��� �� ���������� �� ��������

�����+ ��� ��� ����0�� � � �� ��� � ����� � ��� ��� �� ������ �� ���� ����� �(������+ �����

����+�� �� �� + ��� ��� ���(��+������+ �������� 1� �� ��� "���� ����� ��� ������� ����� �(

������+ ����� ����+�� ��� �� �� ��� �� ������� ���(��+������+ ���������

&������4 + ��� ���� ����� �� �������� ����� �������� ��#�'(�������������

1����� �����

-��� � )� %��� ������� ��'�%�� )� ���+� � .�� ��

�)���)���� ��� %�� � /��� ��� ����������� 0����$

�����% ��'��%� ���% )� ������� � )� ����% ���

�� �������' '���� ��%%$��'��%%��' ��)/��� )� ����% ��

�%������ '���� ��%% ��'� �1%�2 � �� -�)�����

�� � �2 � �,� ��� � )� ��� ������� � )��� ��)/���

�� )� �������� ���� �313,$��'��%%��' ��)/��� 313 ���%��

�� �� )� %����� �����' ���') ������' ����% �%����2

��� )�� ����%�� )� �%�� ������� �� ������' ����%���

� /����

4)� ���% � ����% ������� �� 313 ���%��� �%���$

��� �� '���� ��%% ��'�2 �������� ���*�+��'2 ���+�$

%��% ���'�������2 ��'�� ��� �'���� ���� ����%���

��� �)��'�� �� '��� ��������� �5�)����'�2 � �,� ���

� )� +�� ������������� ���%��� �� ���2 �� � �%%2 313

'���� ��%%$��'��%%��' ��)/��� �� �� �������� �� ���%��

���� ��%���� ��������� �6.���7��, �1%�2 � ��

8�3���) �� � �2 �## � -�)����� ��� 5�'�/���2 �## ,�

����%�� ������'���� )��� �)/� )� 313$������� �%�$

����� �� '���� ��%% 6.���7�� ��)��� ���+�� �����% ���

�����% ������ �9�%�� �� � �2 �##�� 8�3���) �� � �2 �##�2

�##:, ���%����' ���%%���� �3%%�� �� � �2 � � -���� �� � �2

�###,� ;�+ ���-�)�����<� %������ )�� ���������

)� )� ����� � 6.���7�� ���%%���� ���%� )� �����

� )� '���� ��%% ������� 313 �3%%�� �� � �2 � � � ��

0���� �� � �2 � �,�

=� ���� ��������� '���� ��%% 313 ��'��%%��'2 � ��

��������� ��������� )/ 313 '������� )��� �������

�� ) �� <��� �� �, !#2 �>::

� � � 1%��+/�%% ?��%��)��' @� �

Page 2: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

������ � 6.���7�� �%������ 4)��� �� ��������2 %��'�%�

����� � �)�����%'���% ���������2 )� 313 �� ���$

��%� � '�������' ��������� �� '���� ��%% 6.���7�� ����'������% �������� ���)������� 4)��� ��� ��� �������

/�) 313 �������' � �%���� �������� ��%����$�����$

��%� �)����% �5���%� �� � �2 � � 8�������2 � � ?��

�� � �2 � � -�)����� ��� 5�'�/���2 �## ,� )�� ������$

���� ����� � �)�����%'���% ���������2 ������ �

����% �2 2:$����)��)�� �=?�,2 � ���%���� � �)��)�$

������� ����� )� ���%����� � � ��)/�� ����� �

�)��)�������$�����*� �)��)%����� . �?=$?@.,A=?��1%� �� � �2 �## � 9�%�� �� � �2 �## � @�� �� � �2 �##"�

8�������2 � � ?���� ��� 1����%��2 �##�2 �##:� -����

�� � �2 �###,� =� ������ =?�2 )��� �� �������� )� ���%��

3�?$����� ��3�?�, �@��+�� �� � �2 �##!,2 ��)��'����$�$

�)��)�� �B' �� � �2 � �, ��� �����%� ����% )���+�$

��)��)�� �@�����$.)%��) �� � �2 � , �� �� ��%����$

���%����' ������� �� '���� ��%% 313 ��'��%%��'

�8�������2 � ,� ?)��)%����� � �?@�, �� �%� ���%���

�� 313$������� ����% �%���� �-��' �� � �2 � �,2 �� )�

���� � )�� ��C��� �� ��%����� �� ��)�� ����������

� �/������� �%������ �� 6.���7�� ����� �� � �2 �###,�?������ /�+� �8�������2 � � -���� �� � �2 �###, �

)� �%� � ?=$?@. �� '���� ��%% 313 ��'��%%��' )��� %��'�%�

��%��� � ������� ������)��2 ���) �� )� ��� � )� ?@.

��)���� D����� /)��) �� �����%� ��� )��� ��$�����*�

������ �.���� ��� ?�����2 �###� @�+)�� ��� 8�B��%2

�###� ?�%����%%� �� � �2 �##!� ;�%+�� �� � �2 �##!,� 4)������2

/� '������� ����'���� ���� �%��� /�) �������

%���%� � ?=$?@. �� )��� '���� ��%%�� 3��%���� � )���

������� '���� ��%% ?@. �%��� �%%/�� �� ��*�� � �%�

�� ?=$?@. �� 313$������� ����% �%����� 5/����2 ��

)� ����'���� �%��� /�) ������� ?=$?@. %���%�2 �%�+�'�

� 313 ��'��%%��' /�� �����%��� 4)��� ��� ��''�� )�

�%)�') ?=$?@. �� ��E����� �� )� ��%% ������� 313 ��

'���� ��%%�2 )�� ��%����$���%����' ��)/��� �%� ��$

����� '���� ��%% 313 ��'��%%��'� 4)�� ������ )�

����'��' ���/ )� '���� ��%% �������� 313 ���

���') ��� �� � ���%�� ��������' ��'��%%��' ��/�+

�5�)����'�2 � �,�

)� ���

7���� �� � �-����� � �� ����.��������� ����� ����� *

;� )��� �)/� �������%� )� )��� ��� � %��� /

�������% ?=$?@.� �B�?@.� ��� �, �� '���� ��%%� � !����.

�� ������� �?���% �� � �2 �##�� 9��1��+ �������� �������

F#:!�� ��� G��#��� -���� �� � �2 �###, ���'��� �,� 3 9-4>

B�?@.� ����� ����� /�� )���%'��%� ��������� ��

+���������� � �= ��'���� /�) )����� ����%�� �� �

����� � ���������%� "� +��2 �%�� )� ��������

�%���%�� /��') � ""�# +�� ���'��� ��,� 9-4>B�?@.�$

�%��%� ����� /�� ��%��� �� ��� �� ��C��� ������

��� ������ �������� 9-4>B�?@.� ���%���� )�

)���%���� � �)��)����%����% 2:$����)��)��

=?�2 ��� )�� ������ /�� '���%� ��)����� �� )� ������

� �����%�� ���������� � ���� ��%����� 4)�� �����$

���� ���'� �� �����% �� � ���� ������ �� ��%����$���$

���� ��C���� �H�+� �� � �2 �##!�,� =� ��������2

)���%���� � �)��)����%����% /�� ���� %/ ���'$

��� ��,2 �����%��' � ���������� �� �)��)����%����%

2:$����)��)�� ��� �)��)����%����%�

!�)#*� �� ��������� /��� ������� ���9���� �� ��

������ � ����� �� �

?=$?@. ������ )�� ���� ������ �� �) )� �%��%� ���

)� �������� ������� � ������ �%�� ������ ����)�'

�� � �2 � �� ?���% �� � �2 �##�� -)� �� � �2 �##:,� ;� ������$

'��� )� %���� � B�?@.� ����� �� �) ;�����

�%��' ��� �����%��%������ 3 �%��%��% ������

/�� ������ 9-4>B�?@.�2 /)��) ������ � �%�������

� "� +�� �� ���� %����� ��� '���� ��%%� ���'��� �,� 4)�

$�+ � �� 9���� ��%% B�?@.� )���%���� �)��)����% ����% 2:$����)$��)�� �� � ��%����$�������� ���������, ?���*���� � 9-4>B�?@.� ����� ������ ���� ����'���� � ����*������� ����� �%��� �, /�� ��'���� /�) )����� �%��� �, ���� )���$%'�� ��������� �� += � �2 �������� � � ��:I -�->?390 '�% ��� ������/�) .������ ���%%��� �%��� 4)� �������� ��C� � B�$?@.� �� "� +�����, 4)� ����� � ��%���� � B�?@. ������� ?���*�� 9-4>B�?@.� /��������� �� �)��)����%����% 2:$����)��)�� ��, ��� �)��)����%�$���% � , )���%����' ������ �� ��������' )� �������� � ����%�$��%%�� ������� =?�2 � � ���'� � ���� .��� ����������� J�%����������� ��� ������������ � )��� *�� ���������� ����������2��� )� ���� ���'� /�� ��/��� : ��� � I � ���) ���� ��%�� ���������

! #�� 0�� � �%�

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

Page 3: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

������ �%� ����$������ /�) B�?@.� �)���%'��%�

��������� �� += � �2 ��� � �)/�,� �� ;����� �%�2 ?=$

?@. /�� ������ ���%�����%� �� )� �������% ������ �

%����� ��� '���� ��%%� ���'��� �,� 4)�� �����%%�%�� %���� ��

������� /�) )� �������� %��%����� � )� ��C���

�������2 �)��)����%����% 2:$����)��)��2 ��� ��

����%�� )� ���� �������%� �� )�� �%��� �5���'

�� � �2 �##:� ���)�' �� � �2 � �� ?���% �� � �2 �##�,� 3�

)� �%��%��% ������ ������ 9-4>B�?@.� �����%�

����$���� /�) )�� B�?@. ������2 /� /��� ����%�

�������� /)�)�� B�?@.� �� ��������� ���%�����%� ��

'���� ��%%�� 4)� ��������% ���'��� ���������� �����

� �%� '���� ��%% ������ �� �%� ���)�� ��� ������$

��% ��%% /�%% ������� 5/����2 �����%��%�����

���'��� �, ��*���� )� �������� � ?=$?@. ����� �� '����

��%%� � �) )� ������% ��� )� ������% �������� � %�����

���'��� ��,� D�� � ���$������ ����� ��������� )�

������' �� �����*� ?=$?@.� =� ������2 ?=$?@. /��

������ �� )� �����%�� ����� ��� �� ��� ���)���

�� �)/�,� 4)�� ��������� ����� ��� ������ ��

���%����� �� )� ������� � )� ?=$?@. ����$������'

���� �� )� %��� ������ �� ��'��� �2 /)��) ���������

������%��� � ����� ��� ������% ������ /�)�� )�

%���� 3 �%��%��% ������ 9-4 �)/�� � ����$����$

�� �� ��� ���� %��� ������ �� ;����� �%� ���� �

�)/�,�

9��� � ��� ����� ���� � �-����� / ��� � � �

)3.)#* ��� ��������� � � ����� �� � ���� �������

��� � � )3.)#* ����� �� �-��9�� ������� ������

���������� � $�$ �� ������

4 ������'�� )� ���%����� � ?=$?@. �� '���� ��%% 313

��'��%%��'2 ���� �%��� /�) '������%%� ������� %���%� �

?=$?@. ����� /��� '�������� ?%��� /��� ���������

/�) )� ��%%$%��') B�?@.� ��B3 ����� )� ���% � )�

'���� ��%%$�����*� �� �)��)��%������� ������$

%��� �?0?., ����� �H�+� �� � �2 �##�, �'��� ������

�%%������ �� ��'��� �,2 ��� ���%���� �� �������� ��

'���� ��%% ��'��%%��'� 4)�� ������ /�%� �� �������

����� )� %���%� � �) B�?@.� ��� � ���� ���)���

��� )�� ������ ������ �� ���� '���� ��%%�, �������

� )��� )�') ��'��� � ��E����� ����%�����

3 ��������' � )� ������� ���������� �4 '�������,

/�� �������� ����' �������� '�� ���%���� �=�93, ����

)� ����% ��������� � ��� %���� )� )�� ���� �)/�

����� )� ����'���� ��� ��� / ��%���� %����2 [email protected]

��� [email protected] ��� �������� �� ��'��� ��,� 4)��� %���� /���

��%���� �� )�� /��� ����%� ������ )��� ����%

��������� �� ��*����%� �� ����$�%� %���� /)�� ���$

&���� /��� ������ 3��� � ���� � /��� /�)���/�%2 )�

����$�%� %���� )�� ������� )��� ����% ���������

�� ��� I � )��� /�%%$/����� %���%2 �� ���)�� [email protected]

�� [email protected] �%��� �)/�� ��� ������� �� ����% ��$

�������� 4 ��*�� )�� ����%2 4� '������� [email protected] �%���

/��� ���&���� ����%�� =�93 ���'��� �, ��� �'���

�)/�� �����%%� � ���% � ����% ��������� ��

������� /��� /�)���/�%� 3%% ����'���� �%��� '��/

����%%� ����� /�%%$/����� �������2 �%)�') [email protected]

������� ���������� )�� �/�%� �)����� �� � /�����

/�%%2 /)����� ����$�%� �%��� ��� � �)/ )�� ������

[email protected] �%��� ��� � �)/ )�� �)������ ?)���)���

���� � �%% ����'���� �%��� ������ �� � ����%�� ������

��� �������� ���%�, /)�� ���&���� /��� �����

$�+ � !� =����%��%����� � B�?@. ����� �� ���� %��� �������4���� %��� ������/��� �����/�) B�?@. �%��%��% ������� 3%+�%����)��)����$%���%%�� �������� ������ /�� ������ ����' ���������, -���� �)/��' ������' �� '���� ��%% ���� � � ��,���, 9���� ��%%� � �) %��� �������� �������� �� ���/� ���� � � ��,���, 4��������� ����� � '���� ��%% �)/��' ������' �� �) ��%%� � �������� � � ��,���, .��% ����� ����� /�) ���$������ ����� �%%/��' ��%�'��������'� B ������' /�� ���� �� '���� ��%%� ��������� �� ���/,���� � � ��,�

$�+ � � ��������� � ?@. ����� ��/��� %��� ��� '���� ��%% �������-%��%� ��� �������% ������ ��� �% %��� ��� '���� ��%%$�����)����������% ���'���� /��� �������� � � ��:I -�->?390 '�%2 )�� �%����� ����� /�) �%��%��% B�?@. ������� 3 �% � � �' ����� /��%���� �� ���) %���� @-2 �% %��� �%��%� ������� @82 �% %��� �������%������� 9.-2 '���� ��%%$�����)�� �%��%� ������� 9.82 '���� ��%%$�����)�� �������% �������

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

)���� ����� *. �� $�$.������ ������ � ���� #

Page 4: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

���� � �)/�,� 4)��� /��� � ����������� �� ����%

������� ��/��� ���% ��� ����'���� �%��� ���� �

�)/�,2 ��������' )� )� ������� ����������� �� ���$

�% ���������� /��� ������� � � �������� �� ����%

������ ��)�� )�� � �)��'� �� ����% ������� [email protected]

��� [email protected] %���� )�C�'�� �� +�������� ��������� �4�'�������, /��� '������� ��� ���� �� �%% ���)�� ���$

%����� 1) � )��� %���� �)/�� � � K � ��'��'��� ���

�� +�������� ��������� �� )� 4� '�������2 ��''����' �

���'%� ��� � ������� �� )� ����'��� ���� � �)/�,�

4 ������'�� )� ����� � )� B�?@.� ����'��� �

%���%� � [email protected] '���� ��%% ������ /��� ������� ���

4� [email protected] ��� [email protected] �%���� ;����� �%��' /�) ?=$?@.

������ ��''���� )� ?@. ����� /�� ������ � ����

%/ %���%� �� �) ����'���� ����%�� ���'��� :�,� 4)�

������� � )� %���% � ?=$?@. �� )� '���� ��%%� � [email protected]

��� [email protected] �%��� �� �������� �� /��' ��$��������$

���% '��� ��%�����' � )� ?=$?@. ��B3 ������� �� )�

�������� � )� ����'��� �1��%����2 �###,� 4/ 4� %����

[email protected] ��� [email protected], /�) '���%� ������� ?=$?@. ����� %���%�

/��� ���� ������'�� )� ���%����� � ?=$?@. �� '����

��%% 313 ��'��%%��'� 0�������% �������� /��� ��������

�� � ���'� � 313 ���������� �� ���� ������'�� )�

����� � 313 � %�')$������� ����% �����'� .�$

����� )� ���% �%���2 )� ���� � [email protected] ��� [email protected]

%���� /��� %��� �������� )� ������ � 313� 4)��2 )�

'���� ��%%� � )��� %/ ?=$?@. �%��� �������� )���

������� ��������� 313� .������� ��/��� )� �$

���% ������� ����������� �� [email protected] ��� [email protected] ���'���

:�, �� � �����%� �� )��� ���������� /��� ������� �

���������� � ���) )�� � �������� ��� � �%���� ;�

������� ��'��*��� ���������$$��������� �������%��

/)��) ��� ��L�� ������% �������%�� � ���%% �)��'�� ��

'�/) ��������

$�+ � '� 4)� ����� � 313 � %�')$������� ����% �����' �� / 4�'������� ����'���� %���� �!������ ��9����/�) ������� ?@. %���%� ��'���� ��%%����, =�����% �)/��' ��%���� %���%� � B�?@. ����� �� '���� ��%%� �/�%� ���2 )� ���������� ���� ���% ��� 4� '������� ������� ?@.%���� [email protected] ��� [email protected]� 4�% '���� ��%% ������/��� �������� � � ��:I '�%2�%�� ��� ������ 3 �% � � �' ����� /�� %���� �� ���) %������, 0�������% ����� � [email protected] [email protected] ��, ��� )� ����$�%� ���% � ,�%��� /��� L��� �� � �8 80-A� �8 H.% ��5 "��:, ����� �������)� ���� ����% �����' �� � ) /�) � ���'� � 313 ������������� � �8� 0��) ��%�� ��������� )� ���� � � � ������������-������ ����� ��� )� ���� ��� �)/��

$�+ � #� 3��%���� � �%��� ��������� /�) '���� ��%%$�����*� ?@. ��$�������, ?%�� ���������� ������ ����'��� ������ ?@. %���%� �����*��%%��� '���� ��%%�� 4)� '���� ��%%$�����*� ?0?. ����� ��'�� ��� ���H�+� �� � �2 �##�, /�� %�'��� ������� � B�?@.� ��B3 �� )� ���������� �1���# ��� ���� ������� �������2 �, =������� '�� ���%���� �������� ������% ����% ��������� �'�,� ����'���� �[email protected] ��� [email protected] ��������� /�) '��� ������ ��%%�������� ��,,2 J2 ���������/�) �1���# ���� �%�, ���/�%�$��� �;4, �%���� ��,4 '�������2 ��, 4� '������� �%��� �*%%�� ����2 /����� ���%�� ��� ����2�$��� ���'),� -������ ����� ��� ���� ��� �)/�� ;�%�$��� ��%����������� )� ���� � ��� ���������� ������'� ��� )��� �������� �%���2����'����� ��� ������'� ��� / �������� �%����

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

: #�� 0�� � �%�

Page 5: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

5��� �����

=� )�� ����2 /� )��� ������� � )� �%� � ?=$?@. ��

'���� ��%% 313 ��'��%%��'� ?������ ������'���� )���

�)/� )� )� ������ � )� ?=$?@.$������� ������%%�%��

��%����$���%����' ����� ������'�� =?� ����'� ���

�������� �� '���� ��%% ��'� �1%� �� � �2 �## � 9�%��

�� � �2 �## ,2 ��� )� =?� %���%� �������� �� '���� ��%%�

�%%/��' 313 ������ �@�� �� � �2 �##",� ;� )��� ���$

����%� �)���������� / ?=$?@. ��B3� �!�)#*� ��� �,

��� '���� ��%%$�����)�� ��������% ���'���� �!= �������

�?���% �� � �2 �##�,� 1) � )��� �)/ �)��)����%����%

2:$����)��)�� )���%����' ������ /)�� ��������� )�$

��%'��%� �� += � � �-���� �� � �2 �###, ���'��� �,� =�

������2 � )�� ���� �)/� )� B�?@.� ������ �� ��)�����

�� )� ������ D����� ��� )� )�� ��)���� �����%%�

��������� /�) )� ���� � 313 � ����% ������� ���

)� '������� � 313$������� ���%%���� �� ���%��

��%���� �8�������2 � � -���� �� � �2 �###,� 3� �������

������ /��� ��)�� ������� � ���� � /��� ����� � )�

��� � ��)����� )� ��') '������ ��$�����*� ����%�2 ��

)�� /�+ /� )��� �����%� ��������� )� E����� �

/)�)�� ?=$?@. �� ���%��� �� 313 ��'��%%��' �� ������%�$

��' )� %���%� � � '���� ��%% ?=$?@. �����������' ����%

���������

)�������� � !�)#*� � )3.)#* �-������� � ����� �� �

��'��� � �)/� )� B�?@.� �� ������� �� �����%��

���������� � ��%���� ��� ��)���� � ���������� ��

�)��)����%����% 2:$����)��)�� ��� �)��)����%�$

���%� 4)�� �� �����% � �%% �%�� ?=$?@.� � ��� �)����$

������ �5�������C$-���� �� � �2 �###� 5���' �� � �2

�##:� H�+� �� � �2 �##!�� ���)�' �� � �2 � �� ?���% �� � �2

�##�� -)� �� � �2 �##:,� @�%� �� +�/� � )� ��'�%���

���)������ � �%�� ?=$?@.� /)��) )��� ��%����%� ����%�

������� %��+��' �� ��'�%��� ������2 �%)�') �� $��.

9������ ?=$?@. �����2 34?@.� �5������ �� � �2 �##�,2

��� )��� �� B$������% 0� )��� )� �� )�') ��

��������� �� ������ ����)�' �� � �2 � �,� 4)��� ���

��%��%� ������ � ?=$?@.� ��� �����%�2 $��9������

)�� � %��� ����� ?=$?@.� �8��%%��$����� ��� ?���%2

� �,,� =� != ��9���� ��� != �������2 / ������ )���

���� ������= 4)� / ��B3� ��%��� ��� != �������

��������% ���'���� ����� ?=$?@.� )� ��� ������%�

����%�� �#�I �������% � )� ���� ���� %���%, ��� ���� ��

��C� �� �%� �� +�� �?���% �� � �2 �##�,� ;� ������ � �%�$

�%��% ������ B�?@.�2 /)��) ������ � ���'%� ���� �

;����� �%� � )� �������� �%���%�� ���� ���'���� �

��� :,� 3� /�%� �� ������� �� )� �%�� �������%

��E������2 )� ������ ��������� ����� �) B�?@.�

��� � ���� � �)/�,�

?=$?@. ������ )�� ���� ������ �� �) )� �%��%� ���

)� �������� ������� � ������ ��� $��9������

����)�' �� � �2 � �,2 ������ �-)� �� � �2 �##:,2 *�����.

����� ����� �5�������C$-���� �� � �2 �###, ���

�� �H�+� �� � �2 �##!�,� ;� ���� ?=$?@. �����

�� ���%�����%� %��%���� �� )� �������% ������

�� � ��%%��, � ���� %��� ������ ���'��� �,2 ��'$

'����' )� � �� �������� ��������� 3%% �%�� ?=$?@.

��E������ ���%����' $��9������ �5������ �� � �2 �##:,2

�� �H�+� �� � �2 �##!�,2 ������ �-)� �� � �2 �##:,

��� )�!= ������� ��E������ �?���% �� � �2 �##�, ��� ������

������%��� �%��%� )� �����% ?=$?@.� ������ 9����

)� �������� %���� � �)��)����%����% 2:$����)$

��)��2 )� ?=$?@. �������2 )� ����� �� %�+�%� ��

�������� /�) )� �%���� �������� � )�� ������%

���������� 4 ���2 �%% � )� ?=$?@.� ��%��� ��� �%���

%��+ )� ?5 ����� � )� B$������� )� �� ��%����� ��

��E����� �� �������� ���)���' � �����%��� ?@.�

�0���� �� � �2 �##",� 4)������2 � �� �����%� )� �%�� ?=$

?@.� ������ /�) �������� �)��)%����� �� � ��%����$

�������� ������ ������� ��� )��� .�$������ �H�+�

�� � �2 �##!�,� �����%�2 � ���% �����%��� �����

)� �%� %��+� )� ?5 ����� �?@.�, )�� ���� ������

�-������� �� � �2 � �,� ?@.� �� �����$�����*� ��� ��

��%����� ������ ����� ����%���� �� '�������'

.��� ���%%���� �� ����%���� �����%��� �''�� 4)��

�����%� ��������� ?@.� ����� )�� � ���� ����%�� ��'���

� )�%'� B�?@. �� �����%��� ?@.� ������ �?@.�2� I ������2 "I ����%����� ?@.�2 �#I ������2 I ����$

%����, ��� )� %��') � B�?@.�� 4)��2 � ������� )� �%��

?=$?@.� ��� �������%%� ��� ��%��� )� ?@.� �����

)�� )� ?@.� ������

> � � )3.)#* � ����� �� $�$ ���� ��

;� '������� ��� �)���������� / ����'���� ����

%���� /�) ������� ����� � ?=$?@. ����� �� '���� ��%%

������ �[email protected] ��� [email protected] ��'���� ��� :�,� 4)��� /��� �

����� ����������� ��/��� )� �)������ � )� ���%

��� %/ ?=$?@. �%���2 ����� )� [email protected] ������� ������$

���� /��� ������� �� ������%��%� ���� /�%��'� 3%%

�%��� �� ���� ��� '�������� ����%%�� ����%�� ����%

������� ����������� �����%�� )� )� ���� � [email protected]

��� [email protected] �%��� /��� ��'��*���%� %��� ��������� 313

)�� )� � ���% �%��� ���'��� :�,� 4)��� ��� ��''��

)� ?=$?@. ������ �� ��������� �� )� ��%% ����%

������� 313� 5/����2 )�� �%� �)/ )� �������%%�

�������' )� ���� � ?=$?@. ����� �� )� '���� ��%% �%�

�����%%� ��������� /�) 313 ���� �� ��)����� � ����%

�����'2 �%��� �������2 /�� ��%% �������� �����%�2

���)�� �������� �� )� �%� � �)��)�������� �� )�

���% � ����% ������� /�� ������� �� ���' �� � �

�� �,� =� /)�� %�')$������� ����% �����' ������$

���� �� ?���� '���� ��%%� �������%� ���������' � 9�?$

?5 ����� '��� �����2 )� �������� /��� '����� )�� ��

)�� ��%%� ���������' 9�? �%� �� )� �������� � : �8

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

)���� ����� *. �� $�$.������ ������ � ���� :�

Page 6: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

313� 4)�� ����� /�� ��������%� /��' )� �������

����%���%�� � =?� ��� ?=?�� 4)�� ��� )� ��� ��������

)��� ������ �������� �� ����� � )� ��''���� )�

��%��%� ��'��%%��' ��)/��� ��� ���%��� �� )� ���% �

����% ������� �� 313 �5�)����'�2 � �,� 3%����$

���%�2 � �� �����%� )� )� ������� %���% � 313 �����$

�������� )� �������� �� )� '���� ��%%� � %/ ?=$?@.

�%��� /�� ������� � �����%�� ?=$?@. '��� ��%�����'

� )� ������ � )�� ��+�/� ?=$?@. ������ )� /���

���)��� � ������� �� )� ����'����

) ���� )3.)#* � ����� �� .���� �� ����/���

��� ��� ��� '���� ��%%� ��� �� �'������ /�) )��

�������� ���%�����' �)��)������� ���%����� ��

313 ��'��%%��' �� )�� �%�� ��%%�� �����%�2 )� ���������

� �� �������� ?@. �$ )#*�, ��� $��9������ ����� ��

�������%� ����� /�� �)/� ������ )� ��)�����

����� � 313 � '�������� ��� �������) )� ���������

� ���')A�%�$�������%� '���� �-���)�C ��� .)��2 � �,�

���)�����2 )� $��9������2 ����� ����2 /�) � %����

�� =?� ����%���2 �)/� ��������� ��������� ��% �����

��� ���� '��������2 ��� �� )������������ 313 �F��'

�� � �2 � �,� 4)� �=0�G� ����� �� �� ����% �%��)$

��)��$�$�)��)����� ;)�� � ����� /�) ����%�� ����$

�� /�� ������������ �-���)�C ��� .)��2 � �,2

��������� �%��� �)/�� )������������� 313� =���$

����'%� )� @3+>&� ����� /)�� ����� 9D- �)/��

� ������ �� '���� ��%%�2 ��� )��� ���� �%��� ��� �

�)/ ��� �������� �� ����% �)���%'�2 ��''����'

)� �������� ������ ��') �� ������ �� )�� ��C��� ��

�%� ���%��� �� )� ������� � )� 313 ������� ��

'���� ��%%��

��� � )� ������ E������ )� ����'�� ��� )��

/�+ �� M;)��� �� ?@. ������� �� )� '���� ��%% 313

��'��% ��������� ��)/��N< 4)� ����%� � ����������

������ �� )�� ����� �)/2 � %��� �� )� ���� � )�

��������� B�?@.�2 )� �)���%'���%%� ��%���� %���%�

� ���� ��%���� ������ )�� ��C���� 4)�� ��� )� ��� )�

�%% �%�� ?=$?@.� �����*�� � ��� %��+ )� ���� ��������

/�) 9 ����� � ������ +����� ������ ������� ��'$

'�� )� )� �%�� ��C���� ��� ������� �� ��������� ��

���%�� ���� ��%����� 3� ������� ���% /�%� ���%�� �

������� 313$'������� �������� �� ���%�� ���� ��%����

)� ������� '���� ��%% [email protected] /)��) )�� '�������

��)�� ��%����$���%����' ��'��%2 =?�� =� )�� ���%2 )�

�%� � ?=$?@. /�%� �� ���%��� )� ������� ��%����

��'��%� 3 ���%��� ������ )� ��%% ��'��% ���%�*����

/�%� �� ������� /�) )� ������� �� ���������

313 )� /� )��� ������� �� �� ���������� ���

���)�� )� �)������ ������� �� )� ������� ?=$?@.

�%��� ���'��� :�,�

��� ����%� ��� ������� /�) ����� /�+ �� /)��)

)� �%� � ?=$?@. �� 313$��'��%%��' ��)/��� %�����'

�%������ �� '��� ��������� /�� ��������� 1� �������'

)� ��������� � ��$��9������ [email protected] -���)�C ��� .)��

�� �, ���%���� )� ?=$?@. /�� ��E����� �� ������%

������� � � ����� � 313$��'�%��� '����� 4)�� ��

����%�� )� ������ ������� �� '���� ��%%� /)��� )�

������% ��)����� � %�')$����%��� ����% �����' ��

313 ��E����� ?=$?@.� ;� �%� �'��� /�) -���)�C ��� .)��

�� �, )� ������% ?=$?@. ������ ��E����� �%����� ����$

�����%�, ���%�� ��%����� 5/����2 � )�� ��'� /� ���

���)�� �� � ����� ���� ����� �� ������� )� ��'$

'���� � -���)�C ��� .)�� �� �, )� ?@. �� �/������

� ���%�� 3�? ����� �� 313 ��'��%%��'� 4�%% � �� �����%�

������%�� )� ��������� � )� 3�? �����% ���%��� '���

���������%� ��������%� �� )� ���)���� � ���%�� 3�?

�����, � �������� /)� ����� ��'�%�� )� ������ �

)� ��C���2 /� /�%% � �� ��%� ������ )� ��%����

�������� � )� �3�?� ��)/�� )� ?=$?@. ��)/��

�� '���� ��%% ��'��%%��'� =� '���� ��%%�2 )� ������ �� %�+�%�

�� ���� ���%�� �� )��� ��� � %��� ��� �����%�

���)������ ��%���� �������� ��%���� �)����%�2 =?�2

�3�?�2 ������� ���� ������� �����%���� �)��)��

�B33�?,2 ��)��'����$�$�)��)�� ��� �����%� ����%

)���+���)��)��, �� '�������' ��������� �� ���%��

���� ��%����� =� ������ )��2 8������� �� , )��

�)/� )� )� ������� ��� ���� �� )� '������� �

�%����� �� ���� ��%���� ������� ��� )� ���������

� ���%��� 313� =� )� %�') � 8�������<� /�+2 � ��

���)��� ��� ��������� )��+ � 313$��'��%%��' ��)$

/��� �� ����' �)���������� �� L����%� �������� ��)��

)�� ����' )��� /����� 3 L����%� ��/�+ ��)�� )�� �

)������)���% ��'�� ��)/�� /�%� ���� ���������%� ����$

*� )� �%�� �5�)����'�2 � �,�

,6�������� ����� ��

) �� �������

!������ ��9���� ��� ;������� �! /�� '�/� �� @����'� 8����� ����� L������� %�') ��: �8 ��� �����, /�) � �" )�)�����2 �:�. ���A� �. ��')� 5�C�'�� 4� �%��� /������� �� �%% ����'���� ���� ���%���� ��%��� ���������� ?��������%�� /��� �+�� ��� %����� � : ���� ���������%�� ��)� %� �%���, � ���$�)������

@��� ����� ����������

9-4>B�?@.� ����� ����� /�� ����*�� �������%%� �� �������%���������� �� 9-4>B�?@.� �-���� �� � �2 �###,� += � � 1@�� ��$�����' �90F 4$�$B�?@.� /�� ��%���� �� �G4 �4�����2 �" ' %������� �����2 � ' %��� B�.%2 : ' %��, �������' : �' %�� ����$��%%�� � ���. ���% ��" � =�����% �$�$%$)�'�%�� ����������=?49, /�� ����� � �8 ��� ��%%� '�/� �� ) � �!�.� 4)���%��� /�� �������'�� ��� )� ��%%� ��C�� � �� �.� ?�%%� /����$��������� �� ��I 4��� F$� 2 ������� � ���2 �������'�� �� � �� �: ���� 4)� ����� ����� /�� ����*�� ��� )���������� � 9-4 ����� �3����)��$?)�������2 1��+�2 DH,��� )����� ��'���� �������� �������' �����������<�

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

:� #�� 0�� � �%�

Page 7: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

���������� B�?@.� ����� /�� ��������� �� � : +�� 8;.����� �%��� �8�%%����2 5���2 DH, ���������%� � �' �%���

)3.)#* ������

?)��)����%����% ��� �)��)����%����% 2:$����)��)��)���%����' ������ /�� �������� �� ��������� �?���% �� � �2�##�� -���� �� � �2 �###,� 4)� ������ ������ �������: �8 4��� ��%��� ��5 "� >"�:,2 �� �8 �)��)����%6�$�57��$��% 2:$����)��)�� � @$�$�)��)����%6�$�57����% �� >� ��� ��%��, �� ����%%�� �%��� �2 � �8 ���� .���2! �8 H.%2 ��: �8 8'.%� ��� � :> �� �' � 9-4>?@. ���������� � � �. �� � >�: ��� ����� ������� /)�� )� ��������� /�� �������% �������� ��� ��� ���� � ������

$��9�� ������� �� ����������

������ /��� ��&���� ����������%� /�) �: �' � ���������9-4>B�?@.� ����� ����� /�) �� �E��% �%��� � ������<���&���� ��� ���� ��� ���� � �!$��� ������%�� -���� /���%%���� /��+� ���� )� *��% ��� 3� ��*��� �%���2 ��$����� �� %��+��' �% �%��%� ������ ������� ��� =?49$������� += � � 1@�� ��%%� �������' �90F 4$� 1�$��� 3�*'�%� ����� �������' ������������ ���������2 /�� ���� ����� �������% ��� 9-4 ����$������' ��������� ��� ��%%�%���� ����� /�� ������ )���� ��� � �% 41- ��: �8 4���>5.%��5 �� ,2 �: �8 B�.%, ���$�E��%������ ����� ������ /�) � �%41- '��� � *��% �%��� � � �% �� K : ��%��� /�� ���� ��;����� �%�2 � K � �� �����%��%�����,�

+������� ������� �-������ �� ����� �� ��������

���'���� /��� �������� ����' )� �%����� ��)� �� ����������� H�+� �� � � ��##�,� 3 �����%�� �� /�) L������� ���������*���� )� )� �%� ���� ��%%� /��� '���� ��%%� �� �)/�,�

) �� ����� ���������

@��� ����� � ��������% ���'���� �� �', /��� ������� �� ���: �% ��� �� �: �% �� @����%� ������ ���: �8 4���>5.%��5 "�!,2 I �/A�, -�-2 �I �/A�, �$�������)��%2 � I '%����%2 � �I ����)��% �%��, ��� �������'�� � �� ���������� � �� -%��%� ��� �������% ������ /��� ������� ��������� �� ��������� �-��� �� � �2 �###,� -���%�� /��� '��������� %�E��� B� ��� : �% '�� ������� ������ ������ 0�����/��� *%���� )��') 8����%) �.�%���)��2 B��')��2 DH,��� )�� �������'�� � � �� 4)� ��������� /�� �������'��� � � �� � ���2 ��� )� ��%%� /�� ����%��� �� ��$������$��� ������� 4)�� /�� ����'���� �� )� �������% ������ ���)� � � ��������� �� )� �%��%� ������� 3%�E�� /�����C�� �� %�E��� ���'�� ��� ���� � �� �.� ?���� �������$��� /��� ������� �� 4.3>@/�� ��)��

+ ������������ ������ 9 ���� �� �������

?���� ����%�� /��� ��&���� � *��% ��������� � ��@����%� ������2 ���%��� �� -�->?390 � ��:I �����$'�%��1�$���, ��� �%����)�����%%� ���������� �����%%�%���5����$0.@2 3����)��, �� )� �������� � �: �8 4���>5.%2�5 !��2 � �8 '%�����2 � :I -�-2 � I ��)��%� ��%��� /��������� /�) ��I �/A�, ?����� -2 �I �/A�, ���)%������ ����2�I �/A�, ��%�)��%����%�� ��%�)��%����%�� ���� �����%��� ����$������ ������� ��%��� /��� �%�+�� �� �I �/A�, �����2 �+�������%+ �� 41-2 � :I 4/��� � � 4)� �%�+��' �%��� /�� ���%����/�) ����) �%��� �%�� �������� ��� �'���� �� � )2 )��

/��)�� )���� �� : ��� �� 41-2 ��� )��������)$���������$%��+�����$����� �������� ������ �?���'�, /�� ����� � ��%���� � K �: �� � )� 4)� *%��� /��� /��)�� )���� �� � ��� ��41-2 ��� )�� ������ ����' ?����� -������'��% ;�� ?�� ��������� 5����*%� 0.@ �3����)��,� ��%��� /��� ������ /�)�I �/A�, ���� �%��+2 �I �/A�, ���)% �%��$�%��+2 I��)��%2� I ����� ����2 ��� )�� ��$������ /�) I ��)��%2 � I����� ���� ��*�� �E��% %����' � �������

3��� �� ����� � )3.)#* � ��� ������

-����� � %��� /��� *��� �� I �/A�, ��������%��)���2 ������)��)�� ��5 �� ,2 )�� ���������� ����������%� � I � : I� ! I � � I � � I �)��%2 )�� K � � � K � � : K: � ! K � � � K � � K 5���%��� ����)�� -�����*�,K�)�$�%� 4������ /��� ���������� : K : 5���%���K/�� ��� )��������� /�) �%�� /�� �� � ) � " �.2 ���������� ��%��2�%�� ��� �������� -����� /��� ��$)������2 �%�+�� �� I�/A�, 1-3 �� �)��)��$�������� ��%��� �?1-K � �8 B�.%���� �8 H.%� � �8 B��5?� � ��! �8 H5�?� � �5 ���, ��� ����$���� /�) ���$?@. ������ �� � )2 /��)�� �� ?1-2 ��� )���������� �� � ) �� �%+�%��� �)��)����$%��+�� ���$����� ���$����� ������ �� � � K : ��%���� 3 ����$������' ����� /�������%���� /�) ������2 ��� ������ /��� �������� ����' ���')*�%� �������� ��%����� 1F:�, ��� ���'�� /��� ��������)'���)���%%��

) �� ����������

!�)#*� ��B3 /�� %�'��� �/������ � )� ����� ��'�� �)� '���� ��%%$�����*� )+)* '��� �H�+� �� � �2 �##�, �� )� ���������� �1���# ����� )� '��� ������ �1��D@?@.�� 4)���%����� /�� ��������� �� �%����)����� $��9������������������ @13 ��� ���� %��� ����� ��������� ����������� ��8�)�� ��� 5���)�� ��## ,� -������ �����������/��� ������� � /�) )� �1���# ���� �%�� '������ ���%�%���� ?%��� /��� ��'������� � � �' %�� +��������2 ���?.� /�� ���� )� ��*�� �������� � )� ����'����

3������ ��� �� ���� � ��������� �9���

@��� ����% ��������� ��� �)���)��� ���� � �%���/������������ �� =�93 �.����$��2 ?? -�����,� 4)� ������� �� )�%��� �)����� /���K ��� � ������ .�� ��������� � �: ��������:�.� %�') ������� :: ��% �)�� ��� ����� �/)�� %�'),���%���� )������ � ::I ��� '�� L/ � � �% ������ 4 ����������% �����'2 �%��� /��� ���+$������ �� � ) ���� )�=�93 %�') ����� ����' �/��)�� �� =�93 ������'� /��� �+�����% � ����� ��� � ����% ��������� /�� ����)��� 3��%����� 4 ��� 4� �%��� /�� ������� � � / ��'����� ����'� �����) ��������� ��� ������� )��� /�%�$��� �%���� ����$��'� /��� �+�� ��� )��� ��� %����� �)��� ���) %����� �������, � ���������%� � $/��+$%� �%���� 4)� �%��� /��� )�����&���� � �$��� ���') ����� �� ���������' ���%� /�����'2��� )� =�93 ������'� /��� ��������

+������� ����� 9�������

3�����% ���������/�� ���%�� ��� "$ !$/��+$%� ���� �%������ ���� �� � �8 80-AH�5 ��5 "�:, � � �. ���% ��E������ 4������'�� )� ����� � )� ������ � 3132 )� ��������% �����/��� �������� �� � �8 80-AH�5 ��5 "�:,2 � �8 H.% � )���������� �%��� � ��+ � �: 8 � ���A����$�������� ���� �%�$�� � �:�. /�) �%%������� � �: ��% ��� ����� ��� ������� )� ������ /�) .��$���� ��� �� � )� 0�������% ������ /���

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

)���� ����� *. �� $�$.������ ������ � ���� :�

Page 8: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

����� � � �������� �%���2 ��� ����% �������� /����������� �� ��������� �� 8�3���) �� � � ��##:,�

��"�����+����

4)�� /�+ /�� ������ �� )� 1���)�%'� ��� 1�%'���%-������� �������) .����% �11-�.,2 DH� ;� )��+ ��� 0� 8���)����� 8� ;��/�) �� )�%� /�) =�93 ���%�����

)�����

����� -�%�� � � .���� ������+���� ���� .�� ������ &�� ��������/�� /��+� 7�7�� -����� ,� ��� .������� %�1� �� �, 3 ��*��� ���'�� '���� ��%% ��%���� ���%%��� ��������� ������ ����%�������� !�����2 #��2 � :�>� :��

����� -�%�� � � .���� .�� ������ &� �� ��� �� , 3%����� �����%��$�����*� '���� ��%% ��%���� ���%%���� ��� ����%�%���' �� $��9������ ���( ����� ������2 892 ���!>�� ��

�� ������ 5�� ��###, 9��� ��%�����'K �B3 ��+�� � ������*���= �� = 92 �:##>�" ��

������ ��)� �� �, .�%%�%�� ��'��%��' ��� �%��� ���% ������% ������� �� �%���� $�= >��= *� ���= �� = �*2���>� ��

��������)� �� �, .��� ��'��%%��' ��� ���% � '����$��%% �%����� ����% �������� *���= ,��= ) �� �� = !2 �#">� �

������ ��)�� /���� -� ��� /������� 5�)� ��## , ��������%� �����$���� � H� �)����%� � ?���� ����% '���� ��%%� �%%/��' )��)%���� � ��'�� ����% �2 2:$����)��)��� !�����2 !#*2�"">�"#�

���� �� ��� ������� 5� ��###, 4/ ������� ����%� ������ �)��)%����� . ��)����� ������ )� ���%��� ���'���������� ������= ������= >��= *���= *�2 � >� �

,���� ��:�� ������� :�� � �+� )�� &����� �� ��� 2�������� )�����##", .����% ������� � � �����%��� �)��)�������$���$��*� �)��)%����� . ��%�� !�����2 !8;2 :#:>" ��

,0���� ���������������)� ���������+���� ���� �� �, .�%�������%%���� �� )�')�� �%���� *���= ,��= ) �� �� = #2 �:> � �

-������ .�� $���"�� ��5�� )��� ��5� ��� /���0��� ��%� ��##�, �%�� ��%���� �� ��'��% ��������� � *��� �� '���� ��%%��) �� *� 2 !2 ���>� �

-������ .�� )��� ��5� ��� /���0��� ��%� ��## , 0%����� ����%����� ��%���� �� ��'�� ��%���� � ��'�� ����% ����)$��)�� ������� ����% �%����� !�����2 !#*2 �"#>����

��������� 5�2���� ������ ��� &����� �� ��� ������ ��)� �� , .���

�)����%� � )� �%���� �������� � ����% '���� ��%%� ���������� �� )�����%���C��� ��� �������� ����� )��= !�� =$���= ���= ��$2 9<2 #"�> #���

������=(.��������� /�.���� 5 ��� .�����(������� ��������� � �> �=(.�?���=� %� ��� ������(@��+��� @��� ��###,H����� ���%���� � �)��)%����� . ��� *���������� �������������� �� ����' �������� ������� ) �� )���� = � ;2� �:>� !��

������+���� ���� �� �, 9���� ��%% ��'��%%��'� *� 2 �;<2 ���>�� ��������� /�� ���� "���� ��� .������� 5� ��� .����=�"�� &� ��##�,3?@.�� � ��� ����� ������������.������� ����� �.���� *� �� ���������� � �-������� � ���������� �� 5�� ������� � $��9������ ��� ���� ) �� � = �� = !#2 ��:>�! �

�������� /�� :���� �� ��=�+ ���� /� ��� .����=�"�� &� ��##:, 3'��� ������' � �)��)����%����%$�����*� �)��)%����� .�� ������� �� ��)������ ��� ��% ����� �� $��9������ ��� �.��� )��= !�� = $���= ���= ��$2 9 2 �# �>�# ��

� ��+� �(��� /��� ��$�� ����� )�� ��� ��? � -�-� ��##:, 8�%��%��)��)�������$�����*� �)��)%������ . �� � ��K�)�������C��� ��� �����% ����*����� ) �� <= 82 �:�>�"��

%����� /�� )������ .�� �������� .��� ��� -������ .� ��###, 3��$����� ���� ��'��% ��������� �� '���� ��%%� �� ������� ���)��)%����� � ������� )��= !�� = $���= ���= ��$2 9*2���#�>���#��

% �+� %�(7�� &��� 7�(2�� &��"� %���� ����+� %�(A�� 7� �+� %��.������� %�1�� ����+� 1� ��� �� 7� �� �, ?)��)����%����%�$ ��� $�)��)�� ��� ��E����� �� ����% ����% ���$����� ) �� *� 2 �#2 ��##>� ���

&��"�� %�� ������ �� -���� %�,� ��� � ���()���� �� ��##!�,8%���%�� ��� ��C����� �)�������C��� � )��� �)��)��$�����$�����*� �)��)%����� . ������ ��� ��� ) ��)���� = ��*2 ��#>�: �

&��"�� %�� ������ �� ������+���� ���� ��� � ���()���� ����##!�, .���A�)��)%����$������' �.$�, ����� �� ��%��%��%�� ������K ���% ������� � )� ��%����$������' ����$����� ) �� � = �� = !*2 "��>"���

&��"�� %�� ���0���� ��%� ���� ���()���� �� ��##�, ?� '������%%� ������ �����' ��% �� � ���%�� �)��'� �� )� ������$��� � '���� ��%��� ����� ����%��� ��� ��'� ��'�%�$��� ) �� <= ��2 !��>!!��

��"�� ���� �������� ��)�� ����� -�%�� .������ 5� ��� ����(��+���� ���� ��##!, 3������� ����$������� ����% �%����������� �� ���%�� 3�?$������ )��= !�� = $���= ���= ��$2 9'2�:!��>�:! ��

�� 7�.�� ���� 7���� . �� .�� �� %�� �������� .���� %�� �:��&����� %�$� ��� ����� )�� ��##", 3������� ����$������� �)�$�)������� ������ �� '���� ��%% ���%��� � ?���� ��9��) �� )���� = ��;2 #!�>##"�

������(����� $�� ���)����� ,���� ��� ������� ��� �� ,=���% )���+���)��)�� �� � �)���%'���% ��'��% ��'�%���')� H�$��/��� ��������' ��������� �� '���� ��%%�� )��= !�� =$���= ���= ��$2 9<2 !"!�>!"#��

���"����� ��&� ��� �������� �� ��###, 4)� �)��)%����� . ��)�$��� D����� ��)���� �)��% ����$������� �%��%� ��������<= )������ = +-�= ���= 892 ���>��!�

���)����� ,���� �� , 313 ������� ��%��%� .��� L���� ������% '���� ��%%�2 ��''����' ����%�� H� ����, ��%����� )��=!�� = $���= ���= ��$2 9<2 ���"�>���"!�

������� ���� ��� ������ ����2� ��## , $��9�������� ����%�$�� ��)��E��� �� �%�� ������� =� ) �� � ��� �� �� ������ �9�%���2 -�1� ��� -�)�%����2 ��3�2 ����, 1�%'���KH%�/�� 3������� ?��%��)���2 ��� �>#�

�������� ��)�� ������� � ��� ������+���� ���� ��## , 3����$��� ����$������� �%����� � '���� ��%% ���%�� .��� ������������% �%����� !�����2 !#!2 �!">�!!�

�������� ��)�� ������� � ��� ������+���� ���� ��##�, J����$%����' �)��'�� �� ���%�� ���� .��� �����' )� ������� �����% '���� ��%%� �������� ����� ) �� *� 2 #2 ����>�����

�������� ��)�� 2��� ����)�� /������ %�,� ��� ������+���� ������##:, -���%��$������� ���%%���� �� '���� ��%% ���%��$������%����� ) �� *� 2 <2 �� �>���#�

� ���()���� �� ��� ������ � �� �, =���% �)��)%���� ���$�%��� �� $��9������� .)�������C�� ��� ������ ������ �����% �)��)%���� +����� ��� �)��)�������$�����*��)��)%����� . ������� ) �� )���� = �!;2 ��> "�

�+� �&�7�� ���� &�� �������� ��)�� ������ ��� ������+���� ����� �� �� �, ���')$������� '���� ��%% ��'��% ������������%��� ��)��'����$�$�)��)��� !�����2 #�;2 :#">:##�

:�����+� ��� .���������� ��� ������ � �� �, B$������% 0�$)�������� �� ��E����� �� �)��)�������$�����*� �)��)%�����. ������ �� $��9������ ��� ���� @+�� #���= #9<2 �":>�� �

������ ���� ��� ������� ��� ��##�, =����*���� � �$�)�$�)��%��� �)��)������ ��� ����% �)��)��� �� ���$�% '���� ��%%�� ) �� <= #2 �::>�"��

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

: #�� 0�� � �%�

Page 9: Phospholipase C is required for the control of stomatal aperture by ABA

������ ���� ��� ������� ��� ��##:, 8���%��� � �$�)�$�)��%��� ��� $�)��)��%��� �)��)����%����%� ������% '���� ��%%� � *��� �� ������� ) �� <= 82 �:> ���

��� B�(��� � ����� 7�� �����+� -�� /������ .�� &� ���� ��� �����-�%�� -����� ,� ��� .������� %�1� �� , .�%���� �)����%� ���$���� �� )���'�� ������� ������ �������� ���� ��'��%%��' ��'���� ��%%�� !�����2 #;*2 ���>�� �

������ �� &��"�� %�� � ���()���� ��� ������+���� ���� ���-���� %�,� ��##�, =�%��� � / ��B3 �%��� �� �)��)����$���$�����*� �)��)%����� . ��� ��������% ���%� ��������������� F#:!��, ��� '���� ��%%� ��������� ������ G��#��, �!������ �������� ) �� )���� = ��#2 � !�

������ �� .����� �� ��.�� ����� ��(�� ��� .�������� �� ��##�,?%��)��)������� �)��)%����� . �� �%���� ���������� /)�� � ������� �������� @�,� ) �� )���� = �;;2 ��#">�� ��

� �������� $���� -���� ��� ��� +���� �� ��� -�==���+�� ������##!, 0������� �� ������� ������ � D����� � �)��)%�����. ��� ��%���� �)����%� �� )���� �%��%��� ������= )�����.� = '*2 � !�>� ! �

.����=� %�(�� ��� � �� ��(�� �� �, $��9������ ?@.� �� ��E������� �������� �������� �������� ���� ��'��%�� ) �� *� 2 �!2�� �>��: �

.��+� 7���� B��+� .�C�� ��� 2�C�� � ��+� ��)� ��� 2��+� D����� �, ��'�%��� � �%�� /��� %�� �� ������%���' )���������� � �)��)%����� � �%�)�� ) �� <= 82 ��:>� �

.� ����� ���� ������� ��-�� ������+���� %�� �6� ��%�� )���� %��������� ����� .����� &� ��� ���� $��� �� �, [email protected] � �����$

�����*� ��''�� � .��� ���%%���� �� �''� ��� ����� ����%$����� ���� ����2 � 92 �:��>�: �

.������� %�1�� ����� -�%�� � +� 0� 6� @�� &��"� %��� ��� 2��(��� 5� �� �, 9���� ��%% ��'��% ���������� $�= >��= ) ��)���� = ) �� � = �� = '*2 "��>":!�

.������� %�1� ��� ��+������ .� ��## , �������� ��������� �����%�� ��%���� � '���� ��%%� �� �������� ����K ������� �����%����� ��%���� �������%� �)����%�� )��= !�� = $���= ���=��$2 8<2 #� :>#� #�

.��� %�� -��=���� )��� ��� �������������� ��&� ��##:, .)������$����� � � �%���� �������� �������� �)��)�������$�����*� �)��)%����� . ��� ������� ) �� <= 82 �!�>�# �

.����� ����� ����� ���� ��� ������ ���� ��###, =�%��� � �B3��� ����� ��� '���� ��%%� �!������ � ����� ) ��� = �� =>��= �<2 ���>�!��

.��6�� 1�� ������ �� ����+����� ��� -���� %�,�� ������+���� ������� �������� ��)� ��###, 3������� ���� ������� ���%%���� ��'����$��%% ���%�� ���� ��%���� )� ���%�� �)��)�������$�����*� �)��)%����� .� )��= !�� = $���= ���= ��$2 9*2���#>��! �

2��"��,������������%�)���������.�%� ��##!, B���%����� ������� )� ������ �)��)%����� . ��)����2 D�����2 � ��������3 ��, ������$������� ��'��% ��������� ����� �� .)�����)����� ���� ��%%�� ������= )������ = '*2 � ::>� "��

D���+� ��� �� ��(��� 1�������� ��� �� ��� B���+� � ��� B� � %�(&��� �, @3+>&� ������' �� ����% �%��)��)�� �$�)��)�$��� �� � ��'���� ��'�%�� � �������� ���� ��� ����� ��'��%%��'�� $��9������� 7��� ���= �'2 �#��>�#! �

� 1%��+/�%% ?��%��)��' @�2 �� ) �� <��� 2 �� �,2 !#2 �>::

)���� ����� *. �� $�$.������ ������ � ���� ::