INVESTIGACIÓN ORIGINAL Revista de la Facultad de MedicinaUniversidad Nacional de Colombia1997 - Vol. 45 N° 2 (63-69)

Nueva técnica colorimétrica para la determinación de nitratos en el plasma

Fernando Palomino, MD., Profesor Asistente, Unidad de Fisiología. Manuel Rojas, MVD., Docente Ocasional, Unidad de Toxicología,Departamento de Ciencias Fisiológicas. Facultad de Medicina. Mauricio Beltrán, BLe., Laboratorio Clínico Central. Hospital SanJuan de Dios. Universidad Nacional de Colombia.

Se presenta una nueva técnica colorimétrica para la cuantificación de la concentración del ión nitrato en el plasma. El método sebasa en la reacción de nitración del ácido salicílico en medio ácido con la formación de un compuesto con un pico de absorción en410 nm. El límite de detección es alrededor de 0.1 mmol/l y la linearidad llega hasta 9.46mmol/l de N03 . Sehace una comparacióncon otras técnicas publicadas para la determinación de nitrato.

SUMMARYIt presents a new colorimetric technique for quantification of plasma nitra te ion concentration. The method is based upon thenitration reaction of salicilic acid in acidic media with the formation of a compound with an absorption peak at 410 nm. Thedetection limit is about 0.1 mmol/l and linearity up to 9.46 mmol/l N03. Itmakes a comparison with other published techniquesfor nitrate determination.

INTRODUCCION

En el pasado el ión nitrato (N03) hasido de interés como sustanciacausante de intoxicaciones agudaspoco frecuentes en humanos, peromuy importantes en el ganado(1,2,3), siendo responsable de estatoxicidad su capacidad para relajaral músculo liso y para oxidar lahemoglobina a metahemoglobina(4,5).

En las últimas décadas se ha venidodando atención al nitrato(principalmente al contenido en losalimentos) como agente etiológico deladenocarcinoma gástrico. Se hadocumentado suficientemente unacorrelación directa entre la ingesta denitratos inorgánicos y la frecuencia decáncer gástrico (6,7,8,9,10). Losnitratos presentes en el estómago sonreducidos a nitrito, principalmente enpresencia de hipoclorhidria (11). Elnitrito, a su vez, reacciona con aminasorgánicas para formar nitrosaminas(12,13), las cuales ejercen un efectocarcinogénico directo sobre la mucosagástrica (14,15).

Más recientemente, el incremento delinterés científico sobre el ión nitratose debe al descubrimiento de laimportancia fisiológica del óxidonítrico (NO) (16,17), el cual se hacaracterizado como mediador de lainflamación y como agenteantitumoral en la respuesta inmune(18,19,20,21), como neurotransmisorcentral y periférico (22,23) y comoregulador periférico de la presiónarterial y del flujo sanguíneo(24,25,26).

El producto estable principal delcatabolismo del óxido nítrico es elnitrato (19,21), por suerte que laproducción de NO se sueledeterminar midiendo el nitrato.

Los hechos citados han obligado abuscar técnicas de laboratorio quepermitan una determinación fácil,sensible y lineal de ni trato en elplasma y otros líquidos biológicos.Diversas metodologías se hanutilizado para la determinación denitratos en especímenes biológicos,aguas, suelos y alimentos. Dentro deestas se encuentran técnicas

colorimétricas directas e indirectasluego de la conversión de nitrato anitrito (27,28,29,30,31,32), fotomé-tricas UV (33), cromato-gráficas -gas/líquido y HPLC- (34,35,36) yelectroquímicas (37).

Varias de las anteriormentemencionadas presentan deficienciaspor falta de sensibilidad o delinearidad, o bien, por escasareproducibilidad. Otras requierenequipamiento complejo y costoso y,todas son laboriosas y demoradas,dificultándose por lo tanto el estudiodel metabolismo del óxido nítrico ydel nitrato, así como el diagnósticotoxicológico de este último. Estasconsideraciones, reforzadas por laexperiencia previa con varias deestas técnicas, motivaron eldesarrollo de una metodologíacolorimétrica sensible, rápida,sencilla y al alcance de loslaboratorios sin equipamientocomplejo, para la determinación dela concentración de nitratos en elplasma (con posibilidad de adaptarsea otros líquidos biológicos) y cuyascaracterísticas se presentan en este

63

F. PALOMINO Ycols.

trabajo. La metodología delaboratorio en cuestión ha sidoprobada y utilizada en trabajos decampo en estudios sobre la nitrato-nitrito toxicosis en ovinos y bovinos(38,39) .

Para el desarrollo de la téc nica sedecidió explotar la reacción denitración de los compuestosaromáticos, la cual se usa para ladeterminación de la concentración dealgunos de estos, p.ej. el salicilato(40,41), y que fué utilizada porCataldo y cols. (31) para ladeterminación de nitratos enextractos acuosos de tejidosvegetales.

METODO:l-Muestra:Plasma (separado próntamente)

Anticoagulante : EDTA al 10% (p/v)en agua, en la proporción de 4 gotas(80 ul) para 5 ml de sangre.

2-Desproteinización :Cloruro mercúrico (HgCl)al 5% (p/v) en aguaCarbonato de sodio 0.5MPlasma

1.0 ml1.1 ml0.9 mI

Agitar, dejar reposar 2 minutos ycentrifugar a 1500-2000 G durante 5minutos. Se obtiene un sobrenadanteincoloro y libre de turbidez, el cualse utiliza a continuación para lareacción de color.

3-Reacción de color:a) Reactivos:

Reactivo A: Acido salicílico al 8%(p/v) en ácido sulfúricoconcentrado.Reactivo B: NaOH 2.5 N.

b)Reacción:Primera fase:Mezclar en tubos de ensayo 16 x 150mm:

64

Reactivo ADeproteinizado

0.4 ml1.0 ml

Esta reacción es exergónica y debentenerse precauciones con lassalpicaduras de ácido sulfúrico.Dejar reposar 30 minutos.

Segunda fase:Agregar al tubo de ensayo 8.0 ml dereactivo B ; mezclar bien y leer laabsorbancia a 410 (405-415) nm delongitud de onda, contra blancopreparado utilizando aguadesionizada en lugar de plasma.

Calcular la concentración de nitrato(N03) en la muestra a partir de unacurva de calibración realizada consoluciones de nitrato de sodio(estándares) en solución salinafisiológica (NaCl 0.9%) conconcentraciones entre O y 660 ppmde N03. Estos estándares decalibración se preparan a partir deNaN03 anhidro grado analítico. Elestándar de concentración cero estomado como patrón negativo.

La concentración final de ácidosalicílico obtenida antes de la lecturafotométrica es 0.34% (246.19 mM).

RESULTADOS

l-Caracterización del compuestoformado:

El espectro de absorción del ácidosalicílico (disuelto en ácidosulfúrico) se presenta en la Figura 1ay, aquel del compuesto formadoluego de reaccionar con el N03 (1.0mmol/l en solución acuosa) sepresenta en la Figura lb.

El ácido salicílico disuelto en ácidosulfúrico presenta tres picos deabsorbancia : 206, 232, Y 296 nrn,característicos de la di-substituciónsobre el anillo aromático (Rl =

n~~~--~~-T--~~~--~~

Figura la. Espectro de absorción del ácidosalicílico disuelto en ácido sulfúrico.(hp diode array; 2nm ancho de banda).

.c

~rr----r---~---r----r---"

460prr,

Figura 1b. Espectro de absorción del compuestoformado tras la reacción del nitrato con el ácidosalicílico en medio ácido.(hp diode array, 211mancho de banda).

COOH Y R2 = OH en posición"para") con un corrimiento hacia elrojo de la banda primaria (203.5 nm)por el pH ácido. El compuestoformado luego de la reacción muestracinco picos de absorción: 208, 232(solapado), 260, 298 Y 410 nm. Lospicos a 208 y 298 nm sonequivalentes a aquellos del ácidosalicílico en 206 y 296 nm (eldesplazamiento de 2 nm en ambospuede interpretarse como uncorrimiento al UV por el cambio depH generado por la adición final deNaOH). La aparición del pico en 260nm correspondería al corrimiento dela banda de 232 nm del ácidosalicílico debido a la nitración delanillo bencénico en posición "meta"y/o "para" al carboxilo (42). El picoobservable en el visible (410 nmmáx), correspondería a un

NUEVA TÉCNICA COLORIMÉTRICA

desplazamiento de 114 nm hacia elrojo del pico a 296 nm del ácidosalicílico por nitración en posición"para" al hidroxilo (42,43). Lapersistencia, aunque con intensidadmuy disminuída, de un pico a 296-298 nm indicaría la remanencia demoléculas sin reaccionar con el N03,o bien, la nitración en posición"meta" al hidroxilo, en cuyo casosucede un corrimiento de 65 nm dela banda a 232 nm (42). Porconsiguiente, en las condiciones deensayo, sucede la formación de loscompuestos 1-OR,3-Nitro benzoicoy 1-0R,4-Nitro benzoico (el y czrespectívamente en la Figura 2),siendo responsable de la absorciónen el visible (410 nm) el compuestoe2. Las estructuras propuestascorresponden a productos denitración de la molécula del ácido

25 0.40350 0.80675 1.209100 1.612150 2.419o

340 ~ 4.0crr 300 4.838

600 9.467

Figura 3. Detalle de la región NUV- VIS delespectro del compuesto formado por nitraciándel ácido salicílico.(hp diode array; 2 nm ancho de banda).

Rev Fac Med UN Col 1997 Vol. 45 N° 2

Tabla 1. Valores de absorbancia obtenidos paraconcentraciones de nitrato entre 25 y 600 ppm enagua.

N03 (*)ppm rnmolfl Absorbancia C.Extinción

0.030 0.07440.065 0.08060.101 0.08350.125 0.07750.210 0.08680.405 0.08370.818 0.0864

x= 0.0818

Abs

1.0

(*) UAbs/mmol/l/cm

diferentes a 410nm. A lalongitud de ondapropuesta parala lectura colori-

08

métrica no 06

existen in ter-salicílico. La nitración del benceno f e r e n e i a sy sus derivados sucede por reaccióncon el ácido nítrico en ácidosulfúrico concentrado (44), en la cualel reactante es el ión nitronio.

COOH COOH

O, 'OH (1oHN03---"--+)0 el

Figura 2. Estructuras propuestas, con base enespectroscopia de absorción UV- VIS, para elcompuesto formado por nit raci án del ácidosalicílico.

El espectro detallado en la regiónNUV -VIS del compuesto formadoaparece en la Figura 3. Se encuentraun lambda máximo = 410 nm, con unpico casi simétrico alrededor dedicha longitud de onda y con unancho de banda considerable (78.4nm), lo cual hace posible la lecturacolorimétrica en longitudes de onda

04

fotométricas conninguno de losdos reactivos,los cuales nopresentanabsorción de luzen esta regióndel espectro.

02

r 099

50 lOO 150

0806 1.612 2419

300t1 83S

600 N03 PO"'"9467 :\103 m m ot/¡

Figura 4_Curva de calibración para la determinación de nitrato disueltoen agua a 410 nm (*).(Carl Zeiss Spekol 10; 8 nm ancho de banda). (*)Promedio de cincodeterminaciones seriadas

2-Linearidad y sensibilidad de laprueba:Los valores de absorbancia y loscoeficientes de extinción obtenidosutilizando estándares de nitrato desodio equivalentes a unaconcentración de ión nitrato entre 25y 600 ppm se presentan en la Tabla1. La reacción es lineal en todo elrango mencionado (Figura 4), siendola reacción estequiométrica hasta porlo menos una concentración de N03de 600 ppm (9.46 mmol/l); paramuestras con una concentración denitrato superior a 1000 ppm esnecesario hacer una dilución de lamisma. El coeficiente de extinciónpromedio es de 0.0818 +/- 0.0004UAbs/mmol/l. El límite de

sensibilidad se encuentra alrededorde 6.2 ppm N03 (0.1 mmol/l); sinembargo, la sensibilidad puedemejorarse utilizando cubetas demayor recorrido óptico (los datosaquí presentados se obtuvieron concubetas de 1 cm de paso de luz).

3-Estabilidad de color:El color obtenido es estable por lomenos durante 30 minutos luego deadicionar el NaOR.

4-Interferencias:a)Interferencia del cloruro:La gran mayoría de las técnicaspublicadas para la determinación delnitrato sufren una marcadainterferencia por el cloruro. La

65

F. PALOMINO Ycols.

técnica aquí presentada fué probadacon diferentes concentraciones decloruro adicionadas a la muestra. Enla Tabla 2 se presentan los datosobtenidos para estándares de nitratoentre 25 y 600 ppm disueltos ensolución salina fisiológica(concentración de Cl = 155 mmol/l).En este caso, comparativamente conlas soluciones acuosas, se observó unligero incremento de la absorbanciaen la reacción. La concentración deCl utilizada fué más de 16 vecesmayor a la máxima de nitrato, porsuerte que el cambio observado en elcoeficiente de extinción promedio de0.0036 Uabs/mmol/l equivale a uncambio de 2.32 x 10(Exp -3) Uabs/mmol/l, cifra no muy importante sise compara con el coeficiente deextinción encontrado para N03. Sinembargo, se recomienda realizar lacurva de calibración utilizandosolución salina.

Tabla 2. Valores de absorbancia obtenidos paraconcentraciones de nitrato entre 25 y 600 ppm enNaCL 0.9%. Curva de calibración.

N03ppm mmol/l Absorbancia C.Extinción

25 0.403 0.03250 0.806 0.06675 1.209 0.106100 1.612 0.128150 2.419 0.218300 4.838 0.429600 9.467 0.862

0.07940.08180.09760.07940.09010.08860.0910

x = 0.0854

(*) UAbs/mmol/l/cm

b)Interferencia del nitrito:Análogamente a lo que sucede conotras técnicas fotométricas,cromatográficas y electroquímicaspara la determinación de nitrato, estemétodo presenta una fuerteinterferencia por el nitrito. Dichainterferencia es diréctamenteproporcional y lineal a laconcentración de nitrito. Lasignificancia de esta interferenciapor N02 en muestras de plasma sediscute más adelante.

66

La figura 5 presenta las absorbanciaspara concentraciones de N02 ensolución salina, en el rango de 25 a600 ppm (1.08 a 13.04 mmol/l). Elcoeficiente de extinción promedioobtenido para el nitrito es de 0.0244i.], 0.0016 Uabs/mmol/l y esequivalente al 29.8% de aquel delnitrato. Por lo tanto, para corregir elefecto de la interferencia por elnitrito se debe encontrar laconcentración de este en la muestra,por ejemplo mediante la reacción conNaftil-etilen-diamina (NEDA)(30),luego multiplicar esta concentraciónpor el coeficiente de extinción parael ni tri to en la técnica del ácidosalicílico, para así obtener laabsorbancia calculada debida a N02;a continuación se calcula la"absorbancia corregida" debida alnitrato "verdadero":

Abs. corregida =Abs. obtenida - 0.0244 [N02]

(*)

A partir de la absorbancia corregiday utilizando la curva de calibración(Figura 4) se obtiene laconcentración de nitrato.

acuosas de hidróxido de amonio,urea, anilina y asparagina enconcentraciones de 5 y 10 mM. Losvalores de absorbancia obtenidos sepresentan en la Tabla 3. Estos datosmuestran que la técnica presentadaes marcadamente específica frente adiferentes tipos de compuestosnitrogenados. Adicionalmente,ninguno de los compuestosmencionados mostró interferenciaalguna al ser adicionados para unaconcentración final de 10 mM a losestándares de nitrato y a muestras deplasma.

Tabla 3. Valores de absorbancia obtenidos paracompuestos nitrogenados diferentes a N03 (4/ Onm)

Compuesto Absorbancia

Hidróxido de amonio 5mMHidróxido de amonio 10mMAnilina 5 mMAnilina 10 mMAsparagina 5 mMAsparagina 10mMUrea 5 mMUrea io nM

0.0060.0060.0010.0020.0030.0030.0010.006

6-Indice de recuperación:Para evaluar el índice derecuperación, se adicionaron

cantidadesconocidas denitrato de sodioal plasma (con

Ab'lO

08

06

04

02 r 096

una concen-tración base de28 ppm deN03), paraobtener adi-ciones de 160,180, 380 Y 450ppm. Lasconcentracionesobservadas y losrespectivoscoeficientes derecuperación sepresentan en laTabla 4, para un

promedio de 97.11 %.

50 100 1501086 21733260

3006521

600 N02 ppl'T'I

13 043 N02 mMOI!

Figura 5. Lecturas de absorbancia a 410 nm obtenidas para estándares denitrito de sodio disuelto en solución salina fisiolágica (*). (Carl Zeiss Spekol10; 8 nm ancho de banda). (*)Promedio de cinco determinaciones seriadas

S-Especificidad:Con el fin de determinar laespecificidad de la técnica seprocesaron, de manera análoga a losestándares de nitrato, soluciones

7-Precisión :En la Figura 6 se presenta el perfil

NUEVA TÉCNICA COLORIMÉTRICA

Tabla 4. Valores del coeficiente de recuperación para diversas cantidades de N03 adicionadas al plasma.

Cantidad adicionadappm

Coeficiente de recuperaciónConcentración encontradappm

o60180380450

28.087.2189.9404.3481.7

n.d.98.66%89.94%99.02%100.82%

x= 97.11%

de precisión obtenido luego de 50determinaciones seriadas deestándares de nitrato conconcentraciones de 50, 300 Y 600ppm, obteniéndose un CV que varíadesde 6.2% para concentracionesbajas de N03, hasta 1.4% paraconcentraciones altas (600 ppm),apreciándose un perfil análogo al dela mayoría de las técnicas analíticas.

C_V""s

Figura 6. Perfil de precisión de la técnica parala determinación de nitratos por medio de lanitracián del ácido salicílico (*).(*)Obtenido a partir de 50 determinaciones en cada rango de concentración

S-Comparación con otras técnicasfotométricas :Debido a la poca reproducibilidadobtenida con las técnicascolorimétricas basadas en lareducción de N03 a N02, se realizóuna comparación con ladeterminación UV directa (33). Paratal fin se analizaron estándares deN03 en el rango de concentración de50 a 600 ppm a 210 nm, obteniéndoseel espectro que aparece en la Figura7. Para concentraciones en el rango100-300 ppm los resultados de lasdos técnicas fueron equivalentes(r=0.93); sin embargo, a

concentraciones mayores lalinearidad de la determinación UVdisminuye, en parte por Abs>2,obteniéndose una correlación pobre.

DISCUSION y CONLUSIONES:La utilización de plasma en lugar desuero en el método aquí presentadose debe a la posible oxidación por loseri troci tos del ni tri to presente,durante el tiempo que dura lacoagulación y la retracción delcoágulo. En este orden de ideas seaconseja la pronta separación delplasma por centrifugación. Si bienanticoagulantes como el citrato desodio y la heparina nos permitieronobtener buenos resultados, laescogencia final de EDTA se basó ensu uso rutinario en el laboratorio,gran estabilidad y bajo costo.

Las técnicas que se desarrollaroninicialmente para la determinaciónde nitratos y nitritos lo fueron paraanálisis de aguas o de extractosacuosos de material vegetal. Elmanejo de muestras con altocontenido de proteinas implica unadeproteinización previa, debido,entre otros, al hecho de la formaciónde precipitados y turbidez a partir delas proteinas por el mediofuertemente ácido utilizado, lo cualimpide las lecturas fotométricas. Elácido tricloroacético (TCA) comoagente deproteinizante fuédescartado porque lleva a pérdidas denitrato, probablemente por nitraciónde las proteinas plasmáticas por supH ácido. La precipitación etanólica'es poco confiable y con frecuencia

Rev Fac Med UN Col 1997 Vol. 45 N° 2

lleva a la gelificación de la muestra.La escogencia final del cloruromercúrico se debió a la rapidez delproceso, a la obtención de unsobrenadante libre de turbidez y a laconservación del nitrato, tal como sedemuestra por el adecuado índice derecuperación obtenido utilizandoeste compuesto como despro-teinizante (Tabla 4). En este sentido,el pH alcalino aportado por elcarbonato de sodio hace pocoprobable la nitración de las proteinasplasmáticas.

Tanto la sensibilidad como lalinedaridad de la técnica presentada(0.1 mmol/l y 0.33-9.4 mmol/l) sonsuperiores a las informadas para elmétodo colorimétrico directo basadoen la reacción con el ácidofenoldisulfónico (1 y 1-5 mmol/l,respectívamente )(27).

Otras técnicas colorimétricas(28,30,32) se basan en la estimaciónde la concentración de nitrato luegode reducirlo a nitrito, determinandoeste último por su reacción conNEDA; la reacción de reducción secataliza por la adición de polvo dezinc o de cobre, o bien, haciendocircular la muestra por una columnade vidrio empacada con escamas decadmio. Estas técnicas sondispendiosas, poco reproducibles(por cambios en la eficiencia delcatalizador), demoradas y muy pocolineales debido al hecho que laconversión de nitrato a nitrito no esnecesariamente estequiométrica. Sehan hecho intentos para estandarizarlas columnas de reducción de cadmio(45), pero a pesar de esto, lasdeterminaciones no son muyreproducibles y, por experienciapersonal con estas se puede afirmarque la regeneración de la columnaentre muestra y muestra es pococonfiable; adicionalmente, susensibilidad no supera los 0.5 mmol/1 de N03. A pesar de lo anterior, la

67

F. PALOMINO Ycols.

~~----r---~----'---~----~..

Figura 7: Espectro de absorción del nitrato desodio disuelto en solución salina fisiológica.(hp diode arra)'; 2 nm ancho de banda)

técnica de reducción en columna decadmio ha sido utilizada recien-temente en investigaciones sobre elóxido nítrico (18,19,21). Lareducción de nitrato a nitrito con finesanalíticos se ha realizado también porpaso de la muestra durante 3 minutospor un serpentín de calentamiento,previa adición de sulfato de hidrazinay sulfato de cobre (5).

En todas estas técnicas conreducción previa se obtiene un datoque es la sumatoria del nitritoproducido por reducción delnitrato más el nitrito presentepreviamente en la muestra; por lotanto, el valor del nitrato"verdadero" se obtiene restando elvalor obtenido en una alícuotasometida a reducción menos elnitrito determinado en otra alícuotade la muestra no sometida a dichoproceso. Este tipo de técnicaspresenta un CV entre 0.91 y 6.83%Y un coeficiente de recuperaciónentre 86% y 103% y, presentan demanera similar a la técnica delácido difenildisulfónico una fuerteinterferencia por el cloruro. Estoobliga a una remoción previa delcloruro, p.ej. por la adición de unexceso de iones de plata.

1. Guzmán V.H., Morales G., Ochoa R. :Intoxicación en bovinos por nitratosacumulados en pasto elefante (Pennisetum

68

Con base en lo anterior, la técnicapropuesta fundamentada en lanitración del ácido salicílico, muestraventajas notorias sobre las técnicascolorimétricas previamente desarro-lladas: rapidez, sencillez,sensibilidad, linearidad, escasainterferencia por el cloruro (lo cual,al menos en el caso del plasma, puedeobviarse realizando la curva decalibración en solución salina),buena precisión, especificidad, bajocosto y, posibilidad de realizarse concolorímetros sencillos de filtros.

Vale la pena insistir en el hecho quetodas las técnicas colorimétricasexistentes para la determinación denitrato incluyen como error el nitritopreviamente presente, obligando a uncálculo por sustracción. La técnicapresentada permite hacer unasustracción adecuada del nitritopresente, debido al conocimiento delcoeficiente de extinción delcompuesto formado a partir de esteúltimo. Sin embargo, debido al hechoque el nitrito posee un coeficiente deextinción de solo 28.5% de aquel delnitrato y, a que la proporción de laconcentración de nitrato a nitritoesperado en el plasma normal o encasos de intoxicación es de 50: 1 a500: 1 (46) la no sustracción de laabsorbancia debida al nitrito llevaría,en casos de diagnóstico toxicológicoa un error por exceso desde una parteen 175.4 partes hasta de una en1754.3, lo cual no es muy apreciable.

La determinación del nitrato pormedio de espectrofotometríaultravioleta a 210 y 300 nm (33),posee una alta sensibilidad y unabuena linearidad en concentracionesbajas, pero requiere de unainstrumentación más compleja ycostosa y, además, está sujeta a

REFERENCIAS

purpureum).Rev.ICA 1978; 13:113-118.2. Trheebilcoock E., Montaño J., León J.,

Villafañe F. : Sindrome "caída del ganado".

múltiples interferencias tales comoaquellas del nitrito (el cual posee uncoeficiente de extinción a 210 nmequivalente al 55% de aquel delnitrato) y del hierro; muestra un CVde 6-10% y requiere de variascorrecciones.

En el caso de la utilización deelectrodos ión-selectivos paraevaluación potenciométrica delnitrato es necesario hacer unaestimación indirecta luego de laadición a la muestra de una cantidadconocida de NaN03; la sensibilidades similar a la de las técnicascolorimétricas pero el electrodo estásujeto a la interferencia de por lomenos 18 aniones diferentes (35,37).

La cuantificación del N03 por mediode cromatografía HPLC usandocolumnas de intercambio iónico ydetector electroquímico o conduc-timétrico tiene una muy buenasensibilidad (aprox. 0.1 mmol/l) ylinearidad, pero existen dificultadespara resolver los picos de N03 yN02, sufre interferencia fuerte porel cloruro y requiere de unainstrumentación compleja y costosa(35,36). Además, dado el tiempogastado en la separación en lacolumna y en la regeneración de lamisma, el tiempo de análisis esrelativamente prolongado y sedificulta por lo tanto el procesamientode una serie grande de muestras.

Por último, la linearidad de la técnicaaquí presentada es buena y posee unamplio rango, no requiriendo durantesu calibración de correcciones más alláde la regresión lineal simple (47) y,dados su CV y perfil de precisión, llenalos requisitos necesarios para tenerutilidad en procesos de diagnóstico(48) Yen investigación.

Consideraciones experi-mentales con baseen plantas acumuladoras de nitratos. Rev.ICA 1981; 16:151-160.

NUEVA TÉCNICA COLORIMÉTRICA

3. González M. : Intoxicación en bovinos pornitrito y nitratos acumulados en pasto pará(Brachiara mutica). Rev. ICA 1981; 16:189-192.

4. Asbury A.C., Rhode E.A. : Nitriteintoxication in cattle. The effects of lethaldoses of nitrite on blood pressure.Am.J. Vet.Res. 1964; 25:1010-1013.

5. Vertregt N. : The formation ofmethemoglobin by the action of nitrite inbovine bood. Neth.J.Agric.Sci. 1977;25:243-254.

6. Correa P., Cuello C. :Estudio de la etiologíadel cáncer gástrico. I:Epidemiología decáncer y lesiones precancerosas. ActaMed. Valle 1978; 9:1-9.

7. Cuello C., Correa P. :Estudio de la etiologíadel cáncer gástrico. II:Epidemiologíaanalítica de lesiones precancerosas: estudiosambientales. Hipótesis etiológica. ActaMed.Valle 1978; 9:10-14.

8. Tannenbauen S.R., Morán D., Rand W.,Cuello C., Correa P. : Gastric cancer inColombia.IY.Nitrite and other ions in gastriccontents of residents from a high-risk region.J.Natl.Cancer Inst. 1979; 62:9-12.

9. Frazer P., Chilvers C., BereaI v.,HiII M.J.: Nitrate and human cancer : a review of theevidence. Int.J.EpidemiolI980; 9:3-11.

10. Correa P.: Human gastric carcinogenesis:A multistep and multifactorial process. FirstAmercan Cancer Society Award Lecture oncancerepidemiology and prevention. CancerRes. 1992; 52:6735-6740.

11. Rudell W.S.J., Bone E.S., HiII M.J.,Blendis L.M., Walters cr., Gastric-juicenitrite. A risk factor for cancer in thehypochlorhydric stomach. Lancet 1976;2:1037-1039.

12. Mirvish S.S.: Kinetics of nitrosamideformation from alkylureas, N-alkylurethansand alkylguanides: possible implications forthe etiology of human gastric cancer.LNatl.Cancer Inst.1971; 46:1183-1193.

13. Ruddell W.S.J., Walters cr., Nitrite andN-nitroso compounds in gastric juice. Lancet1980; 1:1187.

14. MontersG., Cuello C., Gordillo G., PelonW., Johnson W., Correa P.: Mutagenicactivity of gastric juice. Cancer Lett. 1979;7:307-312.

15. Bulay O., Mirvish S.S., García H.,Pelfrene A.F., Gold B., Eagen.:Carcinogenicity test of six nitrosamides anda nitrosocyanamide administered orally torats. J.Natl. Cancer lnst. 1979; 62: 1523-1528.

16. Snyder S.H., Bredt D.S.: Funcionesbiológicas del oxido nítrico. Invest.Ciencia1992; 12:12-20.

17. Editorial. NO molecule of the year. Science1992; 258:1862-1863.

18. Ding A.H., Nathan C.F., Stuerhr D.J.:Release of reactive nitrogen intermediatesand reactive oxygen intermediates from

mouse peritoneal marophages : comparisonof activating cytokines and evidence forindependent production. J.Immunol1988;141:2407-2412.

19. Dbourn R.G., Belloni P.: Endothelial cellproduction of nitrogen oxides in response tointerferon-gamma in combination withtumor necrosis factor, interleukin-I orendotoxin. LNatl.Cancer Inst. 1990;82:772-776.

20. Keller R., Keist R., Erb P., Aebiseher T.,De Libero G., Balzer M., Grouseurth P.,Keller H.V.: Expression of cellular effectorfunctions and production of reactive nitrogenintermediates: a comparative study inclui-ding T-Lymphocytes, T-like ceJls, neutrophilgranulocytes and mononucJear phagocytes.Cell.Immunol. 1990; 131:398-403.

21. Roekett K.A., Awburn M.M., AggarwalB.B., Cowden W.B., Clark I.A.: In vivoinduction of nitrite and nitrate by TumorNecrosis Factor, Iymphotoxin andinterleukin-l : possible roles in malaria.Infect.Immun. 1992; 60:3725-3730.

22. Garthwaite J.: Glutamate, nitric oxide andcell-cell signaling in the nervous system.Trends Neurosci. 1991; 14:60-67.

23. Lipton S.A., Singel D.J., Stamler J.S.:Nitric oxide in the central nervous system.Prog.Brain Res. 1994; 103:359-364.

24. Amezaea J.L., Palmer R.M.J., de SuzaB.M., Moneada S.: Nitric oxydesynthesized fom L-arginine regulatesvascular tone in the coronary circulation ofthe rabbit. B.J.Pharmacol. 1989; 97:1119-1124.

25. Ito S., Carretero O.A. Abe K.,: Nitricoxide in the regulation of blood flow. NewHor. 1995; 3:615-623.

26. Editorial: Hemoglobin reveals new role asblood pressure regulator. Science 1996;271:1670.

27.Johnson C.M., Ubich A.: Determination ofnitrate in plant material. Anal.Chem. 1950;22:1526-1529.

28.Diven R.H., Pistor W.J., Reed R.E.,Trautman R.J., Watts R.E.: Thedetermination of serum or plasma nitrate andnitrite. Am.J. Vet.Res. 1962; 23:497-499.

29-Housholder G.T., Dollauhite J.W., HulseR. : Diphenylamine for the diagnosis ofnitrate intoxication. J.A .. V.M.A. 1966;148:662-665.

30.Sehneider N.R., Yeary R.A.: Measurementof nitrite and nitrate in bood. Am.J. Vet.Res.1973; 34:133-135.

31.Cataldo D.A., Harron M., Sehraeder L.E.,Youngs V.L.: Rapid colorimetricdetermination of nitrate in plant tissue bynitration of salicylic acid. Commun.SoilSci.Plant.Analys. 1975; 6:71-80.

32.Nrisnha P.S., Donaldson B.: Improvedcolorimetric method for determining nitrateand nitrite in foods. J.Assoc. Off.Anal. Chem.1978; 61:1389.

Rev Fac Med UN Col 1997 Vol. 45 N° 2

33.Cawse P.A.: The determination of nitrate insoil solutions by ultraviolet spectro-photometry.Analyst 1967; 92:311-315.

34. Kaspar H.F.: Response of electron-capture detector to hydrogen, oxygen,nitrogen, carbon dioxide, nitric oxideand nitrous oxide. J.Chromatogr. 1980;193:142-147.

35. Thayer J.R., Huffaker R.C.:Determination of nitrate and nitrite byhigh-pressure liquid chroma-tography:comparison with other methods fornitrate determination. Anal.Biochem.1980; 102:110-119.

36. Buermans H.J.: Diagnosis of nitratetoxicosis in cattle using biological fluidsand a rapid ion chromatographicmethod. Am.J. Vet.Res. 1990; 51:491-495.

37.Carlson M.P., Schneider N.R.:Determination of nitrate in forages byusing selective ion electrode :collaborati ve study. J.Assoc.-Off.Anal.Chem. 1986; 69:196-198.

38. Rojas M., Palomino F., Osuna O.:Nuevo enfoque en el tratamiento de lanitrito-toxico si s con base en salesferrosas. Rev.ACOVEZ 1990; 14:56-58.

39. Gómez J.C., Rojas M., Luque G.,Palomino F., Beltrán M.:Suplementación de sulfato ferroso en ladieta como método profiláctico para lanitrato-nitrito toxicosis en bovinos.Rev.ACOVEZ 1994; 19:31-35.

40. Hirtz J.: Les méthodes analytiquesdans les recherches sur le métabolismedes médicaments. Masson et Cie., Paris,1968.

41. Vallejo M.C.: Toxicología Analítica,Pasto, 1984.

42. Parik V.M.: Absorption spectroscopyof organic molecules. Addison- WelseyPubI.Co., Reading MS, 1974.

43. Rao C.N.R.: Espectroscopíaultravioleta y visible. Alhambra De.,Madrid, 1970.

44. Reutov O.: Theorethical principles oforganic chemistry. MIR De., Moscú,1967.

45. Davison W., WoofC.: Comparison ofdifferent forms of cadrniun as reducingagents for the batch determination ofnitrate. Analyst 1978; 162:403-408.

46. Schneider N.R.: Nitrite and nitratepharmacokinetics in the dog, sheep andpony.Am.J. Vet.Res. 1975; 36:941-947.

47. Tholen D.W.: Altemative statisticaltechniques to evaluate linearity.Arch.Pathol.Laborat.Med. 1992;116:746-756.

48. Ehrmeyer S.S., Laessig R.H.: Therelationship of intralaboratory bias andimprecision on laboratories ability tomeet medical uselfulness limits.Am.J. Clin.Pathol. 1988; 89: 14-18.

69