PCR-Reverse Blot Hybridization 방법

을 이용한 수인성 세균 모니터링 기

법

개발을 위한 연구

연세대학교 대학원

임상병리학과

이 지 영

PCR-Reverse Blot Hybridization 방법

을 이용한 수인성 세균 모니터링 기법

개발을 위한 연구

지도 이 혜 영 교수

이 논문을 석사 학위논문으로 제출함

2004 년 7 월 일

연세대학교 대학원

임상병리학과

이 지 영

이 지 영 의 석사 학위논문을 인준함

심사위원 인

심사위원 인

심사위원 인

연세대학교 대학원

2004 년 7 월 일

감사의 글

어렵게 결정하고 나서게 된 대학원 생활이었습니다. 지난 2년여의 시간 동안 수

없이 주저앉고 포기하고 싶어했던 저를 한결같이 옆에서 격려해주시고 믿어주셨

던 많은 분들에게 진심으로 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.

결핵연구원 재직 시절부터 철없던 저를 돌봐주셨고 제가 대학원 생활을 시작하

고 무사히 끝맺을 수 있도록 늘 당근과 채찍으로 제게 많은 가르침과 감동을 주

신 이혜영 교수님께 가장 큰 감사를 드립니다. 바쁘신 와중에도 논문을 세심하게

지도해주신 양용석 교수님, 김태우 교수님과 대학원 과정에서 많은 가르침으로 지

도해주시고 자상하게 대해주신 오옥두 교수님, 김종배 교수님과 박용석 교수님께

존경의 마음과 감사의 말씀을 올립니다. 가까이에서 자주 뵙지는 못했지만 인자하

신 모습으로 많은 도움을 주신 조상래 교수님께도 감사를 드립니다. 그리고 늦은

나이에 시작한 대학원 생활에서 따뜻한 배려와 격려를 주셨던 임병혁 선생님께도

감사의 마음을 전합니다.

함께 직장생활을 하다가 아무것도 모르고 대학원 생활에 뛰어든 부족한 저에게

처음부터 지금까지도 도움을 주고 충고해주는 연이언니, 은영에게 너무 고맙다는

말을 전하고 싶습니다. ㈜M&D의 재주꾼 한석씨, 꼼꼼하고 예의바른 성룡, 항상

에너지가 넘치는 마산댁 은진이 그리고 깔끔쟁이 은주, 저의 부탁에 무조건적으로

순응해주었던 착한 인호, 그리고 바이러스 연구실 후배로서 자신들은 모르겠지만

제게 든든한 버팀목이 되어준 준호와 주환이, 저의 대학원 생활에 있어 즐거움과

행복을 주었던 사람들입니다. 이들 모두에게 고마움의 뜻을 전합니다.

대학원이란 울타리 안에서 함께 기쁨과 어려움을 나눠준 졸업 동기, 홍성오빠,

근식오빠, 규상, 명민, 인수 모두 수고했다는 말을 전하고 싶고 앞으로 아주 좋은

일들만 함께 하길 바랍니다. 대학원 과정 중에 조언과 격려로 많은 도움을 주셨던

박사 과정 선배님들과 졸업하신 동문 선배님들께도 감사드리며, 예쁜 지은, 얼굴

보기 힘들었던 대식, 이제 대학원 최고 학기로서 후배들 잘 도와주고 졸업 준비

잘하길 바랍니다. 그리고 이제 막 대학원 생활 시작한 은아와 은주, 좋은 선배와

동기들이 있으니 남은 학기 잘 보내길 바라고 이들에게 좋은 선배가 되어주지 못

해 미안한 맘과 함께 고마움도 전합니다. 또한 ㈜M&D의 소장님이시면서 대학원

선배님이신 최현일 선생님께도 좋은 일들만 함께하시길 바랍니다. 그리고 대학원

시작부터 많은 힘이 되어준 동갑내기 친구 은숙, 가끔씩 연락해서 기쁨을 안겨주

는 좋은 선배이자 동생인 종철, 나에게 지금까지도 제게 많은 위로와 격려를 아끼

지 않는 친구들입니다. 좋은 일들 많이 생기길 바라고 이들에게도 고마움을 전합

니다.

대학교 1학년 때부터 제게 아낌없는 관심과 격려를 아끼지 않는 믿음직스런 사

랑하는 장은언니와 영미언니, 항상 힘이 되어주고 걱정해주는 소윤, 을순, 봉림,

그 외 94학번 동기들에게 진심으로 고마움을 전합니다. 학교 생활하면서 저의 건

강을 챙겨준 지영, 꿋꿋하고 씩씩하게 제 구박을 다 받아주며 함께 졸업하게 된

설, 계속 연락하고 지냈으면 좋겠고 행복하길 바랍니다.

마지막으로 사랑하는 가족에게 깊은 고마움을 전하고 싶습니다. 얼마 전 결혼

30주년 기념일을 맞이하시게 된 부모님에게 30살이 되어서도 변변하게 아무것도

해드릴 수 없어서 너무나도 마음이 아팠던 접니다. 제 욕심만 채우겠다고 결심한

대학원인 것 같아서 더욱 죄송스러운데 그래도 이렇게 마무리 짓게 될 수 있어서

그나마 부모님 뵐 면목이 생깁니다. 늘 건강하시길 바라고 앞으로 좌절하거나 약

한 모습 보이지 않고 열심히 살아가는 모습 보여드리고 싶습니다. 또한 언니로서

따뜻한 말 한마디 전하지 못하고 챙겨주지 못한 동생 주영이에게 미안한 마음과

고마움을 전하며 모든 분들에게 지난 2년 동안의 결실인 이 논문을 드립니다.

2004년 7월

이 지 영 올림

- i -

차 례

그림 차례 ………………………………………………………………………………… iii

표 차례 …………………………………………………………………………………… iv

약기호표 ………………………………………………………………………………… v

국문 요약 ………………………………………………………………………………… vi

제 1 장 서론 ……………………………………………………………………………… 1

제 2 장 재료 및 방법 …………………………………………………………………… 8

2.1 재료 ………………………………………………………………………………… 8

2.1.1 실험 균주 …………………………………………………………………… 8

2.1.2 시료수 ………………………………………………………………………… 8

2.1.3 16s rRNA oligonucleotide primers ……………………………………… 10

2.1.4 배지 ………………………………………………………………………… 10

2.2 실험방법 ………………………………………………………………………… 12

2.2.1 DNA 추출 ………………………………………………………………… 12

2.2.2 DNA 증폭 ……………………………………………………………… 13

2.2.3 소독 장치 및 처리 ……………………………………………………… 15

2.2.4 시료수의 배양 ……………………………………………………………… 15

2.2.5 16s rRNA의 Cloning ……………………………………………………… 16

2.2.6 PCR-RFLP ………………………………………………………………… 16

2.2.7 염기서열의 분석 …………………………………………………………… 17

2.2.8 Dot blot hybridization …………………………………………………… 17

2.2.9 Reverse blot hybridization …………………………………………… 18

제 3 장 결과 …………………………………………………………………………… 21

3.1 수인성 병원균 및 각종 장내세균에 대한 16s rRNA primer의

유용성 확인 …………………………………………………………………… 21

3.2 시료수에서의 16s rRNA primer의 유용성 확인…………………………… 21

3.3 다양한 소독공정처리 전후 시료수에서의 16s rRNA primer의

- ii -

유용성 확인 …………………………………………………………………… 23

3.4 배양을 통한 다양한 시료수 내 균의 존재 확인 ………………………… 25

3.5 PCR-clone library 제조와 PCR-RFLP 염기서열 분석 ………………… 29

3.6 16s rRNA species-specific probe 제작 …………………………………… 34

3.7 Dot blot hybridization 방법을 이용한 16s rRNA probe의 유용성 확인

…………………………………………………………………………………… 37

3.8 Reverse blot hybridization ………………………………………………… 40

3.9 Reverse blot hybridization 방법과 16s rRNA primer를 이용한

PCR 방법의 민감도 ………………………………………………………… 42

제 4 장 고찰 …………………………………………………………………………… 44

제 5 장 결론 …………………………………………………………………………… 49

참고 문헌 ………………………………………………………………………………… 52

영문 요약 ………………………………………………………………………………… 59

- iii -

그림 차례

Fig. 1. Amplification of diverse enteric bacteria by 16s rRNA primers …………… 22

Fig. 2. Amplification of DNA extracted from water samples by 16s rRNA primers

……………………………………………………………………………………… 24

Fig. 3. Amplification of water samples before and after treatment with

diverse sterilization methods by 16s rRNA primers ………………………… 26

Fig. 4. Diverse water samples cultured on Luria-Bertani (LB) media …………… 28

Fig. 5. Amplification of PCR-clone library by 16s rRNA primers ………………… 30

Fig. 6. PCR-RFLP profiles of PCR products with PCR-clone library

……………………………………………………………………………………… 31

Fig. 7. Alignment of the V6 regions of 16s rRNA genes of enteric bacteria ……… 35

Fig. 8. Dot blot hybridization using each of 12 probes ……………………………… 39

Fig. 9. Reverse blot hybridization using 5 probes …………………………………… 41

Fig. 10. Sensitivity of the reverse blot hybridization and the PCR ………………… 43

- iv -

표 차례

Table 1. 수인성 전염병 유발 주요 병원성 세균과 발병비율 ……………………… 3

Table 2. Bacteria strains used in this study …………………………………………… 9

Table 3. Primer sequences used to amplify 16s rRNA gene ………………………… 11

Table 4. Various bacteria detected from river water by PCR-RFLP-sequence Analysis

…………………………………………………………………………………… 32

Table 5. Various bacteria detected from sewage water by PCR-RFLP-sequence Analysis

…………………………………………………………………………………… 33

Table 6. List of probe sequences designed for enteric bacterial identification

…………………………………………………………………………………… 36

- v -

약기호표

ATCC : american type culture collection

bp : base pairs

DNA : deoxyribonucleic acid

EDAC : 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

EDTA : ethylenediamine tetra-acetic acid

EHEC : enterohemorrhagic Escherichia coli

EIEC : enteroinvasive Escherichia coli

EPEC : enteropathogenic Escherichia coli

ETEC : enterotoxigenic Escherichia coli

GC content (%) : ratio of guanine-cytosine

HRP : horse radish peroxidase

nt : nucleotide

PCR : polymerase chain reaction

RFLP : restriction fragment length polymorphism

RNA : ribonucleic acid

rRNA : ribosomal RNA

SDS : sodium dodecyl sulfate

SSPE : sodium chloride, sodium hydrogen phosphate (NaH2PO4-H2O), EDTA

TAE : tris acetate EDTA

TBE : tris borate EDTA

TE : tris EDTA

Tm : melting temperature

vi

국문 요약

PCR-Reverse Blot Hybridization 방법을 이용한

수인성 세균 모니터링 기법 개발을 위한 연구

병원성 미생물에 의한 수인성 전염병은 감염 후 급성 질환을 유발하고 2차

감염에 의한 확산을 초래하기 때문에 그 전파를 초기에 예방해야 한다. 그러므로

물에 존재하는 수인성 병원균을 신속하고 효과적으로 모니터링하는 것은 매우 중

요하다. 본 연구에서는 물에 존재하는 다양한 종류의 수인성 세균을 PCR로 증폭

한 뒤, Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)-sequence analysis 및

reverse blot hybridization 방법과 같은 분자생물학적 방법으로 동정하는 효과적인

모니터링 기법을 마련하고자 하였다. 이러한 분자생물학적 방법이 실제 물에 생존

하는 세균의 집단을 모니터링하는데 유용한지를 확인하기 위하여 오존과 자외선

과 같은 대체 소독법으로 처리한 시료수를 대상으로 분석하였다. 즉, 오존과 자외

선 각각 단독으로 소독처리한 시료수 및 혼합하여 소독처리한 시료수로부터 추출

한 DNA를 PCR로 증폭하였다. 본 연구에서 사용된 PCR primer로 16s rRNA 유

전자 부위 중 992 bp 크기의 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 이어 16s rRNA primer

로 증폭된 다양한 세균의 PCR 산물을 포함하는 clone-library를 제작하고 각각의

PCR-clone library에 대한 PCR-RFLP를 수행하였다. 그 결과 서로 다른 profile을

갖는 colony들에 대해서는 염기서열 분석을 실시하여 각 소독처리 전후의 다양한

세균 종류의 변화를 확인할 수 있었다. 그 결과 음용수로 사용되는 염소 소독처리

된 정수에서는 증폭된 산물이 없었고, 원수의 경우에는 소독처리하지 않았을 경우

60여종, 방류수의 경우에는 10여종의 서로 다른 수중 세균이 존재하는 것을 확인

하였다. 이어 임상적으로 유용한 몇 가지 수인성 병원균을 표적으로 하는 12가지

종류의 reverse blot hybridization용 16s rRNA probe를 제작하였다. 제작된 각각의

probe의 표적균에 대한 특이도를 평가하기 위해 dot blot hybridization을 수행하였

고 이 중 그 유용성이 확인된 5개의 probe를 이용하여 membrane을 제작하고,

vii

reverse blot hybridization을 수행하였다. 그 결과 reverse blot hybridization 방법은

한 번의 시도로 두 가지 이상의 균을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다. 결론

적으로 본 연구에서는 PCR-reverse blot hybridization 방법이 먹는 물에 존재할 수

있는 다양한 수인성 전염병 유발 병원균을 모니터링할 수 있는 기법으로서의 유

용한 가능성을 확인할 수 있었다. .

핵심되는 말 : 수인성 병원균, 모니터링, 16s rRNA primer, PCR-RFLP 염기서열

분석법, 16s rRNA probe, dot blot hybridization, reverse blot

hybridization

1

제 1 장 서 론

먹는 물은 우리 생활에 필수불가결하므로 매우 중요하다. 따라서 위해성이

없는 안전한 먹는 물을 모든 사람에게 공급하는 것은 사회의 기본 명제이다. 때문에

나라마다 사회보건복지 측면에서 수인성 질병을 법정 전염병으로 지정하여 우선순

위를 두고 관리하고 있으며, 이에 따라 수인성 전염병의 위협은 과거에 비해 현저히

줄어든 상태이다. 그럼에도 불구하고 전세계적으로는 아직도 최소한 2천 5백만 명의

수인성 전염병 환자가 발생하고 있으며, 5세 이하 어린이의 2/3 가량이 물에 관련된

질병으로 인해 사망하고 있는 실정이다(1). 미국과 같은 선진국의 경우를 살펴보면,

수인성 병원균으로 인한 위장염이 성인의 경우 1년에 2번 정도 발병하여 감기 다음

으로 빈번하게 걸리는 질병으로 분류되어있다. 이 중 장출혈성 대장균 감염증은 1군

전염병으로 지정되어 미국에서만 매년 10,000~20,000여명의 환자가 발생하고 있다.

또한 일본에서는 1996년 1,200 여명이 장출혈성 대장균 감염증에 걸렸고, 이 중 12명

이 사망하였다고 보고되고 있다. 우리나라의 경우에는 국제 검역 전염병인 콜레라,

장티푸스, 세균성 이질 등이 대표적인 수인성 질병의 예이다. 발병 사례를 보면, 장

티푸스의 경우 1990년 이후 연간 200~300 여명의 새로운 환자가 발생하고 있으며,

세균성 이질의 경우에는 1992년부터 눈에 띄게 증가하기 시작하여 현재까지 지속적

으로 증가하고 있다(2, 3, 4).

수인성 전염병이란 감염의 매개체가 물인 전염성 질환으로, 세균, 바이러스,

원생동물 등의 병원성 미생물에 의해 감염된 숙주 (사람이나 가축)의 분변으로 오염

된 물이나, 이렇게 오염된 물로 만들어진 식품에 의해 발생되는 주로 분변-경구 경

로에 의한 소화기계 전염병을 총칭한다. 과거에는 수인성 전염병의 전파 양상에 따

2

라 물을 통해서만 전파되는 수인성 전염병과 식품을 통한 식품매개 전염병으로 구

분하였다. 그러나 근래에는 상하수도 시설과 위생 수준이 향상됨에 따라 비위생적인

급수 관리로 인해 야기되는 수인성 전염병은 상대적으로 감소하는 반면 오염된 물

로 제조된 식품을 통한 감염의 사례가 더욱 많기 때문에 이 모두를 수인성/식품매개

성 질환으로 통합하여 다루고 있다. 또한 레지오넬라증과 같이 호흡계나, 피부 접촉

에 의한 피부계 질병도 수인성 전염병에 해당되므로 전파 양상이 반드시 먹는 물

을 통해서만 이루어지는 것은 아니다. 따라서 수인성 전염병이란 먹는 물 및 식품을

매개로 하는 전염성 질병을 통칭한다고 할 수 있겠다.

수인성 전염병을 유발하는 병원균 대부분은 설사, 구토, 복통, 두통 등의 증상

을 보이다가 자연적으로 치유되는 가벼운 증상을 유발한다. 그러나 콜레라균, 세균

성 이질균, 장티푸스균 등은 심각한 증세를 일으키고, 일부는 심각한 합병증까지 발

생시켜 면역 체계가 약화된 사람의 경우 치사까지 이르게 한다(5). 수인성 전염병을

유발하는 비율이 높은 대표적인 병원성 세균을 Table 1에 요약하였다.

수인성 질병을 일으키는 병원성 미생물은 감염된 동물의 체내에서뿐만 아니

라 오염된 음식이나 음료에서도 번식하여 오염량이 증폭되고, 다시 제 3자에게 전염

되어 2차 오염을 유발하기 때문에 2차 감염에 의한 확산의 우려가 있다. 또한 감염

후 급성 질병을 유발하며 특히 급수 체계를 통하여 오염될 경우 대규모 발병으로 심

각한 사회 문제를 일으키기도 한다(6, 7).

그러므로 먹는 물에 존재하는 병원균을 미리 검출하여 병원성 미생물의 오염

여부를 사전에 진단하는 것은 미생물 오염에 의한 수인성 질병을 미연에 예방하는

데 매우 중요하다. 그러나 물에 존재하는 다양한 수인성 질병 관련 세균을 측정 하

는 것은 현실적으로 어려운 일이다. 왜냐하면 물을 오염시키는 병원성 미생물의 주

오염원이 사람이나 동물의 분변이고, 그 분변에 존재하는 미생물의 종류

-３-

Table 1. 수인성 전염병 유발 주요 병원성 세균과 발병비율

병원체 발병비율 임상 증세

캄필로박터 (Campylobacter spp.) 45% 설사 (가끔 혈변), 복통, 발열

살모넬라 (Salmonella typhi) 29.5% 장티푸스, 발열, 식욕부진, 권태, 두통, 근육통, 복통, 설사, 구토, 위장염, 고열, 오한,

쉬겔라 (Shigella spp.) 17.2% 세균성 이질, 설사 (가끔 혈변), 발열 및 복통 동반

장출혈성 (Enterohaemorrhagic) 설사, 복통

장관독소성 (Enterotoxigenic) 설사, 복통, 오심

장병원성 (Enteropathogenic) 설사, 복통, 발열 병원성 대장균 (pathogenic E. coli) 5.3%

장침습성 (Enteroinvasive) 설사, 복통, 발열,

예르시니아 (Yersinia enterocolitica) 1.9% 설사, 복통

침습성 (Invasive) : 뇌막염, 신생아패혈증, 발열 리스테리아 (Listeria monocytogenes) 0.9%

설사형 (Diarrheal) : 설사, 복통, 발열

장염비브리오 (Vibrio parahaemolyticus) 0.2% 설사

-４-

가 상당히 많으므로 모든 병원균을 검사하는 것은 현실적으로 어렵기 때문이다(8).

또한 발병시 인체에 존재하는 병원성 미생물의 개체수는 많지만 평소 물속에 오염

되어 있는 병원성 미생물의 개체수는 매우 적기 때문에 민감도가 높은 방법으로만

검출할 수 있기 때문이다.

물에 존재하는 병원균을 검출하는 방법 중 가장 전통적인 방법은 배양법이다.

배양법은 선택배지를 이용하여 균을 분리하고 검출한 후 생화학적 특징을 이용하여

동정하는 방법으로 균에 따라 5일 이상의 시간이 필요한 경우도 있다. 전통적인 방

법 외에 상업적으로 판매되고 있는 API identification system (Vitek, bioMerieux,

Hazelwood, MO, USA)등의 자동화된 방법을 사용하는 경우도 있다. 이 방법은 자동화

로 간단해진 장점은 있으나 비용이 비싸고 배양과정이 필요하기 때문에 여전히 상

당한 시간이 필요하다는 단점이 남아있다(9). 또한 배양에 기초를 둔 검사 방법의 경

우에는 적절한 배지 선택이 안되어 배양을 못했거나 배양이 어려운 미생물에는 적

용할 수 없는 검사 한계가 있다. 따라서 배양법으로 수인성 병원균을 상시 모니터링

한다는 것은 현실적으로 어렵다고 할 수 있겠다.

현재 가장 보편적으로 사용되고 있는 수인성 병원균의 모니터링 방법은 모든

병원균을 검사하는 대신 비병원성이지만 병원성 미생물의 오염원인 분변의 오염도

를 나타낼 수 있는 (총)대장균군이나 분원성대장균군, 대장균 등과 같은 지표 미생물

을 사용하는 간접적 방식이다. 대부분의 실험실은 이와 같은 지표세균을 이용하는

방법으로 수인성 질병의 주원인인 분원성 오염 여부를 상시로 진단하고 있다(10, 11).

그러나 지표세균만으로 모든 수인성 병원균의 오염 여부를 측정하는 것은 한계가

있다는 지적과 논란이 있다. 왜냐하면 마이코박테리아와 같은 균종은 지표세균이 생

존하지 못할 정도의 열악한 수계 환경이나 강력한 소독처리에도 살아남을 수 있다

고 알려져 있어 지표세균만으로 모든 수인성 병원균을 모니터링 할 수 있는 것은 아

-５-

니기 때문이다.

이러한 한계점을 극복하기 위해 그 동안 많은 노력들이 이루어져왔으며 그

결과 다양한 분자생물학적 기법이 개발된 바 있다(12, 13, 14, 15, 16). 이와 같은 다양

한 분자생물학적 방법은 일반적으로 배양법과 비교하여 간단하고 검출에 필요한 시

간을 단축시킬 수 있을 뿐 아니라 각 병원성 미생물을 한번에 모두 증폭할 수 있어

검사법의 민감도 및 특이도가 높아 유용한 것으로 보고되고 있다(17, 18, 19, 20, 21).

분자생물학적 기법 개발에 주로 사용되어 온 유전자 표적 부위는 16s

ribosomal RNA (16s rRNA)이다. 16s rRNA 유전자는 모든 생물체에 기능적 및 발생학

적으로 상동하게 존재하는 유전자이다. 때문에 이들의 보존성 (conserve nature)과 보

편적으로 잘 분포되어있는 성질 (universal distribution)을 이용한 16s rRNA 염기서열

의 비교는 미생물의 계통 발생학적인 분류에 효과적인 방법으로 이용되어 왔다(22,

23, 24, 25). 16s rRNA 유전자는 보존영역 (universally conserved domain), 반보존영역

(semiconserved domain), 다형적영역 (variable

domain)으로 구성되어 있으며(22) 그 염기서열이 대체적으로 잘 밝혀져 있다. 따라서

Polymerase Chain Reaction (PCR)을 이용하여 16s rRNA 유전자 부위를 증폭한 후 증폭

된 유전자를 다양한 분자생물학적 방법으로 분석하는 기법이 개발되어 왔다. 이와

같은 기법에는 PCR 산물의 직접적인 염기서열 분석법, Restriction Fragment Length

Polymorphism (RFLP) 분석법, probe를 이용한 hybridization 방법 등이 있다(26, 27, 28).

분자생물학적 기법 중 PCR 방법은 수행하기 편하고 배양에 의존하지 않는 방

법으로 비교적 신속하고 정확하게, 매우 적은 양의 검체를 높은 민감도와 특이도로

검출해 낼 수 있는 장점이 있다. 특히 multiplex PCR 방법은 한 번의 PCR 반응으로

다양한 종류의 균을 검출해 낼 수 있는 방법이다.

직접적인 염기서열 분석법은 GeneBank (NCBI, USA)에 이미 정보화 되어있는

-６-

다양한 병원성 세균의 16s rRNA 염기서열을 이용하여 정확하게 균을 동정할 수 있

다는 장점이 있다(29). 그러나 PCR에 사용된 시료에 단일 균종 이상이 존재하는 경

우에는 혼합된 PCR 산물이 증폭되므로 cloning하지 않는 이상 직접적인 염기서열 분

석이 불가능하다는 단점이 있다.

한편 RFLP 분석법은 다양한 세균의 typing에 널리 사용되고 있는 방법이다.

RFLP는 세균의 genomic DNA에 제한효소를 처리하여 전기영동함으로써 제한효소

절단 단편의 다형성을 비교하는 방법이다. 기존의 RFLP 방법이 순도 높은 많은 양

의 genomic DNA를 필요로 하여 균의 배양에 장시간이 요구되고, 숙련된 기술이 필

요한 방법인데 반해, PCR-RFLP는 PCR로 증폭된 산물을 제한효소로 처리하는 방법

으로 PCR을 수행하기 위해 순도 높은 DNA가 필요하지 않으므로 실험에 걸리는 시

간이 짧고 상대적으로 간단한 방법이다. 따라서 PCR-RFLP 방법은 기존의 RFLP 방

법에 비해 훨씬 간단하고 신속하여 여러 연구에 널리 사용되고 있다(30, 31, 32, 33).

그러나 직접적인 염기서열 분석법과 같이 시료에 단일 종 이상의 균이 존재하는 경

우에는 PCR 산물을 각각 cloning하지 않는 이상 각각의 균종을 동정할 수 없다는 단

점이 있다.

또 다른 방법은 DNA-probe hybridization 방법이다. 이는 보통 10~1000

nucleotide 길이의 단일 가닥 DNA probe를 이용하여 hybridization을 실시하여 상보적

인 염기서열을 지닌 DNA 분자를 탐지하는 방법이다(34). DNA probe hybridization 방

법에는 dot blot hybridization과 reverse blot hybridization 방법이 있다. Dot blot

hybridization 방법은 하나의 probe로 이에 맞는 표적을 검출해내는 방법으로, 시료에

여러 균종이 존재하는 경우에는 각각의 probe를 개별적으로 사용해야 한다는 단점이

있다. 반면에 reverse blot hybridization 방법은 초기에 겸상 적혈구성 빈혈 (sickle cell

anemia)를 진단하기 위한 reverse dot blot assay로서 개발되었는데(35), 이 방법은 PCR

-７-

을 통해 증폭된 산물의 염기서열의 차이점을 확인하기 위해 membrane에 고정된 특

별한 probe와 PCR 증폭 산물을 hybridization한다. 다수의 probe를 다수의 sample에 동

시에 hybridization 시키는 방법으로 여러 종류의 세균을 신속하게 동시에 검출할 수

있다는 장점이 있다(36, 37).

따라서 본 연구에서는 reverse blot hybridization 기법을 이용하여 여러 종류의

물 오염균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 분자생물학적 기법 개발을 위한 연

구를 수행하였다. 검출 대상균은 물에 오염되어 있는 임상적으로 중요한 수인성 전

염병의 원인균 가운데 캄필로박터, 살모넬라, 쉬겔라, 장출혈성 대장균, 예르시니아,

리스테리아 그리고 장염비브리오 등을 대상으로 하였으며 16s rRNA 유전자를 표적

유전자로 사용하였다.

-８-

제 2 장 재료 및 방법

2.1 재료

2.1.1 실험 균주

본 연구에서는 E. coli strain과 non-E. coli strain을 포함하여 현재 수인성 질병의

원인인 분변 오염의 지표로서 사용되고 있는 지표세균 및 수인성 전염병을 일으키

는 병원성 세균 등 총 27개의 균주를 사용하였다. 균주는 서울대학교 미생물 연구소

미생물 균주센터에서 7주(株)와 연세대학교 임상병리학과 미생물학 연구실에서 20주

를 각각 분양받았다. 본 연구에서 사용된 균주는 Table 2에 나타내었다.

2.1.2 시료수

본 연구에서는 다양한 수원에 대한 미생물 모니터링 데이터를 확보하고자 W

시에서 상수원수 (섬강 표층수, Drinking Water Source), 정수 (전염소-응집/침전-모래여

과-활성탄-후염소, Drinking Water) 및 하수방류수 (최종처리수, Sewage Effluent Water)

를 선정하여 2002년 11월에 채수하였다. 채수 용기는 다른 유기물의 오염을 막기 위

하여 증류수 및 메탄올로 세척하고 완전히 건조시킨 뒤, 채수하기 전 각 채수 지점

의 지점수로 세척하였고, 수두 (head space)가 없도록 4 ℓ를 채수하여 얼음 박스에

담아 운반하여 4℃에서 보관하였다.

-９-

Table 2. Bacteria strains used in this study

Strains Strain No. Source and Toxin

Non-pathogenic E. coli EC (ATCCa 25922)

Enterotoxigenic E. coli (ETEC) ET1 (TD225C4, LTc, O78:H9)

ET2 (214-4, STd)

ET3 (411C1, LT/ST, O25:H24)

Shiga-toxin producing E. coli (STEC) STEC (ATCC 43894, O157:H7)

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC) EH (U4-41, O4:K3:H5)

Enteroinvasive E. coli (EIEC) EI (Ewing 227, O124:H30)

Enteropathogenic E. coli (EPEC) EP (Su3912-41, O55)

Citrobacter fruendii CIT (ATCC 6750)

Enterobacter aerogenes ENB (ATCC 13048)

Klebsiella pneumoniae KLE (ATCC 35657)

Enterococcus faecalis ENC (ATCC 19433)

Pseudomonas aeruginosa PSE (ATCC 27853)

Salmonella typhimurium SM (ATCC 14028)

Salmonella typhi ST (ATCC 33459, Ty21a)

Salmonella paratyphi-A SP (ATCC 9150)

Shigella flexneri SF (ATCC 9199, serotype la)

Shigella sonnei SS (ATCC 25931)

Shigella dysenteriae SD (DMLb 400)

Yersinia enterocolitica YE (ATCC 9610)

Yersinia pseudotuberculosis YP (ATCC 29833)

Vibrio parahaemolyticus VP (ATCC 33844)

Camphylobacter jejuni CJ (ATCC 33560)

Listeria monocytogenes LM (ATCC 15313)

Staphylococcus aureus SA1 (ATCC 25923)

SA2 (ATCC 33586, exotoxin C)

SA3 (ATCC 27664, enterotoxin E)

a : American type culture collection b : Diagnostic microbiology laboratory

c : Heat labile toxin d : Heat stable toxin

-１０-

2.1.3 16s rRNA oligonucleotide primers

수인성 병원균의 16s rRNA 부위를 증폭하기 위해 사용한 16s rRNA

primer는 Table 3에 나타내었다. 본 연구에서는 균의 16s rRNA 유전자의 보존

영역을 표적으로 하는 primer를 Kouichi Ohwada 등(19)이 사용한 것과 같은

염기서열로 주문 제작 (Bioneer Co., Daejeon, Korea)하여 사용하였다.

2.1.4 배지

본 연구에서 사용된 균주들은 Luria-Bertani (LB) broth [per 1 ℓ ; 10 g

Bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g Bacto-yeast extract (Difco Laboratories, MI,

USA)]를 이용하여 37℃에서 배양하였고, 채수한 시료수 내의 균을 배양하기

위해 LB agar [(per 1 ℓ ; 10 g Bacto-tryptone, 10 g NaCl, 5 g Bacto-yeast

extract, 15 g Bacto agar (Difco Laboratories, MI, USA)]를 사용하였다.

-１１-

Table 3. Primer sequences used to amplify 16s rRNA gene

Primer Sequence (5′→ 3) Position

(nt)

Length

(mer)

GC

(%)

Tm

(°C) 519F* CAGCM†GCCGCGGTAATW†C 519-536 18 61.1 60.9

1492R** GGTTACCTTGTTACGACTT 1510-1492 19 42.1 42.9

* 519f : 519-536 of E. coli 16s rRNA numbering; Brosius et al.,1978, Lane et al,.1985 (38).

** 1492r : 1510-1492 of E. coli 16s rRNA numbering; Eden et al.,1991 (39).

† M=C:A, Y=C:T, K=G:T, W=A:T [Stackebrant and Goodfellow, 1991. (40)]

-１２-

2.2 실험 방법

2.2.1 DNA 추출

2.2.1.1 수인성 병원균 및 각종 장내세균 DNA의 추출

본 연구에 사용된 수인성 병원균과 장내세균 (Table 2)의 genomic DNA

를 얻기 위해서 각 세균을 LB media가 들어있는 액체 배지 3 ㎖에 접종하여

호기성 상태로 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양된 균액 400~500 ㎕를 1.5 ㎖

effendorf tube에 분주하고 12,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 상층액을

완전히 제거한 후 침전된 pellet을 멸균된 증류수로 2~3회 세척하여 남아있는

배지를 완전히 제거하였다. 침전물은 1×TE buffer (10 mM Tris-Cl, 10 mM

EDTA, pH 8.0) 400 ㎕에 다시 부유시켜 5분간 끓였다. 가볍게 원심분리하여

세포 침전물을 침전시키고 상층액을 분리하여 본 실험에 사용하기 위한 DNA를

얻었다. 그람 양성균인 S. aureus, L. monocytogenes와 C. jejuni의 경우에는 균

배양액에서 배지를 완전히 제거하고 1×TE buffer 400 ㎕에 다시 부유시킨 후

lysozyme (10 ㎎/㎖) 25 ㎕를 첨가하여 37℃에서 24시간 반응시켰다. 반응액을

5분간 끓인 뒤 원심분리하여 세포 침전물을 침전시키고 상층액을 분리하여

DNA를 얻었다. 분리해 낸 DNA는 0.8% (w/v) agarose gel (Bioneer Co.,

Daejeon, Korea)과 1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA pH

8.0)를 사용하여 전기영동한 후 ultraviolet trans-illuminator (Vilber Louramat,

Mame La Valle, France)로 그 농도를 확인하였다.

-１３-

2.2.1.2 시료수로부터 DNA의 추출

채수하여 4℃에 보관되어 있던 시료수의 가라앉은 침전물을 잘 혼합한 후

high speed용 50 ㎖ Oak Ridge Centrifuge Tube (PPCO, Nalge Co., USA)를

사용하여 실온에서 4500×g (20,000 rpm)로 30분 동안 원심분리하고 조심스럽

게 상층액을 제거하였다. 이 과정을 세 차례 반복하여 시료수의 전체 부피를 100

㎖이 되도록 하였다. 시료수 100 ㎖로 부터 얻은 침전물은 1×TE buffer (pH

8.0) 100 ㎕에 녹인 후 부유액을 5분간 끓였다. 12,000 rpm에서 1분 동안

원심분리하여 상층액을 분리하여 시료수 내에 존재하는 균의 DNA를 얻었다(41).

분리해 낸 DNA는 0.8% (w/v) agarose gel (Bioneer Co., Daejeon, Korea)과

1×TAE buffer (40 mM Tris-acetate, 1 mM EDTA pH 8.0)를 사용하여

전기영동한 후 ultraviolet trans-illuminator (Vilber Louramat, Mame La Valle,

France)로 그 농도를 확인하였다.

2.2.2 DNA 증폭

2.2.2.1 수인성 병원균 및 각종 장내 세균 DNA의 증폭

수인성 병원균과 각종 장내세균의 16s rRNA 유전자 부위를 증폭하기 위

한 PCR은 Thermal Cycler (GeneAmp® PCR System 2700, Perkin-Elmer

Cetus, Boston, MA, USA)를 사용하였다. 전체 반응 부피는 50 ㎕로 하여 PCR

AccuPower premix® (Bioneer Co., Daejeon, Korea) 제품을 사용하였다. PCR에

사용된 각 세균의 DNA 양은 10 ㎕를 사용하였다. PCR 과정에서 주형으로 DNA

대신 멸균된 증류수를 첨가하여 negative control 반응을 실시하였다. PCR

-１４-

반응은 총 25 cycle을 시행하였고, 첫 cycle이 시작하기 전에 94℃에서 2분간

가열하여 DNA를 완전히 해리시킨 후 매 cycle당 94℃에서 2분간 denaturation,

45℃에서 1분 30초 동안 annealing, 72℃에서 2분 동안 extension반응을 실시하

였다(19). 그리고 완전한 extension을 위해 72℃에서 10분 동안 반응시킨 후

4℃에서 보관하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% (w/v) agarose gel (Bioneer Co.,

Daejeon, Korea)과 0.5×TBE buffer (45 mM Tris-borate, 1 mM EDTA, pH

8.0)를 사용하여 전기영동한 후 ethidium bromide 용액에 염색하여 ultraviolet

trans-illuminator (Vilber Louramat, Mame La Valle, France)로 DNA band를

확인하였다. 증폭 산물의 크기를 확인하기 위해 GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder

Plus (MBI Co., Germany)를 사용하였다.

2.2.2.2 시료수로부터 추출한 DNA의 증폭

시료수로부터 추출한 DNA의 16s rRNA 유전자 부위를 증폭하기 위한

PCR은 Thermal Cycler (GeneAmp® PCR System 2700, Perkin-Elmer Cetus,

Boston, MA, USA)를 사용하였다. 전체 반응 부피는 50 ㎕로 하여 PCR Accu -

Power premix® (Bioneer Co., Daejeon, Korea) 제품을 사용하였다. PCR에 사용

된 시료수 DNA의 양은 10 ㎕를 사용하였다. PCR 과정에서 주형으로 DNA대신

멸균된 증류수를 첨가하여 negative control 반응을 실시하였고, 시료수 내 PCR

반응을 방해할 수 있는 물질의 존재를 알아보기 위해 positive control로 이미

증폭됨을 확인한 E. coli O157:H7 ACCC 35150 균주 3 ㎕도 함께 사용하였다.

PCR 반응은 총 25 cycle을 시행하였고, 첫 cycle이 시작하기 전에 94℃에서

2분간 가열하여 DNA를 완전히 해리시킨 후 매 cycle당 94℃에서 2분간

-１５-

denaturation, 45℃에서 1분 30초 동안 annealing, 72℃에서 2분 동안

extension반응을 실시하였다(19). 그리고 완전한 extension을 위해 72℃에서

10분 동안 반응시킨 후 4℃에서 보관하였다. PCR 증폭 산물은 1.5% (w/v)

agarose gel (Bioneer Co., Daejeon, Korea)과 0.5×TBE buffer (45 mM Tris-

borate, 1 mM EDTA, pH 8.0)를 사용하여 전기영동한 후 ethidium bromide

용액에 염색하여 ultraviolet trans-illuminator (Vilber Louramat, Mame La

Valle, France)로 DNA band를 확인하였다. 증폭 산물의 크기를 확인하기 위해

GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder Plus (MBI Co., Germany)를 사용하였다.

2.2.3 소독 장치 및 처리

시료수를 소독처리하기 위한 소형의 소독 장치를 set-up하였다. 소독처리

반응기의 전체 부피는 0.5 ℓ이고 오존, 자외선 각각 단독 공정과 오존/자외선

혼합 공정을 실시하였다. Ozone generator (OZONIA Co., Swiss)를 이용하여

고순도 산소로 오존을 발생시켜 기체상의 오존을 소독처리 반응기에 연속적으로

주입하였다. 주입되는 오존가스 유량은 0.8 ㎎·min/ℓ로 flow meter에서 일정하

게 조절하였다. 총 반응 시간은 5분으로 하여 실제 오존 주입량은 4 ㎎/ℓ를 처리

하였다. 자외선 조사는 254 ㎚의 저압 램프를 이용하여 417 ㎽/ℓ를 처리하였다.

2.2.4 시료수의 배양

채수하여 4℃에서 보관되어 있던 시료수의 침전물이 가라앉지 않도록 잘

혼합한 후 high speed용 50 ㎖ Oak Ridge Centrifuge Tube (PPCO, Nalge Co.,

USA)를 사용하여 실온에서 4500×g (20,000 rpm)로 30분 동안 원심분리하고

-１６-

조심스럽게 상층액을 제거하였다. 이 과정을 세 차례 반복하여 시료수의 전체

부피를 100 ㎖이 되도록 하였다. 시료수 100 ㎖로부터 얻은 침전물은 1×TE

buffer (pH 8.0) 100 ㎕에 녹였다. LB media가 들어있는 고체 배양판을

4분획하여 침전물이 녹아있는 부유액을 각각 10 ㎕, 20 ㎕, 30 ㎕, 40 ㎕씩 분주

하고 37℃에서 20시간 배양하였다.

2.2.5 16s rRNA의 Cloning

Gene clean III kit (BIO 101 Inc., California)를 이용하여 증폭된 PCR

증폭 산물을 elution하고, TOPO TA cloning kit (Invitrogen, USA)의 plasmid

vector pCR2.1®-TOPO® plasmid vector를 이용하여 ligation, One shot®

chemical transformation kit (Invitrogen, USA)의 TOP 10 competent cell을

이용하여 cloning하였다. 이러한 과정을 통해 cloned된 16s rRNA PCR 증폭

산물을 다시 PCR하기 위해 100 ㎕/㎖ ampicillin을 포함한 LB media가 든 고체

배지에 배양한 후 여러 개의 colony를 선택하여 PCR-clone library를 제작하였다.

2.2.6 PCR-RFLP

위에서 실시한 direct PCR과 동일한 조건으로 PCR-clone library 각각의

colony PCR을 실시하여 원하는 크기와 방향으로 cloning 되었는지를 확인하였다.

그리고 PCR 증폭 산물을 이용한 RFLP를 실시하기 위해 증폭된 DNA의 양은 10

㎕, DNA의 양이 적은 것은 적당한 양으로 맞추어 전체 반응 용액의 부피를 20

㎕로 하였다. 5 U의 Hae III (MBI Co., Germany) enzyme 0.5 ㎕을 사용하여

37℃에서 1시간 동안 처리하였다(31, 32). 잘려진 DNA 절편은 2.5% (w/v)

-１７-

agarose gel (Bioneer Co., Daejeon, Korea)과 0.5×TBE (pH 8.0)를 사용하여

전기영동하고 ultraviolet trans-illuminator (Vilber Louramat, Mame La Valle,

France)로 제한효소 처리 후 DNA의 잘려진 패턴을 확인하였다. GeneRuler™

100 bp DNA Ladder Plus (MBI Co., Germany)를 DNA size marker로 사용하였

다.

2.2.7 염기서열의 분석

각각의 library에 대한 RFLP 패턴을 그룹화하여 염기서열을 분석하기 위해

대표적인 clone을 선택하여 plasmid extraction kit (Bioneer Co., Daejeon,

Korea)를 이용하여 plasmid DNA small-scale miniprep을 실시한 뒤 마크로젠

(Seoul, Korea)에 의뢰하였다.

2.2.8 Dot blot hybridization

16s rRNA primer로 증폭한 PCR 증폭 산물 10 ㎕를 dot blot buffer (per

100 ㎖ ; 0.4 M NaOH, 25 mM EDTA) 190 ㎕와 혼합하여 95℃에서 10분 동안

반응시켜 두 가닥의 DNA를 한 가닥으로 변성시켰다. 변성된 DNA 용액 200 ㎕

모두를 Easy-Titer™ ELIFA System (77000, Pierce Biotechnology, USA)

dot blot apparatus를 이용하여 Hybond-N+ membrane (Amersham Life

Science, Amersham, UK)에 blot하였다. Blotted된 membrane을 기기로부터

분리하고 80℃에서 2시간 동안 반응시켜 blocking하였다.

Oligonucleotide labeling은 Gene Image 3’-oligolabelling module

(RPN5770, Amersham Bioscience, UK)을 사용하였다. Oligonucleotide probe

-１８-

(10 pmole/㎕) 1 ㎕와 Fluorescein-11-dUTP 0.5 ㎕를 혼합한 후 37℃에서

90분간 반응시켰다.

Hybridization buffer (7.2 ㎖ 5×SSPE, 0.4 ㎖ 10% SDS, 0.4 ㎖ 100%

Denhardt’s solution)로 42℃에서 30분간 membrane을 prehybridization시킨 뒤,

표지된 oligonucleotide probe를 앞서 membrane의 prehybridization 반응에서

사용하였던 buffer에 첨가하여 42℃, 90 rpm 항온수조에서 1시간 동안

hybridization시켰다. Hybridization이 끝난 뒤, membrane blot으로부터

hybridization buffer를 제거하고 0.1% SDS가 포함된 2×SSPE로 실온에서

30분 동안 2회 세척하고, 0.1% SDS가 포함된 1×SSPE로 62℃에서 10분 동안

2회 세척하였다.

Membrane에 고정된 표적균의 PCR 증폭 산물 염기서열과 결합된

oligonucleotide probe의 3’ 말단의 Fluorescein-11-dUTP label를 검출하기

위한 chemiluminescent detection은 Gene Image ECL Detection Kit

(RPN3130, Amersham pharmacia biotech, UK)를 이용하였다. 1:20로 희석된

liquid block (RPN5770) solution으로 30분 이상 반응시키고, 1:1000로 희석된

anti-fluorescein-HRP conjugate (RPN 3130) solution으로 30분 동안 반응시

켰다. 그리고 ECL detection solution 1, 2를 동량 혼합하여 membrane을 1분간

반응시킨 뒤, Hyperfilm™ (Amersham Bioscience, UK)에 30분 동안 노출시키

고 X-ray developer로 현상하였다.

2.2.9 Reverse blot hybridization

모든 oligonucleotide probe는 activated negatively charged Biodyne C

-１９-

membrane과 공유 결합할 수 있도록 5' 말단에 아미노기를 포함하도록 주문 합성

(Bioneer Co., Daejeon, Korea)하였다.

Biodyne C blotting membrane (Pall Biosupport, MI, USA)을 10 ㎖ 16%

(w/v) 1-ethyl-3-(3-dimethyl- aminopropyl) carbodiimide (EDAC) (Sigma,

MO, USA)으로 실온에서 10분 동안 반응시켜 활성화시킨 후 멸균 증류수로

2분간 세척하였다. 활성화된 membrane을 MN45 miniblotter (Immunetics, MA,

USA)에 장착하였다.

Specific oligonucleotide는 농도가 200~1600 pmol, 전체 부피 150 ㎕가

되도록 500 mM NaHCO3 (pH 8.4)에 희석하였다. 희석된 oligonucleotide 용액

은 MN45 miniblotter slot에 기포 없이 채우고 실온에서 2시간 동안 반응시켜

oligonucleotide의 amino linker와 membrane을 공유 결합되도록 하였다. 2시간

incubation후에 oligonucleotide 용액을 aspiration하여 빨아내고 miniblotter에서

membrane을 분리하였다. 분리된 membrane은 실온에서 100 mM NaOH 100

㎖과 10분간 반응시켜 membrane을 불활성화시킨 뒤 0.1% SDS가 포함된 2×

SSPE로 60℃에서 5분간 세척하였다. Hybridization에 사용하기 전 membrane을

2×SSPE/0.1% SDS로 42℃에서 5분간 세척한 뒤, 앞서 oligonucleotide probe

가 결합된 방향과 수직이 되도록 MN20SL miniblotter (Immunetics, MA, USA)

에 장착하였다.

Reverse blot hybridization을 위한 표적 DNA는 biotin을 표지한 primer

인 5’ biotin-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’와 5’-CAGCMGCCGCGGTAA

TWC-3’를 사용하여 앞서 실시한 증폭 조건과 동일하게 증폭하였다. 증폭된

표적 DNA의 농도를 결정한 뒤, PCR 증폭 산물을 전체 부피가 370 ㎕이 되도록

2×SSPE/0.1% SDS에 희석하였다. 희석된 DNA를 100℃에서 10분간 끓여

-２０-

변성시킨 뒤 즉시 얼음에 넣어 식힌 후 MN20SL miniblotter slot에 채웠다.

50℃에서 90분간 hybridization한 후에 aspiration으로 slot에 있는 PCR 증폭

산물을 제거하고 miniblotter에서 membrane을 분리하였다. 분리된 membrane

blot은 2×SSPE/0.5% SDS로 62℃ 90 rpm 항온수조에서 10분간 2회 세척하였다.

세척된 membrane blot은 2×SSPE/0.5% SDS 10 ㎖에 1:2000으로 희석한

alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Boehringer Mannheim, Germany)

을 처리하여 42℃에서 40분간 반응시키고 2×SSPE/0.5% SDS로 42℃, 90 rpm

항온수조에서 10분간 2회, 2×SSPE로 실온에서 5분간 세척하였다.

결합된 DNA에 표지된 biotin label를 검출하기 위해 Gene Images CDP-

star™ detection kit (Amersham Biosciences, UK)를 사용하였다. CDP-Star™

detection reagent로 3분간 반응시킨 뒤 Hyperfilm™ (Amersham Biosciences,

UK)에 30분 동안 노출시키고 X-ray developer로 현상하였다. Membrane을

사용한 후에는 1% SDS로 80℃에서 30분간 2회 세척하여 모든 PCR 증폭

산물을 떼어버리고 20 mM EDTA (pH 8.0)으로 실온에서 15분간 2회 헹구어 준

뒤, SaranWrap에 넣고 봉하여 2~8℃에서 membrane이 마르지 않도록 주의하

며 신선한 상태로 보관하였다.

-２１-

제 3 장 결 과

3.1 수인성 병원균 및 각종 장내세균에 대한 16s rRNA

primer

의 유용성 확인

물 속에 존재하는 다양한 세균을 모두 증폭할 수 있도록 16s rRNA 유전자

부위 가운데 다양한 세균의 동정에 사용될 수 있는 특정 부위를 포함하면서

가능하면 모든 세균에 잘 보존되어 존재하는 부위를 PCR primer로 선정,

제작하였다 (Table 3). 이어 제작된 PCR primer가 수인성 병원균과 물에 존재하

는 각종 세균을 증폭할 수 있는지의 여부를 확인하였다. 총 26종의 장내세균을

포함한 다양한 표준균주를 대상으로 (Table 2) PCR를 실시하였고 그 결과를

전기영동으로 확인하였다 (Fig. 1). 그 결과 사용했던 모든 균주로부터 예상했던

크기인 992 bp의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 이로써 본 실험에서 사용하

게 될 16s rRNA PCR primer가 각종 수인성 병원균 및 장내세균을 효과적으로

증폭할 수 있으리라는 것을 알 수 있었다.

3.2 시료수에서의 16s rRNA primer의 유용성 확인

물 속에 균이 존재한다면 제작된 16s rRNA primer를 이용하여 PCR을

실시하였을 때 증폭될 수 있는지의 여부를 확인하였다. W시 섬강 상류에서 채취

한 강물 (원수), 정수 처리된 수돗물 (정수) 및 하수 (방류수)를 시료수로 이용하

여 PCR을 실시하였다. 각 시료수에서 추출한 DNA를 주형으로 사용하여 16s

-２２-

rRNA primer로 PCR 증폭을 실시한 결과, 강물 및 하수 시료로부터 992 bp 크

-２３-

Fig. 1. Amplification of diverse enteric bacteria by 16s rRNA primers. In order to

confirm whether the 16s rRNA primers used in this study could efficiently amplify

water-borne pathogens, a total of 26 reference strains were subjected for PCR.

Products were analyzed by electrophoresis in a 1.5% (w/v) TBE agarose gel and

visualized by ethidium bromide staining. Lane M, DNA size marker (1 kb ladder,

MBI Co.); 1, E. coli ATCC 25922; 2, E. coli ATCC 43894; 3, EHEC U4-41; 4, EPEC

Su3912-41; 5, K. pneumoniae ATCC 35657; 6, P. aeruginosa ATCC 27853; 7, S.

dysenteriae; 8, Y. enterocolitica ATCC 9610; 9, Y. pseudotuberculosis ATCC 29833;

10, S. aureus ATCC 25923; 11, S. aureus ATCC 33568; 12, L. monocytogenes ATCC

15313; 13, S. typhimurium ATCC 14028; 14, S. typhi ATCC 33459; 15, V.

parahaemolytucus ATCC 33844; 16, C. fruendii ATCC 6750; 17, E. aerogenes ATCC

13048; 18, E. faecalis ATCC 19433; 19, S. paratyphi-A ATCC 9150; 20, S. flexneri

ATCC 9199; 21, S. sonnei ATCC 25931; 22, ETEC TD225C4; 23, ETEC 214-4; 24,

ETEC 411C1; 25, EIEC Ewing227; 26, C. jejuni ATCC 33560; 27, negative control.

-２４-

기의 PCR 증폭 산물을 얻을 수 있었다. 반면에 살균 소독이 된 수돗물로부터는

PCR 산물이 증폭되지 않았다 (Fig. 2, Lane 1).

또한 여러 종류의 부유물이 존재하는 자연수나 살균 작용을 거친 수돗물에

PCR 반응을 억제하는 inhibitant가 존재하여 PCR 증폭을 억제하는지의 여부를

확인하기 위해 이미 16s rRNA primer로 증폭됨을 확인한 E. coli 균주의

genomic DNA를 positive control로 사용하여 함께 PCR을 실시하였다. E. coli

O157:H7 ATCC 35150 균주의 positive control DNA와 시료수로부터 추출한

DNA를 혼합하여 PCR 증폭한 결과는 E. coli O157:H7 ATCC 35150 균주의

genomic DNA만으로 PCR을 실시한 결과 (Fig. 2, Lane 3)와 동일하여 992 bp

크기의 증폭 산물을 얻었다 (Fig. 2, Lane 2). 이로써 대상 시료수로부터 추출한

DNA에 PCR 증폭을 방해하는 inhibitant가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다.

3.3 다양한 소독공정처리 전후 시료수에서의 16s rRNA primer

의 유용성 확인

앞서 살균 소독된 정수를 제외한 원수와 방류수에 존재하는 세균을 16s

rRNA primer를 이용한 PCR로 증폭할 수 있음을 확인하였다. 이어 원수와

방류수에 오존, 자외선 각각 단독 공정과 오존/자외선 혼합 공정과 같은 다양한

소독처리를 한 후에도 각각의 시료수에 세균이 남아있는지 여부를 확인해보기로

하였다. 원수와 방류수, 두 시료수에 소독처리를 하지 않았을 때를 포함하여 오존

과 자외선으로 각각 단독 소독처리했을 때, 오존/자외선으로 혼합 소독처리한

시료수를 이용하여 PCR을 수행하였다. 각각의 시료수로부터 추출한 DNA를

주형으로 16s rRNA primer를 이용하여 PCR을 수행한 결과, 992 bp 크기의 증

-２５-

Fig. 2. Amplification of DNA extracted from water samples by 16s rRNA primers.

In order to confirm whether DNAs extracted form diverse water samples can be

amplified by PCR without influence from any inhibitant possibly present in diverse

water samples, PCRs were carried out with DNAs extracted from tap water, river

water, and sewage water with and without spiked positive control DNA. Products

were analyzed by electrophoresis in a 1.5% (w/v) TBE agarose gel and visualized by

ethidium bromide staining. Lane M, DNA size marker (1 kb ladder, MBI Co.); 1,

Only water sample; 2, Mixture of water sample with positive control; 3, Positive

control, E. coli O157:H7 ATCC 35150; 4, negative control.

-２６-

폭 산물을 모든 시료수에서 확인할 수 있었다 (Fig. 3, Lane 1). 즉 소독 전후의

모든 시료에서 PCR 산물이 증폭되었다. 이로써 염소 소독된 물과 달리 오존, 자

외선으로 소독처리한 후에도 세균의 DNA가 완전히 제거되지 않음을 확인할 수

있었다.

본 실험에서도 여러 종류의 부유물 및 오염물이 존재하는 원수 및 방류수

와 각각의 소독 공정 처리한 후의 시료수에 PCR반응을 억제하는 inhibitant가

존재하는지의 여부를 확인하기 위해 이미 16s rRNA primer로 증폭됨을 확인한

E. coli O157:H7 ATCC 35150 균주의 genomic DNA를 positive control로

사용하여 PCR을 실시하였다. 즉 E. coli O157:H7 ATCC 35150 균주의 positive

control DNA와 시료수로부터 추출한 DNA를 혼합하여 PCR 증폭하였다. 그 결과

E. coli O157:H7 ATCC 35150 균주의 genomic DNA만으로 PCR을 실시한 결과

(Fig. 3, Lane 3)와 시료수와 혼합하여 PCR을 실시한 결과는 동일하여 992 bp

크기의 증폭 산물을 얻을 수 있었다 (Fig. 3, Lane 2). 이로써 대상 시료수로부터

얻은 DNA에도 PCR 증폭을 방해하는 inhibitant가 존재하지 않음을 확인할 수

있었다.

3.4 배양을 통한 다양한 시료수 내 균의 존재 확인

앞의 두 실험 결과를 통해 16s rRNA primer를 이용하여 물에 존재하는

세균 DNA를 증폭할 수 있음을 확인하였다. 그러면 실제로 16s rRNA primer를

이용하여 PCR로 증폭된 것이 물에 존재하는 다양한 세균의 DNA인지를 배양을

통해 확인해 보고자 하였다. 정수를 포함하여 원수와 방류수 각각에 대해 소독처

리를 하지 않았을 때와 오존, 자외선으로 각각 단독 소독처리했을 때 그리고 오존

-２７-

Fig. 3. Amplification of water samples before and after treatment with diverse

sterilization methods by 16s rRNA prmers. Products were analyzed by

electrophoresis in a 1.0% (w/v) TBE agarose gel and visualized by ethidium bromide

staining. Lane M, DNA size marker (1 kb ladder, MBI Co.); 1, Only water sample; 2,

Mixture of water sample with positive control; 3, Positive control, E. coli O157:H7

ATCC 35150; 4, negative control.

-２８-

/자외선 혼합 소독처리했을 때의 시료수를 LB media가 들어있는 고체 배양판을

각각 4분획하여 10 ㎕, 20 ㎕, 30 ㎕, 40 ㎕씩 분주하여 37℃에서 20시간

배양하였다. 배양한 결과, 정수를 제외하고 원수와 방류수 각각에 소독처리를

하지 않았을 때와 오존, 자외선 각각 단독으로, 오존/자외선 혼합하여 소독처리한

시료수를 배양한 배지에서 모두에서 균이 배양됨을 확인하였다 (Fig. 4). 즉 16s

rRNA primer를 이용한 PCR로 증폭된 산물은 물에 생존하는 균의 DNA가

증폭된 것임을 확인하였다.

-２９-

Fig. 4. Diverse water samples cultured on Luria-Bertani (LB) media. In order to

check whether DNAs in diverse water samples amplified by 16s rRNA primers were

indeed derived from bacteria present in water, water samples from tap, river and

sewage before and after treatment with diverse sterilization methods were cultured.

-３０-

3.5 PCR-clone library 제조와 PCR-RFLP 염기서열 분석

소독처리 후 물에 생존하는 세균이 어떤 세균인지 동정하기 위해 증폭된

PCR 산물을 PCR 증폭 산물 cloning vector인 T-vector에 cloning하여 E.

coli를 형질 전환하였다. 이렇게 얻어진 E. coli colony를 PCR 산물이 들어있는

clone의 library로 사용하여 각각의 clone이 유래된 세균을 동정하기 위해 PCR-

RFLP를 실시하였다. PCR-RFLP를 위해 각각의 colony로부터 얻은 DNA와 16s

rRNA primer를 이용한 PCR을 수행하고 (Fig. 5) 제한효소인 Hae III로 처리하

여 RFLP profile을 얻었다 (Fig. 6). 이어 PCR-RFLP profile을 분석하여 서로

같은 profile이 나오는 clone은 같은 종류의 세균 DNA를 증폭한 clone으로

간주하여 분류하였다. 그리고 서로 다른 PCR-RFLP profile을 갖는 colony의

16s rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 원수의 경우 소독처리를

하지 않았을 경우에는 60여종의 서로 다른 PCR-profile이 나오는 것으로 확인되

었고, Flavobacterium spp., β-proteobacterium spp., Pseudomonas spp., γ-

proteobacterium spp. 외 다양한 수중 세균이 존재하는 것을 확인하였다 (Table

4). 방류수의 경우도 다양한 균이 존재하는 것을 확인하였다 (Table 5). 즉 16s

rRNA primer를 이용한 PCR로 다양한 수중 세균을 증폭할 수 있다는 것을

확인할 수 있었다.

-３１-

Fig. 5. Amplification of PCR-clone library by 16s rRNA primers. In order to

identify diverse populations of bacteria in water, each of colony in the PCR-clone

library was subjected to PCR. Products were analyzed by electrophoresis in a 1.0%

(w/v) TBE agarose gel and visualized by ethidium bromide staining. Lane M, DNA

size marker (1 kb ladder, MBI Co.); 1-31, colonies from the library constructed with

PCR products with river water treated with UV sterilization process; 32, negative

control.

-３２-

Fig. 6. PCR-RFLP profiles with PCR products with PCR-clone library. In order

to identify bacterial populations in water samples, PCR products were digested with

Hae III enzyme and run on a 2.5% (w/v) agarose gel. Some of them (e.g. Lane 5 and

8, lane 12 and 13, lane 20 and 21 etc.) show the same RFLP profiles indicating these

clones in the library represent the same bacteria in the water. Each of representitive

PCR products was then subjected to sequence analysis. Products were analyzed by

electrophoresis in a 2.5% (w/v) TBE agarose gel and visualized by ethidium bromide

staining. Lane M, DNA size marker (100 bp ladder, MBI Co.); Lane 1, 10, 15, 16,

Commamonadaceae bacterium; Lane 2, 4, 14, 20, 21, Pseudomonas sp.; Lane 5, 8,

Flavobacterium sp.; Lane 6, γ-proteobacterium sp.; Lane 7, 9, 11, 12, 13, 17, 22,

Janthinobacterium sp.; Lane 19, E. coli.

-３３-

Table 4. Various bacteria detected from river water by PCR-RFLP-

sequence Analysis

River water

Treatment

Kinds of

bacteria Identified bacteria

Similarity(%) to

known sequences

Unsterilization Over 60 Flavobacterium sp. 98

Beta proteobacterium sp. 97

Pseudomonas sp. 98

Actinobacteria 99

Haliscomenobacter hylrossis 98

Thermodesulfabacteria 97

Ozone 5 Flavobacterium sp. 98

Beta proteobacterium sp. 96

Pseudomonas jessenii 97

Gamma proteobacterium sp. 96

Zoogloea ramigera 96

UV 7 Flavobacterium xinjiangense 97

Pseudomonas veronii 98

Commamonadaceae bacterium 98

Janthinobacterium lividum 97

Variovorax sp. 97

Zoogloea ramigera 96

Beta proteobacterium sp. 96

Ozone/UV 3 Flavobacterium sp. 98

Beta proteobacterium sp. 95

Pseudomonas sp. 98

-３４-

Table 5. Various bacteria detected from sewage water by PCR-RFLP-

sequence Analysis

Sewage water

Treatment

Kinds of

bacteria Identified bacteria

Similarity(%) to

known sequences

Unsterilization 10 Flavobacterium sp. 99

Beta proteobacterium sp. 98

Pseudomonas sp. 98

Zoogloea sp. 97

Besides 6

Ozone 9 Flavobacterium sp. 99

Beta proteobacterium sp. 98

Pseudomonas sp. 96

Janthinobacterium sp. 97

Besides 5

UV 6 Flavobacterium sp. 97

Pseudomonas sp. 98

Comamonadaceae bacterium 97

Janthinobacterium sp. 98

Besides 2

Ozone/UV 5 Flavobacterium sp. 98

Beta proteobacterium sp. 97

Besides 3

-３５-

3.6 16s rRNA species-specific probe 제작

앞의 실험을 통하여 16s rRNA primer가 물에 존재하는 다양한 세균을

증폭하는데 유용함을 확인할 수 있었다. 이어 증폭된 세균을 신속하고 정확하게

동정하기 위하여 reverse blot hybridization를 실시하였다. Reverse blot

hybridization 제작을 위한 표적균은 C. jejuni, L. monocytogenes, Y.

enterocolitica, V. parahaemolyticus, S. typhi, Shigella spp. 등의 수인성 전염병

발생 빈도가 높은 균을 선택하였고 이들 표적균을 검출하기 위한 reverse blot

hybridization용 probe를 디자인하였다. 우선 16s rRNA primer로 증폭된 수인성

병원균 및 각종 장내세균의 PCR 증폭 산물과 결합할 수 있는 16s rRNA

oligonucleotide probe를 제작하기 위하여 GeneBank database (NCBI, USA)에

보관 중인 각 세균의 16s rRNA 유전자의 염기배열 순서를 참조하였다. 각 장내

세균의 GeneBank accession number에 해당하는 유전자 염기배열 순서를

기초로 하여 species-specific한 부위에서 probe를 선정하기 위하여 서열분석용

http://probes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html을 이용하여 각 균의 16s

rRNA 유전자 부위 중 앞서 제작한 16s rRNA primer로 증폭된 유전자 부위를

비교하였다 (Fig. 7). 비교한 결과 16s rRNA 유전자의 V6 region에서 12개의

oligonucleotide (nt 999-1029, E. coli 16s rRNA numbering)를 디자인하여

주문 제작 (Bioneer Co., Daejeon, Korea)하였다. Table 6은 이러한 과정을 통해

본 연구에서 사용된 장내세균을 동정하기 위해 디자인된 16s rRNA probe를 나

타내었다.

-３６-

Fig.

7. A

lignm

ent o

f the

V6

regi

ons o

f 16s

rR

NA

gen

es o

f ent

eric

bac

teri

a.

-３７-

Table 6. List of probe sequences designed for enteric bacterial identification

Target organisms Sequence(5’→3’) No.1

E. coli

S. paratyphi-A

S. flexneri

S. sonnei

ACGGAAGTTTTCAGAGATGAGAAT

X80724

U88546

X96963

X96964

S. typhi

K. pneumoniae ACAGAACTTTCCAGAGATGGATTG

Z47544

X87276

S. dysenteriae ACAGAACCTTGTAGAGATACGAGG X96966

S. typhimurium ACAGAAGAATCCAGAGATGGATTG X80681

C. fruendii

E. aerogenes AGAGAACTTAGCAGAGATGCTTTG

AF025365

AB099402

Y. enterocolitica ACGGAATTTAGCAGAGATGCTTTA AF366378

Y. pseudotuberculosis ACAGAATTTGGCAGAGATGCTAAA AF366375

V. parahaemolyticus AGAGAAGTTTCCAGAGATGGATTG AF388389

P. aeruginosa TGAGAACTTTCCAGAGATGGATTG AB037545

S. aureus TTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTC AF015929

L. monocytogenes TTTGACCACTCTGGAGACAGAGCTTTC M58822

C. jejuni TAAGAACCTTATAGAGATATGAGGGTG

CTAG M59298

1 ) Gene Bank Accession Number

-３８-

3.7 Dot blot hybridization 방법을 이용하여 species-specific

16s rRNA probe의 유용성 확인

위의 과정을 통해 모두 12개의 spec i es-spec i f i c 16s rRNA

oligonucleotide probe를 선정하였다. 선정한 probe가 실제 각각의 수인성

병원균 과 장내세균에 결합하는지 알아보기 위해 각각의 probe를 이용한 dot

blot hybridization을 수행하였다 (Fig. 8). 총 26 균주의 DNA를 PCR하여

membrane에 장착한 후 각각의 probe로 dot blot hybridization을 수행하여 각

probe의 특이도를 평가하였다. 그 결과 12개의 probe중 예상했던 대로 자신의

표적균에만 특이하게 결합한 probe는 3개의 probe로, S. typhimurium, Y.

pseudotuberculosis, 그리고 C. jejuni를 표적으로 하는 probe였다 (Fig. 8A).한

편 자신의 target에 결합하였지만 다른 균과도 결합한 probe는 7가지였다. 예를

들어, C. fruendii와 E. aerogenes를 동시에 표적으로 하는 probe는 표적균

이외에 K. pneumoniae와 Y. enterocolitica와도 결합하였다. S. aureus를

표적으로 하는 probe는 S. aureus 이외에도 L. monocytogenes와도 결합하는

결과 를 보였 으며 Y . e n t e r oc o l i t i c a 의 경 우 에는 표 적균 이외 에 도 Y .

pseudotuberculosis도 함께 결합하였다 (Fig. 8B). 지표 세균으로 잘 알려진 E.

coli를 표적으로 하는 probe는 E. coli 뿐만 아니라 염기서열의 유사성으로 인해

Shigella spp. 중 S. flexneri와 S. sonnei, Salmonella spp. 중 S. paratyphi-A도

표적으로 하게 되는데 dot blot hybridization 실험 결과에 의하면 이들 probe는

표적으로 하는 각 균들뿐 만 아니라 S. dysenteriae와도 결합되는 결과를 보였다.

또한 S. typhi와 K. pneumoniae를 표적으로 하는 probe는 target 이 외에

pathogenic E. coli 중 EIEC, EPEC, S, typhimurium, S. sonnei, P.

-３９-

aeruginosa와도 결합하였다. V. parahaemolyticus를 표적으로 하는 probe와

P. aeruginosa를 표적으로 하는 probe는 동일한 결과를 보였는데 대부분의

E. coli균과 Citrobacter와 Klebsiella와 같은 대장균군 등을 모두 포함하는 비특

이적인 결합을 보였다. 마지막으로 표적균과 결합하지 않고 전혀 다른 양상을

보였던 probe도 있었다. 예를 들면 L. monocytogenes를 표적으로 하는 probe의

경우 자신의 표적은 물론이고 다른 sequence와도 결합하지 않았다. S. dysenteriae

에 대한 probe도 자신의 표적에는 결합하지 않았으나 S. aureus와 병원성 E. coli

균종인 EPEC와 결합하는 결과를 보였다.

-４０-

A

B

Fig. 8. Dot blot hybridization using each of 12 probes.

1 : EC 2 : ET1 3 : ET2 4 : ET3 5 : STEC 6 : EH 7 : EI 8 : EP

9 : CIT 10 : ENB 11 : KLE 12 : ENC 13 : PSE 14 : SM 15 : ST 16 : SP

17 : SF 18 : SS 19 : SD 20 : YE 21 : YP 22 : VP 23 : CJ 24 : SA1

25 : SA2 26 : LM 27 : negative control

-４１-

3.8 Reverse blot hybridization

앞서 dot blot hybridization을 이용하여 그 유용성이 확인된 5개의 probe,

S. typhimurium, C. fruendii, Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis 그리고 S.

aureus를 표적으로 하는 probe를 이용하여 membrane을 제작하고 reverse blot

hybridization을 수행하였다. Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis, S. aureus

를 각각 표적으로 하는 probe의 경우 dot blot hybridization의 결과와

일치하였다. 즉 Y. pseudotuberculosis를 표적으로 하는 probe는 자신의

표적균만 결합하였고 S. aureus를 표적으로 하는 probe는 S. aureus 이외에도 L.

monocytogenes와도 결합되는 결과를 보였으며, Y. enterocolitica에 대한 probe

는 Y. pseudotuberculosis와도 함께 결합하였다. S. typhimurium을 target으로

하는 probe의 경우 dot blot hybridization의 결과와 달리 결합하지 않았다. 또한

C. fruendii의 경우에는 약하게 C. fruendii의 표적 DNA와 결합함을 확인할 수

있었다. 비록 E. aerogenes의 PCR 증폭 산물을 사용하지 못하였으나 dot blot

hybridization의 결과에서처럼 비특이적인 결합을 보이지 않았다 (Fig. 9).

-４２-

1 : SM 2 : CIT 3 : YE 4 : YP 5 : SA1 6 : SA2 7 : SA3 8 : LM 9 : EC 10 : EH

11 : EP 12 : SD 13 : SF 14 : SS 15 : ST 16 : SP 17 : KLE 18 : PSE 19 : VP 20 :

ENC

Fig. 9. Reverse blot hybridization using 5 probes.

-４３-

3.9 Reverse blot hybridization 방법과 16s rRNA primers를

이용한 PCR 방법의 민감도

16s rRNA probe를 이용한 reverse blot hybridization 방법의 민감도를

알아보았다. 대상 균주로 Y. pseudotuberculosis ATCC 29833 균주를 사용하였

다. 900 ㎕의 멸균 증류수에 균 배양액 1 ㎖ 중 100 ㎕를 혼합하여 단계 희석된

희석액으로부터 DNA를 얻었고 이 중 10 ㎕의 DNA를 사용하여 PCR을

수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 증폭 산물을 이용하여 reverse blot hybridization

을 실시하였다. 그 결과 PCR 방법과 reverse blot hybridization 방법의 검출한계

는 10 cells/㎖을 보였다 (Fig. 10).

-４４-

Fig. 10. Sensitivity of the reverse blot hybridization and the PCR. I : PCR products

using 16s rRNA primer on DNA extracted from serial dilution of Y. pseudotuberculosis.

II : Corresponding RBH of PCR product derived from DNA extracted from serial

dilution of Y. pseudotuberculosis. Lane M, DNA size marker (1kb ladder, MBI Co.);

Lane NC, negative control.

-４５-

제 4 장 고 찰

본 연구에서는 수인성 전염병의 원인이 되는 각종 병원균을 신속하고 정확

하게 동시에 검출할 수 있는 기법을 개발하기 위한 분자생물학적 방법 확립에

연구목적을 두었다. 본 연구에서는 분자생물학적 방법 가운데 PCR-reverse blot

hybridization 방법을 선택하였다.

Reverse blot hybridization 방법은 membrane에 oligonucleotide probe를

공유결합시킨 뒤 이 membrane에 PCR 산물을 결합시키는 방법이다. 다양한 종류

의 균에 대한 probe가 membrane에 결합되어 있으므로, 검사 시료에 들어있는

다양한 종류의 균을 한번에 screening할 수 있는 간단한 방법이다. 또한 모든

과정 (membrane preparation, hybridization, detection)이 하루에 완료될 수 있어 신속한

방법이기도 하다. Probe가 결합된 blot은 수개월 보관이 가능하며, hybridization과정이

모두 끝난 뒤 PCR 증폭 산물을 제거해 내는 과정에서의 중요한 signal의 손실

없이도 적어도 10회 이상 재사용이 가능하다(42). 따라서 reverse blot

hybridization은 다수의 probe를 사용하여 다수의 sample을 동시에 검출할 수 있고,

blot을 재사용할 수 있으며, 비교적 실험을 위한 간단한 장비가 요구된다는 점에서

다른 분자생물학적 방법에 비해 비용 및 시간적인 면에서 매우 유용하면서

효과적인 방법이다.

16s rRNA 유전자는 염기서열의 보존성이 높은 영역과 probe로 제작하기

용이한 다형적영역이 존재한다. 염기서열의 보존성이 높은 지역은 대부분의 원핵

생물에서 동일하나, 다형성이 높은 지역은 종간 사이의 판별이 가능할 정도의

차이를 보여주기도 한다. 따라서 본 연구에서 PCR 증폭을 위한 primer와 DNA

-４６-

hybridization을 위한 oligonucleotide를 제작하기 위해 16s rRNA 유전자 부위를

사용하였다. 본 실험의 결과에 의하면 16s rRNA 유전자 부위는 물에 존재하는

다양한 종류의 세균을 모니터링하기에 좋은 표적이 된 것으로 생각된다. 실험에서

16s rRNA PCR primer로 증폭이 가능한지 확인한 세균은 모두 수인성 전염병을

일으킬 수 있는 잠재력을 가진 세균들로 향후 다양한 종류의 물을 대상으로

PCR을 수행할 경우, 특히 이들 균이 존재하는 경우에 증폭할 수 있도록 하기

위해 그 여부를 확인한 것이었다.

섬강에서 채취해 온 강물 및 소독처리 된 수돗물, 그리고 하수장에서

채취한 방류수를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 염소 소독에 의해 세균 등의

오염원 제거가 된 수돗물의 경우에는 세균에 의한 16s rRNA PCR 증폭이 되지

않았다. 수돗물에서 PCR이 되지 않은 이유가 물에 존재하는 PCR을 억제하는

인자에 의한 것인지를 알아보기 위해 이미 증폭됨을 확인한 E. coli 균주의

DNA를 물 시료에 넣어 PCR을 수행해 본 결과, E. coli 만으로 수행한 PCR

결과와 동일하게 나옴으로써 억제 인자가 존재하지 않음을 확인할 수 있었다.

결국 염소 소독수인 수돗물은 세균이 존재하지 않는 것으로 볼 수 있었다. 강물

및 하수 처리장에서 채취한 물을 대상으로도 PCR 억제인자의 존재 여부를

알아보는 실험을 실시하였으며, 그 결과도 억제 인자가 존재하지 않음을 보여 주

었다. 따라서 향후 다양한 종류의 물을 대상으로 모니터링을 실시하는 경우에도

본 실험에서 사용한 DNA 분리 방법을 사용하면 억제인자가 존재하지 않을 것으

로 사료되며 억제인자가 존재하는 지의 여부를 알아보는 방법으로 본 실험에서

사용한 방법을 사용하면 좋을 것으로 생각된다.

원수와 방류수, 그리도 이들 시료수를 오존이나 자외선과 같은 새로운 대체

소독법으로 처리한 시료수를 대상으로 PCR을 수행한 결과, 증폭되는 산물이

-４７-

존재하였다. 따라서 오존이나 자외선으로 소독처리한 물에도 세균이 남아있다고

볼 수 있다. 그러나 PCR은 시료수에 존재하는 균의 DNA를 증폭하는 것이므로

소독처리 과정에서 이미 죽은 균의 DNA가 증폭되었을 가능성도 배재할 수 없었

다. 따라서 PCR 증폭 산물이 실제로 시료수에 살아남아있는 균으로부터 증폭된

것인지의 여부를 확인하기 위해 동일한 시료수를 이용하여 배양해 본 결과 다양한

종류의 균이 배양되었다. 따라서 PCR로 증폭된 것은 물에 존재하는 살아있는

다양한 세균의 DNA임을 확인할 수 있었다.

소독처리한 후에도 물 속에 세균이 존재한다면 어떤 세균인지를 동정해 볼

필요가 있다. 왜냐하면 물에 존재하는 세균을 모니터링하는 목적은 소독처리되어

음용수로 사용될 물에 수인성 전염병을 유발하는 병원균이 존재하는지를 확인하

는 것이기 때문이다. 이를 확인하는 방법은 염기서열 분석법 및 RFLP 혹은 특정

probe에 hybridization 하는 방법 등이 있다. 이 가운데 probe hybridization

방법을 제외한 나머지 방법들은 PCR한 산물이 다양한 세균에 의해 증폭된

산물이므로 각각의 DNA를 cloning하여 분석해야 하는 방법이다. Cloning된

산물을 직접 각각의 염기서열을 분석할 수도 있으나, 이는 colony의 수가 많아

비용과 시간 등의 노력이 많이 든다. 따라서 본 연구에서는 PCR 증폭 산물로

clone library를 제작하고 PCR-RFLP 염기서열 분석 방법을 이용하여 강물에

존재하는 60여종의 다양한 미생물을 동정하는데 성공하였다. 그리하여 각각의

clone으로부터 얻은 PCR-RFLP profile은 향후 다양한 물을 대상으로 PCR-

RFLP를 수행하면 별도의 염기서열 분석없이 각각의 균을 동정하는데 이용될 수

있을 것이라 생각된다.

이어 좀 더 간단하게 물 오염균을 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해

표적균을 검출할 수 있는 probe 선정을 위한 dot blot hybridization을 실시하였

-４８-

다. 표적이 될 수 있는 다양한 수인성 병원균 및 지표세균으로 사용되고 있는

다양한 세균의 PCR 증폭 산물을 membrane에 고정시키고 각 표적균의 16s

rRNA 유전자 부위에서 각 균종을 동정할 수 있는 특이적인 부위를 probe로

제작하여 hybridization시켰다. 모두 12개의 probe를 제작하였는데 이 중 자신의

표적균에만 정확하게 결합한 probe는 dot blot hybridization에 사용된 기타

균주의 PCR 산물과는 결합하지 않아 특이도가 높은 것으로 생각되었다. 그러나

그 외에 비특이적인 결합을 보인 probe나 전혀 다른 양상을 보인 probe의

경우에는 hybridization에 영향을 미칠 수 있는 요인을 조정하여 결합하기에

알맞은 최적의 조건을 찾을 필요가 있다. 즉 자신의 표적 이외의 비특이적인

결합을 보이는 probe의 경우 결합 온도를 증가시키거나 buffer의 염 농도를 낮춰

줌으로써 hybridization의 stringency를 증가시킬 수도 있을 것이며, probe의

길이를 조정하여 비특이적으로 결합될 확률을 줄일 수 있을 것으로 생각된다.

또한 전혀 다른 양상을 보인 probe의 경우에는 16s rRNA 유전자 부위 중

특이적인 부위를 새롭게 개발할 필요가 있다. 본 연구에서 사용되어진 수인성

전염병을 유발하는 병원성 세균의 특이적인 probe들로 모두 12가지 종류를

이용하였는데 이 중 특이성이 낮게 나타나는 경우도 있었기 때문에 무엇보다도

여러 수인성 병원균을 모니터링하는데 있어 가장 중요한 것은 높은 특이성을

갖는 probe를 확보하는 것이라 사료된다.

각 probe의 특이도를 알아본 후 어느 정도 그 유용성이 확인된 probe는

membrane에 고정시키고 다양한 장내세균 및 수인성 세균의 PCR 증폭 산물

결합시켜 reverse blot hybridization 방법을 수행하였을 때 한 번의 시도로 두

가지 이상의 균을 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다.

본 연구를 통하여 PCR-reverse blot hybridization 방법이 기존의 물에

-４９-

존재하는 수인성 전염병을 유발할 수 있는 병원성 세균을 모니터링하는 방법들의

여러 문제점을 해결해 줄 수 있는 대안으로 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

-５０-

제 5 장 결 론

본 연구의 목적은 물에 존재하는 수인성 전염병을 유발하는 병원성 세균을

보다 효과적으로 모니터링 하기 위한 기법을 개발하는데 있다. 이를 위해 수질

오염의 주원인인 분변 오염을 진단하는데 사용되는 지표세균 및 각종 수인성

전염병을 유발할 수 있는 수인성 병원균 및 장내세균을 대상으로 하였고 이들

균의 16s rRNA 중 특이적인 염기서열을 표적으로 하여 PCR-reverse blot

hybridization 방법을 토대로 신속하고 정확하게 모니터링할 수 있는 기법을

개발하고자 하였다.

1. 물 속에 존재하는 다양한 수인성 병원균 및 장내세균의 16s rRNA 유전자

부위의 증폭을 위해 모든 세균에 비교적 잘 보존되어 있는 부위를 선정하여

16s rRNA primer를 제작하였고, 제작된 primer를 사용한 PCR을 수행하여

26종의 다양한 수인성 병원균과 장내세균이 증폭됨을 확인하였다.

2. 정수, 원수 및 방류수를 대상으로 제작된 16s rRNA primer를 사용한 PCR을

수행하여 염소 소독처리된 정수를 제외하고 원수와 방류수에 존재하는 세균이

증폭됨을 확인하였다.

3. 원수와 방류수를 대체 소독법인 오존과 자외선으로 소독처리한 후 16s rRNA

primer를 사용한 PCR을 수행하여 오존이나 자외선으로 소독처리한 후에도

세균의 DNA가 완전히 제거되지 않음을 확인하였다.

-５１-

4. 원수와 방류수를 대체 소독법인 오존과 자외선으로 소독처리한 후 배양하여

물에 존재하는 살아있는 균의 DNA가 16s rRNA primer로 증폭되었음을

확인하였다.

5. 본 연구에서 사용된 시료수로부터 DNA를 분리하는 방법은 다양한 물에 존재

하는 균을 16s rRNA primer를 이용하여 PCR하는 과정을 방해하는 물질이

존재하지 않도록 하는 방법임을 확인하였다.

6. PCR-RFLP-sequence analysis 방법을 통하여 소독처리한 물에 생존하는

세균을 동정하였다. 원수의 경우 소독처리하지 않았을 경우 60여종, 방류수의

경우 10여종의 다양한 수중 세균이 존재함을 확인하였다.

7. Reverse blot hybridization을 수행하기 위해 수인성 전염병 발생 빈도가 높은

세균을 표적으로 하여 16s rRNA 유전자 부위 중 각 균마다 특이적인 부위를

선정하여 12개의 oligonucleotide probe를 제작하였다.

8. Dot blot hybridization을 실시하여 자신의 표적균에만 특이적으로 결합한 S.

typhimurium, Y. pseudotuberculosis, 그리고 C. jejuni를 표적으로 하는

3개의 probe와 표적균 이외에 비특이적으로 결합하는 probe 등으로 제작된

probe의 특이도를 평가하였다.

9. 특이도를 평가하여 유용성을 확인한 5개의 probe를 이용하여 membrane을

제작하고 reverse blot hybridization을 수행하여 한 번의 시도로 두 가지

이상의 균을 검출할 수 있음을 확인하였다.

-５２-

10. 본 연구에서 사용된 PCR-reverse blot hybridization 방법의 검출한계는

10 cells/㎖임을 확인하였다.

11. PCR-reverse blot hybridization 방법을 이용하여 물에 존재하는 다양한

수인성 병원균을 모니터링하는데 있어 가장 중요한 것은 높은 특이성을 갖는

probe를 확보하는 것이다.

-５３-

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-５８-

Abstract

Development of PCR-Reverse blot hybridization

for bacteria causing water-borne diseases

Lee , Ji young

Dept. of Biomedical Laboratory Science

The Graduate School

Yonsei university

Since water-borne infection causes acute diseases and results in spread of

diseases by secondary infection, the prevention of transmission at the earliest point is

very important. Therefore, it is necessary to have a method that is rapid and effective

to monitor pathogenic bacteria in water. In this study, PCR using 16s rRNA primer

and subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP)-sequence analysis

and reverse blot hybridization method were used to detect and identify various kinds

of bacteria in water samples. In order to test whether this method is useful to monitor

populations of bacteria in water, water samples treated with diverse sterilization

methods, such as Ozone, UV, or Ozone/UV were analyzed. In brief, DNAs from

diverse water samples were extracted, and then subjected to PCR analysis. PCR

primers used in this study were derived from 992 bp region of the 16s rRNA gene.

Subsequently, a library of clones containing PCR products that were amplified from

diverse bacterial 16s rRNA gene was constructed. With cloned PCR products, PCR-

-５９-

RFLP-sequence analysis was done. That is, PCR products were digested with

restriction enzyme, Hae III to obtain species-specific RFLP. RFLP profiles were used

to classify each PCR clones in the library for their identity. Clones with unique RFLP

profiles were then all subjected to sequence analysis. As a result, the distributions of

bacteria before and after the treatment of each sterilization method were revealed. In

brief, no PCR product was detected in drinking water. On the other hand, in

unsterilized river water, over 60 different species of bacteria were found, in

unsterilized sewage water, a total of 10 bacterial populations were found. We

manufactured species-specific 12 kinds of 16s rRNA gene-based probes targeting

significant water-borne bacteria and in order to estimate their specificity carried out

dot blot hybridization. After probes usefulness was confirmed, 5 probes were used to

make a membrane for reverse blot hybridization. The results showed that reverse blot

hybridization method can detect more than 2 kinds of bacteria at once. The results

from this study clearly indicate that PCR-reverse blot hybridization method can be

useful for monitoring diverse water-borne bacteria in water samples.ii

Key Words : water-borne bacteria, monitoring, 16s rRNA primer, PCR-RFLP

sequence analysis, 16s rRNA probe, dot blot hybridization, reverse

blot hybridization