p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative,...

10
p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA Seong Gon Kim a , Gnana Ravi a , Carsten Hoffmann a , Yun-Jin Jung b , Min Kim b , Aishe Chen a , Kenneth A. Jacobson a,* a Molecular Recognition Section, Laboratory of Bioorganic Chemistry, National Institute of Diabetes, Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health, Building 8A, Room B1A-19, Bethesda, MD 20892, USA b Medicine Branch, National Cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA Received 26 July 2001; accepted 9 August 2001 Abstract A 3 adenosine receptor A 3 AR) agonists have been reported to in¯uence cell death and survival. The effects of an A 3 AR agonist, 1-[2-chloro-6-[[3-iodophenyl)methyl]amino]-9H-purin-9-yl]-1-deoxy-N-methyl-b-D-ribofuranonamide Cl-IB-MECA), on apoptosis in two human leukemia cell lines, HL-60 and MOLT-4, were investigated. Cl-IB-MECA 30 mM) increased the apoptotic fractions, as determined using ¯uorescence-activated cell sorting FACS) analysis, and activated caspase 3 and poly-ADP-ribose-polymerase. Known messengers coupled to A 3 AR phospholipase C and intracellular calcium) did not seem to play a role in the induction of apoptosis. Neither dantrolene nor BAPTA-AM affected the Cl-IB-MECA-induced apoptosis. Cl-IB-MECA failed to activate phospholipase C in HL-60 cells, while UTP activated it through endogenous P2Y 2 receptors. Induction of apoptosis during a 48 hr exposure to Cl-IB-MECA was not prevented by the A 3 AR antagonists [5-propyl-2-ethyl-4-propyl-3-ethylsulfanylcarbonyl)-6-phenylpyridine-5-carboxylate] MRS 1220) or N-[9-chloro-2-2-furanyl)[1,2,4]triazolo[1,5-c]quinazolin-5-yl]benzeneacetamide MRS 1523). Furthermore, higher concentrations of MRS 1220, which would also antagonize A 1 and A 2A receptors, were ineffective in preventing the apoptosis. Although Cl-IB-MECA has been shown in other systems to cause apoptosis through an A 3 AR-mediated mechanism, in these cells it appeared to be an adenosine receptor-independent effect, which required prolonged incubation. In both HL-60 and MOLT-4 cells, Cl-IB-MECA induced the expression of Fas, a death receptor. This induction of Fas was not dependent upon p53, because p53 is not expressed in an active form in either HL-60 or MOLT-4 cells. Cl-IB-MECA-induced apoptosis in HL-60 cells was augmented by an agonistic Fas antibody, CH-11, and this increase was suppressed by the antagonistic anti-Fas antibody ZB-4. Therefore, Cl-IB-MECA induced apoptosis via a novel, p53-independent up-regulation of Fas. Published by Elsevier Science Inc. Keywords: Adenosine receptor; Antagonist; Poly-ADP-ribose polymerase; CD95; APO-1; Phospholipase C; HL-60; MOLT-4 1. Introduction Following the introduction of A 3 AR-selective ligands [1±3], the A 3 AR has been demonstrated to have diverse physiological functions, including its effects on in¯amma- tion [4], hypotension [5], mast cell degradation [6], protec- tion of brain and heart [7±9], and apoptosis [10±15]. Speci®cally, potent A 3 AR agonists showed dual effects leading to either cellular protection or death. In rat astro- glial and human astrocytoma cells, micromolar concentra- tions of A 3 AR agonists reduced the cell number, while nanomolar concentrations promoted cytoskeletal changes that were associated with cytoprotection [13,16]. In chick ventricular myocyte culture [14] and in the isolated rabbit heart [17], the activation of the A 3 AR showed a precondi- tioning-like effect that improved the outcome following an ischemic injury. Similar effects were observed in vivo in a gerbil model of global ischemia [8]. In promyelocytic human leukemia HL-60 cells [11], the A 3 AR agonists IB-MECA 1-[6-[[3-iodophenyl)-methyl]amino]-9H-purin-9-yl]-1- deoxy- N-methyl- b- D-ribofuranuronamide) and Cl-IB- MECA induced apoptosis at high concentrations. At lower concentrations, they protected the cells from apoptosis induced by A 3 AR antagonists. In CHO cells transfected with the human A 3 AR, effects on the cell cycle were induced with high concentrations of Cl-IB-MECA in those cells expressing the A 3 AR, but not in control cells [18]. Biochemical Pharmacology 63 2002) 871±880 0006-2952/02/$ ± see front matter Published by Elsevier Science Inc. PII:S0006-295202)00839-0 * Corresponding author. Tel.: 1-301-496-9024; fax: 1-301-480-8422. E-mail address: [email protected] K.A. Jacobson). Abbreviations: A 3 AR, A 3 adenosine receptor; FACS, fluorescence- activated cell sorting; PLC, phospholipase C; PARP, poly-ADP-ribose- polymerase.

Transcript of p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative,...

Page 1: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

�������������� ���� � � ��� ��� �� � �� � ������� ������� �� ���� ��� �������� ����������

�� � ! � "��� !���� #���� ������ $ �������� %���&� &�� ���� "��� ��'� �'���� "����' �( &�� �� ���)

���������� ����� ��� ��� ���� ������ ��� �� ��������� ������ ��� �� ����� ��� � � � �� ����� ��� ���� ��� ��� ������ ���������

�� ����� ��� � � �� �� ���� �� ������� !� ��� �"!#"$� �� ������ �� %& $%� '�!��������� ������� �� ����� ������ ��� � � �� �� ����� ��� � � �� �� ���� �� �� ������ �� %& $%� '�!

#������ *+ &��� *,,-. ������� / �� �� *,,-

��������

�� ���� ��� ����� � 0���#1 � ��� '��� ���� ��� ��� �2����� ���� ���' ��� �������( 3'� ������ � �� ���# � ���

-�4*��'� � �+�440�� � �'����1��'��5��� 5�/�������/���5�-��� 6������'�����7��� ����� ����� 0����������1� � �� � �� �

8 '���� ������� ���� ����� $9�+, ��� �:93�;� 8��� ���� ���( ���������� 0��, ��1 �������� '� �� � � ���� ��� ��

�������� ��� 2� ��������������� ���� � �� 0����1 �������� ��� ������ ������� � ��� � ����7<��� ���� ��������( "� 8�

������ ��� � ����� ���# 0�' ��' ����� � ��� ����������� ������1 �� � ���� ���� � � �� � '� ���� � � �� � ��( =�'��

���� ���� � � ��<3���� ������� '� ����������������� �� � ��( ���������� ����� ����� �' ��' ����� � � $9�+, ������

8'�� >3< ������ '� � ' ��� �� �� <*%* ����� ��( ����� � � �� � �� ���� � ;? '� �6� ���� ���������� 8�� �

�������� �� '� ���# ��� ��� 4���� ����*��'���;��� ������0�'�������������� ���1�+��'����������������� 6����5 0�#� -**,1

� ��4/��'� � �*�0*��������14-�*�;5��@ � 4-����5A���@ �������5���@���������� 0�#� -�*�1( ���'��� ��� ' '�� � ������ ��

� �#� -**,� 8'�' 8 ��� ��� ��� �@� �- ��� �*� ����� ��� 8��� �������� � ������� '� �� � ��( ��' � ' ����������

'�� ���� �' 8� � '�� ������ ����� �� � �� '� � ' �� ���#������� ���'����� � '��� ����� �������� �� �� ���� ���

����� ����������� ������ 8'�' ��A���� �� � � �� ����� �( �� � ' $9�+, ��� �:93�; ������ ���������� ������ '� �6����� �

� ���� � ���' ����� �( 3'� ���� � � ��� 8�� � �������� �� � ���� ������� ��� � � �6������� � �� ���� � �� � �'�� $9�+,

� �:93�; �����( ����������������� �� � �� � $9�+, ����� 8�� �� ����� �� �� � ��� ��� ��� ��� �$�--� ��� '� �������

8�� ���������� �� '� ��� ��� ������ ��� �� B��;( 3'���� ��� ���������� ������ �� � �� ��� � � ���� �������������

����� ��� � � ���( <����'�� �� ������� ������ ���(

���(����) ���� ��� ����� �. ��� ��. < ����7<��� �� � ��������. �7/�. �<:�-. <' ��' ����� �. $9�+,. �:93�;

� ���� ������

� �� 8� '� �� ��� � � ���#�������� � ����

4-C�5� '� ���# '�� ���� ��� ������ '��� ������

�'�� � ��� ���� ��� ������ � ������ � �2�����

� 4;5� '�� ��� � 4�5� ��� ���� �� ���� � 4+5� �� ���

� � ���� ��� '��� 4DC/5� ��� �� � �� 4-,C-�5(

����E������ � �� ���# � ��� �' 8�� ���� ������

����� �'�� �������� �� �� � � ���'( �� �� ��� �

��� ��� '���� ��� �� �� ������ ��� � ��� � �������

�� � ���# � ��� ������� '� ���� ������� 8'��

��� � ��� � ������ �� �� � �� �� ������� �'�� ��

'� 8��� ��� ���� 8' �� �� �� � 4-��-+5( �� �'��

��������� �� ��� ������ 4-;5 ��� � '� � ���� ����

'��� 4-D5� '� ���� � � '� ���# �' 8�� � ���� ���

�� ���� ����� '� ��� ��� '� �� �� � �� 8� ��

��'��� �F���( ����� ������ 8��� ������� �� ���� � �

����� ��� � � ��� ��'��� 4?5( ���� ���� ���'����

������� $9�+, ����� 4--5� '� ���# � ��� �������

0-�4+�440�� � �'����1���'��5��� 5�/�������/���5�-�

�� 6������'�����7��� ������� �����1 ��� ������

���� ������ �� � �� � ' ' � ������ ��( � � 8��

� ������ ��� '�� �� ���� '� ����� �� � �� � ��

������ �� ���# ��� ���( �� �$: ����� ���������

8' '� '���� ���#� ������ � '� ���� ����� 8���

������ 8' ' ' � ������ �� � ���������� � ' ��

����� �6������ '� ���#� �� � � � �� � ����� 4-?5(

� �'����� <'����� � � +� 0*,,*1 ?D-C??,

,,,+�*/�*G,*GH C ��� �� � ���� <����'�� �� ������� ������ ���(

<��I � , , , + � * / � * 0 , * 1 , , ? � / � ,

) � ����� ��� ��' �( 3��(I �-��,-�;/+�/,*;. ��6I �-��,-�;?,�?;**(

*#���� �������) ��F�� ��J'��6(�'( � 0"(�( &�� �� �1(

!������� ����) ���#� �� ���� ��� ����� �. ����� ��� ���������

������ ���� � �� . <9�� �' ��' ����� �. <�#<� � ����7<��� ���

� ��������(

Page 2: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

3'� ���� � � ' �� �� '� ���'���� � '� �� ��

� ���� ���' ������ �� ���������� � '� $9�+, ���

�:93�; ������� ���� ����(

� ��������� �� ����� �

%+"+ �� ������

$9�+, ����:93�; ����� 8��� ����� �� � '� �3��(

#<�� -+;, ������ ���� � ��� ������ �������� �����

����� ��� ������ 8��� ����'���� �� � !�� �#9(

���������� ��� �#� -**, 0��4/��'� � �*�0*��������1�

4-�*�;5��@ � 4-����5A���@ �������5���@����������1

8��� ����� �� � #���� ��( �#� -�*� 4���� ����*�

�'���;��� ������0�'�������������� ���1�+��'��������

���������� 6����5 8�� ���'��@�� �� �������� ����

� ���� 4-/5( � 3���3� * 3�3�7�� �� �� � �� � ��

���� � � 8�� ����� �� � 3��� ��( 7 8�6 �! -�K?

���� 8�� ����'���� �� � � �#��( ������ 0�*,1� ���

����* 0-,,1� �����6 0��/1� ��� ���3#��9 0��-/1 8���

����'���� �� � ���� ���@ � ��'� � �( ������ ���

� ��� 0�$�-- ��� B��;1 8��� ����'���� �� � >����

� ��'� � �( �������* ��� ���<�#< 0�*�-,1 8���

����'���� �� � <'���� ��( ��� '�� ��� ��� 8��� ����

�'���� �� � � ��(

%+%+ ���� ��� ��� ��� ,��,��� ���

$9�+, � �:93�; ����� 8��� � 8� � �D� � � '���

�E�� ����� � 8' �L �:*G/�L �� � #<�� -+;,

����� ����������� 8' -,L ���� � ��� ������

-,, ���G�9 � �������� -,, � G�9 � ���� �����

��� * �� 9� ������( 3'� ������ 8�� ������� ��

���� ����� '�� ���( � � ���' �6������� '� �����

����� � � �'��� � 8' 8��� � ������ ��� ������

������ � � 8' ����� ,��� -,+ �����G�9� ��� � �9

��A� � 8��� ������ � '� ������� 8���� � �������

+�8��� ������ �����( 3�� � �� ���� ��� ���� � 7��:

� '� ���� ���� � ������ � 0 � ��� 7��: �� � �� �1

8��� ����� ���' 8���( 3'� E��� � ������ � � 7��:

� ���' ������ �� � �6���� ,(*L(

%+-+ ���� ������� � ��������

���� ����� 8�� �������� ��� '� 3����� ����

�6���� � ��( 3����� ���� 8�� �6�� 8' '� ���� ����

���� � 0E��� � ������ � � ��� 8�� ,(*L1� ��� '�

������� � ������� 0���1 ��� ����� 0����1 ����� 8���

� ���� ��8��� � ��� D �� ���� '� ��� 8�� �����(

%+.+ !,�, ���� �������� �� ���( �� ��� ��

���� ���� $9�+, � �:93�; ����� 8' ��� ��

��� ���� '� ����� 8��� 8��'�� 8�� 8' � �� <�� ��

������ � � 0�,, � � � �� � � � ���������1�

8��'�� � �� 8' � �� ���� ������ 0*�, �� ���� ���

�L 7��:� ;, �� �� ��� ����� �$ D(�1� ��� E6��

8' *L ����� ������'��� � ;�( 3'� ����� 8��� 8��'���

����������� � -,, �9 � � �� ���� ������� ��� �����

8' /,, �9 � ����� � �� � 0�,, ���G�9 � ������

�(; �� �� ��� ����� ,(-L 3�� � 0��� =<�;,�

� ��1� -(� �� �������� ,(� �� 3�� 0�$ D(�11 � �

-, �� � � � ���������( 3'�� D�, �9 � #=��� � ���

� 0�,, � G�9 � ����� �'� �� -,, � G�9 � #=���

�� �(; �� �� ��� ����� ,(-L =<�;,� -(� �� �����

���� ,(� �� 3�� 0�$ D(�11 8�� �����( ���� � -, ��

����� � � � � ���������� ����� 8��� ����� �� '�

��� � � D�, �9 � �� ���� ��� � �� � 0,(+ ��

�� ���� ���� � �� �������� �(; �� �� ���

����� ,(-L =<�;,� ,(� �� 3�� 0�$ D(�11( 3'� �� � �

���� � 8�� A���E�� � � -,; ����� �� �����@� '� ����

!- 0������� �1 � ���� � �� ������� '� 2� ��������

���� � �� ���� ��������� 7=� � E6�� ����� �

� ���������� 0��� � 7���� �1(

%+/+ ��������� �� ��������

<� ��� �� � '� ����� $9�+, � �:93�; ����� 8���

�6����� ��� � ���� ������ 0,(�L =<�;,� -*, �� =����

;, �� 3�� 0�$ ?(,11( ���� �7��<�!�� '� �� �� �����

8��� ���������� �� ������ �� ������ ��� 8��� �� ����

8' �L � 8����� � ���� ���( 3'�� 8��� �������

���� ' 8' '� ������ ��� ��� ��� � � - '� 8'

'� ' �������' ��� 6���� ����� ��� ����� ��� ���(

����� �� � 8��� ����� ��� 8' ��'����� �'������

�������� 0��91 ��� ��� 0<����1(

%+0+ 1���,����,��� � �����

3'� �� �� � � � � �' ��'��� 8�� �������� �� �

� �E�� � � '� ��' � � ���� � ��+ 4*,5( ����

������ 8' ����4�$5�� � � 0- ��G-,+ �����1 � �

*; '� � �D�� 9�� 8�� ����� 0E��� � ������ � 8��

*, ��1( 3'�� '� ����� 8��� ����������� � �����

� *� -,D �����G�9 � #<�� -+;, ����� � ����

,(�L ���� � ��� ������ *, �� $�<�� 0�$ D(*1�

*, �� 9��� ��� - � G�9 � � ��� ����� ������(

�� ��A� 0-�, �91 � ���� ������� � 8�� ����������

���' 8��� � � /+�8��� ���� '� � ����� �'�� ������

���� � >3<( 3'� ����� 8��� ������� � � �, �� �

�D�( 3'� ���� � 8�� ������� �� '� ��� � � -,, �9 � ���� �� -?, �� � ��� ���( ���� ������ � �

0*,,, � � -, �� � ;C+�1� '� ���������� 8��� ����

���@�� 8' �,, �9 � +, ��=$;:$ ��� ������ � �

#�� 7 8�6 �! -�K? �� � �6�'�� � � �����( 3'�

� ����� 8��� 8��'�� 8' 8��� � �� 8�� �� � +, ��

� ��� � ���� � �� � � ���� � �� � ��� ����

� ���( 3 �� � � � �' ��'��� 8��� ����� 8' - �

��� ��� � ���� � ���� ,(- � � ��� ���� ��� '�

�� ��� � ��� ���� 8��� �������� ��� � �A��

������ � � ���� 0�������1(

?D* �+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 &

Page 3: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

%+6+ �1�� �������� �� �� "%%& � ����� �

3 '� ������ ����� ���� � '� �6�������� * � �( �

��� �� 8�� ����� ��� '� �6��� 8�� ������ �� 0�,,

� � -, �� � � � ���������1( 3'� ��������� 8��

��� ��� ��� � �������� ����� � ����� � =*( 3'�

��' � 8�� �' 8� ��� ��� '� �#� -**, ��E�����

�� � '� � 8' �����( 3'� �� �� � �#� -**, � '�

� ������� 8�� �����@�� 8' � $�8���<������ -,/,

$<9� �������� �A����� 8' � <'�� ����6� #<��-?

�������� � ���� 0*�,��� ;�+ ��� ����� ����� � ��

��� �����I ,(- � ��'����� ��� �����G�$��=

�� � ,G-,, +,G;, � *, ��� 2 8 ��� - �9G��1(

>M ���� � � *+, �� 8�� ����( >���� '��� � �� ���

�#� -**, '�� � ���� � �� � ;(? ��(

� �������

-+"+ ����� ��� �� �,�, ���� �� ��#��#�*�!

$9�+, � �:93�; ����� 8��� ����� 8' ,C�, �� ���

������� � � *; � ;? '�� ��� '� ���� � � ����� ������

� �� � �� 8�� �������� ��� ����( � �E���

�� � �� 8�� ������ �� �, ������������ � � ' ����

���� 0�+ ��� �?L � $9�+, ������ ��� */ ��� ;?L �

�:93�; ������ � *; ��� ;? '�� ����������1� �� ������

� � ( -( 3'� �� � �� ��� 8�� � �E���� ��� '�

������ �� 6������ �� ����������������� �>3<�� �

� ������� ������ 03>=�91 ��' � 03���3� * 3�3�

7�� �� �� � �� � �� ���� � �. ��� � �' 8�1( 3'�

�� ��� � ���� ���' �������� ��� '� ��� �6���� �

� ( -( ����� � � �� � �� �� ���������� � $9�+, 0�1 ��� �:93�; 0�1 �����( ���� ������ 8' ,� -�� � �, �� ���������� � � *; � ;? '�� '�

����� 8��� � ������ ��� '�� �����@�� �� �� 8 �� ���� �� �������� � ��� � *( 7�� �' 8� ��� ������ �7 � � ���� '��� ��������� �6�������(

"��I � ������� ������� 8' ������ '� , '� ������ �1 � ,�,- 0�����N� ���1(

�+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 & ?D�

Page 4: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

��'�A�� 8�� ��� � ����� 8' '� �� ��� � �� � ��(

�� $9�+, ������ � � �E��� �� � �� 8�� ������� � �

� ������ � � ���������� � �-, �� � � �6� ����

��� �' ��� '�� *; '�( 3'���� ��� � �, �� � ������ �

8�� ���� ���� '� ���'���� � �� � �� ������ ��

���������� � �����A��� �6�������( �� � �� 8��

� ������� � ;? '� 8'�� '� ����� 8��� ����� � � ��� ;

� ? '� 8' ����������(

-+%+ *���� � �� ������� ��������� �� �,�, ����

������� �� ��#��#�*�!

3'� � �� � ����������� ������ � �����������

������ �� � �� 8�� �6������ ���� '�� ���� ��� ���

'� ���������� �������� ����������� ������ ������

4-,�-�5( � ( * �' 8� '� '� ����������������� �� ��

�� ��� ���� ���' 8��� � ������� 8'�� '� ������� �

������ �� � ����������� � ����� 8�� �� ���� �� ����

� ���� 0*� � �, ��1� � 8'�� '� ����������� ������

8�� �'����� � �� 8� �������� � 8' ��<3����

0,(- � ,(* ��1( ���� '� �� � �� ���� 8��� � �������

�� '� ��� � � ������ � �E���� ��� � ���� �'�� �

� ����������� ������ ������ �� ���������� 8 ��� �

����� �� �� ���� � �� � �� ������ �� ����������(

-+-+ *���� � �� !-! �� ����� � �� �,�, ����

������� �� ��#��#�*�!

38 '���� ���#�������� ��� ���� �#� -�*�

0��� ������� � ��1 ��� �#� -**,� 8��� �6�����

� ( *( ������ � ������ � ����� � ����������������� ���� ���' ��� �� � ��( $9�+, 0�1 � �:93�; 0�1 ����� 8��� ������� � � ;? '� � ������

����� � ���� ������ � ���� �� 07��I ���� ����� ��<I ��<3����1 8' � 8' � �, �� ����������( 3'� �� ��� � ���� ���' 8�� ��������

�� '� 3����� ���� �6���� � ��( #����� ��� ������ �7 �� � '� � ����� ��� � 8 ��������� �6������� ���� ���� � ������( <�����

�� � ��� �� �������� �� �� 8 �� ����� � �' 8� � �����'����(

?D; �+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 &

Page 5: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

� � '�� ���� �� �� ����������������� �� � ��

� $9�+, ��� �:93�; �����( �� �' 8� � � ( �� � ;? '�

����� � 8'�#� -�*� 0,C-, ��1 �� � ��� �� ����

������ 8'�' 8�� ������� �� �, �� ����������( �

'� ' '�� � ������ � 0-, ��1� �#� -�*� �� '��

�� ����� '� ����� � �, �� ���������� � $9�+,

�����( �#� -**, 0,C� ��1 ��� �� � ����� '� �� �

� � ��� ������ �� �, �� ���������� 0��� �

�' 8�1( � � ��� �#� -**, 8 ��� �� �6����� �� ��

�- ��� �*� ����� �� 4-5( 3'��� '� �� � � �, ��������

���� � ;? '� �������� �� ���� ��� ����� ������

������(

-+.+ 1���,����,��� � �� ��� �

� '�� ���� ��� ��� '� '� ���# � � �����

�' ��' ����� � 0<9�1 4*-C*�5� � ������� �� � '�

��� ��� �� ������ �� ������ � ����� '� ���#( ��

�' 8� � � ( ;� ' 8����� '� �� ��� � � � � �

�' ��'��� 8�� � �������� �� �� +, �� ������

���� � �'�� $9�+, � �:93�; �����( 3 �������

'� � ���� ��� <9� �����8�� ������� 8� �6����� '�

����� � >3<� 8'�' ������ ��� �� �� <*%* ����� �

�� ����� �� � $9�+, �����( 3������ � $9�+, �����

8' >3<������� <9� 8' �� ���� 6����� *�� ��

� ( �( ������ � '� ���# ��� �� �#� -�*� � ����������������� ���� ���'( $9�+, 0�1 � �:93�; 0�1 ����� 8��� ������� � � ;? '� �

������ ����� � ���� ,C-, �� �#� -�*� 8' � 8' � �, �� ����������( ���� ����� 8�� �������� �� '� 3����� ���� �6���� � �� ��

�������� � ��� � *( 7�� ��� ������ �7 � '��� ��������� �6�������( "��I � ������� ������� 8' ������ , �� �#� -�*�� �1 � ,�,-0�����N� ���1(

�+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 & ?D�

Page 6: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

������� � -, ��( 3'���� ��� $9�+, ����� ������ �'��

���� '� ���# � � ���� � ���� � ���� <9�( >3<

'�� � ����� � �:93�; �����(

-+/+ 8�� ��� ��� ��������

3 ��������� '� ���'���� � �� � �� ������ ��

���������� 0�, ��1� ������� �� � � � ������� 8���

���� ��� ������� � ���� �� � 0� ( �1( ������� �

��� � ����7<��� ���� �������� 0<�#<1 8��� ������

� � ' ������� ���� ���� � � ����������� �������

�' 8� '� ����������������� �� � �� '� � ' '�

������� ��'8��( O� ��� ������� � � �E��� �������

� ��� � �� 8� *; ��� ;? '� �6� ����� ����������(

3'��� 8��� � �'�� �� � '� �6����� � � 3#��9� ����*�

� ��6 0��� � �' 8�1(

-+0+ *���� � �� ����� �� 4��#""5 ��� �� ����� �� 49�#.5

�� �#:�� �� ������� �� �,�, ���� ������� �� ��#��#�*�!

7�� � �� � ����� ����� ��� � � '��� ���� �����

'� �� ������ � ��� �6����� � � �����������

������ �� � �� 8�� ���� ��� ���'��( $9�+,

0� ( +�1 ��� �:93�; 0� ( +�1 ����� 8��� ����� � �

*; '� 8' ���������� ���G � �$�--� �� � ��� ���

��� �� 4*;5� ��� �� � �� 8�� �������� ��� ����(

3'� �� � �� ��� � � ' ���� ���� 8�� � �'�� ��

� �E����� �� �$�-- �� �� ���� *; '�� ��' � ' '���

� ( ;( <� ��� � � � � � �' ��'��� �� ����������( $9�+, 0�1 � �:93�; 0�1 ����� 8��� ������� 8' ����4�$5� � � 0- ��G-,+ �����1 � � *; '�(3'�� '� ����� 8��� ����� � � �, �� � �D� 8' ���������� � >3< � #<�� -+;, ����� � ���� ,(�L ���� � ��� ������ *, �� $�<�� 0�$ D(*1�

*, �� 9��� ��� - � G�9 � � ��� ����� ������( 4�$5��� � � �' ��'��� 8��� �6����� ��� �������� �� 7 8�6 �! -�K? �� �������� � ��� � *(

#����� ��� ������ �7 �� � '� � ����� ��� � 8 ��������� �6������� ���� ���� � ������(

?D+ �+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 &

Page 7: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

8��� �� ' �������� � ���� ���' � - � G�9� ��� '�

3����� ���� �6���� � �� 0��� � �' 8�1( �� � ��

������ �� ���������� 0�, ��1 � $9�+, ����� 0� ( +�1

8�� �� ����� -�, ��� -?,L � � �� � 8' ,(*� ���

-(, � G�9 � �$�--� ����������( �� ���� � ������

�� ���������� ��� ���'���' �� � ��� � �$�-- 8���

������� � �:93�; ����� 0� ( +�1( � ��� ��� �� 8��

��� ���� ��� ����� '� '� ������� � ������

����������� �� � �� ����� �� �$�-- 8�� ������

��� �� � ���( 3'� ��������� � $9�+, ���� �������

8' '� ��� ��� ��� ��� �� B��; 0; � ? � G�91 � �

- '�� ��� � � ����� �������� ���� '� �����A���

����� �� ������� '� �� ��� � �� � �� ������ ��

�� � � �� 0*; '�1 �6� ���� ���������� 0�, ��1 ���

�$�-- 0- � G�91 '� � �� � ����� � ���� 6�����

�,L 0��� � �' 8�1( 3'��� ������ ����� '� ��������

��� �6����� � ������ '� �� � � ����� � ������

����(

� ����������

� '�� ���� ��� ��� '� ���# � ��� ����� ����

���' � ������� ��� '�� ����� 4-,C-�5� 8'�� '�

���'����� ����� ���� 8�( 3'� ������ ���� 8��

��������� ������� ' 8 ����������� �� ���#

� ��� ������ �� � �� � ������� �����(

������������ ������ '�� ���� �� 8� � �����

� �������� ���� ����������� � ���� ������ ' ��

� �� ������ ���� ���' � �� � ��( 3'� ������� �

����������� ���� ������ � �� 8� '� ���� � � '�

���# '�� ���� ��� ��� � $9�+, ����� ��� � ������

�� ���� 4-,�-�5( O� '��� ���� ��� 8'�'�� ������

���� ������ �� � � ���� ���' '� � ' �� ������� �

����������� ������ ������( �� �' 8� � � ( *� '�

���� � � ���� ���' �� ���������� 8�� � �������

8'�� '� ������ ������� �� � ���� ������ ������� 8��

�'��� �� ���� ����� � 8'�� '� ���� �����������

������ 8�� ��� ��� �� �'��� �( 3'���� ��� '� �'�� �

� ����������� ������ �� � ���� ���� � � �� � '�

����������������� �� � ��(

3'� ���# �������� ����������� ������ ������ '� � '

'� � ���� <9� 4-5( 3'���� ��� 8� ���� '� ����

� <9� � '��� ������� ����� �� � ������ 8' ������

���� 0� ( ;1( �� � � �' ��'��� 8��� � �������� ��

���������� � �'�� $9�+, � �:93�; �����( $ 8�����

� � � �' ��'��� 8��� �������� �� >3< ���� �� �

� ��� � �� � '� ��� '� � ' <*%* ����� �� �� 8�

�� �6������� � $9�+, ����� 0� ( ;1( O'�� >3< 8��

����� $9�+, ������ �������� '� �� ��� � � � � �

�' ��'��� � � � ������ ���������� ������� ��� ��

���� '� �6����� � ������ � ����� �� � �����

<9�( $ 8����� �:93�; ����� ������ ���� <*%* � <*%;

����� ��� 8'�' ��� � ������ ������ �� >3<� ��' � '

'� �������� � <*%+ ����� �� � �:93�; ����� '�� ����

��� ��� 4*�5( 3'���� ��� ���������� �� � �� '� � '

� <9��� ����� ���#(

��� ��� ������� '� '� �� � � ����� � ������

���� 8�� � �6���� '� � ' ���# ���� � 8��

����� ��� '� ������� ���# ��� �� �#�

-�*�( 3'� �������� � '� ��� �� � '� �����

'� � ' � '� ����� � �� � �� �� � ����' '�

����������������� ���� ���' 0� ( �1( �� '�� ��� �

�� � ���� ��� ����� ��� �#� -**, 0� - ��� � ��1�

��� '�� � ����� 0��� � �' 8�1( ���� � ��� ���

8�� �������� '� ����� � �#� -**, � '� �6����

����� � �� �� 8�� ���� ���( � 8�� ��� ������

�� $<9� ������� '� �#� -**, ������� ��� ���� �

� ( �( ���� � � ������� � ��� <�#< ��� ������� � ��� �6����� � � $9�+, ��� �:93�; �����( ���� ���� ����� 8' �, �� ���������� � � *;

��� ;? '�� �� ��� 8��� �6������ ��������� ��� �����@�� �� O����� �� � �� �������� � ��� � *( ��� �� ���� � � ��� ����� ��� ������

'� '� ���� �� �� � �� �� 8�� ������ � ���' ����( �� � �' 8� ��� ����������� � � ���� '��� ��������� �6�������(

�+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 & ?DD

Page 8: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

;? '� ����� � � '� �������� � $9�+, ����� 0��� �

�' 8�1( 3'���� ��� � ���'���� '�� '�� ���� � �

���� ��� ����� �� ����� �� ���� �����( �� �� ������

�� ���� 4*+5� � � 8�� � ������ � � ��� �� 0�#�

-�*�� - ��1 8�� ��� ��� ��� �@� �� � �� ������

�� *, �� �������� �� ��� 8'�� '� � �� 8��

������ � � � �' � ��� �� (�( * '�( �� '� ������� ������

' 8����� 8� ������� '� '� �' � ��� �� � ������

8' ��� ��� 0*� ;(�� /� -? '�1 ��� �� � ������ '�

�� � �� ������ �� ���������� 0*; '�1( >���� � ���

�� ����� ' �� � � ( -� � ��8�� ��� ��� �� � ��

4*D5� �#� -?/? 0�, ��1� �� � ����� �� � �� � �

�E����� 0�L � ;? '� � ������ 8' +,L � � ������

����1� 8'�' � ��� ��� ������� '� '� ������

����������� �� � �� � $9�+, ����� � �� � ����

'� � ' '� ���# 0��� � �' 8�1( =����'������ '�

�������� � ���# �#=� � $9�+, ����� '�� ���� �' 8�

4-,5 �� ������� ������� ��� �������� �'�� ���� �

0#3�<�#1( � 8�� � � ������ ��� -*�����������

���� ��� � ��� ���� '� ���# � $9�+, ����

��������� 4-,5( 3'��� ��� �� �� ����E��� �� ��

� ���# � '� ���� �������� �������� '� � ���( ���

������� ��� ����� �� � �� '� � ' � ��'8�� ���

����� �� � ���# ���� �( $ 8����� '��� � ��� �

� ����� '� '� ���# ��� � ����� �� � �� ��

����� � ��'8�� ������� �� � '� ��� �� ������ ��

� ���� ���� �� �� � '� �� � � �� � �� �6� ����

��� '��� ������@�� '� ���#( 3'� ! �� ��� '�

� ( +( ����� � �$�-- � ����������������� �� � ��( $9�+, 0�1 � �:93�; 0�1 ����� 8��� ������� � � *; '� � ������ ����� � ���� ��� ��

� ������ �� � �$�-- 8' � 8' � �, �� ����������( 3'� �� � � ��� 8�� �������� �� '� 3����� ���� �6���� � �� ��� �� �� 8 �� ���� ��

�������� � ��� � *( 7�� ��� ������ �7 � '��� ��������� �6�������( "��I � ������� ������� 8' ������ , � G�9 � �$�--� �1 � ,�,-

0�����N� ���1(

?D? �+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 &

Page 9: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

���� � � � ���� '� ���# ��� �� �� ���� � '�

�� � � �� ����( � � �6������ '� ���� � � ���

8'�' ����� �� ����� � � �������� �� '� �- �

�* �������� ����� ��� � ' � 8'�' ��� ! �� ���

� ����� ����� ��� ����� �� � ����� '� � ' !�A� !����� �� 8' � ���� � � �� �� ����� � 0<"�1 4*?5(

O'�� �� � �� 8�� ������ � $9�+, ��� �:93�;

����� �� ����������� ���� � � ������� � ��� <�#<

8�� ������� 0� ( �1( 3'��� 8�� ��� �� ������� � ���

�6����� �� 8'�' ��� ����� '� �� � � ���� ���'

0� ( �1( ��� ���� � 8�� � ������� 8'�� �� � ��

8�� ������ �� -, �� ���� '���� � � � ������ �

�'� �� � � � '� 0��� � �' 8�1( 3'��� �����������

������ �� � �� ������� '� � ' � ��'8�� �������

�� � ���� '���� ��� '� ���� � � '� ��� � ��� �

�� �� ��� ��� � '� ��'8��(

���� � ������ � '� �� � ���� �� ��� � 03=�1

����� � ������ '�� ���� � ������� '��� �� �� ���

� �� � '� �� ��� � � ���' � ���� ���� ����� ���������

� ����� � ���� ����� ����' ��� �� � �� ���

������ �� ����� ������ 4*/��,5( 9��� ����� ������

8' '���� � ���� �' 8�� ����� ��� � � ���� 8'�'

� ' � ' �� ������ �� '� ��� � ��� 0���91 � '� 3

����� � �� �2���� ��� � � '� ���� 4�-5( � 8�� ���

�� ���� '� '� ���� � � ��� �6����� � ��� �� ��

� '� ���'����� � �� � � �'�� 6� ��� � ��� '��

� ' ��'���� '� ���� ��������� ����������

�� � �� 4�*5(

3'� �� ����� � ��� � ��� �6����� � '�� ����

��� ��� �������( �� '���� �������� �� ' ������ ������

��� ���� � �������� �������� ������� ��� �6����� �

4��5( ��� 8�� ����� ����� � ����G�� �� � � ����G�

'���� ������� ����� 8'�� �� � �� 8�� ������ ��

����� � 4�;���5( 3'� ������� � � 8������ ��� �

� �������� ���� ����� �� ������ '� ������ ����� ����

� � ��� 4�+5( �� '���� � � � ������ ���� ����� '�

���� � � ��� �� ��2� � ����� ��� ���� � �� 8�� ���

� ��� �� ������������ 4�D5( � 8�� �� ���� '� ���

��'����� ���������� �� � �� 4�?5� ��� '� ��� ����

�@�� ����� ���������� �� � �� 4��5( ��� ���

'� ��� '� 8� '��� �' 8�� '� �������� �6����� � �

��� �� ���������� ����� �� � � ��� ���'���� � �

'� ���� � � �� � �� � '���� ������� ������ 8'�'

� � '��� ���� ��� ���( $9�+, ����� ��� �� 8� ��

�������� 4�/5� ��� �:93�; ����� '��� � ����� ��� '�

���� �� �6������� 4;,5( 3'���� ��� �� ������ �� �� �

���� � �� � ���� ���� �'������@�� ��'8��� � �� ��

��( � 8 ��� �� �� �� ��������� ' 8 ������

���� ������ '� �6����� � � ��� ��� � '� ��'8�� �

������ '� � ��� � ����( ��' � ' � ������� ' 8

���������� ������ '� �6����� � � ��� � '��� ������

8� '��� �' 8� '� ��� ��� �� ����� ����� �����������

� ���(

���� ��������� � ���� ����� �� �� ��� ��� �

'� �� ��� � � ����' ��� � ���� ��� '� ������ �

�� ���� �������� M���� 8'�' ������� ����������

�� � �� � ���� �� ������� 8�� �� ���� �� � � �����

���� � � � '� ������ � �� ����� ������� ��

��'���� �� � �� ������ ����������� 3 �����

4;-5( O���� ���� �������� ��� �� ���' �� ��' ��6��

��� � 6 ������ '��� ���� �� 8� �� '� � ' '� ���

�� ��� � � ���9 �6����� �� ����� �� � �� � ����

������ �� � ����� 4;*5( $��� 8� �� �� '� '� ���

�� ����� ��� �6����� � �� ���������� ��� ��� �� �

� ������� ���� � � � �� ����� ������ � � �

������ ������ � � ���� �� 8' ' �� ������ ��(

����������

4-5 &�� �� � "�( ���� ��� �� ����� ��I � ��� � ���� ��� ����� 6���

������( 3����� <'����� � �� -//?.-/I-?;C/-(

4*5 "� $:� & K7� ���A ��� :��' ��� ���� !9� &�� �� � "�( *�

����� � � �+����@������ ��������� ������ ��'����� ������

�� � � �� ���� ��� ����� ��( & ��� �'�� -//;.�DI�+-;C*-(

4�5 "����� 9&�� �'���� 8� �&� # ���� ��� � ����� &<� :���� >��

3' ���� �� � 8��� �=( ���� ��� �-� ��� ���������� ��

��� 6������� �� � ��� �� ��� � ���� �� ��� ���� �� �����(

7�� 7�� #�� -//?.;�I*-;C*-(

4;5 9���� &( �� ��� ���� ��� �� ����� ��P�'����� � ��� �� ����

��� ����������������� ��� ����� � ���� ��( 3����� <'����� �

�� -//;.-�I*/?C�,+(

4�5 $��� � &<� <�������'� $&� � @��� &#( � � �� � � ��������� �

���� ��� �� ����� �������� '�� ��� � � '� ��( �� &

<'����� � -//�.--�I/;�C�*(

4+5 � @��� &#� <�������'� $&� ��'������ $&( ��� ���� �� ������ �

� �� 8� ���� ��� �� ����� � ���� � � ���( ��� & <'����� �

-//+.*/?I*/�CD(

4D5 ���'�����' &�� #@� �� Q� %� 3�� K�9� ���� ��� �� 3���'���

�� � �� #( ������� ���� � � �� ���� ��� ����� �� 8' �+�0��

� ���@��1���� �����������'���� ����� �� ��� � ��� �� �

������ ����� ��� ����� � 8' � '�� ������ �'�� �� �

� ��� �� �����( ��� #�� -//D.?,I?,,C/(

4?5 M � 9��@ 7"&�� 9� #��� � �� �� ���' ���� �� =� &�� �� �

"�( �'� �� ������� � � ���� ��� �� ����� � � �� ���

�������� ��'���I ���� ��� ��� ��� ������( ��� & <'����� �

-///.�+DI-�DC+�(

4/5 M � 9��@ 7"&�� ����� ��� 7����' ��� 9� #��� ���� �� � &�

���'���� %� &�� �� � "�( 3'� ������ � ���� ��� �� ����� �

����� � � ��@���� � ���( ��� & <'����� � -//�.*D�I*�C/(

4-,5 " '� %� �� %� " �'�� �� "� $:� &�� �� � "�( ����� � �

�� � �� � $9�+, '���� �� ���� ��� ������� ����� ��

���� ��� �� ����� � � ���( � �'�� � �'�� #�� � ����

-//+.*-/I/,;C-,(

4--5 %� %� �� %� �������' �<� &�� &9� "� %�� &�� �� � "�(

���� ��� �� ����� � � ��� �� �� $9�+, ��� >�/�D ����� �� �

�� � �� ������ �� �� ��� ���( � �'�� � �'�� #�� � ����

-//D.*�*I�-DC**(

4-*5 ������ 7� �������' �<� ���� � �� � � 7� � ����@@� ��

���� �� �������� #� ������ �� &�� �� � "�� ��������' �(

�� � �� �� *��'� � �*���� 6������ ��� ��� *��'� � ����� ��� �

'���� ����'���� �� � � � ������� �����( =��� �'�� ��

-//?.�*I;/�C�,;(

4-�5 �������' �<� ���� �� �������� #� ������ 7� ������ ��

��������' �� !����� � ��� &�� �� � "�� ������ �� ��� ��

O( ���� ��� �� ����� �� ��� ����� � ��� ����( 7�� 7�� #��

-//?.;�I�D/C?+(

4-;5 ������� &� &�� �� � "�� 9�� �3( 7��� ���� �� �� �

������� �'�� ��������� �� ����( = ��� ���� �� � ������

���� ��� �*� ��� �� ����� ��( & ��� ����� -//+./?I-DD�C/(

�+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 & ?D/

Page 10: p53-Independent induction of Fas and apoptosis in leukemic cells by an adenosine derivative, Cl-IB-MECA

4-�5 �'������� M� =�8��' $� &�� �� � "�� �'����� �( ����� � �

�� � �� � ������ �� ���� �� �� �� ���� ��� ����� � � ��(

�6� ���� #�� -//?.*;�I�?�C/D(

4-+5 �������' �<� #����� !� !����� � ��� ���� �� ��������

#� ������ �� ������ 7� ��������' �� &�� �� � "�� ��� �� O(

3'� �� ���� ��� ����� � ������ ���� ������� � �� � ��@� � �

��� �� ����� �� ��� ����� � � ����69I ����� � '����

��� � �� �����( � �'�� � �'�� #�� � ���� -//D.*;-I*/DC

�,;(

4-D5 $�� #&� :������ &&� �� �� O� "� ' 7#� 3����� O#( #�����

�� ����� � ���� ��� �- ��� �� ����� �� � �����

�'�� � ��� � �'����� � ��� �� �� � �� � ��'��� �� ����

��� �F��� � '� ���� '���( & � � ���� ���� � -//?.�,I�D/C?�(

4-?5 �������� #� ������ �� ���� �� ������ 7� ��������' �� "�

%�� &�� �� � "�� "� @ "=� 9 '�� �&� �������' �<( ���� �

� '� �� ���� ��� ����� � ������ ���� ����� �� ���� � ���

���� � 8'( =����� ��'������� � ���' <'����� � *,,,.�+-I**�C

�;(

4-/5 9 �$� � � �� ������ =� & K7� &�� �� � "�( ������������

���� ��'�� ��� � ������� � ���� � ����������*�;�����������

��� �������� �� ������� �� ���� ��� ����� � ��� ���( &

��� �'�� -//?.;-I�-?+C*,-(

4*,5 ���� �$� �� &"� �'�� ���� ��' <�!� #�� �$( ������� � � '�

������ '� ������ '� �' ��' � ��� '��� ���� � ����' �

��� ���� ���� �� � ����� �������( & � � �'�� -//+.*D-I?-D,C�(

4*-5 �������' �<� �������� #� ���� �� "� $:� � � 9��@ 7"&��

&�� �� � "�� ������ �( ! �� ����������� ���� � �

�' ��' ����� � �� ���� ��� �� ����� �� � �� ����( � �

<'����� � -//�.;?I-,�?C;�(

4**5 #������� M� ���� !9� ������ ��� �� $( 3'� �� ���� ���

����� � � '� ��A�� ���� ��� ����� � 8'�' ������� ������� �

����� � ���� �� � ��� �����( & � � �'�� -//�.*+?I-+??DC/,(

4*�5 �� $� ���'����� &#� ���� O�� ������ ��( ���� � �

�' ��' ����� � ��� ���� ��� ����� �� �� ���� ����� �� � ����

� � ����� � � �� ���������� #�9�*$� �����( & � � �'��

-//,.*+�ID;�C��(

4*;5 Q��� ��� � 8�� #!� & �' �!� $����� � "<( ��� �� ���

������ �� � �� � '���� ����� �������� �����( � � #��� �

-//�.�*I*D/C?D(

4*�5 � ���� 7� # ���� �� &������� #� <������� �� � ������� &��(

#���� �� ���� ���� �6���������� ����� ����� ���( 7�� 7��

#�� -//?.;�I-�,C;(

4*+5 �'������� M� &�� �� � "�� 9 ��$� =�8��' $� B���� 3� ����� ��

�'����� �( ����� � � �� � �� � �� ���� ���� �� ��

���� ��� ����� � ���� � ��� � �������� � �� � �� ���� �(

�6� ���� #�� *,,,.*�DI---C*+(

4*D5 9�� "� #�� !� & K��� ���A��@ M�� &�� �� � "�( #� �� �������

0�1���'�� ����������� ���� �� ���� ��� ����� � � ���I ��

�������� ����� ����� ��� *���� 6� � ���� ��( � � ���

�'�� 9� *,,-.--I-���CD(

4*?5 ��� � �� 9� �� � 9� O�@��� #� ������� �� !���� &�(

���� � � ��G�� �� ����� � �� ! �� ���� ����� ����� ��(

� � �� � � � ��� �� ������ � '��� ����� ! �� ��� ���

'� � ' �' ��'����� � ����:$ ����� �( & � � �'�� -//?.*D�I

-/,?,C�(

4*/5 O������������� � #� ������� ��� � ������ =!� &����� =��

=� �� �( 9���' �� ����� � �� ���� � ��� �6������ �� ������

� ��� �� �� '� ������ �� � ��( =���� -//*.��+I�-;CD(

4�,5 3���'��' 3� 3����� �� ������� ��� &����� =�� � ������ =!�

���� 3� =� �� �( !������@�� ����' �� ������� ������ � ����

������ �� � � � ��� � � '� ��� � ���( ���� -//;.D+I/+/CD+(

4�-5 =��� �� �� �� $�� "���� $�( �� � �� ��� ��' ����� � ����

'���� �P�� �����( �� M� *,,,.-;I*/DC�,,(

4�*5 9��� ��� !� 7���� <� 9�� ��� �� ���� � �( �� 8 �� ����

������ � � ��� �6����� � � ���� � ���� ��� ��� ��������

��'��������� � ������� �����( �� ���� *,,,.�/I-/�C*,*(

4��5 ����� �� ���� ���� "� �'�� ��O� 9�@ &<� ���� #� ����

������� ������� � ���I � ���� ���'���� � ����������

�� � �� <( ������ -//?.*?*I*/,C�(

4�;5 �'�� %�#� 3�� 3�$( 9��� � � ����� � � &=" ���� � ��� ����

�������� ��� �6����� � ������ �� �� � � ����( � �'��

� �'�� #�� � ���� -///.*�+I�/�C/(

4��5 " �����' 3� #��� �� &����� &#� � �� � >� �� � "� �'�� $�

:8�����'��� 9�� �������� �� #��� &�� B'�� O( 7�������� ���

�' ��' ���� � ��� ���� � � �� � ����� � � ���� ��6

��� ���G�<:�- �� ����� � ��� ����� ������( ���� 7��' 7����

-//?.�I�?;C/-(

4�+5 :8�����'��� 9�� B'�� O� ������ &�� �� �� 9�� ����� ���

��F8��� 3� # ' &�� 7����� ' ��� B'�� OO� "��@�� �� #������

#( O������ '���� ��� ��� � ���������������� ���� �����

���G�<:�- �6����� �( � � ���� � � -//�.-�I�,�*C;,(

4�D5 <��� �� 3����� 7�� $ � ' � &�( ��� ���������� � ��� ���� �

��� ���� �� � �� � ���� ��� ����� � ���������� � �� �

'���� � � � ����� �� ���� ����( ��� ������ #�� *,,,.+I;;�*C;-(

4�?5 #����� �=� "��� �� %� "� �� ��� �� :'� �� 9 B� � 8�� "$�

��' <�( = ��� ���� ���� ��� � �6������ '���� ���G�7/�G�<:�

- ��'����� ���������� �� � ��( ���� 7��' 7���� -///.+I�*+C

��(

4�/5 O �� 7� # �� M( ��F � ���� �� � '� ��� ��� �� '� ���

�� ���� �� ����� ���� � ��� �6����� � � $9�+, �����( <� � =��

���� �� >�� -/?�.?*ID/,C;(

4;,5 # �� ��� =#� # 8�� �� ��' ���� "��� ��� � ���� O�� !��� �

&M� 9��� 7<( ��� ��� �� � � � ������������( <� � =�� ���� ��

>�� -//,.?DID���C/(

4;-5 B' � 3� � � 9� %�� <� O�� B� 9� 7� & �� #�( ���� ������

����� M��� ������� ���������� �� � �� ��� �'�� 3 �����

������ �� ����� �������( =� ��� -///.�I;*C?(

4;*5 ������ �� $��� �� "������ <$� 7���� "�( ��� ������ � '�

�7/� 0�<:�-G���1 ����� �G� ��� ����� � ��� ������� �� � ��

� �������( =� ��� -//+.*I�D;CD(

??, �+2+ ��� � ��+ 3 ����������� 1���������� 0- 4%&&%5 6"7 &