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1 Sci Tech Anim Lab COLLOQUE OPAL

Introduction

Dr Chantal AUTISSIER (Présidente du Colloque)

Pr Jean-Pierre CLOT (Président de l’OPAL)

OPALRecherche Expérimentale et Protection de l'Animal de Laboratoire

28, rue Saint Dominique75007 Paris

mail : [email protected]

L’OPAL a pour objectifs de promouvoir et de soutenirtoutes les actions en faveur du respect dû aux animaux delaboratoire, et plus particulièrement de contribuer audéveloppement de méthodes alternatives oucomplémentaires fiables permettant de limiter le recours àl’animal, ainsi que d’améliorer les conditionsd’hébergement et d’utilisation.

Remplacer, réduire, raffiner… les mots-clés de lapublication de 1959 de Russell et Burch font depuislongtemps l’unanimité parmi les expérimentateurs. Et cesobjectifs en matière d’expérimentation animale, ontégalement été pris en compte dans notre réglementationeuropéenne.

Le colloque, organisé par l’OPAL en octobre 2003, avaitpour but de faire le point sur le développement desdifférentes méthodologies utilisées ces dernières annéesen recherche biomédicale. Ces méthodes ont permisprogressivement de diminuer le recours à l'animal delaboratoire, voire de le remplacer.

Il faut distinguer le remplacement " relatif " qui recourtà l’animal pour obtenir soit ses tissus, soit ses cellules, ouencore les embryons, et le remplacement " absolu " grâceentre autres aux techniques physico-chimiques, aux basesde données informatisées ou encore à la bioinformatiquestructurale.

Il y a également de plus en plus d’études sur tissuhumain qui permettent d’obtenir des données fiablesdirectement transposables à l’organisme humain ainsi quedes études pharmacocliniques sur l'homme, au tout débutdu développement d'un médicament.

Toutes ces méthodes ne permettent pas de s’affranchircomplètement du recours à l’animal entier qui, seul, enl’état actuel de nos connaissances peut fournir desdonnées intégrées complexes de physiologie.

Les orateurs, dont le propos a été réactualisé et figuredans ce fascicule, ont abordé les principaux domaines derecherche pour les méthodes alternatives :

Francelyne Marano expose les deux grands axes dedéveloppement de l'utilisation des cultures cellulaires dansle domaine de la pharmacotoxicologie :

- le criblage des nouvelles molécules utilisant des lignéescellulaires,

- les recherches dans la compréhension de la physiologiedes cellules différenciées et dans l'étude des mécanismesd'action des xénobiotiques, mettant en oeuvre denouvelles techniques de culture, notamment cultures surmatrice et cultures tridimensionnelles.

Pascale Gaussem fait ressortir les extraordinairesapplications biomédicales potentielles des différents typesde cellules souches qui pourront également être utiliséesen remplacement de modèles animaux au cours,notamment, du criblage de nouvelles molécules.

André Guillouzo souligne les avantages et les limites desdifférents modèles cellulaires hépatiques. En particulier, leshépatocytes humains en culture sont maintenantlargement utilisés pour des études physiologiques,pharmacotoxicologiques avec, en particulier, la recherched'interactions médicamenteuses, mais également ensuppléance hépatique. Le principal problème est ladédifférenciation rapide de ces cellules, qui peutcependant être retardée par immobilisation, supportmatriciel, coculture,…

Maïté Corvol traite ensuite les potentialités et les limitesde l'utilisation des chondrocytes humains enpharmacologie. Les progrès récents de la biologie et de lagénétique moléculaire ont permis d'établir des lignées dechondrocytes humains ou murins immortalisées, utilisablesà la fois pour le criblage et pour la recherchefondamentale. La culture de chondrocytes humains laissemême entrevoir la possibilité de thérapie cellulaire.

Dominique Bellet montre l'intérêt du modèle in vitro desphéroïdes de cellules tumorales en 3-D qui mime lesmicrométastases avasculaires in vivo. Ce modèle présentel'avantage par rapport aux cultures classiques en 2-D, deprendre en compte les forces mécaniques et la complexitédu microenvironnement qui influencent les propriétés descellules tumorales, et permet de repousser l'utilisation desmodèles animaux.

Valérie Audinot met l’accent sur la diminution massive del'utilisation d'animaux dans les expériences de

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réceptologie et de criblage de molécules,puisque, très rapidement, beaucoup d'informationssont obtenues grâce aux lignées cellulaires, cequi permet de diminuer assez tôt, lors dudéveloppement des médicaments, le nombre deproduits à tester chez l'animal.

Bruno Villoutreix développe certaines notionsde bioinformatique structurale en se concentrantsur l'aspect criblage in silico ou criblage virtuel.Cette approche in silico permet d'explorerrapidement un maximum d'hypothèses pour seconsacrer aux seules molécules qui offrent la plusgrande probabilité d'atteindre la phase clinique.

Enfin André Michel traite de l'expérimentationvirtuelle en recherche pharmaceutiquedéveloppée par la société Aureus Pharma. Ils'agit d'un système d'intégration de bases de

données traitant de l'expérimentation biologiqueet pharmacochimique décrite dans la littérature.Ce système permet de choisir a priori lesstructures moléculaires les plus à mêmed'entraîner une réponse sur une cibledéterminée, de prévoir de nouvelles applicationspour des produits donnés ou encore de prévoirle risque d'apparition d'effets indésirables.

Les différents intervenants ont fait ressortir lesdéveloppements actuels et prévisibles desexpérimentations in vitro utilisant des techniquesde culture cellulaire de plus en plus complexes,des lignées cellulaires et, de plus en plus, lescellules souches humaines et animales. Ils ontégalement montré les apports de labioinformatique structurale et de bases dedonnées dans la stratégie de découverte denouvelles molécules à usage thérapeutique.

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Les approches cellulaires in vitro et leurs limitesApplication à la toxicologie

Francelyne MARANO

Laboratoire de Cytophysiologie et Toxicologie,Université Paris 7 - Denis Diderot

2 place Jussieu - 75005 Parismail : [email protected]

RésuméLes cultures cellulaires représentent

actuellement la plus grande partie de cequ’on appelle « méthodes alternatives » àl’expérimentation animale. Elles sontutilisées pour le criblage de nouvellesmolécules, pour l’étude de la toxicitéorganospécifique en complément del’expérimentation animale et pour lesétudes sur le mécanisme d’action desxénobiotiques. Cette présentation avaitpour but de montrer, à partir d’exemples,en quoi elles pouvaient apporter desréponses aux questions posées par lapharmacologie et la toxicologie ainsi queles limites de leur utilisation.

Mots clés : Cultures cellulaires,méthodes alternatives, épithéliumrespiratoire, toxicologie des particulesatmosphériques.

SummaryCell cultures represent now the most

part of alternative methods. They are usedfor the screening of drugs, for studies onorgan toxicity in complement of animalexperiments and for mechanistical studies.In this presentation, we have focused onthe uses of these methods in pharmaco-toxicology and their limits.

Les méthodes in vitro représentent actuellement une partie très importantedes méthodes « alternatives » et comprennent l’utilisation d’organes isolés, detranches d’organes, de cultures cellulaires, d’organites ou de moléculesbiologiques. Elles permettent de limiter de façon notable et dans certains casde remplacer le recours à l’expérimentation animale, notamment dans ledomaine de la toxicologie. Nous allons ici nous focaliser sur les culturescellulaires qui sont utilisées en pharmaco-toxicologie pour le criblage denouvelles molécules, pour la toxicité organospécifique et pour l’étude dumécanisme d’action des xénobiotiques.

Cultures cellulaires : de la recherche fondamentale aux applications

Les cultures cellulaires se sont d’abord développées dans le domaine de larecherche fondamentale. Alexis Carel a été le premier, au début du 20e siècle, àisoler un fragment d'organe, à le maintenir dans des conditions de milieuadéquates et à constater que finalement ce fragment d'organe pouvait survivrehors de l'organisme. Cependant, c’est Moscona en 1952 qui, en découvrant latrypsination et l’isolement de cellules à partir de tissus, réalisa les premièrescultures de cellules. L’extension de ces techniques a été ensuite considérableet nous leur devons en partie l’essor de nos connaissances en biologie cellulaire.Ensuite, tous les modèles développés pour mieux comprendre lefonctionnement des cellules, ont été utilisés dans d'autres domaines plusappliqués, comme en pharmacotoxicologie, mais aussi - et c'est plus récent - enmédecine régénératrice. Un exemple frappant est l'utilisation de cultures depeau pour le traitement des grands brûlés. Un autre domaine émergent est celuides cellules souches, qu’il s’agisse des cellules d'origine embryonnaire ou descellules souches adultes que nous parvenons maintenant à mieux connaître. Cedomaine a certainement un grand avenir, notamment en thérapie cellulaire etgrâce à l'utilisation des outils de la transgénèse permettant de transformer lescellules au moyen de gènes d'intérêt. Dernière application : la recherche denouveaux agents anticancéreux qui sont testés essentiellement sur des lignéestumorales.

Un problème de fond : préserver la différenciation

Le challenge essentiel des cultures cellulaires est le maintien in vitro de l’étatdifférencié tel qu’il est observé in vivo. A cette fin, différentes méthodes ont étédéveloppées :

Les cultures organotypiques, tout d’abord, consistent à isoler et là mainteniren survie un fragment d'organe ou de tissu. C’est à ce type de culturesqu’appartiennent les tranches d'organe largement utilisées enpharmacotoxicologie : tranches de foie, de poumon, de rein, voire de cerveau.Leur avantage est de pouvoir maintenir in vitro différents types de tissus danstoute leur complexité. Leur inconvénient est qu’elles fournissent une réponseglobale dont on ne sait pas toujours l’origine, ce qui a conduit au

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développement des cultures primaires. Il s’agitalors d’isoler un type cellulaire et de le maintenirle mieux possible in vitro dans les milieuxadéquats. Cependant, en général, on observeune rapide dédifférenciation en culture.Parallèlement, on a assisté au développementdes lignées cellulaires, d'abord d'originecancéreuse ou embryonnaire, puis des lignéesimmortalisées par transfection. Ces dernièressont des cellules normales qui pour certainesd'entre elles – nombreuses actuellement – sontd'origine humaine.. (*)

Les lignées transformées ont eu au cours desdernières années un développementvéritablement exponentiel. Transfecter descellules devient une pratique courante dans leslaboratoires, ceci pour les transformer de façondéfinitive en les immortalisant ou de façontransitoire au moyen d’un gène d'intérêt. Cesimmortalisations ont été réalisées, le plussouvent, avec des oncogènes. On a beaucouputilisé l'antigène T du virus SV40. Mais, leproblème de ces lignées, là encore, est celui,d’une perte partielle ou totale des fonctionsdifférenciées. Notons qu’on peut obtenir unemeilleure différenciation in vitro avec des lignéesobtenues à partir de souris transgéniques, enassociant au transgène un promoteur spécifiquede tissu. Nous avons également la possibilité,avec l'immortalisation, d'introduire despromoteurs inductibles qui sont par exempleinductibles par la chaleur ou par desantibiotiques, et qui vont permettre de jouer surla balance prolifération-différenciation.

Ainsi, voit-on bien que le maintien de ladifférenciation est le problème central. Il estapparu que le microenvironnement jouait un rôledéterminant. Ce microenvironnement est fait dece que la cellule va sécréter, les protéines de lamatrice qui peuvent avoir pour origine la celluleelle-même ou les cellules voisines. Mais il résulteaussi des contacts que les cellules établissententre elles et qui vont être essentiels pour ladifférenciation d’abord, puis, ensuite, pour lemaintien de l'état différencié. Pour maintenir, invitro, cet état différencié, il faut évidemmentutiliser les bons outils, les bonnes protéines de lamatrice. Le rôle de la polarité cellulaire pour lescellules polarisées est aussi extrêmementimportant, et il faut faire en sorte de la maintenirin vitro. Pour cela, différentes solutions ont ététrouvées : la culture sur filtre, la culturetridimensionnelle, par exemple. Nous pourrionsaussi évoquer les cocultures qui, en associantdeux types de cellules qui, dans l'organisme,sont très directement en contact, permettent unbon maintien de l'état différencié.

Il existe quelques lignées cellulaires quipermettent d'assurer cette bonne différenciation

par exemple, Caco2 - qui est une lignée d'origineintestinale (entérocytes) - qui peut se différencierde façon tout à fait remarquable dans un systèmede type Transwell sur filtre. Mais ces lignéesdifférenciables restent, malheureusement,beaucoup trop rares.

Un tissu humain complexe : l’épithélium respiratoire

Prenons un exemple: l'épithélium respiratoire.On peut utiliser des tissus d'origine animale, enparticulier à partir de trachée de lapin ou de rat,pour réaliser des cultures primaires. Mais on peutégalement utiliser des muqueuses d’originehumaine qu'on peut se procurer, aprèsautorisation des comités d’éthique, auprès desservices de chirurgie ORL ou de pneumologie.

L’épithélium respiratoire est un tissu complexe.Il borde les voies aériennes depuis le nezjusqu'aux bronchioles. C’est un épithéliumpseudostratifié avec deux types de cellules trèsspécialisées : les cellules sécrétrices - enparticulier les cellules à mucus - les cellules ciliéesqui permettent le mouvement unidirectionnel dece mucus et, enfin, des cellules basales,impliquées dans le renouvellement de cetépithélium, en particulier dans la réparation decelui-ci. On y distingue également des glandesséreuses ou muqueuses qui possèdent unépithélium unistratifié, simple, et concourent à laconstitution du mucus. Cet épithélium estintéressant à cultiver in vitro parce que :

• Il joue un rôle très important de protection del’organisme vis-à-vis des aérocontaminants ;

• Il est aussi la cible d'un certain nombre depathologies, ainsi que de polluantsenvironnementaux et de maladies génétiques.

Comme pour la peau, ou la plupart desépithéliums, l’intérêt de celui-ci provient de lafonction importante d’interface qu’il remplit.

Les méthodes de culture ont déjà étéévoquées. Pour les cultures primaires, on peutdissocier des polypes ou des cornets nasaux.Dans un premier temps, les cellules épithélialesprolifèrent sur une matrice de collagène. Aconfluence, on sépare alors le tapis cellulaire dela matrice. Ce tapis est mis, ensuite, en agitationrotationnelle dans un milieu adéquat, additionnéde facteurs de croissance. La définition du milieuest déterminante pour éviter la perte dedifférenciation. En effet, quand les cellulesprolifèrent – c'est une règle assez générale – il ya, très souvent, perte de la différenciation. Ellesconservent leur caractère épithélial, mais elles nesont plus ni sécrétrices, ni ciliées alors qu'audépart, on avait des cellules sécrétrices et ciliées.La prolifération est essentiellement le fait des

* "Culture de cellules animales", aux Editions Technique de l'INSERM par Georgia Barlovatz-Meimon et Monique Adolphe.



cellules basales. Ici, l’agitation rotationnellebloque la prolifération et permet ladifférenciation. On obtient ainsi un épithéliummucociliaire tout à fait comparable à lamuqueuse humaine d’origine.

En pratique : des applications en pharmacologie

Pour suivre la différenciation, on va utiliser desmarqueurs spécifiques, par exemple unmarqueur des cils. Il s'agit d'un anticorps dirigécontre une modification post-traductionnelle dela tubuline qui est la protéine majoritaire des cils.On peut voir que lorsqu'on met en agitation, iln'y a plus du tout de cellules ciliées. Ellescommencent à apparaître au bout de 10 jours.On observe leur augmentation jusqu’auvingtième jour où l’on obtient de magnifiquesciliatures.

On peut réaliser le même type d’expériencespour suivre la différenciation des cellules àmucus. En effet, dans cette approche, on necherche pas à séparer les types cellulairesconsidérant qu'il est au contraire important deconserver leurs interactions pour reconstituer unépithélium in vitro.

On peut également avec ce modèle étudier invitro les mécanismes de réparation del’épithélium. Les lésions-réparations sont quasicontinuelles dans les voies aériennes, lésionsmécaniques, chimiques ou infections. Lespolluants atmosphériques, par exemple,provoquent des lésions. On assiste alors à unedénudation de la lame basale et la migrationcellulaire va permettre de reconstituer le plusrapidement possible l’épithélium. Sinon lesaérocontaminants pourraient franchir cettebarrière endommagée, en particulier lesbactéries, les champignons, les virus, lespolluants etc… On assiste donc d'abord à uneprolifération intense au cours de laquellel'épithélium se stratifie et prend un aspect tout àfait différent de l'épithélium mucociliaire normal.C'est la différenciation épidermoïde. Nouspensons que cette étape pourrait, dans certainscas, évoluer vers la cancérogenèse. On trouved’ailleurs assez souvent ces foyers de métaplasieépidermoïde - qui apparaissent notamment chezle fumeur - associés avec des foyers cancéreux.Ensuite, s’il n'y a pas cancérisation, ces cellulesdesquament et retournent à un épithéliummucociliaire pseudostratifié.

On comprend aisément que tout ce processusest soumis à un contrôle très précis. Différentsfacteurs de croissance interviennent. Il a doncfallu les identifier. C’est très important pour lesapplications, aussi bien sur le plan de laconnaissance des maladies respiratoires, quepour trouver des médicaments qui permettent

de contrôler l'ensemble de ce processus. Ainsi,a-t-on pu déterminer, par exemple, que ladifférenciation épidermoïde était contrôlée par leTGFß, et que le processus de réversion estassocié à la vitamine A qui joue un rôle essentieldans le maintien ou le retour vers un étatmucociliaire.

Il y a d’autres techniques qui permettent deréaliser ce type d’études in vitro. Il s'agit, parexemple, de la technique des chambres à deuxcompartiments avec un filtre ayant des pores de0,4 micron et un coating - c'est-à-dire unematrice reconstituée. Le milieu se trouve ici au-dessus et en dessous. Il y a prolifération jusqu'àconfluence et pas de différenciation dans cesconditions. On enlève alors le milieu au pôleapical de façon à reconstituer une interface airliquide qui est celle qu'on retrouve dansl'appareil respiratoire. Le milieu est maintenu aupôle basal et la polarité est ainsi reconstituéed'un point de vue nutritionnel.

Selon qu'on ajoute de l'acide rétinoïque oupas, nous allons avoir une différenciationnormale, mucociliaire, ou une différenciationépidermoïde. Ce système permet d'étudier desagents pharmacologiques susceptibles d’agir surla différenciation, voire la réversion de l’étatépidermoïde. Nous avons, d’ailleurs, utilisé cemodèle pour étudier une série d'analogues del'acide rétinoïque. Alors que c’estl’expérimentation animale qui était utilisée, àl’origine, pour étudier la réversion des atteintesde l’appareil respiratoire et de la muqueuse, c’estce modèle in vitro qui a permis, sans avoirrecours à une expérimentation animale, d'étudierune série de molécules intéressantes pourpréserver ou retrouver une bonne différenciationau niveau de cette muqueuse. C'est une belleillustration de méthode alternative.

Une application environnementale : les particules de diesel

La toxicité de particules diesel a été étudiée aulaboratoire sur une lignée bronchique humainetransfectée par le gène T du virus SV40, mais quia conservé ses caractéristiques épithéliales,certaines de ses capacités de métabolisation etde sécrétion, après induction, des cytokines. Uneétude mécanistique a été faite à l'aide de cettelignée, étude qui a été complétée sur cultureprimaire. Selon de nombreuses étudesépidémiologiques les particules atmosphériquessont incriminées dans la mortalité et la morbiditérespiratoire et cardio-vasculaire. Les études invitro sur cultures cellulaires associées à desétudes chez l’animal et à des études humainessur des volontaires ont permis de donner uneexplication causale à ces donnéesépidémiologiques.



Une des conclusions concerne le rôle essentieldes composés organiques adsorbés sur lesparticules. Ces données ont été importantespour les constructeurs automobiles car cela les aincité à diminuer la fraction organique grâce àl’utilisation de pots catalytiques. Mais on a aussimis en évidence le rôle du « cœur » carboné deces particules fines et ultrafines, ce qui a conduitau développement des filtres à particules quenous connaissons, aujourd’hui. Nous avons ainsipu déterminer les mécanismes moléculaires quiconduisaient à un processus pro-inflammatoire àpartir de la cellule épithéliale. Cette approchemécanistique est quelque chose qui relèvevraiment typiquement du domaine des culturescellulaires et de l'approche in vitro.

En conclusion, on voit donc que les culturescellulaires ont des applications multiples. Danscertains cas, elles peuvent éventuellement êtreconsidérées comme une alternative, au sensanglosaxon du terme, à l'expérimentationanimale. Mais, malgré tout, il apparaît qu’unelimite infranchissable demeure, qui est celle de lacomplexité de l'organisme. Pour le moment,malgré les outils, de plus en plus performants,développés dans le domaine de la culturecellulaire et la connaissance de plus en plus fineque nous avons du fonctionnement des celluleset des interactions cellulaires, il n’est pas possiblede répondre in vitro à toutes les questions quesoulève l’approche intégrée au niveau del’organisme entier..



Les cellules souches comme modèles cellulaires

Pascale GAUSSEM

Service d’Hématologie Biologique, Hôpital Européen Georges Pompidou, INSERM U. 765, Faculté des Sciences Pharmaceutiques et Biologiques

Université Paris 5 - René Descartes4 avenue de l'Observatoire - 75006 Paris

mail: [email protected]

SummaryEmbryonic stem cells are derived

from the inner mass of blastocyst.Recently, adult stem cells have beenidentified in many organs and tissues,althougth in a very small number. Theyremain quiescent and are supposed to beactivated by disease or tissue injury. Stemcells have two important characteristicswhen compared to mature cells. First, theyare unspecialized cells that renewthemselves and, second, under specialexperimental conditions, they cangenerate cells with special functions. Atypical example of the use of progenitorcell derived from adult stem cells is theendothelial cell therapy, based thepresence of circulating endothelialprogenitor cells. This has completelymodified the concept of post-natalangiogenesis and raised new hopes for thetreatment of cardiovascular diseasesbased on cell therapy. These cells,originating from bone marrow, contributeto the development of collateral arteriesand capillary networks to promoteischemic tissue revascularisation. Theproof of concept was obtained in vivo in aseries of animal models such as hind limbischemia, myocardial infarction or vascularprothesis revascularisation. Besides thepreclinical studies, a number of in vitroexperiments are designed to prove theangiogenic capacity of such cells such asthe determination of the “endothelialphenotype”, the formation of capillary-likestructures in matrigel and the migration ina Boyden chamber upon a VEGF gradient.

IntroductionLes cellules souches ne sont pas seulement utilisées comme modèles

cellulaires, mais elles sont également à la base de toute une nouvelleméthodologie d'étude conduisant à leur utilisation en thérapie cellulaire.

Cellule souche et cellules souches

Qu'est-ce qu'une cellule souche ? C'est une cellule extrêmement curieuse quel’on connaît depuis longtemps du point de vue hématologique. Elle a lacapacité de proliférer et de redonner la même cellule, c'est ce qu'on appellel'autorenouvellement. Cette propriété d'immortalité commence à être élucidée.Elle serait notamment due à une activité télomérase élevée dans les cellulessouches, empêchant la dégénérescence chromosomique. La cellule souchepeut se maintenir également dans un état quiescent en phase G du cyclecellulaire. Ainsi, des facteurs de transcription permettant de maintenir lescellules à l'état « souche » commencent à être connus. Ensuite, sans que nousen connaissions le mécanisme, elle peut se transformer en progéniteur et sedifférencier, proliférer, et donner naissance à des cellules différenciées. A ce jour,il existe deux types de cellules souches : les cellules souches embryonnaires etles cellules souches adultes.

S’agissant des cellules souches embryonnaires, on peut en décrire trois types :

- Les cellules ES (embryonic stem) qui proviennent du blastocyste

- Les cellules EG qui proviennent du fœtus (embryonic germ cells)

- Les cellules EC (embryonal carcinoma) qui sont issues d'une tumeur, untératocarcinome.

Ces cellules sont dites pluripotentes car elles peuvent donner naissance àplusieurs lignées. En culture, il est nécessaire de supprimer leurs cellulesnourricières, notamment les fibroblastes et le stroma, qui sécrèteraient dessubstances qui les maintiennent à l'état de cellule souche. Si on cultive lescellules embryonnaires en suspension, on obtient des corps embryonnaires.Cultivées sur une matrice appropriée et en présence de milieux de culture biendéterminés, les cellules peuvent donner naissance à différents types cellulaires :cellules hématopoïétiques, îlots pancréatiques, cellules musculaires, cellulesnerveuses, kératinocytes etc… C'est, indiscutablement dans ce dernier domaineque de gros progrès ont été réalisés ces dernières années, grâce à ladécouverte des facteurs de croissance spécifiques de chaque lignée. C’est ainsique les cellules ES de souris, sous forme de corps embryonnaires, ont pu êtretransformées - à partir de la même cellule souche - en neurones, ou en cellulespancréatiques sécrétrices d'insuline. Si on utilise des cellules embryonnaires, etselon le feuillet auquel on s'adresse, on peut obtenir des cellules de différentstissus issus de ce feuillet. De même, chez l’adulte, des cellules progénitrices

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mésodermiques en présence de milieux deculture appropriés peuvent générer desostéoblastes, des chondroblastes etc., c’est àdire toutes les cellules du tissu issu dumésoderme.

Les cellules ES humaines

Les cellules ES humaines posent, pour leurpart, un certain nombre de problèmes qu’il fautrésoudre. Rappelons tout de suite qu’en France,cette recherche n’est pas encore autorisée.Lorqu’elle est autorisée, il faut évidemment, toutd’abord, pouvoir trouver des alternatives auxcellules nourricières pour l'expansion, c'est-à-direpour les maintenir à l'état de cellule souche. Onpeut envisager d’établir des lignées de cellulessouches différenciées. Dans une optique dethérapie cellulaire, ce qui est fondamental est decaractériser les fonctions cellulaires in vitro. Or,lorsqu’on part de cellules souches pour aboutir àune lignée déterminée, il faut bien, pour lesétudier, en connaitre au préalable toutes lesfonctions, la morphologie, le phénotype... Cen’est qu’ensuite qu'on en démontrera l’efficacité,d'abord chez des rongeurs, puis éventuellementchez des primates. Quand on administre cescellules à l’homme, on peut imaginer en prévenirle rejet lors des études cliniques. Un desexemples assez ambitieux est de transfecter cescellules avec des gènes du complexe majeurd'histocompatibilité humain. Enfin, il fautdémontrer la sécurité de ces cellules, parexemple l’absence de formation de tumeurs oude transmission d'agent infectieux.

Les cellules souches adultes : espoirs et interrogations

De nouveaux espoirs sont nés avec ladécouverte de la cellule souche adulte. Elleexiste dans chacun des tissus de l'organisme.Mais il y a un certain nombre de questions quirestent en suspens. On ne sait pas d'où elleprovient : de la moelle osseuse ? du cerveau ? dufoie ?… Quel est le signal qui induit ladifférenciation des cellules en un tissu donné ?Existe-t-il un seul type de cellules souchesadultes ? Nous savons que dans tous les tissus ilexiste des cellules souches qui sont capables dedonner les cellules du tissu d'origine. C'est-à-direqu'une cellule de la moelle (le MAPC :multipotent adult progenitor cell) peut donnerdes cellules sanguines, mais également desadipocytes, etc… On sait également qu'enprenant des cellules souches dans un tissudonné, on peut les transdifférencier, c'est-à-direles transformer en cellules d'un autre tissu. Ainsi,même si un certain nombre de pointsd’interrogations subsistent, ces cellules souchesadultes représentent un réel espoir notammenten thérapeutique.

Des perspectives thérapeutiques

En France, pour ce qui concerne la recherchesur les cellules souches embryonnaires, laquestion est en suspens. Dans l’hypothèsed’utilisation des cellules fœtales, on a déjàévoqué la culture de neurones susceptibles desoigner la maladie de Parkinson, ou des cellules ‚des îlots de Langerhans dans une application : lediabète. On peut aussi citer la cellule souchehématopoïétique, obtenue à partir de sang decordon. Il s’agit bien d’une cellule fœtale puisquele sang de cordon est le sang du fœtus. Le sangplacentaire est extrêmement riche en cellulessouches hématopoïétiques. Il y a d'ailleurs,maintenant, tout un réseau de banques de sangde cordon qui sont agréées et réglementées.Pour les cellules souches adultes, de trèsnombreux travaux sont en cours. S’agissant descellules hématopoïétiques, ce n'est pas unenouveauté, puisque cela fait plus de 40 ans qu'onpratique des greffes de moelle, des allogreffesou des autogreffes, le plus souvent, aujourd’hui,à partir du sang mobilisé par des facteurs decroissance, plutôt qu'avec de la moelle. On a,aussi, déjà évoqué les kératinocytes pour lesgreffes de peau chez les brûlés, les myoblastes.

Développer un protocole

de thérapie cellulaire ?

Lorsqu’on veut développer un protocole dethérapie cellulaire, on doit évidemment répondreaux critères destinés à assurer la sécurité dans lesessais cliniques. Comment, alors, replacer lemodèle animal dans ces critères-là ? Si l’ontravaille en autologue, c'est assez simple. Il n'y apas de problème de rejet de greffe. Mais si ontravaille en allogénique, il faut évidemment faireun criblage des donneurs pour détecter lesagents infectieux, les anomalies génétiques, quine seraient pas désirables. Ensuite, le problèmeessentiel de savoir comment cultiver des cellulesdans un but thérapeutique. En effet, nousquittons totalement le milieu expérimental, pourles cultiver dans ce qu’on appelle les "gradescliniques", c’est à dire avec des produits qui ontl'autorisation de mise sur le marché et devantêtre compatibles avec l'administration àl'homme. On doit se conformer aux procéduresde l'assurance et du contrôle de qualité, puis,autre contrainte importante, établir desprocédures standardisées et sécurisées. Avant depasser au modèle animal, il va falloir définir tousles critères de caractérisation de ces cellules quiseront utilisées en thérapie cellulaire : leurmorphologie, leur phénotype. Il est doncnécessaire de définir toute une série de critèresmorphologiques et fonctionnels de ces cellules.Enfin, il appartiendra à l'étude pré-clinique,inévitable, de démontrer la validité du concept.



Comme exemple, on va d’abord vérifier, dansdes modèles animaux qui reproduisent lamaladie, si les cellules migrent et font leurhoming, c’est à-dire retrouvent le site où ellesdoivent aller, en fonction de leur tropisme. Onvérifiera, ensuite, la toxicité, le potentiel deprolifération de ces cellules. C'est facile chezl'animal, puisqu'on dispose des marqueurs quipermettent de reconnaître les cellules humaines.En fin de compte, on n’aura plus qu’à définir lesprotocoles d’études cliniques de phase I.

La thérapie cellulaire endothéliale, une illustration

La thérapie cellulaire endothéliale est unebonne illustration de la thérapie cellulaireémergente. On a longtemps conservé unereprésentation traditionnelle de la moelle dansdes os longs. Or la moelle hématopoïétique setrouve, sauf chez le fœtus, dans les os plats. Lacellule souche hématopoïétique donnenaissance à toutes les cellules du sang circulant,les leucocytes, les globules rouges et lesplaquettes. En 1997, est découverte une celluleappelée hémangioblaste car elle peut donnernaissance aux cellules souches hématopoïétiqueset également aux cellules endothéliales (Figure).Pour la simplicité du raisonnement on peut neretenir que deux marqueurs permettant decaractériser ces cellules :

- Le CD34 qui est un marqueur d'immaturitédes cellules hématopoïétiques et endothéliales

- Le récepteur au VEGF qui est un des facteursde croissance spécifiques de la lignéeendothéliale.

On a non seulement pu démontrer l’originemédullaire de l’hémangioblaste, mais, en plus,que ce progéniteur endothélial - progéniteurparce que c'est une cellule souche déjà engagéedans une lignée - pouvait circuler dans le sangpériphérique humain. C'est Asahara qui, en1997, a été le premier à mettre en évidence cescellules par tri des cellules qui possèdent lesmarqueurs CD34 et VEGFR2. En les mettant enculture et en les amplifiant, il a obtenu descellules qui avaient toutes les caractéristiquesfonctionnelles des cellules endothéliales et qui,injectées à l'animal chez qui on avait fait uneischémie de la patte postérieure, s'incorporaientaux sites d'angiogenèse.

De nombreux travaux ont suivi qui ont abouti àun nouveau concept. Ainsi, le concept denéovascularisation chez l'adulte, résultant de laprolifération et de la migration des cellulesendothéliales matures avoisinantes, a étérécemment révisé depuis la mise en évidence deces progéniteurs endothéliaux circulants, cellulescapables de participer à la revascularisation detissus ischémiés. Ces cellules progénitrices ont

un fort pouvoir de prolifération, contrairementaux cellules endothéliales matures et, en culture,peuvent prolifèrer pendant 50 à 60 jours sansperdre leurs caractéristiques morphologiques.

Les essais précliniques de thérapie cellulaireendothéliale ont principalement utilisé le modèled’ischémie de la patte postérieure de la sourisimmunodéficiente, par ligature ou section del'artère fémorale. L’ischémie est quantifiée par laméthode au laser doppler qui permet de suivreles progrès de la revascularisation. Il existetoujours après 28 jours une récupérationspontanée de la vascularisation qui est fortementaméliorée par l’injection in situ de progéniteursendothéliaux. La plupart des essais cliniquesréalisés chez l’homme qui ont suivi se sont baséssur l’hypothèse de la présence de progéniteursendothéliaux dans la moelle ou le sang etutilisent des préparations de cellulesmononucléées sanguines ou médullaires plus oumoins bien caractérisées.

Ainsi, une équipe de chercheurs japonais apublié dans le Lancet un essai de faisabilitéd'innocuité chez l'homme. Ils ont inclus unequarantaine de sujets avec une ischémie dumembre inférieur unilatérale ou bilatérale. Unprélèvement de 500 ml de moelle a été effectuésous anesthésie générale, puis les cellulesmononucléées ont été concentrées sous unvolume final de 30 ml. Les cellules ont étéadministrées dans les trois heures suivant leprélèvement en 40 injections intramusculaireslocales au niveau du membre ischémié. Lesrésultats ont été spectaculaires. Au bout de 8semaines, les nécroses et les ulcères se sontatténués et tous les autres paramètres mesurésse sont également améliorés.

Des questions en suspens…

Cette étude a suscité de nombreux travaux,principalement dans l'ischémie myocardique.Dans ces essais thérapeutiques, il s'agissait decellules mononucléées qui provenaient soit dusang soit de la moelle osseuse autologue. C’estévidemment le plus facile parce qu'il n'y a pas deproblème de rejet. Mais cela laisse en suspens uncertain nombre de questions.

Ces cellules mononucléées sont malcaractérisées. Et, on ne sait pas à l'heure actuelle,par exemple, s'il faut vraiment prendre desprogéniteurs endothéliaux en lignée homogène,ou s'il est nécessaire d'avoir les autres cellulesmononucléées afin d’obtenir une coopérationcellulaire.

C’est pour essayer de répondre à ces questionsqu’a été créé un réseau INSERM de recherche surles cellules souches dont Martine Aiach est lacoordinatrice. Première question à laquelle noustentons de répondre : la mise au point de



l'isolement des progéniteurs à partir de sangpériphérique et leur caractérisation. Ceci aconduit à déposer un projet de rechercheclinique destiné à reproduire l’expérience desjaponais : « faisabilité, innocuité chez l’homme ».Le programme consistera à utiliser le sang et lamoelle des sujets pour caractériser parfaitementles cellules et pour réaliser et développer unprocédé d'expansion de cellules, afin d'aboutir àun produit de thérapie cellulaire et d'identifierfinalement le principe actif contenu dans cespréparations cellulaires.

Cela pose, évidemment le problème de la miseau point de modèles précliniques adaptés, avantde passer aux essais cliniques.

Des modèles

Les expériences préliminaires ont été réaliséesà partir de progéniteurs issus de sang de cordon.Ce sang est très riche en progéniteurs,hématopoïétiques et endothéliaux. Ces derniersont été sélectionnés par tri positif grâce à desbilles magnétiques puis cultivées dans un milieuqui contient des facteurs de croissancespécifiques, notamment le VEGF, le FGF. afind’obtenir au bout de 14 jours des cultures decellules de précurseurs endothéliaux.

Avant de passer aux phases pré-cliniques, ilfaut caractériser parfaitement ces cellules. Enimmunohistochimie, par exemple, on voit queces cellules expriment le facteur Willebrand quiest spécifique de la lignée endothéliale. On peutensuite quantifier le nombre de récepteurs à lasurface de ces cellules à l'aide d'une méthode decytométrie en flux quantitative. Après quoi, onpeut développer des modèles d'angiogenèse invitro pour voir si ces cellules sont capables dedonner des vaisseaux. La question est alors desavoir ce qu'on peut faire in vitro pour remplacerle modèle animal ? Si l’on part de l'hypothèseque le tissu ischémique va sécréter du VEGF quiva mobiliser ces cellules à partir de la moelle,cellules qui vont ensuite coloniser les sitesd'ischémie, on peut faire des tests de migrationde cellules en chambre de Boyden selon ungradient de concentration de VEGF. Lesprogéniteurs sont placés dans la chambresupérieure et on regarde leur possibilité demigration à travers une membrane. On constateque plus on augmente la concentration de VEGFdans la chambre inférieure, plus les cellules vontmigrer. Cela signifie qu’elles répondent au VEGF.On peut tester, enfin, l'angiogenèse in vitro par laformation de microtubules ou de pseudo-tubesvasculaires en Matrigel. Ce modèle permet demontrer que les progéniteurs endothéliaux ontdes capacités angiogéniques comparables au

modèle utilisé le plus couramment : les HUVEC,c’est à dire les cellules isolées du cordonombilical humain.

Ces cellules une fois obtenues, doivent êtreamplifiées dans des conditions de gradeclinique, et conditionnées de façon à ce qu'ellesse dirigent réellement vers les sites d'ischémie.C’est seulement quand on aura obtenu unepopulation de cellules bien caractérisées que lesessais précliniques chez l'animal seront débutés.Enfin, les études de phase I chez l'hommepermettront de définir le nombre de cellules àinjecter, ainsi que la voie d'administration.

À titre d’exemple, on peut retenir deuxmodèles validés chez l’animal :

- Un premier modèle assez simple à réaliserutilise un implant de matrigel sous cutané chezune souris. On utilise des sourisimmunodéprimées afin qu’elles tolèrent lescellules humaines. L'implant de matrigel libèredes facteurs de croissance spécifiques et attireles cellules humaines injectées à la souris. Puis,en reprenant cet implant de matrigel et en faisantdes coupes, on peut mettre en évidence lescellules humaines qui ont colonisé cet implant,en réponse aux facteurs de croissance.

- Le second modèle est la ligature de l'artèrefémorale de la souris, qui entraîne une ischémiede la patte postérieure. On mesure alors lareperfusion du membre ischémié par laserdoppler en fonction du traitement (cellules ouplacebo).

Il faut également étudier le potentielcancérigène de ces cellules puisquel'angiogenèse est impliquée dans la croissancedes tumeurs. C'est un test préalable audéveloppement d'un produit de thérapiecellulaire. Des cellules tumorales seront injectéesaux souris, générant des tumeurs qui sont soit àcroissance rapide soit à croissance lente, pourvoir si le traitement par les progéniteursendothéliaux fait augmenter la taille destumeurs. On pourrait très bien imaginer que cescellules vont aller coloniser la tumeur et favoriserl'angiogenèse au niveau de celle-ci. C'est un peule cas des facteurs de croissance, comme leVEGF, qui ont une AMM et qu'on hésite àadministrer parce qu'ils pourraient faire"flamber" des tumeurs.

L’important, au bout du compte, est de biencomprendre comment et pourquoi ces modèlesanimaux se replacent dans les projets dedéveloppement de produits de thérapiecellulaire et surtout l’importance qu’ils yprennent.



Figure - Filiation du progéniteur endothélial. MAPC : multipotent adult progenitor cell.


L'hepatocyte in vitro :Intérêts et limites

André GUILLOUZO

INSERM U 620Université de Rennes 1

Mail : [email protected]

Le foie est le siège de fonctions essentielles pour l'organisme, incluant cellede détoxication des produits chimiques; il est aussi une cible privilégiée desmétabolites toxiques formés et de virus hépatotropes et une étape obligée decertains parasites. Cependant il existe des variations qualitatives et quantitativessouvent importantes entre les résultats obtenus chez l'homme et l'animal, ce quirend aléatoire l'extrapolation des résultats d'une espèce à l'autre. De plus defortes différences individuelles sont fréquemment observées chez l'homme.

Très tôt, il est donc apparu nécessaire de pouvoir disposer de modèleshépatiques in vitro pour étudier les principales fonctions du foie et en particuliersa capacité de détoxication. Les principaux modèles incluent le foie isoléperfusé, les tranches d'organe, les hépatocytes isolés en suspension ou enculture primaire, les lignées cellulaires obtenues à partir d'hépatocytestumoraux ou immortalisés, les microsomes, la fraction S9 et les cellulesrecombinées exprimant une ou plusieurs fonctions hépatiques. Tous cesmodèles ont des intérêts et des limites, certains étant plus dédiés à des étudesparticulières (par exemple la fraction S9 de foie de rat au test de mutagenèsede Ames). Le modèle considéré comme le plus intéressant est l'hépatocyteisolé. La mise au point de conditions de culture permettant sa survie et lemaintien de ses fonctions au-delà de quelques heures ou quelques jours a faitl'objet d'un nombre d'études considérable. Il est apparu que seules desconditions de culture sophistiquées pouvaient au moins partiellement répondreà cette attente. Les domaines d'utilisation des hépatocytes sont multiples,notamment l'étude de la biologie de cette cellule et les applications enpharmaco-toxicologie, virologie, parasitologie, thérapie cellulaire,…L'hépatocyte a été largement utilisé, souvent en association avec d'autresmodèles hépatiques in vitro, pour étudier les propriétés pharmacocinétiques etle profil métabolique interespèce de xénobiotiques, prédire les interactionsmédicamenteuses de molécules en développement, préciser les mécanismesde toxicité de composés toxiques,… Bien qu'elles aient des limites, les étudessur hépatocytes sont aujourd'hui reconnues par les agences d' enregistrement.

Si les hépatocytes humains sont le modèle de choix, les difficultés d’obtentionet les différences fonctionnelles d'une population cellulaire à l'autre liées nonseulement au donneur mais aussi à la qualité des cellules après leur isolementen limitent leur utilisation. Certaines lignées d'hépatocytes humains tumorauxpeuvent, dans certains cas, être utilisées. La solution pourrait bientôt venir descellules souches lorsque les conditions expérimentales permettant le maintiende leur prolifération ou leur différenciation en hépatocytes auront étémaîtrisées.

Au total, même si aucun test n'est validé, l'hépatocyte isolé continuera d'êtretrès largement utilisé dans de nombreux domaines et a donc encore un belavenir. Il réduira et remplacera dans bien des cas l'expérimentation animale.

12 André GUILLOUZO 13/10/06 12:09 Page 12



Les chondrocytes humains en pharmacologie:potentialités et limites.

Maité CORVOL

Inserm-UMR-S 747 ; Université Paris 5 – René DescartesPharmacologie et signalisation cellulaire du cartilage

UFR Biomédicale,45 Rue des St Pères - 75006 ParisMail : [email protected]

SummaryHuman chondrocytes in culture are

used as a biological materiel for thepharmacological screening of anti-inflammatory, anti-degradative, or anti-apoptotic drugs used in osteoarthritis orrheumatoid arthritis. Since the cause ofthese diseases are not known, humanchondrocytes in culture are also used inbasic research to study the moleculardisorders of pathological chondrocytes ascompared to normal cells. The aim is tofind new target genes, and in turn, newtherapeutic targets. More recently, humanautologous chondrocytes have beenproposed as cell therapy for post-traumatic cartilage defect.

The technical procedure for culturinghuman chondrocytes has been describedmany years ago. Because of the instabilityof their phenotype when these cells werecultured at low density on plastic supports,natural and artificial three-dimensionalmatrixes have been extensively used inorder to maintain the chondrocyticcharacteristics of the cells in vitro.Beneficial effects have been reported witheither natural polymers such as fibrin,hyaluronan, collagen, calcium alginategels, chitosan, or synthetic polymers suchas polyesters, polyglycolic acid, orpolyethylene oxide.

Since human chondrocytes representthe actual trend in articular cartilage repair,many efforts are directed toward theproduction of new biomaterial forcartilage engineering, having goodsimilarities with the normal components ofthe natural matrix.

IntroductionLes chondrocytes humains en culture sont utilisés dans les études

pharmacologiques concernant les molécules destinées au traitementsymptomatique des pathologies articulaires comme l’arthrose ou lapolyarthrite : pharmacologie moléculaire des anti-inflammatoires, de ladégradation du cartilage, de l’apoptose chondrocytaire… La culture dechondrocytes humains est également utilisée pour des recherches plusfondamentales destinées à caractériser les points de dysfonctionnement deschondrocytes pathologiques par rapport aux chondrocytes de cartilagenormaux. Dans tous les cas, le but est de trouver de nouvelles ciblesthérapeutiques. Plus récemment, il a été proposé d’utiliser les chondrocyteshumains, après expansion en culture, pour la thérapie cellulaire des lésions ducartilage.

La culture des chondrocytes humains a été mise au point il y a plusieursdizaines d’années, mais nous allons voir qu’en raison de l’instabilitéphénotypique de ces cellules cet outil biologique doit être utilisé avec prudenceet dans des conditions bien précises.

1. Le cartilage normal et pathologique

Le cartilage est un tissu qui joue un rôle fondamental tout au long de la vie.De la période embryonnaire jusqu’à la période de croissance post natale, c’estau cartilage de croissance que nous devons toute la structuration du squeletteainsi que la croissance en longueur des os longs. Le cartilage de croissancedisparaît à l’adolescence et seul le cartilage articulaire qui recouvre toutes lesépiphyses osseuses reste présent toute la vie.

La fonction du cartilage articulaire est de permettre le mouvement d’unearticulation et de protéger l’os sous-jacent contre les agressions mécaniques ettraumatiques (1). Ces caractéristiques fonctionnelles sont assurées grâce à laprésence des constituants protéiques de la matrice cartilagineuse (2),essentiellement composés de collagène de type II et de protéoglycanesparticuliers, les agrécanes. Ces derniers sont chargés négativement etretiennent les molécules d’eau qui constituent 70 % de la matrice du cartilage.C’est au sein de cette matrice que se trouve l’unique type cellulaire : lechondrocyte.

Dans les conditions physiologiques, les chondrocytes sont le siège d’unprocessus de maturation cellulaire qui se termine par leur mort par apoptose (3).Ce processus est très lent ce qui permet aux chondrocytes de persister ennombre suffisant pendant toute la durée de la vie. En outre, les chondrocytesassurent un équilibre précis entre synthèse et dégradation des différentsconstituants de la matrice. Cet équilibre métabolique se fait dans unenvironnement hypoxique, grâce aux éléments nutritifs qui proviennent du

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liquide synovial, puisque le cartilage n’est pasvascularisé.

Toute atteinte à l’intégrité du réseau matricielentraîne une modification du phénotype deschondrocytes qui se dédifférencient (3). Nousverrons que cette instabilité phénotypique deschondrocytes in vivo est aussi observée in vitrolorsque les cellules sont mises en culture enabsence de matrice extra-cellulaire.

2. Intérêt de la culture de chondrocytes humains dans la pharmacologie des pathologies dégénératives et inflammatoires du cartilage

Dans les pathologies articulaires dégénérativeset inflammatoires les plus fréquentes, commel’arthrose ou la polyarthrite, les constituants de lamatrice sont dégradés et l’articulation est lesiège d’un processus inflammatoire avecproduction de cytokines pro-inflammatoirestelles que l’interleukine-1 beta (IL-1ß‚), ou le TNFalpha qui entretiennent les processus dedégradation et d’inflammation locaux.L’ensemble conduit à la destruction du cartilage.A ce stade, le chondrocyte n’est pas capable deréparer les lésions et meurt.

La cause de ces pathologies n’étant pasconnue les traitements utilisés sontessentiellement symptomatiques. Les recherchespharmacologiques portent depuis denombreuses années sur la production d’anti-inflammatoires, et de molécules susceptibles des’opposer à la dégradation du cartilage(molécules à activité anti-métalloprotéase) oucapables de stimuler la néosynthèse desprotéines matricielles. Les chondrocytes enculture, d’origine humaine ou animale, ontrapidement supplanté l’utilisation de tranches decartilage incubées in vitro en présence et enabsence de cytokines, pour évaluer les effets deces molécules.

Des progrès récents ont été réalisés dans ledomaine de la biologie cellulaire et moléculairedu cartilage ainsi que des avancées dans ledomaine de la signalisation des cytokines (voiesAP1 ou NFkB, interactions avec lesprostaglandines ou d’autres facteurs detranscriptions tels que les récepteurs PPARs…).De nouvelles cibles thérapeutiques sont ainsienvisagées. En raison de la diversité desréponses biologiques observées suivant lesespèces, l’utilisation de chondrocytes d’originehumaine s’impose plutôt que d’origine animale.

3. La culture de chondrocytes humains

Les débuts

Les premières expériences remontent auxannées 70/80 (4). On utilise des pièces

opératoires ou des prélèvements effectués sousarthroscopie. La biopsie de cartilage doit êtretransportée à 4°C et la mise en culture effectuéedans les 48h. Les chondrocytes sont obtenusaprès digestion enzymatique. Le nombre decellules par cm3 de cartilage diminue avec l’âge.Les premières mises en culture ont été effectuéessur des boîtes en plastique à faible densitécellulaire. Dans ces conditions les chondrocytesse dé-différencient en prenant l’apparence defibroblastes et synthétisent du collagène I et III aulieu du collagène II, ainsi que des protéoglycanesnon cartilagineux (5).

Des avancées significatives

Ce phénomène de dé-différenciation estréversible, du moins pour les chondrocytesd’origine animale (6). En effet, lorsque leschondrocytes dédifférenciés sont placés dans unenvironnement tri-dimensionnel (gel d’alginate,fibrine,), les cellules re-expriment un phénotypechondrocytaire. Cette réversibilité est égalementobservée pour les chondrocytes humainsprovenant de sujets jeunes, enfants, adolescentsou adultes < 40 ans (7).

Cela n’empêche pas, néanmoins, d’utiliser lescultures de chondrocytes humains pour lesétudes pharmacologiques. Leur phénotype esten effet conservé lorsque les cellules sontensemencées à haute densité et utiliséesuniquement en culture primaire ou secondaire(8). On peut ainsi évaluer par les techniques detranscriptome ou de protéome les marqueurs dedifférenciation et de dé-différenciationchondrocytaire et mesurer les activités deseffecteurs. Toutes les techniquesd’immunocytochimie sont, bien entendu,utilisables, en particulier grâce au microscopeconfocal et au microscope à déconvolution. Celapermet notamment d’étudier, au niveau de lacellule, la mécanistique d’un certain nombre demolécules.

Les études actuelles sont orientées vers larecherche de matrices naturelles ou synthétiquespouvant permettre à ces cellules de maintenirleur phénotype (9). Des effets bénéfiques ont étérapportés avec des polymères naturels tels que lafibrine, l’acide hyaluronique, le collagène, lesgels d’alginate ou de chitosan ou encore avecdes polymères synthétiques tels que lespolyesters, l’acide poly lactique (10)…

Une autre voie possible d’amélioration consisteà immortaliser des lignées de chondrocyteshumains (11). Mais toutes les lignées existantesont perdu l’une ou l’autre des caractéristiqueschondrocytaires.


Intérêt de la culture dechondrocytes humainsdans la thérapiecellulaire du cartilage

L’existence de traumatismes du cartilage ainsique la pratique sportive de haut niveau ont étéclairement incriminées dans la genèse à longterme d’une arthrose (12). Agir précocement surles lésions traumatiques du cartilage serait unefaçon de prévenir l’arthrose et de reculer d’autantl’heure de la chirurgie prothétique (13). Ceconcept est à la base de la réparation des lésionsdu cartilage par thérapie cellulaire dechondrocytes autologues.

Une équipe suédoise, l’équipe de Brittberg, adonc pensé à retarder l’échéance de la prothèseen ayant recours à la greffe de chondrocytesautologues (14). Le principe consiste à prélever ducartilage sain un peu au-dessus de la lésion,d’extraire ses chondrocytes, de les mettre enculture, de les faire proliférer et de les réinjecterensuite dans la lésion en les recouvrant d’unmorceau d’aponévrose. C’est une première voie

ouverte dans le domaine de la thérapie cellulairedu cartilage et les résultats cliniques sont jugésexcellents dans une fourchette allant de 70% à89% des cas (15). Toutefois, les critèresd’évaluation ne sont pas standardisés etl’ensemble des essais correspond à des étudesouvertes sans contrôle. Les complications et leséchecs sont souvent passés sous silence. Ils sonten partie dûs au degré avancé de maturationcellulaire des chondrocytes.

En conclusionLes recherches actuelles sont tournées dans

deux directions : 1) la culture tri-dimensionnelledes chondrocytes humains. De très nombreuseséquipes essayent de trouver des molécules, soitnaturelles, soit synthétiques qui vont jouer le rôlede leurre pour les chondrocytes. Outre le maintiendu phénotype chondrocytaire, l’utilisation de cesmatrices devrait permettre de produire in vitro unnéo-cartilage dont il serait alors possible d’étudierles propriétés mécaniques. 2) la recherche decellules souches et leur induction vers la lignéechondrogénique (16). Ceci permettrait d’obtenirdes chondrocytes en plus grand nombre , dont onpourrait étudier les facteurs de vieillissement.

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Le modèle in vitro de cellules tumorales en 3 dimensions : les sphéroïdes

Virginie DANGLES-MARIE1,2 , Dominique BELLET1,3

1. Laboratoire de physiopathologie hépatique UMR 8149 CNRS - Faculté des sciences pharmaceutiques et biologiquesUniversité Paris 5 - René Descartes - 4 avenue de l'Observatoire - 75006 Paris

2. Centre de Recherche - Institut Curie - 26 rue d'Ulm - 75005 Paris - Mail : [email protected] 3. Laboratoire d'oncobiologie - Centre René Huguenin - 35 rue Dailly - 92210 Saint-Cloud - Mail : [email protected]

SummaryThe growth of tumour cells as three-

dimensional multicellular spheroids in vitrohas led to important insights in tumourbiology, since the spheroid model isadmitted to mimic avascular tumours oflimited size in many characteristics(morphology, compacted organization,growth dynamics, multidrug resistancesimilar to that observed in clinical setting).Whereas cells in vivo display a three-dimensional (3D) geometry, most of invitro tests are performed withconventional two-dimensional (2D) cellmonolayer. Tumour architecture has stillbeen shown to have a great influence onbiological responses of cells to differingstimuli. Our group demonstrated thatcellular architecture has a dramatic impacton gene expression profile. Likewise, wefound that changes in the tumour structurefrom 2D to 3D led cancer cells to display alower capacity of activating cytotoxic Tlymphocytes. These latter observationshave to be put in line with clinicalresponses which remain limited in cancerimmunotherapy trials.

In a broader perspective, drugscreening with spheroid models could leadto reduced number of animal used inpreclinical tests.

Les sphéroïdes constituent un modèle décrit dans les années 70 et largementutilisé (1). Ce modèle tumoral tridimensionnel (3D) repose sur une agrégationcellulaire induite in vitro en supprimant l’adhésion des cellules à un support deculture. Les sphéroïdes sont préparées le plus souvent à partir de lignéestumorales établies. Moins fréquemment, elles sont réalisées directement à partirde cellules tumorales primaires.

Caractéristiques des sphéroïdes

Par rapport aux cultures cellulaires traditionnellement utilisées en tapiscellulaire, les sphéroïdes ressemblent plus étroitement à la situation observée invivo à la fois par la forme adoptée par les cellules et par le microenvironnementcréé. Ce modèle représente une complexité intermédiaire entre les tumeurssolides in vivo et les cultures en monocouches. Il est à noter cependant quetoutes les lignées cellulaires d’origine carcinomateuse n’ont pas la propriété deformer des sphéroïdes in vitro. D’une taille pouvant atteindre 1 à 3 mm dediamètre, cette formation tridimensionnelle peut être comparée à unemicrotumeur avasculaire (cf Figure 1). Ainsi, beaucoup de caractéristiques sontcommunes :

- L’aspect morphologique des sphéroïdes reproduit une architecture plus oumoins compactée selon les cellules utilisées et très organisée. Dans les plusgrosses sphéroïdes, il est possible de distinguer : une couche périphérique decellules se multipliant activement, une couche interne de cellules quiescentes etun centre nécrotique. Le développement de ce centre nécrotique et laquiescence des cellules intermédiaires sont attribués à un état d’hypoxieconsécutive à une mauvaise diffusion de l’oxygène et des métabolites. Laressemblance morphologique des sphéroïdes avec les agrégats de cellulestumorales observés par les anatomopathologistes dans les ascites tumorauxsuggère que ces microtumeurs in vitro constituent des modèles demicrométastases.

- La dynamique de croissance des sphéroïdes est également proche destumeurs solides in vivo. De nombreux modèles mathématiques mettent enévidence une courbe de croissance similaire entre les tumeurs in vivo et lessphéroïdes, cette courbe étant différente de celle observée avec les tapiscellulaires.

- L’organisation spatiale des sphéroïdes repose sur des interactions cellulairesqui semblent très différentes des interactions existant dans les cultures enmonocouches. En effet, la synthèse des composants de la matrice extracellulaireet de leurs récepteurs peut être largement influencée par les conditions deculture.

16-18 Dominique BELLET 13/10/06 12:17 Page 119


Figure 1 -Sphéroïde forméede 6.000 cellulesde la lignéehumaine decancer du côlonHT29.

Des sphéroïdes mixtes peuvent également êtregénérées en co-cultivant sous formetridimensionnelle des cellules tumorales avec descellules endothéliales.

Les sphéroïdes ont montré tout leur intérêt lorsdes études de la résistance des tumeurs auxdrogues anticancéreuses et à la radiothérapie :les résultats obtenus avec les sphéroïdes sonttrès proches de ceux obtenus chez les patientsalors qu’il n’est pas possible de les reproduire invitro avec les cultures cellulaires en monocouche.Cette résistance, de type mdr (pour multidrugresistance) reposerait notamment à la fois sur lesinteractions intercellulaires et sur l’hypoxieexistant dans l’architecture tridimensionnelle.

Influence del’architecture cellulairesur l’expression géniqueNous avons cherché au laboratoire à

déterminer si l’architecture cellulaire pouvaitmodifier le niveau d’expression génique. Nousavons dans un premier temps sélectionné 28gènes impliqués dans six fonctions gouvernant lacancérogénèse : échappement à l’apoptose,autosuffisance en facteurs de croissance,insensibilité aux signaux inhibiteurs decroissance, invasion et métastases, potentiel deréplication incontrôlé et angiogénèse. Nousavons déterminé l’expression de ces gènes parquantification de gènes en temps réel (TaqMan®)soit dans les prélèvements tumoraux du patient,soit dans les cellules de lignées tumoralesétablies à partir de ces mêmes prélèvements.Ces cellules étaient cultivées en suspension, entapis cellulaire et sous forme de sphéroïdes.Nous avons alors montré que l’architecturetumorale a un impact considérable surl’expression de ces gènes clés : des différencesd’expression variant de 2 à 63 sont trouvées pour24 gènes sur 28 (2). De plus, nous avonsrecherché l’architecture cellulaire in vitroconduisant à des profils d’expression de gènesidentiques ou proches de ceux observés in vivo.Il apparaît qu’il est nécessaire de définir pourchaque patient et pour chaque gène étudié lemodèle in vitro le plus proche de la situation invivo. Ces données sont particulièrement

importantes au moment où se développent encancérologie des thérapies ciblées et où l’actiond’une drogue pourra être tout à fait différenteselon le profil d’expression du gène cible.

Influence del’architecture cellulaireen immunologieantitumorale

Nous nous sommes également intéressés aurôle potentiel de l’architecture tridimensionnelledans la réponse immune cellulaire antitumorale.En effet, les premiers résultats d’essais cliniquesd’immunothérapie anticancéreuse montraientune fréquente inadéquation entre les réponsescliniques observées chez les patients traités et lesdonnées observées in vitro avec des culturescellulaires effectuées à partir de cellules de cesmêmes patients. Ces données sontgénéralement observées avec des culturescellulaires en tapis ou en suspension. Nous avonsalors utilisé le modèle des sphéroïdes pourétudier l’influence de l’architecture cellulaire surl’activation de lymphocytes T infiltrant lestumeurs (TIL). Ceci a été réalisé en mettant enprésence des TIL cytotoxiques et les celluleshumaines tumorales urothéliales autologuesétablis au laboratoire. Nous avons démontréqu’un changement de conformation spatiale descellules tumorales modifiait considérablement lacapacité des cellules à stimuler les TIL (3). Eneffet, la production de cytokines (Tumor NecrosisFactor, Granulocyte Macrophage ColonyStimulating Factor et Interféron γ) par les TIL estfortement diminuée, voire annulée, lors de co-cultures avec les sphéroïdes par rapport aux co-cultures avec les cellules tumorales en tapis, bienque les TIL réussissent à pénétrer uniformémentà l’intérieur de la sphéroïde.

Afin d’identifier les mécanismes impliqués dansla diminution de l’activation des cellules T par lescellules tumorales sous forme de sphéroïdes,nous avons réalisé, en collaboration avecl’équipe de F. Mami-Chouaib (INSERM U487,Villejuif) des co-cultures d’un clone delymphocytes T humains avec des cellulesautologues de cancer du poumon. Dans cesystème, le peptide antigénique cible du clone Tétait identifié. Nous avons démontré que labaisse d'activation des cellules T cytotoxiques estdue à un défaut de présentation de l'antigènepar la cellule tumorale lorsque celle-ci est dansune conformation tridimensionnelle. De plus,grâce à l'utilisation de cellules tumorales ciblestransfectées avec une construction codant laprotéine hsp70, nous avons montré que le défautde présentation de l'antigène par les sphéroïdes


est corrélé à une baisse d'expression de lamolécule hsp70 (4).

Ainsi les sphéroïdes constituent un modèle invitro de microtumeurs qui semble donner desrésultats plus proches de la réalité du vivant. Ilserait maintenant intéressant d'étudier enparallèle les résultats obtenus in vitro sur lessphéroïdes avec ceux observés in vivo chezl’animal. De telles études devraient permettred’optimiser l’utilisation des modèles in vitro en3D et de réduire l’utilisation de modèlesanimaux, notamment pour la sélection demolécules dans le cadre d’essais précliniques.

Bibliographie1. Sutherland R., McCredie J. and Inch W. Growth of multicell spheroids in

tissue culture as a model of nodular carcinomas. J. Natl. Cancer Inst., 46, 113-20, 1971.

2. Dangles V., Lazar V., Validire P., Richon S., Wertheimer M., Laville V.,Janneau, J-L, Barrois M., Bovin C., Poynard T., Vallancien G. and Bellet D. Geneexpression profiles of bladder cancers: evidence for a striking effect of in vitrocell models on gene patterns. Br. J. Cancer, 86,1283-1289, 2002.

3. Dangles V., Validire P ., Wertheimer M, Richon S., Bovin C., ZeliszewskiD., Vallancien G. and Bellet D. Impact of bladder cancer cell architecture onautologous T-lymphocyte activation. Int. J. Cancer, 98, 51-56, 2002.

4. Dangles-Marie V., Richon S., El Behi M., Echchakir H., Dorothée G., ThieryJ., Validire P., Vergnon I., Menez I., Lafjimi M., Chouaib S., Bellet D. and Mami-Chouaib F. A three-dimensional tumor cell defect in activating autologous CTLsis associated with inefficient antigen presentation correlated with heat shockprotein-70 down-regulation. Cancer Res., 63, 3682-87, 2003.




La réceptologie ou « comment est-on passé de l’animal à la cellule »

Valérie AUDINOT

Pharmacologie Moléculaire et CellulaireInstitut de Recherches Servier

125 chemin de Ronde - 78290 Croissy/[email protected]

SummaryReceptors are cellular proteins

located at the plasma membrane of thecell that transmit the information ofextracellular endogenous compounds tothe cell. This interaction can be drawn by akey locker model, where the locker is thereceptor and the ligand is the key thatactivates (agonist) or inactivates(antagonist) the signal.

These receptors are targets of manypharmaceuticals drugs to restore animpaired signalling from the endogenouscompound. To characterise thesereceptors and to find new chemical drugs,an access to these receptors is needed.Before the late 1980’s, experiments wereperformed on animal tissues that weredissected after sacrifice. But the molecularbiology technology has permitted, in mostcases, to stop working on animal tissuessince it became possible to transform celllines to express the receptor of interest.

This approach coupled to assayminiaturization and robotisation enablesnow the screening of a large number ofchemical entities both for their affinity(ability to recognize the receptor) and theirfunctionality (agonist or antagonist) at agiven receptor target.

This higher throughput screeningshould lead to the discovery of new anddiverse chemical entities. Besides, thecharacterization of the selectivity profile ofthe leader compound towards the otherreceptors is also crucial to be detailed, toverify its selectivity and to know potentialsecurity problems at a very early stage ofthe development.

Finally, all these in vitro informationsalso considerably reduce the number ofcompounds to be tested in animalpathophysiological models.

La réceptologie est l’étude des récepteurs, entités protéiques responsablesde la transmisssion d’un signal à la cellule. Les récepteurs sont des protéines quilient des ligands physiologiques. Il existe plusieurs types de récepteurs localisésà la surface membranaire de la cellule mais aussi des récepteurs situés dans lenoyau même de la cellule. Les cibles thérapeutiques sont très souvent desrécepteurs dont le fonctionnement se trouve déréglé.

RCPG : récepteurs couplés aux protéines G (Fig.1)

La classe des récepteurs couplés aux protéines G ou RCPG est importante carenviron 40 à 50 % des médicaments présents sur le marché agissent sur desrécepteurs de cette famille. Sur les cent médicaments les plus vendus aux USA,en 2000, 26 avaient pour cible les récepteurs couplés aux protéines G.

Les visées thérapeutiques sont très diverses. Si l’on reprend les médicamentsles plus vendus aux USA on constate des indications centrales comme laschizophrénie, la migraine ou la dépression qui impliquent des récepteurs duneuromédiateur sérotonine (5-HT) de sous-types différents ou des récepteurs dela dopamine comme les récepteurs D2.

L’allergie est également une visée RCPG impliquant des récepteurs de typehistaminergique H1, alors que les récepteurs de type histaminergique H2 ontpour indication l’ulcère. D’autres indications encore, telle l’hypertension ouencore l’asthme ont pour cible les RCPG.

Qu’est ce qu’un RCPG ? C’est une protéine de 350 à 450 acides aminés, dontla particularité est de traverser 7 fois la membrane plasmatique, un peu commeun serpent qui ondulerait et qui formerait 7 passages à travers la membrane.L’extrémité N-terminale est à l’extérieur de la cellule ; l’extrémité C-terminaleest à l’intérieur. Le récepteur va lier un ligand physiologique naturel comme, par

19-22 Valérie AUDINOT 13/10/06 12:26 Page 19


exemple, la dopamine pour les récepteursdopaminergiques ou l’histamine pour lesrécepteurs histaminergiques. C’est la liaison duligand qui entraîne l’association du récepteur auxprotéines G. Cette association va ensuitetransmettre le signal à la cellule. La transmissiondu signal utilise des voies qui conduiront à laréponse cellulaire aujourd’hui bien décrite :celle de l’adénylate-cyclase avec formationd’AMP cyclique ; celle de la phospholipase C ; ouencore celle des canaux ioniques .

Le ligand et le récepteur : la clé et la serrure (Fig.2)

L’interaction ligand-récepteur peut êtrereprésentée par un modèle où le ligand – lamolécule – est la clé qui irait se lier au récepteurqui serait la serrure.

Si la clé ouvre la serrure, on parle d’un ligandagoniste. Il y a activation du récepteur. Si la clé,au contraire, ferme la serrure, cela signifie quel’on est en présence d’un ligand antagoniste : il ya donc inhibition du système. En fait, la plupartdes médicaments qui ciblent les RCPG sont desantagonistes, il est souvent en effet nécessaire defreiner un système qui s’est emballé.

L’affinité

La première étape dans la recherche demolécules à visée thérapeutique est la mesure del’affinité, c’est-à-dire de la capacité de nouveauxcomposés chimiques à se lier avec le récepteur(ou de la clé à rentrer dans la serrure).

L’approche traditionnelle est une approche dechimie médicinale, en partant du ligand naturelou d’une structure chimique décrite dans lalittérature ou dans les brevets. Il faut évidemmentrester très attentif à la description des produitsdans les brevets pour éviter d’êtreéventuellement dépendant d’un concurrent.

Une approche plus récente dans la recherchede nouveaux composés est le HTS (HighThroughput Screening) ou encore criblage à hautdébit, qui permet de tester un nombre très

important de composés de structures chimiquesles plus diverses (des collections de produits, desextraits naturels d’éponges, de plantes…) afin detrouver des structures particulièrement originaleset innovantes.

Comment, concrètement, est mesurée l’affinitéd’un composé pour son récepteur?

On utilise un radioligand (molécule radioactiveque l’on va pouvoir suivre), dont la propriété estd’être affine pour le récepteur. Le radioligandseul induit une certaine liaison totale. Lorsqu’onintroduira le ligand compétiteur, si celui-cireconnaît aussi le récepteur, il y aura moins deradioligand lié au récepteur. On diminuera ainsila liaison mesurée. C’est cette diminution quipermettra de mesurer l’affinité relative du ligandcompétiteur et de sélectionner ce composéparmi d’autres peu ou pas affins.

La sélectivité

La sélectivité est un aspect très important car ilest très utile d’évaluer l’affinité du ligandsélectionné vis à vis d’autres types de récepteurs,affinité qui peut être non souhaitée pour éviterles effets secondaires, ou au contraire souhaitée.Ainsi, la plupart des composés antipsychotiquessont des ligands qui agissent à la fois sur lesrécepteurs sérotoninergiques de type 5-HT2 etles récepteurs dopaminergiques de type D2 pouroptimiser leur efficacité chez les patientsschizophrènes.

Ces études de sélectivité sont capitales à unstade précoce du développement du produit,non seulement pour réorienter la synthèse versde nouveaux composés mais aussi pour stopperle développement de composés ayant un profilde sécurité non favorable, ce avant d’engagertrop d’études sur l’animal.

La fonctionnalité

Le dernier aspect à aborder quand on étudie unligand est sa fonctionnalité: va-t-il ouvrir ou fermerla serrure ? Va-t-il être activateur, agoniste, ou bieninhibiteur, antagoniste ? Selon le type ou la famillede récepteurs concernés, il existe plusieurs typesde tests membranaires ou cellulaires pour vérifierla fonctionnalité du ligand.


Voilà les informations minimales etindispensables pour caractériser un candidatmédicament, ligand d’un récepteur couplé auxProtéines G.

Le tournant des années 80Jusque dans les années 80, les études

précédemment décrites s’effectuaientessentiellement sur tissus disséqués, nécessitantpar conséquent un sacrifice important d’animaux.

Certaines expériences continuent, encoreaujourd’hui, à ne pouvoir se faire que sur tissus,car certains récepteurs ont besoin du contextecellulaire ou tissulaire d’origine. Certains modèlesin vitro, en effet, ne reflètent pas ce qui se passedans le tissu. Certaines études restent égalementimpossibles à réaliser autrement. Par exemple,lorsqu’on étudie l’effet de conditionsexpérimentales comme l’âge, le sexe desanimaux, le rythme circadien… Ou lorsque l’onveut étudier l’effet de l’administration d’unproduit en aigu ou en chronique, sur l’occupationdes récepteurs. Enfin, autre type d’étude que l’onne peut, à l’évidence, effectuer que sur tissu: lesautoradiographies qui consistent à obtenir desinformations sur la distribution d’un type donnéde récepteurs dans le cerveau en particulier.

Les limites des études sur tissus sont, bien sûr,le nombre d’animaux nécessaires, et aussi, lemanque de spécificité car on peut avoir enprésence, plusieurs sous-types d’une mêmefamille de récepteurs.

En fait, il a fallu attendre 1986 pour que lesétudes de réceptologie ne soient plus faitesexclusivement sur tissus animaux. En effet, avecl’avènement des techniques de biologiemoléculaire, ont été clonés les deux premiersrécepteurs couplés aux protéines G : le récepteurBeta adrénergique et le récepteur muscariniquede type M1. Depuis, environ 350 RCPG sont

désormais clonés. Environ 250 sont caractérisés,c’est-à-dire que leur ligand physiologique estconnu, qu’il s’agisse de neurotransmetteurscomme l’histamine ou la dopamine, ou bien depeptides. Il en reste une centaine qui sont ditsorphelins parce que seul le récepteur est connu,mais pas son ligand physiologique.

Etablissementd’une lignée stable

Un intérêt majeur de cette approche est quel’on peut choisir très précisément l’espèce quel’on veut étudier. La plupart du temps, on travailledirectement sur des récepteurs issus de l’espècehumaine. Le gène codant pour le récepteur estcloné à partir d’un tissu de l’espèce choisie.

L’ADN est alors mis dans un vecteurd’expression, introduit (transfecté) dans unelignée cellulaire (type de cellule capable de semultiplier). Il existe ensuite des moyens poursélectionner la cellule qui aura intégré dans songénome, l’ADN codant pour le récepteur, et quil’exprimera de façon stable. A partir de cettecellule, les cellules filles vont créer une nouvellelignée dite recombinante pour le gène inséré.Cette lignée est ensuite produite en masse et lestests sont réalisés à partir de ces cellulesexprimant le récepteur d’intérêt.

Miniaturisationet robotisation (Fig.3)

La miniaturisation et la robotisation ontrévolutionné les domaines de la réceptologie auniveau industriel.

Tant que l’on travaillait sur tissus animaux on nedisposait que de peu de récepteurs, lamanipulation restait complètement manuelle et


Criblage à faible débit ! Peu

de récepteurs

Réceptologie sur lignées cellulaires transfectées :

Criblage à haut débit(HTS)

Beaucoup de récepteurs

Réceptologie sur tissus animaux :

Fig.3



le faible débit du criblage ne permettait de testerqu’un nombre réduit de molécules.

Sur lignées cellulaires transfectées, aucontraire, on dispose de récepteurs en quantitéquasi-illimitée. L’utilisation de robots est renduepossible par la miniaturisation des volumesd’essais. Le criblage passe au haut débit puisquela réalisation des tests est automatisée. On peutdonc espérer découvrir des composés plusnombreux et plus originaux.

Miniaturisation et robotisation ont permis depasser ainsi du format de tube au format deplaque multipuits permettant de traitersimultanément selon le format de la plaque, 96,384 ou même 1536 échantillons.

Des acquis et des limites

Les acquis de la réceptologie modernepeuvent être résumés ainsi :

• diminution voire absence d’animaux :

• accès aux récepteurs humains ;

• production de récepteurs en grande quantité ;

• satisfaction du critère de spécificité ;

• facilitation du contrôle de l’affinité ;

• possibilité de criblage d’un très grand nombrede produits ;

• meilleure appréhension de la fonctionnalitédes récepteurs ;

• perspectives de développement destechniques de fluorescence pour limiter l’usage dela radioactivité, donc réduction des risquesenvironnementaux et des coûts liés aux déchets,tout en assurant une plus grande sécurité auxmanipulateurs.

Mais à côté de tous ces aspects très positifs, ilfaut, quand même, noter que les lignéescellulaires ont leurs limites. Certains modèlespeuvent être difficiles à obtenir. Le contextecellulaire de la lignée hôte peut être insuffisantpour l’expression fonctionnelle de récepteur. Ilpeut manquer des protéines qui accompagnent lerécepteur (comme, par exemple, la protéineRAMP pour le récepteur CGRP). Dans certains cas,peuvent survenir l’association de deux récepteursou dimérisation, qu’il s’agisse d’homodimérisationquand les deux récepteurs sont identiques, oud’hétérodimérisations quand les récepteurs sontdifférents, ce qui peut conduire à des réponsespharmacologiques spécifiques.

Il arrive aussi que l’on constate des effetsfonctionnels erronés dus au fort tauxd’expression des lignées cellulaires. On peutaussi constater des effets paradoxaux dus à latransfection qui peut induire de façon aléatoire

l’expression de certains gènes dès lors quel’insertion du vecteur est effectuée de façon, elle-même, aléatoire dans le génome.

Une autre limite provient de la différence entreespèces. Le criblage s’effectue en général surrécepteurs humains recombinants. Mais il estparfois nécessaire de revenir aux tissus animaux oubien de cloner le récepteur de l’espèce animaletravaillée par la suite in vivo, pour contrôlerd’éventuelles différences d’affinité interespèces.

La toute dernière limitation tient à l’existencedes brevets. Outre les brevets sur les produits, ilexiste désormais des prises de brevets sur lesrécepteurs. En effet, les nouveaux récepteursclonés sont brevetés en particulier pourl’utilisation de la séquence à des finsthérapeutiques.

L’apport de la Bioinformatique

La création de bases de données, tant auniveau génomique incluant les données duséquençage du génome humain, qu’au niveauchimique décrivant les composés, qu’au niveaupharmacologique reprenant l’énorme quantitéde données générées en réceptologie(notamment avec l’apport du HTS), et leur miseen réseau représente un outil très puissantd’analyse et d’informations.

Des logiciels informatiques permettentdésormais le criblage in silico de collections demolécules qui sont testées sur la modélisationmoléculaire du site réceptoriel responsable de laliaison. L’interaction des molécules sélectionnéesavec le récepteur est ensuite vérifiéeexpérimentalement.

Un outil capital pour la découverte denouveaux médicamentsPour l’industrie pharmaceutique,

l’établissement des lignées cellulairesrecombinantes joint au développement de larobotique représente vraiment un outil capitalpour la découverte de nouveaux médicaments.La conclusion qui s’impose est la diminutionmassive de l’utilisation d’animaux, non seulementpour l’expérimentation en réceptologieproprement dite, mais aussi pour des tests dansdes modèles cellulaires plus complexes. L’onrecueille très rapidement quantitésd’informations, notamment l’affinité, lafonctionnalité et la sélectivité permettant desélectionner très tôt un nombre restreint deproduits intéressants à étudier ensuite dans desmodèles patho-physiologiques chez l’animal.



Bioinformatique structurale, criblage in silico en 3 D

Bruno VILLOUTREIX

Unité de recherche Inserm U648Université Paris 5 - René Descartes45 rue des Sts Pères - 75006 Paris

[email protected]

SummaryAs the structures of more and more

proteins and nucleic acids

become available via StructuralGenomics projects, in silico ligandscreening (or virtual ligand screening orVLS) is increasingly considered for leaddiscovery. As more structures aredetermined experimentally, dockingagainst homology-modeled targets alsobecomes possible for more proteins. Theprotocol involves generation of largecompound collections in 3D and selectionof drug-like compounds via ADME/Toxfilter, prediction of druggable pocket onsome specific targets, docking thedifferent molecules and scoring. The bestmolecules selected in silico are then testedin vitro and/or in vivo. Such computer toolshelp the drug discovery process andreduce the number of experiments to do(in vitro or in vivo on animals).

Several drugs have been developedusing this approach and more are coming.

Pour aborder les éléments de bioinformatique et de criblage virtuel, il fautrevenir sur les principales étapes de la recherche de médicaments, sur ce qu’estla bioinformatique structurale et le drug design, puis se centrer sur le criblagein silico qui est une des fenêtre du drug design.

Les méthodes les plus pertinentes de criblage in silico (voir Figure 1) impliquentgénéralement de connaître la structure 3D des cibles (souvent des protéines), cesinformations peuvent être obtenues expérimentalement ou de manièrethéorique. Il faut aussi des outils informatiques pour pouvoir prédire les sites defixation des médicaments potentiels et pour générer des banques de petitesmolécules chimiques. Il est donc nécessaire de construire des banques dedonnées et d’avoir des filtres informatiques (ADME/Tox) pour essayer d’enextraire toutes les molécules pouvant se révéler comme toxique. Ensuite, nousavons besoin d’outils mathématiques et informatiques pour combiner ces

Figure 1 - Le criblage in silico

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molécules chimiques avec nos protéines cibles.C’est ce qu’on désigne en Anglais par le terme «docking » ou arrimage moléculaire.

Admettons que nous disposions d’uneprotéine impliquée dans une pathologie dontnous voulons cibler le site actif. Nous cherchonsune petite molécule chimique (futur médicament)dans nos banques qui puisse entrer dans ce siteactif et le bloquer. C’est le principe du criblage àhaut débit expérimental. Ce qu’on fait dans destubes à essai, nous cherchons à le reproduire surnos ordinateurs, d’ou le nom de criblage in silico.

L’énorme avantage du criblage informatique,dès lors qu’on possède une structure 3 D de laprotéine cible, c’est qu’on va pouvoir y fairepasser plusieurs millions de composés par jour,alors que le criblage expérimental est bien pluslong et plus coûteux.

Gagner du temps

On considère, communément, qu’actuellement,la mise sur le marché d’une molécule nouvelleprend 15 ans et coûte 500 millions d’Euros. C’estévidemment dû à la complexité du processus deR & D, au temps nécessaire à l’identification et àla caractérisation des cibles, à l’identification desmolécules, puis aux échecs au niveau del’expérimentation animale, et de l’expéri-mentation clinique.

On devrait pouvoir réduire la longueur et lesrisques de ce processus grace à certains outilsinformatiques prédictifs et se donner ainsi plusde chances de succès et surtout éviter de repartirà zéro, après 10 ans de travail.

C’est là que peut intervenir la bioinformatiqueet, tout spécialement, la bioinformatiquestructurale.

Il faut d’abord essayer de caractériser la cible.Par exemple une protéine impliquée dans unepathologie doit être caractérisée au niveaubiochimique. Si l’on peut prédire sa structure,cela va grandement faciliter la suite des travaux.Ensuite si l’on peut faire du criblage in silico et nefaire qu’ensuite la partie expérimentale, on vaencore gagner du temps et limiter le nombred’expériences.

Enfin, pour l’optimisation des « leads » lacontribution de la bioinformatique structurale vaêtre déterminante.

Quand on considère les évolutions intervenuesau cours des dernières années, il est clair que lesmolécules découvertes, l’ont été un peu auhasard ou parce que l’on connaissait plus oumoins les substrats qui devaient se fixer dans lesite actif, on se faisait donc une idéeapproximative de ce qu’il fallait synthétiser.

Dans les années 80 on a mis beaucoup d’espoirdans le drug design basé sur la structure 3D descibles, essentiellement des protéines. On estpassé ensuite au criblage haut débit ou moyendébit expérimental en oubliant les informationsstructurales. Aujourd’hui de nombreuxchercheurs se concentrent sur une approchecombinée : criblage in silico et criblage in vitro.

De la théorie à la pratique

En pratique, si l’on part d’une protéineparticulière, on a besoin de sa structure 3D.Cette structure 3D est obtenue soit pardiffraction des rayons X, soit par résonancemagnétique nucléaire, soit par méthodebioinformatique.

On passe ensuite aux étapes de criblage insilico (voir Figure 1).

On a donc un site à peu près caractérisé (unepoche) dans lequel on va positionner, surordinateur, une première petite moléculechimique présente dans notre banque ouchimiothèque. Si elle s’adapte, on la conserve.Dans le cas contraire, on la rejette. On en prendune autre, et ainsi de suite.

On teste in vitro les meilleurs composéssélectionnés par informatique et graphiquementpar le modélisateur.

Puis on en vient à une deuxième phase de testsbiochimiques qui vont consister à optimiser ce«candidat médicament» à travers une séried’alternances entre chimie, modélisationmoléculaire et autres méthodes biophysiques.Ce n’est qu’après la réalisation de ces cyclessuccessifs que l’on envisagera d’aller plus loinchez l’animal.

Prenons l’exemple concret d’une protéineimpliquée dans un cancer et qu’on va visualisersur l'écran (Figure 2). Les structures secondaires

Figure 2 - Une protéine avec une petitemolécule dans une poche.


(des hélices) apparaissent sous forme decylindres. Les feuillets beta apparaissent sousforme de petites flèches. C’est un médicament(petite molécule chimique non-peptidique), quiest localisé dans la poche, dans le site actif. Cettemolécule inhibe la protéine. Avec ce typed’information, on peut réaliser un projet decriblage in silico et essayer de trouver d’autrespetites molécules qui pourraient se fixer danscette poche.

Mais le problème est que, la plupart du temps,on met en évidence la structure des protéines,mais sans ligand à l’intérieur. Or, il faut trouver unmoyen de prédire les endroits où les petitesmolécules vont pouvoir se fixer. Pour y parveniron peut placer notre protéine au centre d’unegrille. On prend alors un petit cube ou un petitcylindre virtuel que l’on approche de la protéine,dans toutes les directions. Il y a des endroits oùnotre gomme ne va pas pouvoir entrer. Cespoints sont des points potentiels de fixation d’unligand, c’est une façon assez simple et assezefficace de définir les poches susceptibles d’êtredes points potentiels de fixation des ligands.

Ces poches ont des propriétés que l’on peutdéfinir et représenter de façon mathématique.

A l’heure actuelle (en 2005), environ 50 millionsde composés ont été synthétisés. Toutes cesmolécules sont répertoriées dans des fichiersinformatiques, généralement en une/deuxdimension.

Mais sur ces 50 millions de molécules, très peupeuvent prétendre avoir des propriétéspermettant d’obtenir un médicament.

Certains sont trop grands ou trop petits, ontdes atomes et des groupements toxiques… etc.Pour toutes ces molécules qui, a priori,présentent un risque, on tente de définir unesérie de règles de traitement informatique sur labase de données expérimentales. A partir de leurstructure, on va calculer et éliminer toutes cellesqui n’ont aucune chance de devenir desmédicaments. On va donc travailler seulementsur une banque biaisée.

Ainsi, à partir d’une banque d’1 million decomposés après filtrage sur ordinateur, on vareconnaître des propriétés drug-like à 250000composés. C’est pour ces composés, situés dansdes fichiers en 1 dimension, que nous allonsgénérer des structures en 3 D de façon plus oumoins automatique.

Parvenus à ce stade, nous avons bien notreprotéine et nos ligands, sur des fichiersinformatiques et en 3 dimensions. Ce dont nousavons besoin, maintenant, ce sont des outils pourtenter de prédire comment la molécule va venirse positionner dans le site actif.

On va rechercher deux types decomplémentarités. Une complémentaritégéométrique, et une complémentaritéénergétique. A l’intérieur de la poche d’un siteactif, on va dessiner un certain nombre desphères virtuelles, au centre desquelles on vasuperposer les atomes de nos petites molécules.Si plusieurs atomes du ligand peuvent sesuperposer sur plusieurs centres de ces sphères,cela suggère que cette molécule est un ligandpotentiel. Sinon, on la rejette. C’est un premiercriblage, une complémentarité géométrique.

Ensuite, il va falloir caractériser ces interactions,calculer l’énergie d’interaction.

La façon la plus simple consiste à positionnerune protéine sur une grille puis de pré-calculerles énergies dues à cette protéine sur les pointsde la grille. On calcule une énergie d’interactionentre les atomes du ligand et les points de lagrille.

On calcule, par exemple, les interactionsélectrostatiques de Coulomb et les interactionsde Van der Waals.

Evidemment, les experts savent bien que cetype de score ne suffit pas et qu’il faut introduired’autres paramètres beaucoup plus complexes.

Vers des médicamentstrès novateurs au prixde moins d’expériencesin vitro et in vivoOn part d’une banque d’un million de

composés déjà synthétisés, on la filtre. Onobtient

250000 composés qui ont le potentiel d’être unmédicament. On fait une première série decalculs avec de l’arrimage rigide et une fonctiond’énergie (de score) d’interaction assez simple.On sélectionne environ 50 000 composés plusappropriés. On applique une nouvelle série decalculs plus sophistiqués où les énergiesd’interaction vont être beaucoup plus complexeset demander plus de temps de calculs, environ 3minutes par composés.

Cela ne paraît pas énorme, mais lorsqu’ontravaille sur des millions de molécules, celademande une puissance informatiqueconsidérable.

In fine, c’est une centaine de composés qui,après avoir passé tous ces tests in silico, vont êtretestés in vitro.

Après quoi, seuls quelques composés ferontl’objet d’une ultime série d’étapes informatiquesqui seront optimisées puis testées sur animal.




Il est clair que ce processus permet de réduireconsidérablement le nombre d’expériences àeffectuer in vitro et in vivo.

On peut penser que, compte tenu des projetsde Génomiques Structurales existants, on pourraobtenir la structure 3D de la quasi-totalité desprotéines qui nous intéressent chez l’homme etdans d’autres espèces.

Pour les molécules chimiques, on possède déjàdes banques satisfaisantes, dont on va pouvoir

accroître les capacités de façon virtuelle ; c’est-à-dire créer des banques de molécules virtuellesdont certaines pourront être synthétisées etdevenir des médicaments très novateurs.

Il reste bien entendu encore des problèmes àrésoudre, notamment en matière de filtrageADME/Tox et de docking/scoring, mais on atoutes les raisons de penser, compte tenu deslogiciels déjà existants, que des solutions seronttrouvées.



L'expérimentation virtuelle en recherche pharmaceutique

André MICHEL

AUREUS Pharma

AUREUS Pharma, leader dans le domaine de la " e-Discovery ", propose unensemble intégré de technologies, alliant systèmes informatisés deconnaissances et méthodes expérimentales afin d'accélérer la découverte denouveaux médicaments.

Le système d'AUREUS est le seul à intégrer bases de données et systèmes deconnaissances traitant de l'expérimentation biologique et pharmacochimiquedécrite dans la littérature. Ce système intègre non seulement les donnéesconcernant la pharmacopée actuelle ou les produits faisant l'objet de projets enrecherche clinique, mais aussi toutes les autres molécules ayant donné lieu à lapublication de données de recherche en pharmacochimie tant les produitsd'origine naturelle que les produits de synthèse. A terme, la société couvriral'ensemble des cibles connues à ce jour.

L'application du savoir-faire d'AUREUS permet dès lors de :

- Focaliser l'expérimentation biologique et la synthèse chimique enchoisissant les structures moléculaires les plus à même d'obtenir une réponsepositive, diminuant non seulement l'investissement en synthèse de produitsmais également en réduisant le recours au matériel biologique.

- Prévoir pour des produits donnés de nouvelles applications thérapeutiquespar l'interrogation de la base propriétaire d'AUREUS en tenant compte dessimilitudes moléculaires et fonctionnelles pour un grand nombre de composéspubliés : apprendre des expériences antérieures permet d'éviter de reproduiredes expériences déjà réalisées.

- Prévoir le risque d'apparition d'effets indésirables en bénéficiant dessimilitudes moléculaires et fonctionnelles pour un grand nombre de composéset de cibles publiés : les tests de sécurité sont extrêmement " consommateurs" d'animaux d'expérience. Notre approche a pour objectif de limiter cesexpériences en évitant les redondances.

- Produire, par l'interrogation de la base propriétaire d'AUREUS, deshypothèses sur les comportements pharmacocinétiques de nouveaux ligands :une meilleure connaissance des propriétés ADME (Administration, Dispersion,Métabolisme) en vue des essais chez l'homme.

27 André MICHEL 13/10/06 12:34 Page 27

OPAL couv special 13/10/06 11:31 Page 1opal-association.org/infopal/Le_Remplacement_2003.pdf ·...

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