ONCOFETAL GENE SALL4 IN AGGRESSIVE

HEPATOCELLULAR CARCINOMA

Sebastián Naranjo Castaño

Ana Montúfar Pantoja

III semestre Medicina

UPB

Kol Jia Yong, B.Sc., Chong Gao, M.D., Ph.D., Joline S.J. Lim, M.B., B.S.,Benedict Yan, M.B., B.S., Henry Yang, Ph.D., Todor Dimitrov, Ph.D.,

Akira Kawasaki, M.D., Ph.D., Chee Wee Ong, M.Sc., Kwong-Fai Wong, Ph.D.,Sanghoon Lee, Ph.D., Sharada Ravikumar, M.D., Ph.D., Supriya Srivastava, M.D.,

Xi Tian, B.S., Ronnie T. Poon, M.B., B.S., Ph.D., Sheung Tat Fan, M.D., D.Sc.,John M. Luk, D.Med.Sc., Yock Young Dan, M.B., B.S., Ph.D.,

Manuel Salto-Tellez, M.D., Li Chai, M.D., and Daniel G. Tenen, M.D.

Gen SALL4

INTRODUCTION

Is part of a group of genes called the SALL family.

These genes provide instructions for making proteins that are involved in the formation of tissues and organs during embryonic development.

SALL proteins are transcription factors, which means they attach (bind) to specific regions of DNA and help control the activity of particular genes. Location: 20q13.2

Carcinoma, is a form of cancer originating from epithelial or glandular cells.

Hepatocellular carcinoma, develops when there is a mutation to the cellular machinery that causes the cell to replicate at a higher rate and/or results in the cell avoiding apoptosis.

A constant cycle of damage followed by repair can lead to mistakes during repair which in turn lead to carcinogenesis.

INTRODUCTION

Hepatocellular carcinoma Is a primary malignancy of the liver. Most cases of HCC are secondary to either a viral hepatitide infection (hepatitis B or C) or cirrhosis (alcoholism being the most common cause of hepatic cirrhosis).

INTRODUCTION

Gen SALL4 and HCC

In healthy humans, SALL4 is expressed in fetal liver but

silenced in mature adult liver. In a subgroup of HCC livers,

SALL4 is re-activated and plays a functional role in

hepatocarcinogenesis by silencing the tumor suppressor

PTEN through the recruitment of the NuRD complex.

INTRODUCTION

Understand and describe the molecular pathogenesis of hepatocellular carcinoma and

develop more effective targeted therapies.

GENERAL OBJECTIVE

PACIENTES

MATERIALES Y METODOS

Muestra: carcinoma hepatocelular,tejido extraído quirúrgicamente.

Pacientes en el Hospital de la Universidad Nacional de Singapur. 79/179.

Pacientes en el Hospital Queen Mary de Hong Kong. N=228

Demographic and Clinicopathological Characteristics of the Patients (Singapore Cohort) and Association between SALL4 Expression With Clinicopathological ParametersSALL4neg: IHC score 0; SALL4pos: IHC score +1 to +4N=79 (unless otherwise noted in brackets).Fisher’s exact test

StageTumor

CharacteristicsAssociated Liver

FeaturesStage A (early HCC)

  A1 PST 0 Single tumorNo PH and normal

bilirubin level

  A2 PST 0 Single tumorPH and normal bilirubin level

  A3 PST 0 Single tumorPH and abnormal

bilirubin level

  A4 PST 03 Tumors, all <3

cmChild-Pugh A–B

Stage B (intermediate HCC)

  PST 0Large

multinodularChild-Pugh A–B

Stage C (advanced HCC)

  PST 1-2

Vascular invasion or

extrahepatic spread

Child-Pugh A–B

Stage D (end-stage HCC)  PST 3-4 Any Child-Pugh C

Puntos ClaseSupervivencia al cabo de 1 año

Supervivencia al cabo de 2 años

5-6 A 100% 85%

7-9 B 81% 57%

10-15 C 45% 35%

Barcelona-Clínic Liver Cancer Child-Pugh

Grado del tumor. • GX El grado no puede evaluarse (calidad

indeterminada)• G1 Bien diferenciado (calidad baja)• G2 Moderadamente bien diferenciado (calidad

intermedia)• G3 Precariamente diferenciado (calidad alta)• G4 no diferenciado (calidad alta)

Se clasifico la expresión de SALL4 de acuerdo con el porcentaje de células tumorales que resultaron positivas para SALL4. 0: ausencia de

células tumorales teñidaspositivo 

1: 1%- 30% de las células tumorales positivas.

2 : 31%- 50% de las células tumorales positivas.

3: 51% -80% de las células tumorales positivas. 

4: > 80% de células tumorales positivas.

SALL4 expression status of primary HCC tissues from the Singapore cohort

Demographic and Clinicopathological Characteristics of the Patients (HK Cohort) and Association between SALL4 Expression with Clinicopathological Parameters

N=228 (unless otherwise noted in brackets).Chi-square testP < 0,05

Alfa feto-proteína.

Grado del tumor. • GX El grado no puede evaluarse (calidad

indeterminada)• G1 Bien diferenciado (calidad baja)• G2 Moderadamente bien diferenciado (calidad

intermedia)• G3 Precariamente diferenciado (calidad alta)• G4 no diferenciado (calidad alta)

MICROARREGLOS

• Consiste en miles de secuencias específicas de genes individuales estrechamente comprimidas adheridas a la superficie de un portaobjetos de vidrio para microscopio.

• El monitoreo simultáneo de la expresión de miles de genes.

• Analizar los patrones globales de la expresión génica de un organismo durante respuestas fisiológicas específicas o de procesos del desarrollo.

Generación de

oligonucleótido

Hibridación y

Lavado

Patrones

Deposito

fotolitografía

DNA

Amplificado

Marcado F.

MICROARREGLOS, ELABORACIÓN

PCR

PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Técnica para amplificar un segmento específico de DNA en una mezcla compleja mediante múltiples ciclos de síntesis de DNA a partir de oligonucleótidos cebadores cortos, seguidos por un breve tratamiento con calor para separar las hebras complementarias.

Se analizo la expresión endógena de SALL4 en 10 líneas celulares de HCC humano. Por medio de un ensayo de PCR se cuantifico la expresión de SALL4 en varios niveles. Se determino un patrón.

Hibridación con Oligonucleótido

SíntesisReplicación x

DNA pol.Oligo, cebador

Desnaturalización del DND

Hebras Sencillas

Alineación

PCR, ETAPAS

Inmunotinción

Rx Ag-Ac (marcado).

Coloración, presencia de molécula de interés.

identificación de diferenciación y de marcadores pronósticos de neoplasias.

expresión diferencial de SALL4.

INMUNOHISTOQUÍMICA

WESTERN BLOT

Detecta una proteína particular en una mezcla compleja, combina la electroforesis en gel, la especificidad de los anticuerpos y la sensibilidad de las pruebas enzimáticas.

Suele utilizarse para separar proteínas y luego Identificar una proteína específica de interés.

en este método se utilizan dos anticuerpos diferentes, uno específico para la proteína buscada y el otro unido a una enzima informadora.

Para confirmar la participación del PTEN en la reducción de células de carcinoma hepatocelular inducida por el péptido SALL4.

Expresión de PTEN

RESULTADOS

• Probar hipótesis de reexpresión de SALL4 en subtipo de carcinoma hepatocelular.

•Análisis inmunohistoquímica: detectar expresión de SALL4 en muestras de hígado fetales, no en hígado adulto

•Nivel de expresión de SALL4 en pacientes con carcinoma hepatocelular.

SALL4 se expresó en el tejido de hígado fetal, silenciados en el tejido normal del hígado adulto, y reexpresado en muchas de las muestras de tejido de los adultos con carcinoma hepatocelular

•Mayor expresión de SALL4 en células del carcinoma hepatocelular que en las no neoplásicas (P <0,001) (Fig. 1B).

•Microarrays: Confirma el aumento de SALL4 en varios grupos independientes de carcinoma primario hepatocelular.

•Expresión diferencial de SALL4 en las muestras de hígado de tejido de carcinoma hepatocelular-y no neoplásicas, de bases de datos públicas (P = 0,003).

•Expresión endógena SALL4 en varios niveles a través de 10 líneas de células de carcinoma hepatocelular. Ausencia de expresión en THLE-2 y THLE-3.

•Pacientes con un alto nivel de expresión SALL4, tienen un peor pronóstico que los de bajo nivel de SALL4 expresión.

•Carcinomas hepatocelulares con alta SALL4 se agrupan fuertemente con hígados fetales: Agresivos, y se asocia con un mal pronóstico.

•Carcinomas hepatocelulares con bajo SALL4 agrupados con hepatocitos normales.

•Células SNU-398 tratadas con shRNA 1 se agrupan estrechamente con el tejido de hígado fetal humano: ↑SALL4.

•Células SNU-398 con shSALL4 1 se agrupan con hepatocitos humanos,

•Baja regulación de SALL4 puede hacer carcinoma hepatocelular

•Péptido 12-AA SALL4, un inhibidor competitivo de SALL4, disminuyendo de la viabilidad de las células de carcinoma hepatocelular.

•Péptido SALL4, mantiene de la viabilidad celular

•Péptido SALL4 no tuvo ningún efecto sobre las células SNU-387 con la expresión endógena SALL4 indetectable

•SALL4 indujo un aumento en los niveles de proteína PTEN en las células SNU-398

•SALL4 tiene un efecto insignificante sobre la expresión de PTEN en las células SNU-387

•Péptidos TAT-mutantes reducen la tumorigenicidad de SNU-398 células

DISCUSSION

REFERENCE WHAT THE Y SAID AGREE/ DESAGREE

Elling U, Klasen C, Eisenberger T, AnlagK, Treier M.

“SALL4 is one of the key factors for maintenance of pluripotency and self-renewal of embryonic stem cells.”

AGREE

1. The main conclusion obtained after reviewing this article is the role of the SALL4’s reexpression in a subtype of hepatocellular carcinoma.

2. SALL4 expression occurs in hepatocellular carcinoma cells but not in normal adult hepatocytes, thus SALL4 peptide treatment may have less tissue toxicity

CONCLUSIONS

3. The identification of SALL4 can be a prognostic factor and biomarker for Hepatocellular Carcinoma.

4. According to the above, SALL4 is an important target for the treatment of hepatocellular carcinoma and their regulation can reduce the aggressiveness of the cancer.

CONCLUSIONS

MAPAS

Ana María Montúfar Pantoja

MAPAS

Sebastián Naranjo C.

Gracias.