ODKRIVANJE NOVIH INHIBITORJEV D-ALANIL- D-ALANIN LIGAZE … · ˚˛˙ spletna baza proteinskih...
Transcript of ODKRIVANJE NOVIH INHIBITORJEV D-ALANIL- D-ALANIN LIGAZE … · ˚˛˙ spletna baza proteinskih...
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
Ljubljana, 2008
ODKRIVANJE NOVIH INHIBITORJEV D-ALANIL-D-ALANIN LIGAZE Z VIRTUALNIM REŠETANJEM
DISCOVERY OF NEW INHIBITORS OF D-ALANYL-D-ALANINE LIGASE BY VIRTUAL SCREENING
BLAŽ VEHAR
DIPLOMSKA NALOGA
Diplomsko nalogo sem opravljal na Fakulteti za farmacijo pod mentorstvom prof.
dr. Stanislava Gobca in somentorstvom dr. Dušanke Janeži�. Ra�unalniške postopke in
izra�une sem opravil na Kemijskem inštitutu v Ljubljani.
Izjava
Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof.
dr. Stanislava Gobca in somentorstvom dr. Dušanke Janeži�.
Zahvala
Zahvaljujem se mentorju prof. dr. Stanislavu Gobcu za potrpljenje, somentorici
dr. Dušanki Janeži� za zaupanje in vzpodbudo, Janezu Koncu za dragocene nasvete in
napotke ter Andreji Kova� za neusahljiv zanos pri ponavljanju laboratorijskih
preizkusov.
Hvala tudi mami za podporo in jeklene živce, brez �esar te diplomske naloge ne bi bilo.
1
��������
� ��������
� ��� ������������
����
� ����������� ����� ���� ��
�� ������ �������������� ������ ���� �
�� ���� �!���������"� ������������� ����������#
� $�������!���%���� ��!�� �&
�� '"�������������"���� ��(
�� $��!� ������������"���� ���
�)��� ��)�)��� � ���"����
� ���������������
� *���� ����!��������
' � ��� ��������������#
� �������� ���������� ������� ������ ���� �(
�� ����� ������� ������������������ ����!��������� ����
�� +������ �������� ��� ���! ����!��������������� ��
� ���"���!����������*�����%���
�� ������!���*,$-.��
�� /����%���!���"� ��!�����"��������
� 0��� ������#
� ,������� ����������
�� ����������������� ���������*�����%����&
��� 1����� �������������"� ���� �� ����&
��� ��������������������"� �������023������!��4������5
�� ������������������ %����5
��� ����������6� ���� �����7������"������ �"����!���� %���(
��� �����������������!��������������!���� ���
�� '�"� �*�����%��
��� ����������!���� �����*�����%���
� ������������� �����������������������!���� ��
2
�� ��������� �������!���������"� ���� ���������� 8
��� ,���� ����������� ������� �!������ 8
��� ,��������������������!������ �!�� #
8 .���������� ���������
8� 1� ���� ��!���� ���� ����������� $ &
8� ��!��! �������� ����������� ��7 �%��!���� 5
8 .����� ���!���� ����023������!��4����� ��
8� .�������������� ���������� ������� �!�� �
8� ���"����!���� ������������ ���!���� ��
88 .����������������������"���������!� �8
# ����� �&
& /��������� �5
5 �����"�
5� �����"���9�������������������:�������%���� ���; ��
5� �����"���9����� �������������� ��
5 �����"��9����� ����������������� �
5� �����"���9��������(���!��%�������������������� ��
5� �����"���9��!����������������� ��.* �8
3
�� �����
Uspešnost zdravljenja bakterijskih infekcij v zadnjih letih upada zaradi pojava pridobljene
odpornosti mikroorganizmov, premalo kriti�ne uporabe antibiotikov in pomanjkanja novih
protimikrobnih u�inkovin, ki bi delovale na znane, a terapevtsko manj izkoriš�ene
bakterijske tar�ne proteine.
V okviru diplomske naloge smo se osredoto�ili na bakterijski esencialni encim D-alanil-
D-alanin ligazo (Ddl), ki sodeluje pri biosintezi peptidoglikana. Ker je kristalna struktura
Ddl znana, smo za odkrivanje njenih inhibitorjev uporabili metodo virtualnega rešetanja.
S programskim orodjem AutoDock 4.0 smo virtualno rešetali knjižnico 1839 ligandov.
129 najboljših zadetkov virtualnega rešetanja smo ovrednotili z encimskim kolori-
metri�nim testom, ki nam je dal pet aktivnih spojin, ki in vitro zavirajo kataliti�no
delovanje encima. Opisali smo njihove hipoteti�ne lege v aktivnem mestu encima in
interakcije s pomembnimi aminokislinami.
Mikrobiološki preizkus aktivnosti je pokazal, da štiri spojine zavirajo rast bakterijskih
kolonij, od tega tri (NSC48693, NSC86005, NSC130813) le pri Gram-pozitivnem koku
Staphylococcus aureus, ena (NSC176327) pa tudi pri neoslabljenem sevu po Gramu
negativnega bacila Escherichia coli.
4
� �� �������������
�� � koda nativne D-alanil-D-alanin ligaze iz Escherichie coli v bazi RCSB
���� 4-aminobenzojska kislina
��� adenin difosfat
��� AutoDock Tools, grafi�ni vmesnik za uporabo AutoDocka
� �!" družina polj sil za opis molekulske dinamike biomolekul (Assisted Model Building and Energy Refinement)
�#� Unixov skriptni jezik za obdelavo tekstovnih podatkov
��� D-alanil-D-alanin ligaza
�$% dihidrofolat
���& AutoDockova datoteka z rezultati sidranja (docking log)
�� AutoDockova datoteka s parametri za sidranje (docking parameter file)
!' encimska klasifikacija
() po Gramu negativen
(* po Gramu pozitiven
(��+�� N-acetilglukozamin
�& AutoDockova datoteka s parametri afinitetne mreže okrog aktivnega mesta encima (grid parameter file)
�',- koncentracija inhibitorja, ki prepolovi aktivnost encima
.(� lamarckovski genetski algoritem
�' minimalna inhibicijska koncentracija
��+�� N-acetilmuraminska kislina
+'� Ameriški inštitut za raziskovanje raka (National Cancer Institute)
+/' kodna oznaka za spojine v knjižnici spojin NCI
��� proteini, ki vežejo penicilin (penicillin binding proteins)
��� spletna baza proteinskih struktur (Protein DataBase)
��� datote�ni format za predstavitev molekulskih struktur
���0� AutoDockova datoteka s podatki o molekuli za sidranje
� � 2-((1-aminoetil)-fosfat-fosfinoiloksi)-butanojska kislina
"� rezidualna aktivnost encima
�$% tetrahidrofolat
1�� uridin difosfat
�"�+� vzporedni ra�unalnik za akceleracijo numeri�nih algoritmov
5
� �����
�� ������������������������
Protimikrobne u�inkovine so spojine naravnega, polsinteznega ali sinteznega izvora, ki
imajo baktericidno ali bakteriostati�no delovanje. Uporabljamo jih za zdravljenje
infekcijskih bolezni z bakterijskimi povzro�itelji.
Gonilo zdravljenja vseh infekcijskih bolezni je Ehrlichov princip selektivne toksi�nosti.
Zaradi strukturnih in presnovnih razlik med celicami mikro- in makroorganizmov namre�
obstajajo spojine, ki so sposobne uni�iti ali vsaj oslabiti celice parazita, in to
v koncentracijskem obmo�ju, pri katerem celicam gostitelja ne povzro�ijo škode. Zato so
tar�e delovanja protimikrobnih u�inkovin tisti strukturni elementi in presnovni procesi
bakterijskih celic, ki jih v celicah gostiteljev ne zasledimo oziroma so v njih spremenjeni.
(1)
��� �����������������������������������
Danes poznamo štiri glavna tar�na mesta delovanja protimikrobnih u�inkovin (slika 1):
• izgradnja celi�ne stene,
• sinteza proteinov,
• zgradba in delovanje
nukleinskih kislin,
• zgradba in delovanje
celi�ne membrane. (1, 2)
Slika 1 — tar�na mesta delovanja protimikrobnih u�inkovin: � izgradnja celi�ne stene: β-laktami, glikopeptidi, fosfomicin, cikloserin � zgradba in delovanje celi�ne membrane: polimiksini�� sinteza dihidrofolata: sulfonamidi�� sinteza tetrahidrofolata: trimetoprim�
� zgradba in delovanje DNK: kinoloni, nitrofurantoin�
� transkripcija: rifampicin�
� translacija: aminoglikozidi, makrolidi, tetraciklini, linkomicini�
6
Celi�na stena bakterij ima edinstveno sestavo, ki je ne najdemo nikjer drugje v naravi.
Zaradi lege na zunanji strani celi�ne membrane je tudi razmeroma lahko dostopna. Ne �udi
torej, da so bili zaviralci izgradnje celi�ne stene prvi komercialno dostopni antibiotiki in jih
še danes kljub pojavu pridobljene odpornosti najpogosteje uporabljamo. V to skupino
sodijo �-laktamski antibiotiki (penicilini, cefalosporini in drugi), glikopeptidi (npr.
vankomicin), fosfomicin in cikloserin.
Sinteza proteinov poteka na ribosomih v celicah vseh živih bitij. Ker se podenote
prokariontskih in eukariontskih ribosomov razlikujejo v sestavi in v velikosti, obstajajo
u�inkovine, ki se selektivno vežejo na razne strukturne elemente prokariontskih ribosomov
in tako zavrejo proces translacije le v bakterijskih celicah. Mednje prištevamo
aminoglikozide, tetracikline, makrolide, linkomicine in kloramfenikol.
Izgradnja in delovanje nukleinskih kislin sta univerzalna procesa, ki v vseh organizmih
potekata na prakti�no enak na�in. Kljub manj o�itnim razlikam se tudi tukaj najdejo tar�e
za protimikrobne u�inkovine:
• Folno kislino, ki jo moramo sesalci v organizem vnašati s hrano, bakterije sintetizirajo
iz 4-aminobenzojske kisline z encimom dihidropteroat sintazo. Protimikrobno delujo�i
sulfonamidi so kompetitivni antagonisti 4-aminobenzojske kisline na tem encimu.
Trimetoprim je selektivni inhibitor bakterijske dihidrofolat reduktaze, ki katalizira
zadnjo stopnjo aktivacije folata (sintezo tetrahidrofolne kisline).
• Bakterijska giraza se razlikuje od naše topoizomeraze II in ima specifi�ne inhibitorje
(kinolone), ki selektivno zavirajo zvijanje bakterijske DNK in s tem onemogo�ijo
kompaktiranje genskega materiala, ki je za vsako celico življenjskega pomena.
• Rifampicin je selektivni inhibitor bakterijske od DNK odvisne RNK polimeraze.
Celi�na membrana prokariontov se razlikuje od eukariontske. Najbolj izstopa odsotnost
sterolov pri prokariontih, ki zato izboljšujejo fluidnost membrane z vklju�evanjem
hopanoidov in prostih maš�obnih kislin v membrano. Omenjene strukturne razlike
izkoriš�amo pri uporabi polipeptidnih antibiotikov (primer so polimiksini), ki pove�ajo
prepustnost prokariontske membrane (predvsem za molekule vode) in s tem povzro�ijo
lizo bakterijske celice, gostiteljske pa ne. (1, 2, 3)
7
���� ����������������!��� �����������������������
Proces antibioze je v naravi potekal, davno preden je �loveku uspelo izolirati prvi
antibiotik. Biološka raznolikost je poskrbela za to, da so bakterije, odporne na naravne
antibiotike, vedno obstajale. Množi�na in pogosto nekriti�na uporaba protimikrobnih
zdravil je selekcijo rezistentnih sevov mo�no pospešila, zato so danes nekateri sevi odporni
na tako širok spekter u�inkovin, da se pri njihovem zdravljenju približujemo stanju pred
odkritjem penicilina. Za uspešno kosanje z rezistentnimi bakterijami bi potrebovali stalen
dotok novih protimikrobnih u�inkovin, ki pa ga v zadnjih letih ni. (4)
Naravna odpornost na dolo�eno u�inkovino je zna�ilna za celoten bakterijski rod ali vrsto,
saj je posledica strukturnih ali presnovnih zna�ilnosti, ki so zapisane v genetski kod
nativnih mikroorganizmov. Ko se odpornost pojavi v posameznih bakterijskih sevih kot
posledica selekcijskih pritiskov, govorimo o pridobljeni odpornosti. Zanjo so odgovorni
mutirani kromosomski ali plazmidni geni, ki lahko nastanejo v bakterijski celici sami ali
vanjo prodrejo prek izmenjave genskega materiala s konjugacijo (prenos DNK s parjenjem
bakterij), transformacijo (privzem prostih nukleinskih kislin v celico) ali transdukcijo
(prenos genskega materiala prek okužbe z bakteriofagi). (2)
Zaskrbljujo� je tudi pojav navzkrižne rezistence: bakterije, odporne na dolo�eno zdravilo,
so pogosto odporne tudi na druge u�inkovine s sorodnim na�inom delovanja.
Poznamo pet osnovnih mehanizmov bakterijske rezistence:
• sprememba tar�nega mesta oziroma prijemališ�a antibiotika,
• pojav sposobnosti encimske razgradnje u�inkovine,
• zmanjšana prepustnost celi�ne membrane za molekulo u�inkovine,
• sprememba presnovne poti, ki je tar�a antibiotika,
• pojav aktivnega prenosa (efluksa) u�inkovine iz bakterijske celice. (2)
Ker je utopi�no pri�akovati, da bomo kdaj odkrili antibiotik, proti kateremu se odpornost
ne bo pojavila, sta za dolgoro�no uspešno spopadanje z bakterijskimi infekcijami klju�na
racionalna uporaba protimikrobnih u�inkovin, ki so nam na voljo, in stalen trud pri
odkrivanju novih.
8
��� "�����������#�������������
Celi�na stena bakterij je toga, mehansko trdna struktura na zunanji strani celi�ne
membrane, sestavljena iz neobi�ajnih molekulskih gradnikov (predvsem izstopa
pogostnost D-aminokislin). Celico stena š�iti na ve� na�inov:
• z mehansko trdnostjo ohranja obliko in integriteto celice,
• varuje jo pred spremembami osmotskega tlaka in ji omogo�a preživetje v mo�no
hipotoni�nem okolju,
• predstavlja selektivno prepustno bariero za potencialno škodljive molekule,
• prepre�uje dostop gostiteljskih razgradnih encimov do celi�nih struktur, ki so jih ti
sposobni razgraditi (predvsem do celi�ne membrane). (3)
Osnovni gradnik celi�ne stene je peptidoglikan, makromolekula z edinstveno zgradbo, ki
daje celi�ni steni mehansko trdnost, a je obenem najpomembnejša tar�a za delovanje
protimikrobnih u�inkovin. Njihova selektivna toksi�nost je posledica dejstva, da
v eukariontskih celicah ne zasledimo niti peptidoglikana niti encimov, odgovornih
za njegovo sintezo.
Celi�ne stene razli�nih bakterij seveda nimajo enake sestave. Eden prvih in še danes
najbolj uporabnih grobih diagnosti�nih postopkov za prepoznavanje bakterij, barvanje po
Gramu, temelji prav na razlikah v sestavi dveh najpogostejših tipov celi�ne stene:
• G+ bakterije imajo celi�no steno sestavljeno iz do 40 plasti peptidoglikana, ki jih
prebadajo kisli anionski polimeri (predvsem teihojska kislina in derivati) (slika 2).
V to mrežo polimerov so ujeti nekateri pomembni proteini, npr. PBP.
Slika 2 — sestava celi�ne stene G+ bakterij
9
• G– bakterije imajo kompleksnejšo celi�no steno, ki vsebuje sekundarno zunanjo
membrano, zaradi katere je prepustnost celi�ne stene mo�no zmanjšana. Med
membranama, v periplazmatskem prostoru, je enojna ali dvojna plast peptidoglikana,
ob njem pa številni vezavni proteini in encimi (slika 3).
Kljub razlikam v sestavi celi�nih sten je osnovna zgradba peptidoglikana povsod enaka.
In ne glede na to, da predstavlja peptidoglikan pri G+ bakterijah do polovico mase celi�ne
stene, pri G– bakterijah pa le kako desetino, pomeni kakršnakoli motnja v njegovi
biosintezi za obe vrsti celic gotovo smrt. (3)
Slika 3 — sestava celi�ne stene G– bakterij
10
���� $!�������������!�������
Peptidoglikan ali murein je polimerna molekula iz aminokislinskih in saharidnih enot,
ki obdaja celotno bakterijsko celico. Njegove linearne glikanske verige sestavljajo menjaje
vezani monomeri N-acetilglukozamina in N-acetilmuraminske kisline. Peptidni del je
vezan na laktatno skupino v muraminski enoti in je pri ve�ini bakterij tetrapeptid L-alanil-
�-D-glutamil-L-lizil-D-alanin (z možnimi variacijami na glutamatnem in lizinskem delu).
Ti peptidni fragmenti povezujejo sosednje glikanske verige med seboj, s �imer ustvarijo
trdno premreženo strukturo peptidoglikana. Povezava je pri ve�ini G– bakterij neposredna,
pri G+ pa najpogosteje poteka preko povezovalnih mosti�kov iz majhnih aminokislin,
najve�krat glicina (slika 4). (5, 6)
Slika 4 — zgradba bakterijskega peptidoglikana (tipa G+): (a) strukturna formula peptidoglikanskega monomera (b) shema povezav med monomeri v posamezni plasti
11
����� "������� ���������!�������
Izgradnja peptidoglikana se pri�ne v bakterijski citoplazmi s pretvorbami N-acetil-
glukozamina. Znotrajceli�ne stopnje biosinteze katalizira kaskada encimov, imenovanih po
genskem segmentu mur (slika 5). MurA in MurB pretvorita UDP-GlcNAc v UDP-
MurNAc. MurC nanj pripne L-alanin, MurD D-glutaminsko kislino, MurE L-lizin, MurF
pa dipeptid D-alanil-D-alanin, ki je produkt D-alanil-D-alanin ligaze. Nastali prekurzor
UDP-MurNAc pentapeptid se ob odcepu uridin monofosfata poveže z baktoprenolom,
undekaprenilatno prenašalno molekulo (struktura na sliki 6), ki je dovolj lipofilna,
da MurNAc pentapeptidu omogo�a prehajanje plazmaleme. Na muraminski del
prekurzorja se ob katalizi encima MurG glikozidno veže N-acetilglukozamin, tako da
membrano pre�ka undekaprenilni disaharidni pentapeptidni fragment. (6, 7, 8, 9)
�����
��
��������
����
��
��������
��
����
��
��������
��
����
��
��������
�������� ������
����
��
������������������������
�������� ������������������
�
���
��
������������������������
�������� ������������������
����
����
��
�
�
���
� ��
�
���
��
�
����
��
��������
�������� ������������������
���� ���� ����������������
���
���!
���
���
��� ����� ��� ��������"�����#�$ ��������� ����������$�����$��
����� �����������
�������������$����$������������������"%"�%"��������������$����$������������������"%"�%"�����������& �����'����$����$��
Slika 5 — stopnje biosinteze peptidoglikana, ki potekajo znotraj bakterijske celi�ne membrane
�
�
�
�
Slika 6 — strukturna formula baktoprenola v aktivirani fosfatni obliki
12
Na zunanji strani celi�ne membrane se prekurzorji sestavijo v peptidoglikanski skelet.
Glikanska veriga nastane s transglikozilacijo disaharidnih enot, ki je zaradi odsotnosti
energijsko bogatih molekul izven celi�ne membrane energetsko sklopljena z odcepom
baktoprenola (slika 7). Peptidne povezave med glikanskimi verigami se tvorijo
s transpeptidacijo, ki je energetsko sklopljena s cepitvijo vezi med obema D-alaninoma
v MurNAc pentapeptidu. Oba procesa katalizirajo proteini, ki vežejo penicilin (PBP) in so
poglavitne tar�e delovanja �-laktamskih in glikopeptidnih antibiotikov. (6, 9)
Znotrajceli�na stopnja biosinteze peptidoglikana vsebuje mnoge encime, ki so teoreti�no
dobra tar�a za protimikrobne u�inkovine, toda v terapiji njihovih inhibitorjev skorajda ni.
Kot rezervni antibiotik, predvsem za dolo�ene stafilokokne infekcije, se uporablja
fosfomicin, ki zavira sintezo MurNAc iz GlcNAc. D-cikloserin je inhibitor alanin
racemaze in D-alanil-D-alanin ligaze, a se zaradi toksi�nosti uporablja skoraj izklju�no kot
tuberkulostatik. (2)
�
���
��
������������������������
�������� ������������������
���
����
��(�����
�
���
��
����
�������� ������������������
���
����
���
���
��
����
�������� ������������������
���
����
��(�����
��������������������
�
���
��
������������������������
�������� ������������������
����
����
���
����������������"%"�%"�����������& �����'����$����$��$��)�����������(���������#���(�
�
�"���*+���$��)�����������(���������#���(�
Slika 7 — podaljševanje glikanske verige z reakcijo transglikozilacije
13
��� �%������%�%���������!� ��
D-alanil-D-alanin ligaza (Ddl, EC 6.3.2.4) (10) je esencialen encim pri sintezi
peptidoglikana. O pomembnosti Ddl za prokariontsko celico pri�a tudi stroga ohranjenost
njenega zapisa v genomih razli�nih bakterij. Ker poleg tega v eukariontskih celicah
podobnega encima ni najti, predstavlja dobro tar�o za razvoj novih protimikrobnih
u�inkovin.
Ddl katalizira sintezo dipeptida D-alanil-D-alanina, ki je terminalni del UDP-MurNAc
pentapeptida in ima klju�en pomen pri transpeptidaciji peptidoglikana (slika 8). Substrat
za Ddl, D-alanin, tvori iz L-alanina encim alanin racemaza. (11)
Kataliti�no delovanje Ddl je odvisno od prisotnosti ATP. Kataliza poteka po acilfosfatnem
mehanizmu. S fosforilacijo acilne skupine prvega D-alanina nastane acilfosfatni
intermediat, ki se po nukleofilnem napadu drugega D-alanina prek tetraedri�nega
prehodnega stanja pretvori v D-alanil-D-alanin. Stranska produkta reakcije sta ADP in
fosfatni ion.
Aktivnost Ddl je odvisna tudi od prisotnosti kofaktorja – magnezijevega iona. Ta poskrbi
za pravilno orientacijo substrata v aktivnem mestu in z elektrostatskimi interakcijami
stabilizira kompleks med substratom in encimom. (12, 13)
�
�
���
��
�
���
�
�
�
� �
�
���
�
�
�
�
��,
�
��
�
��
�
���
��
�
�����
�- �����
���������������%"�%�$�����$��)����$
���."��"��$��*�
��� ��
Slika 8 — reakcija, ki jo katalizira D-alanil-D-alanin ligaza
14
���� ��������������
Znani sta dve izomorfni obliki encima, DdlA in DdlB, obe izolirani iz Escherichie coli.
Manjši DdlB je za E. coli nujno potreben encim, medtem ko je DdlA neesencialna ligaza.
Obe obliki imata kljub le 35-odstotni homologiji zaporedja aminokislin zelo podobno
kataliti�no aktivnost in substratno specifi�nost ter sta ob�utljivi na iste inhibitorje. (14)
Ker je DdlA, katere kristalna struktura še ni znana, precej slabše raziskana, je bila naša
pozornost usmerjena predvsem v DdlB.
DdlB E. coli (slika 9) sestavlja 306 aminokislin. Razdelimo jo lahko na tri �/� domene:
N-terminalno, centralno in C-terminalno. Na encimu sta dve vezavni mesti za D-alanin:
N-terminalno donorsko vezavno mesto, ki ima visoko specifi�nost za D-alanin, in
C-terminalno akceptorsko vezavno mesto, ki sprejme tudi druge manjše desnosu�ne
kisline. Vezavno mesto za ATP leži med centralno in C-terminalno domeno. (10)
Medtem ko je vezavno mesto za ATP dostopno s površine encima, sta alaninski vezavni
mesti v kristalizirani konformaciji Ddl skriti v notranjosti. Sklepajo, da pride po vezavi
obeh molekul D-alanina do konformacijskega premika znotraj molekule encima in zakritja
dostopne poti, ki v prosti konformaciji seveda mora obstajati.
Slika 9 — struktura D-alanil-D-alanin ligaze (PDB koda 1IOV) Protein je predstavljen v obliki zaobljenih trakov. N-terminalna domena je modre, centralna zelene in C-terminalna rde�e barve. ADP in inhibitor POB sta v obliki pali�ic z atomi ogljika v temno zeleni, dušika v modri, kisika v rde�i in fosforja v turkizni barvi. Magnezijevi ioni so v obliki turkiznih krogel, molekule vode znotraj aktivnega mesta pa v obliki rde�ih kroglic. Vodikovih atomov na sliki ni.
15
Odkrili so ve� mutiranih oblik DdlB, ki v akceptorsko vezavno mesto primarno sprejmejo
druge desnosu�ne kisline: obliki VanA in VanB najmo�neje vežeta D-laktat, VanC pa
D-serin. Posledica tega so spremembe v strukturi terminalnega dela UDP-MurNAc
pentapeptida, kar povzro�i odpornost mutiranih sevov bakterij na vankomicin. (15)
����� &�����������������
Aktivno mesto D-alanil-
D-alanin ligaze obsega vsa
tri zgoraj omenjena vezavna
mesta. Je dokaj ozko in
podolgovato (slika 10),
magnezijev ioni pa ga delijo
na dva dela. V ve�jem delu
(v centralni domeni) leži
vezavno mesto za ATP,
medtem ko sta obe vezavni
mesti za D-alanin v manjšem
delu aktivnega mesta.
Z ligandi lahko tvorijo vezi samo tiste aminokisline, ki imajo vsaj del zunanje površine
v aktivnem mestu – naj bo to stranska veriga ali peptidna vez (tabela I, slika 11).
Tabela I — aminokisline na površini aktivnega mesta DdlB (pomembnejše so tiskane krepko) vezavno mesto ATP donorsko akceptorsko
kisle stranske verige Ser151, Glu180, Glu187 Glu15, Glu68 Tyr216, Ser281
bazi�ne str. verige Lys97, Lys144 His63 Lys215, Arg255
hidrofobne str. verige Ile142, Trp182, Leu183, Leu269 Val18, His63 Tyr210, Tyr216, Leu282
peptidne vezi Ser151, Lys181, Leu183, Tyr210 Ser150 Gly276, Ser281, Leu282
S kofaktorskimi magnezijevimi ioni tvorijo vezi aminokisline Asp257, Glu270, Ala271 in
Asn272 (slika 12). Ob odsotnosti Mg2+ lahko seveda tudi te prispevajo k interakcijam
z ligandi.
Slika 10 — ponazoritev oblike aktivnega mesta Ddl s pomo�jo petdesetih vanj sidranih ligandov
16
Slika 11 — pomembnejše aminokisline v aktivnem mestu DdlB Osnovna veriga proteina je predstavljena v obliki sive cevi. Aminokisline, ki sodelujejo pri vezavi
ligandov s svojimi peptidnimi vezmi, imajo svoj odsek osnovne verige v zeleni barvi. Stranske verige kislih aminokislin so obarvane rde�e, bazi�nih modro in hidrofobnih rumeno.
Slika 12 — vezi, ki jih tvorijo magnezijevi ioni v aktivnem mestu DdlB Ioni Mg2+ so predstavljeni v obliki turkiznih krogel. ADP in inhibitor POB sta v obliki pali�ic
z atomi ogljika v zeleni, dušika v modri, kisika v rde�i in fosforja v turkizni barvi. Stranske verige aminokislin so prav tako v obliki pali�ic, le da so njihovi ogljiki obarvani belo.
17
����� $���������������������
D-cikloserin (slika 14) je edini inhibitor Ddl, ki se je kdaj uporabljal v terapiji (danes je
v redni uporabi le še kot tuberkulostatik). Kot cikli�ni analog alanina ima zaradi rigidne
strukture mo�no afiniteto do vezavnih mest za alanin tako v D-alanil-
D-alanin ligazi kot tudi v alanin racemazi in je kompetitivni inhibitor
obeh omenjenih encimov. Neželeni toksi�ni u�inki omejujejo uporabo
D-cikloserina na izjemne primere, ko druge protimikrobne u�inkovine
odpovedo. Zaradi nevrotoksi�nosti, predvsem zaradi povzro�anja
konvulzij, je kontraindiciran pri psihoti�nih in epilepti�nih bolnikih. (2)
Kot potencialne inhibitorje Ddl so preizkusili že mnogo
fosfinatnih, fosfonatnih in fosfonamidnih analogov
tetraedri�nega prehodnega stanja pri sintezi D-alanil-
D-alanina (slika 15). Te spojine in vitro zelo dobro
zavirajo Ddl, in vivo pa ne dosegajo želene
protibakterijske aktivnosti. Njihovo delovanje onemo-
go�a predvsem po�asen prehod bakterijske celi�ne stene
in plazmaleme. (16)
Zadnja leta se je pojavilo nekaj obetavnih novih inhibitorjev Ddl, ki služijo predvsem kot
spojine vodnice za nadaljnje raziskovanje (slika 16). Leta 2005 je Fishwick s sodelavci s
pomo�jo ra�unalniškega de novo na�rtovanja molekul pripravil ciklopropanski inhibitor.
(17) Nedavno so s pomo�jo visokozmogljivostnega rešetanja odkrili alosteri�ni inhibitor
Ddl iz Staphylococcusa aureusa in ga kokristalizirali z encimom. (18)
�
��
���,
Slika 14 — D-cikloserin
(IC50 = 314 µM)
���
�
!
�
� � /
�
Slika 15 — splošna formula analogov prehodnega stanja Ddl
z zaviralnimi lastnostmi (Y = -CH2- ali -O- ali -NH-)
<
0<�
<
0<
2�
=
=
=
Slika 16 — levo ciklopropanski, desno alosteri�ni inhibitor D-alanil-D-alanin ligaze
18
Pred kratkim je bil objavljen �lanek, v katerem so inhibitorje Ddl iskali med spojinami
s strukturami, zna�ilnimi za zaviralce proteinskih kinaz. Tudi ta pristop, kompetitivna
inhibicija na vezavnem mestu za ATP, je dal nekaj dobrih kandidatov za nadaljnji razvoj
(19) (slika 17).
Na Fakulteti za farmacijo izvajajo rutinske in vitro preizkuse novo sintetiziranih spojin
na encimu DdlB. Med testiranjem doma�e knjižnice spojin so ugotovili, da nekateri
diazendikarboksamidi u�inkovito zavirajo Ddl. Z optimizacijo so prišli do inhibitorjev,
ki na encimskih testih dosegajo ob�utno boljše rezultate kot D-cikloserin (15) (slika 18).
��
� ��
����
��
��
� ��
��� �
� �
Slika 17 — zaviralca proteinskih kinaz z dobro aktivnostjo na Ddl Levo LFM-A13 (Ki = 185 µM), desno LFM-A13-19 (Ki = 60 µM)
��
�
�
� ��
�
�
��
�
�
� ��
�
�
��
�
�
� ��
�
�
��
�
�
� ��
�
�
��
��
�
�
� ��
�
�
��
��
�
�
� ��
�
�
0��&/���1'
0��
0��
0��
0��
0%�
Slika 18 — primeri diazendikarboksamidnih zaviralcev D-alanil-D-alanin ligaze Vrednosti IC50 v µM: 6cB 111, 6cC 36, 6cD 106, 6eC 15, 6eD 33, 6fD 73.
19
Tudi nekatere druge spojine iz doma�e knjižnice so po mo�i inhibicije Ddl pri encimskem
preizkusu primerljive z D-cikloserinom (slika 19). Kasneje jih bomo skupaj z neaktivnimi
spojinami uporabili pri poskusnem rešetanju.
�
��
�
�
� ��
�
��
�
��
�
�
� ��
�
�
��
�
�
� ��
�
��
� �
�
��
�
�
��
��
��
��
��
��
�
�
�
�
�
�,� ��
,
�� ��
��
�
�
�� ��
2
��
� �
�
�
�,�
2
��
� �
�
�
�
2
��
� �
�
�
��
2
��
� �
�
�
��,
2
��
� �
�
�
2
��,
� �
2
��
� �
�
��
�
��
2
��
� �
�
��
�
�,�
2
��
� �
�
��
�� ��,
2��345
2��046
2��313
���10
�7�381
�7�451
�/ 430
�/ 406
�/ ,45
�/ ,41
�/ �,9
��7�0
��734
��:�1���%�
Slika 19 — drugi inhibitorji Ddl iz doma�e knjižnice spojin z vrednostjo IC50 pod 350 µµµµmolL-1
20
��' �����������������������������������������
Vse ve�jo potrebo po novih u�inkovinah skušajo znanstvene inštitucije in farmacevtska ter
biotehnološka industrija zadnja leta zadovoljiti tudi s pomo�jo ra�unske kemije in
molekularnega modeliranja. Cilj teh metod je ustvariti ra�unalniške modele in simulacije,
ki bodo uspešno napovedovali, razlagali in ocenjevali lastnosti molekul in njihove
interakcije. S tem bi skrajšali proces razvoja zdravil ali vsaj zmanjšali obseg
laboratorijskega dela v vseh njegovih fazah. V ospredju prizadevanj je preu�evanje vezave
malih ligandov na posamezne makromolekulske tar�e, predvsem na presnovne encime.
(20)
Na�rtovanje zdravilnih u�inkovin se pri�ne z identifikacijo makromolekulske tar�e, ki igra
pomembno vlogo pri dolo�enem patofiziološkem procesu. Sledi odkrivanje zadetkov,
t.j. ligandov, ki se na tar�o dobro vežejo. Z derivatizacijo in optimizacijo fizikalno-
kemijskih lastnosti zadetkov dobimo spojine vodnice, ki imajo boljšo aktivnost, ve�jo
selektivnost in primernejši farmakokineti�ni profil kot zadetki sami. Spojine vodnice
nadalje optimiziramo v predklini�nih študijah in le najboljše kandidatke napredujejo
v preizkusna zdravila, s katerimi izvajamo klini�ne preizkuse, kjer potrjujemo (ali
ovržemo) njihovo zanesljivost, varnost in u�inkovitost. (21)
Poleg ra�unske mo�i ra�unalnikov, ki nam omogo�a vse natan�nejše izra�une obnašanja
kompleksnih modelov makromolekul v razumnih �asovnih okvirih, so napredovale tudi
eksperimentalne tehnike za dolo�anje tridimenzionalnih molekulskih struktur
(npr. rentgenska kristalografija). Ker je znanih vse ve� struktur terapevtsko zanimivih
proteinov, je smiselno to znanje uporabiti za odkrivanje novih ligandov, ki se bodo vezali
v njihova aktivna mesta in vplivali na njihovo delovanje. Tak pristop imenujemo
strukturno podprto na�rtovanje u�inkovin. Pri tem imamo dve možnosti:
• na�rtovanje povsem nove molekule, ki jo gradimo znotraj aktivnega mesta
ra�unalniškega modela encima (de novo design),
• virtualno rešetanje ve�jega števila že znanih ligandov, s katerim zožimo nabor
kandidatk za laboratorijsko preizkušanje na peš�ico spojin, ki so se v ra�unski
simulaciji na encim najmo�neje vezale. (20, 21)
21
��'� ����������������������������� ���������������������
Ra�unski postopek, ki simulira medsebojno vezavo molekul in ovrednoti njeno uspešnost,
imenujemo sidranje (docking). Receptor je navadno makromolekula (najve�krat protein),
druga molekula je manjša organska spojina – ligand. Možno je tudi medsebojno sidranje
makromolekul, a to pri na�rtovanju zdravilnih u�inkovin nima posebno velikega pomena.
Najpogosteje sidranje ligandov v vezavno mesto encima uporabljamo z namenom
virtualnega rešetanja oziroma prepoznavanja zadetkov v knjižnici spojin. Kasneje, med
optimizacijo spojine vodnice, so podobni izra�uni koristni za hitro oceno, kako dolo�ena
sprememba v strukturi molekule vpliva na njeno aktivnost, preden spremenjeno spojino
sploh sintetiziramo. (20)
Receptor je lahko med sidranjem ponazorjen z atomi, površino ali afinitetno mrežo.
Atomski model je zaradi množice medatomskih interakcij zelo okoren za hitre izra�une,
površinski model pa je primeren predvsem za ocenjevanje medsebojnih interakcij
makromolekul. Afinitetna mreža povzame steri�ne in elektronske lastnosti atomov
receptorja v obliki tridimenzionalne mreže to�k z dolo�enimi potencialnimi energijami,
v kateri nato poteka sidranje na principu iskanja najugodnejše lege konformacije liganda
na danem energetskem profilu.
Sidranje je sestavljeno iz dveh ra�unskih procesov:
• Napovedovanje lege liganda v vezavnem mestu (posing). Algoritem mora hitro,
vendar temeljito preiskati translacijski, orientacijski in konformacijski prostor liganda
ter ugotoviti, ali se posamezen konformer prilega v vezavno mesto ali ne. Le redke
metode upoštevajo fleksibilnost makromolekule, ki je z ra�unskega stališ�a izjemno
zahteven proces.
• Vrednotenje afinitete (scoring). Algoritem poda oceno proste energije vezave liganda
v vezavno mesto. Dobljena števil�na vrednost je osnova za rangiranje zadetkov pri
virtualnem rešetanju. Zaradi mnogih približkov pri ra�unanju energijske funkcije je
vrednotenje afinitete najšibkejši �len v verigi procesov sidranja. (21)
22
Metode za iskanje konformacij liganda so lahko sistemati�ne, stohasti�ne (naklju�ne) ali
simulacijske. Sistemati�ne metode skušajo zajeti vse možne konformacije, kar postane
pri molekulah z veliko prostostnimi stopnjami neracionalno. Simulacijske metode
(molekulska dinamika, minimiziranje notranje energije) so primerne predvsem za iskanje
lokalnih minimumov, višjeenergijskih barier pa v razumnem �asu ne zmorejo premagati.
Najve�krat zato uporabljamo stohasti�ne metode na osnovi naklju�nega spreminjanja
konformacij ligandov (primera sta algoritem Monte Carlo in genetski algoritem).
Najprodornejša je kombinacija: s stohasti�no metodo u�inkovito preiš�emo konformacijski
prostor liganda, nakar s simulacijsko metodo poiš�emo lokalni minimum predlagane poze.
Vrednotenje afinitete pri vezavi liganda najpogosteje opravimo na osnovi ena�be polja sil,
ki podaja razli�ne tipe medatomskih interakcij med receptorjem in ligandom, katerih
kon�ni seštevek je napovedana vezavna energija liganda v aktivnem mestu receptorja.
Druga možnost je empiri�no vrednotenje vezave liganda, ki temelji na eksperimentalnih
podatkih o vezavi homolognih spojin oziroma njihovih fragmentov, katerim smo poprej
z regresijsko analizo dolo�ili energijske prispevke. Slabost obeh metod je zanašanje
na približke, vsaka pa ima tudi svoje prednosti: za ra�unanje v polju sil ne potrebujemo
kopice empiri�nih podatkov, empiri�no vrednotenje pa je ra�unsko manj zahtevno in zato
hitrejše. (21)
23
��'�� �������������������������������������������������
Virtualno rešetanje (virtual screening) na osnovi strukture proteina je obogatitvena
metoda, ki iz množice molekul izluš�i tiste, za katere je najbolj verjetno, da se bodo
na protein z znano strukturo dobro vezale. Ker od naklju�nih ligandov, ki kemijsko
ve�inoma niso sorodni substratu proteina, ne gre pri�akovati, da bodo ob vezavi v aktivno
mesto imeli tudi intrinzi�no aktivnost, s to metodo najpogosteje iš�emo zaviralce
proteinov. (20)
Osnova za razvrstitev molekul po napovedani aktivnosti je vrednotenje vezavnih energij
njihovih sidranih konformacij. Zaradi že omenjenih približkov pri izra�unavanju vezavnih
energij dobimo boljše rezultate (oz. nižje energije) pri ligandih z višjo molsko maso in
manjšim številom vrtljivih vezi ter pri proteinih z bolj hidrofobnimi vezavnimi mesti.
Ker cilj virtualnega rešetanja ni natan�na lestvica zadetkov od najboljšega do najslabšega,
ampak samo zožitev nabora kandidatov, daje metoda kljub mnogim približkom zelo dobre
rezultate. Seveda pa se moramo zavedati, da bomo pri virtualnem rešetanju neizogibno
dobili lažne pozitivne in lažne negativne zadetke. (21)
Predpogoj za virtualno rešetanje je obsežna virtualna knjižnica �im bolj raznolikih spojin,
s katerimi pokrijemo �im ve�ji delež vseh možnih tipov molekul. Ena od prosto dostopnih
virtualnih knjižnic, ki zadostuje temu pogoju, je NCI Diversity Set (razli�nostni nabor
spojin Ameriškega inštituta za raziskovanje raka). V njem je 1990 spojin, izbranih izmed
preko 140.000 spojin kot njihove predstavnice z unikatnimi ogrodji. (22) Poleg tega NCI
omogo�a dostop do vzorcev vseh 1990 spojin, s �imer je možno preizkušanje aktivnosti
zadetkov pri virtualnem rešetanju brez dolgotrajnih in številnih sinteznih postopkov.
24
��( ��!��������������&�����#��
Za uspešno izvedbo virtualnega rešetanja potrebujemo preizkušeno programsko opremo.
AutoDock je priljubljeno in prosto dostopno orodje za sidranje ligandov v receptorje.
Deluje v operacijskem sistemu Linux.
AutoDock za predstavitev proteina uporablja afinitetno mrežo, za vrednotenje afinitete
pri vezavi ligandov polje sil AMBER, za iskanje po konformacijskem prostoru liganda pa
ima vgrajenih ve� metod, od katerih daje najboljše rezultate lamarckovski genetski
algoritem. AutoDock 4.0 ima tudi možnost sidranja v fleksibilen model proteina. (23)
��(� ���������&)"*+�
AMBER je družina ena�b polja sil, prirejenih za opis vezavnih energij biomolekul.
AutoDock uporablja posebej za sidranje ligandov v receptorje prirejeno razli�ico ena�be,
sestavljeno iz petih �lenov:
( ) ( )2 2
12 6 12 10, ,
/2
, ,
ij
ij
ij ij ij ijvdW hbond t hbond
i j i jij ij ij ij
ri jelec tor tor desol i j j i
i j i jr ij
A B C DG G G E E
r r r r
q qG G N G S V S V e
rσ
ε−
� � � �∆ = ∆ − + ∆ − + +� � � �� � � �
� � � �
+∆ + ∆ + ∆ +
� �
� �
Prvi �len predstavlja energijski prispevek steri�nih interakcij, predvsem odbojnih sil med
pari atomov liganda in receptorja. Drugi �len opiše energije vodikovih vezi, tretji pa
elektrostatske interakcije med pari atomov. �etrti �len oceni prispevek omejene gibljivosti
liganda in vrtljivosti njegovih vezi pri sidrani konformaciji. Zadnji �len skuša zajeti vpliv
desolvacije in hidrofobnega efekta pri vezavi liganda v receptor. Vrednosti konstant,
prisotnih v ena�bi, so izbrali z linearno regresijo na osnovi empiri�nih podatkov. Ena�ba
daje zadovoljiv opis za vezavo široke palete ligandov in receptorjev, za specifi�ne primere
pa AutoDock omogo�a, da vrednosti njenih konstant po potrebi priredimo. (23, 24)
25
��(�� ,����#�������!����������!�������
AutoDock za iskanje po translacijskem, orientacijskem in konformacijskem prostoru
liganda uporablja kombinacijo klasi�nega genetskega algoritma, ki z mutacijami genotipa
iš�e globalno, in adaptivnega simuliranega ohlajanja, ki poskrbi za iskanje lokalnega
minimuma. Simulirano ohlajanje namre� z zmanjševanjem temperature med simulacijo
omejuje svoj doseg na vse manjše podro�je iskanja, pri tem pa adaptivna metoda še
prilagaja velikost naslednjega koraka glede na uspešnost prejšnjih. (23)
Genetski algoritmi so skupek stohasti�nih
metod za reševanje zapletenih problemov,
ki se pri iskanju to�nih ali približnih rešitev
poslužujejo na�el evolucijskih pritiskov in
preživetja najsposobnejših. (25)
Pri ligandu dolo�imo genotip kot stanje
spremenljivk, ki opisujejo translacijo in
orientacijo molekule v afinitetni mreži ter
torzijske kote njenih vrtljivih vezi. Fenotip
so koordinate atomov liganda, iz katerih
nato AutoDock izra�una sidrano energijo.
Pri lamarckovskem genetskem algoritmu se uspešni rezultati (navadno fenotipskega)
iskanja lokalnih minimumov prenesejo v genotip z inverznim mapiranjem in dedujejo
v naslednje generacije (slika 20). Posebnost AutoDockovega algoritma je, da iskanje
lokalnih minimumov poteka s spreminjanjem genotipa, ne fenotipa, zaradi �esar inverzno
mapiranje ni potrebno.
AutoDockov algoritem pri vsakem sidranju najprej ustvari naklju�no populacijo osebkov
(števil�nost dolo�i uporabnik), nakar cikli�no izra�unava stanja novih generacij, dokler ne
doseže maksimalnega števila generacij ali maksimalnega števila ocen uspešnosti osebkov.
Takrat AutoDock zapiše energijo sidranja, koordinate atomov sidrane konformacije
liganda in predvideno vezavno energijo. AutoDock za vsak ligand izvede vnaprej dolo�eno
število sidranj.
Slika 20 — shema delovanja genetskih algoritmov levo lamarckovsko, desno klasi�no iskanje
26
Znotraj generacije pri LGA potekajo naslednje operacije:
• mapiranje (mapping) – izra�un fenotipa iz danega genotipa;
• ocenjevanje uspešnosti osebka (fitness) – izra�un skupne energije inter- in
intramolekularnih interakcij liganda s proteinom;
• naravni izbor (selection) – dolo�anje, kateri osebki se bodo razmnoževali, glede na
njihovo oceno uspešnosti;
• križanje (crossover) – menjava celotnih genov med naklju�no izbranima osebkoma,
ki nato zamenjata svoja „starša” v populaciji, �emur sledi nova ocena uspešnosti;
• mutacija – prištevanje naklju�no izbranega števila po Cauchyjevi distribuciji
naklju�no izbranemu genu v naklju�no izbranem osebku, �emur sledi nova ocena
uspešnosti;
• iskanje lokalnega minimuma z adaptivnim simuliranim ohlajanjem; vsakemu
koraku sledi mapiranje in ocena uspešnosti;
• elitisti�na selekcija – v naslednjo generacijo preživi le vnaprej dolo�eno število
najuspešnejših osebkov. (23)
27
' -����������
Cilj diplomske naloge je z metodo virtualnega rešetanja s pomo�jo programa AutoDock
odkriti še nepoznane zaviralce encima Ddl, ki bodo prekurzorji potencialnih spojin vodnic
za nove protimikrobne u�inkovine.
• Izvedli bomo kontrolno sidranje inhibitorja � �, ki je bil prisoten v aktivnem mestu
encima pri dolo�anju kristalne strukture. Sidrano konformacijo � � bomo primerjali
s kristalizirano in s tem preverili pravilnost nastavitev AutoDocka ter njegovo
zanesljivost pri napovedovanju lege ligandov v aktivnem mestu.
• Na dveh razli�icah modela encima bomo poskusno rešetali doma�o knjižnico spojin,
katerih aktivnost na Ddl že poznamo. Tako bomo ugotovili, katera razli�ica je
za virtualno rešetanje ve�jega števila ligandov najprimernejša. Predvsem nas bo
zanimal vpliv prisotnosti magnezijevih ionov v aktivnem mestu.
• Napisali bomo nekaj ukaznih datotek, s katerimi bomo delno avtomatizirali tako
pripravo datotek za virtualno rešetanje z AutoDockom kot tudi zajem njegovih
rezultatov.
• Virtualno bomo rešetali spojine iz ve�je knjižnice spojin (NCI Diversity Set), rezultate
rangirali in pri najboljših zadetkih vizualno preverili primernost sidranih poz
v aktivnem mestu.
• S kolorimetri�no detekcijo fosfatnega iona, ki je eden od produktov reakcije, ki jo
katalizira Ddl, bomo in vitro preizkusili dejansko aktivnost najboljših zadetkov
virtualnega rešetanja.
• Pregledali bomo poze dejansko aktivnih spojin in razložili njihove interakcije
z vezavnim mestom encima.
• Spojine z najboljšo aktivnostjo in vitro bomo preizkusili tudi mikrobiološko in jim
dolo�ili minimalno inhibicijsko koncentracijo.
28
( )�������������������
Ve�ino ra�unalniških procesov od priprave spojin za sidranje do zajema rezultatov
virtualnega rešetanja smo opravili v operacijskem sistemu Linux na ra�unalnikih
Laboratorija za molekularno modeliranje in NMR spektroskopijo na Kemijskem inštitutu
v Ljubljani. Virtualna rešetanja smo izvajali na gru�i vzporednih ra�unalnikov VRANA
na Kemijskem inštitutu.
Ra�unalniške slike molekul smo pripravili s programom UCSF Chimera. (26)
(� ������������������������ �&�����#����
AutoDock 4 potrebuje za izvedbo sidranja encim in ligand v formatu ���0�, v katerem so
standardnim podatkom formata ��� dodani naboji (0) in oznake vrst atomov (� – type).
Druge potrebne datoteke generirata programa AutoDock Tools (ADT) in AutoGrid. Ker je
naše delo obsegalo mnogo sidranj in s tem množico potrebnih datotek, smo morali
postopek sidranja, opisan v navodilih za uporabo AutoDocka (27), temu primerno
prilagoditi.
(�� .�������������������!��������������
Spojine iz doma�e knjižnice smo ro�no zrisali v programu HyperChem 7.5 for Windows.
Minimizirali smo jih z algoritmom Fletcher-Reeves. Shranili smo jih v formatu ����,
ki uporablja enake specifikacije kot format ���. Ker AutoDock kon�nice ���� ne
prepozna, smo jo morali med shranjevanjem vsake datoteke spremeniti.
Za pretvorbo ligandov v format ���0� smo uporabili ADT. Z ukazom .�&���2)32����2
)32 �� smo odprli datoteko ���, nakar je ADT samodejno dodal Gasteigerjeve naboje,
odstranil nepolarne vodike in dolo�il vrste atomov.
Model molekule smo nato ro�no pregledali in popravili morebitne napake samodejnega
algoritma, kot sta na primer ob�asno napa�no prepoznavanje aromatskih ogljikov in
fleksibilnosti amidnih skupin. Pregledali smo vrtljivost vseh vezi in v nekaterih primerih
(npr. pri diazendikarboksamidih) onemogo�ili vrtljivosti vezi, na katerih je možna
tavtomerija.
29
Datoteko liganda smo shranili v formatu ���0� in postopek ponovili za vseh 120 spojin
iz doma�e knjižnice.
(��� �������������������!������� �-/0���������1������
Med spojinami iz NCI Diversity Seta je prek sto takšnih, ki vsebujejo eksoti�ne kemijske
elemente ali pa so zanje dokazali, da njihova dolo�ena struktura ne ustreza dejanski. Te
težavne spojine smo zato izklju�ili iz rešetanja z uporabo seznama &������4�, ki je
vklju�en v arhiv datotek NCI Diversity Seta, pripravljenih za delo z AutoDockom (28).
NCI Diversity Set vsebuje ligande v formatu ���0, s katerim je potekalo sidranje
v starejših verzijah AutoDocka. Pretvorbo v format ���0� smo izvedli z ukazno datoteko
��������&�����5, ki je del programskega paketa AutoDock Tools. Ker je ukazna
datoteka omejena na pretvarjanje enega samega liganda, smo množi�no pretvorbo spojin
iz NCI Diversity Seta sprožili z naslednjim ukazom:
��2�2��26�427���0682��2��9�2:�825�9��492��������&�����52;�2:�2;�2
:�<�<82����2
(��� ������������������#����
Iz spletne baze struktur makromolekul RCSB smo prenesli datoteko �� ���� s kristalno
strukturo encima DdlB, posneto v lo�ljivosti 2.2 Å. (10) Ker je v njej polno podatkov,
ki jih za sidranje ne potrebujemo, smo datoteko pre�istili. Iz nje smo v tekstovnem
urejevalniku izbrisali vse vrstice, ki se ne za�nejo z �� (atomi apoencima), �!" (konec
verige) ali $!��� (neaminokislinski atomi). Nepotrebni so še atomi koencima =���>,
inhibitorja =� �> in vode =$ $>, zato smo izbrisali tudi te. Preostale vrstice s koordinatami
atomov apoencima in magnezija smo shranili v datoteko �� �������. Za drugo razli�ico
encima smo izbrisali tudi vrstice z magnezijevimi ioni = (> in preostanek – apoencim –
shranili kot �� ������. Postopek priprave encima in ligandov smo od te to�ke naprej
izvedli za vsako razli�ico encima posebej.
Pre�iš�eno datoteko smo odprli v programu ADT z ukazom %���2)32"���2 �������.
Nato smo dodali vse atome vodikov, ki jih sicer v datotekah encimov ni, za pripravo
na sidranje pa so nujno potrebni. Ko smo izbrali encim za pripravo afinitetne mreže =(���2
)32 ������������2)32'9��4�>, mu je program samodejno dodal Gasteigerjeve naboje,
odstranil nepolarne vodike, dolo�il vrste atomov in odprl okno za shranitev datoteke
v formatu ���0�.
30
(��' ���������2������������3������!��������!����������#����
Po tem, ko smo v ADT izbrali encim za pripravo afinitetne mreže, smo morali dolo�iti,
katere atome imajo naši ligandi. Ker smo nameravali isto datoteko encima in isto afinitetno
mrežo uporabiti za sidranje množice ligandov, smo morali vklju�iti vse atome, ki jih naši
ligandi vsebujejo. Zato smo vrste atomov dolo�ili direktno =(���2)32/��2 �2�5�42)32
�������5>. Ponujenim atomom =�?2'?2$�?2+?2+�?2 �?2/�> smo dopisali še $?2%?2�?2
/?2 '�?2 ��2 in2 �. AutoDock 4 namre� lo�uje aromatske ogljike =�> od alifatskih ='>,
atome s sposobnostjo sprejemanja vodikovih vezi =+�?2 �?2/�> od tistih brez nje =+?2/>
in vodike, ki lahko tvorijo H-vezi =$�>, od tistih, ki je ne morejo =$>.
V oknu, ki ga odpre ukaz (���22
)32 (���2 ��@ (slika 21), smo
dolo�ili število to�k v mreži (64 ×
68 × 94), razdaljo med njimi
(privzeta vrednost je 0.375) ter
koordinate središ�a mreže
(x = 16.0, y = 7.0, z = 43.0).
Nastavitve smo shranili
v datoteko �&, ki jo lahko
naknadno še urejamo v tekst-
ovnem urejevalniku. V našem
primeru smo ro�no popravili
razdaljo med to�kami na 0.300.
Afinitetne mreže za posamezne medatomske interakcije izra�una AutoDockov
spremljevalni program AutoGrid. Zagnali smo ga iz ukazne vrstice v mapi, v katero smo
skopirali eno od razli�ic encima in njej pripadajo�o datoteko �&. AutoGrid ustvari
po eno datoteko z afinitetnimi podatki za vsako zgoraj dolo�eno vrsto atoma; eno
za elektrostatske interakcije, eno za desolvacijo in tri manjše kontrolne datoteke.
Vse naštete datoteke potrebujemo kasneje za uspešen zagon AutoDocka.
Slika 21 — priprava afinitetne mreže v programu ADT
31
(��( ���������������������������� �����������
Za zagon AutoDocka potrebujemo tudi datoteko ��, ki je specifi�na za posamezen
ligand in vsebuje parametre algoritma za sidranje. Ker virtualno rešetanje pomeni veliko
število ligandov, smo po navodilih kreirali le en ��, ga pretvorili v vzor�no datoteko in
napisali ukazno datoteko, ki je iz vzor�ne samodejno generirala ��-je za vse ligande,
prisotne v trenutni mapi.
V programu ADT smo v meniju ������& izbrali želeno makromolekulo (brez fleksibilnih
stranskih verig) in poljuben ligand. Parametrov nismo spreminjali, ker smo jih prikrojili
naknadno v vzor�ni datoteki. Le-to smo zapisali z ukazom ������&2 )32 ����2 )32
.���������2(� in jo poimenovali ��������. Nato smo jo v tekstovnem urejevalniku
priredili za potrebe rešetanja, in sicer smo:
• vrstico, kjer so naštete vrste atomov v ligandu, zamenjali z naslednjo:
��&�����5�42$2$�2'2�2+2+�2 �2%2�2/�2/2'�2��2�2A2��&���2����2�5�42
• vrstice, ki dolo�ajo datoteke z afinitetnimi parametri za posamezne vrste atomov,
zamenjali z naslednjimi (pri razli�ici encima z magnezijevimi ioni so se imena datotek
za�ela z '�� ����'):
��2�� ����$���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����$����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����'���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����+���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����+����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ���� ����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����%���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����/����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����/���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����'����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ���������22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
32
Izmed parametrov sidranja smo spreminjali samo dva, s katerima smo izboljšali tako
iskanje konformacije liganda kot tudi ra�unanje njegove vezavne energije:
• število energijskih vrednotenj smo pove�ali s poltretjega na štiri milijone:
&����������42�------2222222222222A2��@����2������2�2����&52����������42
• število poskusov sidranja na ligand smo pove�ali z deset na sto:
&�����2�--222222222222222222222222222A2��2�9�42���5295����2(�;./2���42
Tako spremenjeno datoteko �������� (priloga 1) smo shranili. Zdaj smo morali
poskrbeti še za štiri vrstice, odvisne od posameznega liganda =����?2�����?2���9�2 in2
���4��>. V skriptnem jeziku AWK smo napisali ukazno datoteko ��� (priloga 2), ki
iz vzor�nega ��-ja in liganda v formatu ���0� samodejno generira datoteko ��
za želeni ligand.
Ker ��� ustvari le eno datoteko naenkrat, smo si pri pretvarjanju množice ligandov
pomagali z ukazom:
��2�2��26�427���0�682��2��9�2:�82�B���2:�23:���82����2
Tako smo vsaki datoteki ���0� v trenutni mapi generirali pripadajo� ��. Ker sta si
vzor�na ��-ja pri obeh razli�icah encima razli�na, smo morali posebej kreirati datoteke
�� za �� ��� in �� ���� in jih zaradi identi�nih imen datotek tudi strogo lo�evati.
33
(�� $�!���&�����#���
Za zagon (nefleksibilnega) sidranja z AutoDockom 4.0 potrebujemo v mapi, kjer sidranje
izvajamo, datoteki ���0� encima in liganda, datoteko �� liganda, in vse datoteke, ki jih
je kreiral AutoGrid. Pri virtualnem rešetanju so bile v isti mapi seveda prisotne datoteke
���0� in �� ve� ligandov. Ker AutoDock sidra vsak ligand posami�no in pri tem ne
zna izkoriš�ati ve�procesorskih sistemov, smo ligande razvrstili v ve� map in jih tako
razvrš�ene sidrali na ve� procesorjih hkrati. Datoteke �� v posamezni mapi smo želeli
sidrati zaporedno, zato smo AutoDock zagnali z naslednjim ukazom:
��2�2��26�427��682��2��9�2:�82���������2;2:�2;�2:����&82����2
Ker je sidranje z AutoDockom dolgotrajen proces, smo se njegovi morebitni ustavitvi
ob odjavi uporabnika iz sistema izognili tako, da smo pred zagonom AutoDocka uporabili
Linuxov ukaz 4�����.
(��� ������������������ �&�����#����
Za vsa sidranja, ki smo jih izvedli, smo uporabili lamarckovski genetski algoritem (LGA)
z naslednjimi parametri:
• velikost populacije: 150 osebkov,
• maksimalno število energijskih ocen: 4000000,
• maksimalno število generacij: 27000,
• število osebkov, ki preživijo v naslednjo generacijo: 1,
• stopnja mutacije: 0.02,
• stopnja križanja: 0.8,
• število sidranj: 100,
• za�etni položaj in konformacija: naklju�na.
Vsi uporabljeni parametri so vidni v vzor�ni datoteki �� (priloga 1).
34
(�� �������� ��������������� ��� ���������������
Rezultat sidranja z AutoDockom je datoteka ���&, v kateri so shranjeni parametri sidranja,
podatki o poteku sidranja, vse dobljene poze – v našem primeru sto za vsak ligand –
in kratka analiza. Z metodo merjenja skupne napake (RMSD) med koordinatami atomov
dobljenih poz AutoDock le-te združi v razrede (clusters) s konformacijami, pri katerih se
koordinate atomov razlikujejo za manj kot 2 Å. Rezultate analize proti koncu datoteke
���& vidimo v preglednem histogramu (slika 22).
2
2 '.1/�!"�+(2$�/� ("� 2
2 ��������������������2
2
��������������������������������������������������������������������������������2
22222C22222222222C22222C22222222222C22222C2222222222222222222222222222222222222
'��42C2.�D�4�2222C2"��2C2 ���222222C2+��2C2$�4��&���222222222222222222222222222
;���2C2������&222C22222C2������&222C2��22C2222222222222222222222222222222222222
"���2C2!���&52222C22222C2!���&52222C2'��4C2222,2222�-222�,222E-222E,222F-222F,2
�����C�����������C�����C�����������C�����C����G����C����G����C����G����C����G���2
222�2C22222;H�,E2C22EI2C22222;��J,2C22��2CAAAAAAAAAAA2
222E2C22222;���K2C22F�2C22222;F�,,2C222J2CAAAAAAAA2
222F2C22222;F�IF2C22�I2C22222;F�-�2C222I2CAAAAAAAAA2
222�2C22222;F��J2C22,�2C22222;F�-E2C22H�2CAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA2
222,2C22222;F���2C22E,2C22222;F�-F2C222F2CAAA2
222H2C22222;F�E�2C22I�2C22222;F�E�2C222�2CA2
222K2C22222;F��-2C22H�2C22222;E�JH2C222�2CAAAA2
222J2C22222;E��K2C22H�2C22222;E��K2C222�2CA2
222I2C22222;E���2C22��2C22222;E���2C222�2CA2
22�-2C22222;E�FJ2C22F�2C22222;E�FJ2C222�2CA2
�����C�����������C�����C�����������C�����C��������������������������������������2
2
+�����2�2�����;������2�������������2���4���42����2L2H?2���2�2�--2���4�2
Slika 22 — primer histograma v AutoDockovi datoteki z rezultati sidranj
35
Datoteke ���& so izjemno velike (pri upoštevanju zgoraj naštetih parametrov sidranja ima
vsaka okrog 20.000 tekstovnih vrstic), iz njih pa navsezadnje potrebujemo le peš�ico
podatkov. Zato smo napisali ukazno datoteko ������ (priloga 3), ki iz posamezne datoteke
���& izluš�i relevantne podatke in jih strne v eno tekstovno vrstico.
Ukazna datoteka iz datoteke ���& zajame energijske podatke iz zgoraj omenjenega
histograma in preveri, ali je sidrana poza res prisotna v aktivnem mestu encima. �e zazna,
da je poza izven aktivnega mesta, se namesto enote napovedane inhibicijske konstante
izpiše besedica 1�. Meje aktivnega mesta smo dolo�ili z vizualnim pregledom encima in
so v ukazno datoteko ro�no vpisane, zato bi jo bilo treba za uporabo na drugem encimu
prirediti. Obe naši razli�ici encima sta bili izpeljani iz iste osnovne datoteke, zato so imeli
atomi v obeh enake koordinate in prirejanje ni bilo potrebno.
Ker ������ generira le vrstico s podatki enega liganda, smo z naslednjim ukazom združili
podatke vseh ligandov, prisotnih v trenutni mapi:
��2�2��26�427���&682��2�B������2:�82����23���������D2
Rezultate smo sortirali glede na povpre�no vezavno energijo najštevil�nejšega razreda poz
(deseti stolpec v tabeli) z ukazom:
4���2;��-2;&2;�<�������4���<2���������D2
Nazadnje smo sortirano tabelo še oštevil�ili:
�D�2MN2����2<O��2O4P�<?+"2;2�?:-2QM2�������4���23����������2
Datoteka ���������� je bila kon�ni rezultat našega virtualnega rešetanja, saj je vsebovala
vse pomembne podatke o izvedenih sidranjih celotnega nabora spojin iz dane knjižnice.
36
(�' ��� ����������������������!������������������
(�'� )���������� �����������������������
V reakciji, ki jo katalizira Ddl, nastajajo D-alanil-D-alanin, ADP in fosfatni ion.
Kolorimetri�na detekcija slednjega se je izkazala kot dovolj specifi�na in cenovno ugodna
metoda za spremljanje aktivnosti DdlB.
V našem primeru smo uporabili reagent Biomol Green™, modifikacijo barvila malahitno
zelenega (slika 23) z dodanim amonijevim molibdatom. Malahitno zeleno tvori s fosfatnim
ionom kompleks, ki je ob prisotnosti molibdatnih ionov še dodatno stabiliziran.
Spremembo barve smo zaznali z merjenjem absorbance z UV-spektrofotometrom
pri 650 nm. Kot kontrolno meritev smo izmerili absorbanco reagen�ne zmesi brez
dodanega inhibitorja. (29)
Jakost inhibitorja smo izrazili z rezidualno aktivnostjo (RA), ki predstavlja razmerje med
aktivnostjo encima v prisotnosti dolo�ene koncentracije inhibitorja in aktivnostjo encima
pri kontrolni meritvi. Pri naših meritvah RA je bila koncentracija inhibitorja 250 µmolL-1.
Rezidualna aktivnost naj bi pri dobrem inhibitorju znašala pod 50 %, �e pa takih zadetkov
ne bo dovolj, bomo zadovoljni tudi z vrednostmi do 75 %. RA je dokaj groba ocena
inhibicije encima, vendar je edina metoda, ki je dovolj hitra in ugodna za preizkušanje
ve�jega števila potencialnih zaviralcev.
Mo� inhibitorja natan�neje ocenimo z merjenjem vrednosti IC50, ki nam pove, pri kateri
koncentraciji inhibitorja se aktivnost encima in vitro zmanjša na polovico. Dobri zaviralci
imajo vrednosti IC50 v mikromolarnem obmo�ju.
��
� ���
� � ��
�� �� ��
Slika 23 — resonan�no stabilizirana struktura barvila malahitno zelenega
37
(�'�� )����������������� ���������������
Zadetke, ki so najbolje zavirali Ddl in vitro, smo podvrgli preizkusu na živih bakterijskih
kolonijah. Najnižjo koncentracijo inhibitorja, ki še zavre rast mikroorganizmov v koloniji,
imenujemo minimalna inhibicijska koncentracija (MIC) in je ena najbolj merodajnih ocen
jakosti protimikrobnih u�inkovin.
MIC smo za vsako spojino dolo�ili na treh kolonijah: na nativni Escherichii coli 1411 (30),
na oslabljeni Escherichii coli SM 1411 (31) in na Staphylococcusu aureusu 8325-4 (32).
V teko�e gojiš�e Isosensitest (Oxoid, Basingstoke, Velika Britanija) smo inokulirali 104 celic
E. coli na mL oziroma 106 celic S. aureusa na mL. Za�etne raztopine inhibitorjev smo
pripravili pri 256 µg/mL v 50 % vodni raztopini dimetilsulfoksida (Sigma–Aldrich, Dorset,
VB), nakar smo jih dvojno red�ili vse do 2 µg/mL. Vsi inhibitorji so že pri za�etni
koncentraciji tvorili bistre raztopine brez vidnih delcev. V vdolbinico mikrotitrske ploš�ice
smo k 90 µL bakterijske suspenzije dodali 10 µL raztopine inhibitorja. Mikrotitrske
ploš�ice s 96 vdolbinicami (Nunc, Fisher Scientific, Loughborough, VB) z inhibitorjem in
bakterijsko suspenzijo smo inkubirali 16 h pri 37 °C v analizatorju mikrotitrskih ploš�
Spectramax 384 plus (Molecular Devices, Abingdon, VB), na katerem je tekla programska
oprema SOFTmax PRO 3.1.1, ki je vsakih 10 minut od�itala absorbanco bakterijske
suspenzije pri 600 nm. Pred vsakim od�itkom je aparat mikrotitrske ploš�e pretresel.
Za minimalno inhibicijsko koncentracijo smo vzeli tisto koncentracijo inhibitorja, pri
kateri absorbanca bakterijske suspenzije po 16 h ni bila signifikantno višja od za�etne. (15)
38
4 +� ������������ ������
4� .������������������������������ "�
Inhibitor � � smo sidrali v dve razli�ici encima – eno z ioni Mg2+ v aktivnem mestu
=�� ����> in eno brez njih =�� ���>. Rezultati so zbrani v tabeli II.
Tabela II — rezultati kontrolnega sidranja inhibitorja POB
razli�ica encima rang razreda po vezavni energiji
število poz v razredu
povpre�na vezavna energija razreda
1 11 -6,25 kcal/mol �� ���2
4 61 -3,48 kcal/mol 1 11 -18,75 kcal/mol
�� ����210 36 -14,61 kcal/mol
Vidimo, da AutoDock za isti substrat v prisotnosti Mg2+ izra�una nekajkrat nižjo vezavno
energijo in s tem napove boljšo inhibicijo encima. Tak u�inek prisotnosti kovinskih ionov
ne presene�a, saj so ionske vezi najmo�nejše nekovalentne interakcije, inhibitor � � pa je
bil na�rtno izbran za dolo�itev kristalne strukture encima Ddl, ker se kot analog
prehodnega stanja veže v aktivno mesto na enak na�in kot D-alanil-D-alanin.
Zanimalo nas je tudi ujemanje
sidranih poz s kristalizirano
konformacijo � �. Pri obeh
razli�icah encima sta se pozi
z najnižjo prosto energijo zelo
dobro ujemali s kristalizirano,
medtem ko sta bili najpogostejši
pozi obakrat na drugi strani
aktivnega centra, na vezavnem
mestu za ADP (slika 24). Inhibitor
� � je majhna molekula, zato ni
nenavadno, da jo je AutoDock
ve�krat postavil v prostornejše vezavno mesto za ADP. Prisotnost magnezijevih ionov
kljub razlikam v izra�unani vezavni energiji na same poze substrata ni bistveno vplivala.
Kontrolno sidranje je uspelo, saj je program pri obeh razli�icah encima najnižjo vezavno
energijo izra�unal za pozo liganda, ki se odli�no ujema s kristalizirano konformacijo.
Slika 24 — primerjava sidranih poz POB s kristalno Kristalna poza je modra, pozi �� ��� zeleni in �� ���� rde�i.
Levo najpogostejši pozi, desno pozi z najnižjo energijo.
39
4�� �����������������������������3��#���������
Doma�o knjižnico spojin smo rešetali na razli�icah encima z in brez Mg2+ v aktivnem
mestu. Med 120 spojinami iz doma�e knjižnice ima 15 spojin vrednost IC50 nižjo
od 350 µmol/L, kar pomeni, da inhibirajo Ddl podobno mo�no ali mo�neje kot D-ciklo-
serin. Zanimalo nas je, kako dobro bodo v naši tabeli ti inhibitorji rangirani med manj
aktivnimi spojinami, predvsem pa, ali bo imela prisotnost Mg2+ v aktivnem mestu encima
pomemben vpliv na njihovo razvrstitev.
Za rangiranje spojin smo uporabili ukazno datoteko ������, v kateri je kriterij
za razvrstitev povpre�na vezavna energija najštevil�nejšega razreda dobljenih poz (v naših
tabelah �!E). V literaturi sicer najpogosteje zasledimo razvrš�anje spojin direktno
po najnižjih vezavnih energijah posamezne poze (!�), s �imer nismo bili povsem
zadovoljni, saj je energijsko najugodnejša poza mnogokrat v maloštevil�nem razredu,
kar ni dober obet za njeno dejansko obstojnost. Števil�en konformacijski razred precej
pove�a verjetnost, da bo ligand res v taki obliki zasedal aktivno mesto encima.
Na sliki 25 so vrstice z dokazano aktivnimi zaviralci Ddl osen�ene. Ker nas bodo kasneje
zanimali le najboljši AutoDockovi zadetki, smo bili tudi pri poskusnem rešetanju pozorni
predvsem na spojine z najboljšimi rezultati. Vidimo, da je AutoDock pri razli�ici �� ���
v zgornjo �etrtino uvrstil 7 aktivnih spojin, pri razli�ici �� ���� pa le dve.
�� ���22�',-22��&���2222222!�2222 �!E22222�2222222-22 "%��K�22;�K�K,22;���E,22222E2222222-222R R��H22;FE�,E22;EK��I22222F2222222-222 +���F22;�H���22;�F�,-22222�22222��K22 "%���H22;�H�IE22;�F�EH22222,22222EKE22 "%�E�K22;�H�F,22;�E�IJ22222H2222222-22 "%�EJ�22;�K�K-22;�E�,�22222K2222222-222 +���-22;�,��,22;�E�FH22222J22222E-,222 +��FH22;�E�IF22;�-��I22222I2222222-222 +���F22;�F���22;�-���2222�-2222222-22(���'�H22;����H222;I�,J2222��2222222-22(���'��22;�H�--222;I��E2222�E2222222-22 "%�EFE22;�E��I222;I�EJ2222�F22222�-K22 "%��H,22;���K�222;I��K2222��2222222-222 +��F,22;���KH222;I���2222�,2222222-22 "%�EKI22;���HK222;J�IH2222�H22222EK,222 +����22;�F�J�222;J�K,2222�K2222222-221�R;E��222;J�H,222;J��F2222�J2222222-222 +���J22;�-�IE222;J�F�2222�I2222222-222( /�E�22;�-�IH222;J�EK2222E-2222222-222(���,K22;�-�FJ222;J�EE2222E�2222222-2222 /��22;�H�--222;J��K2222EE22222FFI222��;�IK222;I��-222;J��F2222EF2222222-22 "%�FFH222;J�J�222;J��F2222E�2222222-22( /���I222;J��K222;J�-�2222E,2222222-22(���'�F22;�-�-E222;K�JI2222EH2222222-22( /��H-222;J��F222;K�KH2222EK2222222-22( /����222;J�II222;K�K-2222EJ22222�K-22 "%�E�-22;�-�JF222;K�,J2222EI2222222-2222 +��H22;�E�FE222;K�,�2222F-2222222-22 "%��I-222;K�JI222;K��K22
�� ����2�',-22��&���2222222!�2222 �!E22222�2222222-22 "%�FEK22;EJ�F�22;EF��,22222E2222222-222 S;�,22;EH�E�22;�K�,I22222F2222222-222(���,,22;�J�K,22;�H�HH22222�22222FEJ22 "%�FEJ22;E��--22;�H�H,22222,2222222-22 "%�EF-22;EK�,J22;�H���22222H2222222-22 "%��I-22;�K�-,22;�H�FK22222K2222222-222(���EF22;E��E-22;�,�JH22222J2222222-2222(����22;�K�-I22;�,�,I22222I2222222-222 S;�-22;�K��J22;���IJ2222�-2222222-222 "%�II22;�H�HF22;���IK2222��2222222-222 S;E-22;�K�HF22;���,I2222�E2222222-22 "%�FFH22;�H��-22;�����2222�F2222222-222 S;EF22;�J�,�22;���F-2222��2222222-222(���'I22;����J22;����-2222�,2222222-222( /�E�22;E-�-I22;���-F2222�H2222222-222(���,�22;�,�K�22;�F�I�2222�K2222222-222(����K22;���IJ22;�F�I�2222�J2222222-222( /�'�22;���J�22;�F�HK2222�I2222222-222( /�'E22;���KJ22;�F�HH2222E-2222222-2222(���E22;�F��J22;�F���2222E�2222222-2222(���F22;�F�,�22;�F�-E2222EE22222FFI222��;�IK22;�F�,I22;�E�I,2222EF2222222-2222(���,22;�H�-H22;�E�I�2222E�2222222-22 "%��--22;���KH22;�E�J�2222E,2222222-2222(���,22;���F�22;�E�HJ2222EH2222222-2222(���F22;�,��J22;�E�HE2222EK2222222-22 "%��JK22;���HI22;�E�FI2222EJ2222222-2222(����22;�,��E22;�E�F�2222EI2222222-2222(����22;�E�JF22;�E��K2222F-2222222-222 +���F22;�J�JI22;�E���22
Slika 25 — rezultati poskusnih rešetanj doma�e knjižnice spojin (levo �� ���, desno �� ����)
40
Zopet smo po pri�akovanjih opazili precejšnje razlike v izra�unanih vezavnih energijah
ligandov med obema razli�icama encimov. Ker smo tokrat sidrali spojine, ve�je
od inhibitorja � �, so te razlike razumljivo manjše (ve�ja molekula doseže ve� aminokislin
v aktivnem mestu in je njena vezavna energija manj odvisna od interakcij z Mg2+). Poleg
tega za dober izkupi�ek virtualnega rešetanja napovedane vezavne energije niso odlo�ilne.
Precej pomembnejše je táko rangiranje ligandov, da bo �im ve� aktivnih spojin razvrš�eno
�im bolj pri vrhu razpredelnice. Pri tem se razli�ica encima brez kovinskih ionov odreže
neprimerno bolje.
Vidimo tudi, da prisotnost magnezijevih ionov v aktivnem mestu mo�no vpliva
na orientacijo liganda v aktivnem mestu. Spojini na sliki 26 sta se kljub visoki homologiji
umestili v encim na povsem razli�na na�ina. Samo na osnovi sidranja ne moremo
napovedati, kateri je bližji dejanskemu na�inu vezave ligandov tega tipa.
ORF146 v razli�ici encima �� ��� tvori mnoge vodikove vezi. Sulfonamidna -NH-
skupina je donor H-vezi z Glu187, medtem ko -SO2- sprejme H-vez od peptidne vezi
Tyr210. Etrski kisik sprejme H-vez od Lys215, nitratna kisika pa od Gly276, Ser281 in
Tyr216. Poleg tega je naftalenski obro� liganda umeš�en na mesto adenina iz ADT in tvori
hidrofobne interakcije s Trp182 in Leu183.
Slika 26 — napovedani pozi najboljših zadetkov pri poskusnih rešetanjih Levo ORF146, sidran v razli�ico encima �� ���,
desno ORF328, sidran v razli�ico encima �� ����. Napovedane vodikove vezi so ozna�ene s tankimi turkiznimi �rtami.
41
ORF328 v razli�ici encima �� ���� tvori vodikove vezi le s tremi aminokislinami. Lys144
donira H-vez enemu od sulfonatnih kisikov, Lys215 enemu od nitratnih, Ser150 pa dve
H-vezi enemu od sulfonamidnih kisikov. Naftalenski obro� tvori hidrofobne interakcije
na povsem drugi strani aktivnega mesta kot prej, z Leu282 in Tyr216.
Poskusno smo najboljše inhibitorje Ddl iz doma�e knjižnice sidrali še v tretjo razli�ico
encima, kjer je bila v aktivnem mestu prisotna tudi molekula ADP. Pri tej razli�ici
AutoDock mnogim, predvsem ve�jim molekulam (npr. iz serije ORF), ni uspel najti
nobene poze znotraj aktivnega mesta. O�itno je bila prisotnost molekule ADP prehuda
steri�na ovira za njihovo vezavo, zato smo nadaljnja sidranja v encim s prisotnim ADP
opustili.
Magnezijevi ioni delijo podolgovato aktivno mesto Ddl na dvoje, tako da imajo ve�je
spojine ve� možnosti za vezavo v prazen encim. Ve�ina molekul inhibitorjev iz doma�e
knjižnice spojin je precej ve�jih od D-alanil-D-alanina, zato je jasno, da pri njih ne gre
za direktno kompetitivno inhibicijo. Možno je, da ti zaviralci ob vezavi v aktivno mesto
tudi dejansko izpodrinejo Mg2+ iz encima, saj bi druga�e težko tvorili interakcije
z aminokislinami na obeh polovicah aktivnega mesta.
Skratka, najboljše rezultate poskusnega virtualnega rešetanja smo dobili z uporabo
praznega encima, zato smo spojine iz NCI Diversity Seta rešetali samo na razli�ici
�� ���.
42
4�� +����������������� �-/0���������1������
Virtualno rešetanje smo izvajali na stotih procesorjih Intel Xeon v gru�i vzporednih
ra�unalnikov VRANA. Sidranje 1839 spojin iz NCI Diversity Seta s programom
AutoDock 4 je trajalo 2 dni.
Rezultate rešetanja smo z ukazno datoteko ������ razvrstili v datoteko ����������
(priloga 4). Tako smo dobili preglednico rezultatov, sortirano od najboljših do najslabših
kandidatov za inhibitorje encima DdlB.
Pri podobnih virtualnih rešetanjih so navadno v uporabi knjižnice spojin, ki so precej ve�je
od NCI Diversity Seta. V takih primerih lahko raziskovalci preverijo dejanske aktivnosti
izredno majhnega deleža zadetkov – enega odstotka ali še manj. Mi si tega nismo mogli
privoš�iti, zato smo se zgledovali po številu preverjenih zadetkov, ki se v literaturi
najpogosteje vrti med 100 in 150, in se odlo�ili preveriti najboljših 7 % zadetkov,
kar pomeni 129 najvišje rangiranih spojin.
Ker je postopek zbiranja podatkov in sortiranja spojin do tega hipa potekal povsem
na osnovi analize števil�nih vrednosti, smo najboljših 129 zadetkov podvrgli vizualnemu
pregledu. Glede na kriterije, ki smo jih postavili v ukazno datoteko ������, smo tudi zdaj
upoštevali poze iz najštevil�nejšega razreda zadetkov. Pri vsakem ligandu smo v programu
ADT preverili, ali res ležijo v aktivnem mestu in ali so videti „udobne” – imajo normalne
medatomske razdalje in vezne kote. Nobenih odstopanj nismo opazili.
Med najvišje rangiranimi spojinami ni bilo nobene take, da bi ji ukazna datoteka ������
pripisala najpogostejšo pozo izven aktivnega mesta, in tudi med vizualnim pregledom smo
videli, da so vse poze na primernem položaju v encimu. Le za eno od poz z najnižjo
vezavno energijo (�esar sicer nismo vzeli za kriterij) je ukazna datoteka ugotovila, da leži
izven aktivnega mesta. V tem primeru je šlo za majhno molekulo, diaminoheksahidro-
pirimidin karbonitril, ki se je zrinila na mesto nekataliti�nega magnezijevega iona, kjer tudi
mo�no vezana verjetno ne bi bila najboljši zaviralec encimske aktivnosti. S tem smo tudi
potrdili, da so meje aktivnega mesta v datoteki ������ dovolj strogo postavljene, saj bi
ob strožjem kriteriju možne lege manjših ligandov že preve� omejili.
43
4�' +� ����������������� �������������������
129 najboljšim zadetkom z virtualnega rešetanja smo dolo�ili rezidualno aktivnost.
Meritve je izvedla Andreja Kova�, mag. farm., s Fakultete za farmacijo v Ljubljani.
Pri dveh spojinah so neželene interakcije z reagenti povzro�ile ob�utno višjo absorbanco
od kontrolne, zato njihove aktivnosti z našim izbranim testom nismo mogli dolo�iti. Treh
spojin na mikrotitrskih ploš�icah, ki nam jih je poslal NCI, ni bilo, zato meritev pri njih ni
bilo mogo�e izpeljati. Pri drugih spojinah ni bilo ve�jih težav.
Ker je bila rezidualna aktivnost Ddl manjša od polovice le v prisotnosti enega zadetka,
smo uporabili blažji kriterij: RA < 75 %. Ta nam je prinesel petero aktivnih spojin
(tabela III), ki so jim nato dolo�ili tudi vrednosti IC50.
Tabela III — podatki o aktivnih spojinah z merjenja rezidualnih aktivnosti AutoDockov
rang MDE2
(kJ/mol) koda NSC strukturna formula M (g/mol)
RA (%)
IC50
(µmol/L)
1 -18,34 NSC86005
�
�
��
�
��
���
�
����
��
��
585,6 70 102
2 -16,02 NSC130813 ��
��
� �
�
��
�
463,0 65 162
19 -10,86 NSC48693
��
��
�
��
�
354,4 26 1,0
56 -9,49 NSC164640 �
�
�
��
��,
��,
�
�
��
308,7 58 798
123 -8,87 NSC176327
�
��
��,
333,4 64 70
Tabelo z vsemi rezultati merjenj RA, a brez strukturnih formul, objavljamo v prilogi 5.
44
4�( ��!��������������� �����������������
Najpogostejše poze petih aktivnih spojin smo preu�ili in raz�lenili napovedane interakcije
med ligandi in aminokislinami v aktivnem mestu Ddl.
NSC48693 (RA = 26 %, M = 354 g/mol, kemijsko ime 2-(1,3-benzoksazol-3(2H)-ilmetil)-
5((cikloheksilamino)metil)-1,4-benzendiol) (33) lahko tvori tri vodikove vezi. Aminska
skupina liganda donira H-vez karboksilni skupini Asp257, ena od fenolnih hidroksilnih
skupin pa karboksilni skupini Glu187. Oksazolski kisikov atom sprejme H-vez od peptidne
-NH- skupine Tyr210. Benzoksazolni del molekule leži v vezavnem mestu za ATP;
oksazolni obro� zamenjuje ribozo, benzenski obro� pa delno nadomeš�a adeninski skelet in
seže v hidrofobni žep med Trp182 in Leu183.
NSC164640 (RA = 58 %, M = 309 g/mol, kemijsko ime 2-(4-kloro-2-metilfenoksi)-
N-(4,6-diamino-1,3,5-triazin-2-il)acetamid) (33) z amidno -NH- skupino donira H-vez
karboksilni skupini Glu270. Eden od aminskih dušikov lahko sprejme H-vez
od hidroksilne skupine Ser150 ali Tyr216, medtem ko amidni in etrski kisik sprejmeta
H-vezi od amino skupine Lys215. Ligand ne tvori opaznejših hidrofobnih interakcij.
NSC176327 (RA = 64 %, M = 333 g/mol, kemijsko ime 3-(9-metoksi-5,11-dimetil-
6H-pirido[4,3-b]karbazol-6-il)propilamin) (33) ima rigiden piridokarbazolski skelet, ki leži
ve�inoma v obeh D-alaninskih vezavnih mestih. Njegov skrajni benzenski obro� sega
v hidrofobni žep med Leu282 in Tyr216. Aminska skupina liganda donira dve H-vezi
karboksilnima skupinama Glu15 in Glu68, kisikov atom v metoksi skupini pa sprejme dve
H-vezi: od hidroksilne skupine Ser281 in od peptidnega -NH- Leu282 (slika 28).
Slika 27 — sidrani konformaciji NSC48693 (levo) in NSC164640 (desno) z možnimi vodikovimi vezmi
45
NSC130813 (RA = 65 %, M = 463 g/mol, kemijsko ime 4-((6-kloro-2-metoksi-
9-akridinil)amino)-2-((4-metil-1-piperazinil)metil)fenol) (33) lahko tvori dve vodikovi
vezi. Fenolna -OH skupina liganda donira H-vez aminskemu dušiku Lys97, akridinski
dušikov atom pa sprejme H-vez od hidroksilne skupine Tyr216. Akridinski obro� tvori
šibke hidrofobne interakcije z benzenskim obro�em Tyr216. Piridazinski del liganda sega
v vezavno mesto za ATP, v katerem zaseda mesto riboze.
NSC86005 (RA = 70 %, M = 586 g/mol, spojina A nogalamicina) (33) ima antrakinonski
skelet, ki ima v vezavnem mestu Ddl podobno lego kot piridokarbazol iz NSC176327,
le da zaradi visoke polarnosti lahko tvori precej ve� vodikovih vezi z encimom. H-vezi
sprejme od aminokislin Lys97, Ser150, Ser151, Tyr210, Lys215, Tyr216 in Leu282,
dve pa tudi donira Tyr210 in Ser281. Estrska karboksilna skupina liganda v vezavnem
mestu za ATP zaseda mesto riboze.
Slika 28 — sidrani konformaciji NSC176327 (levo) in NSC130813 (desno) z možnimi vodikovimi vezmi
Slika 29 — sidrana konformacija NSC86005 z možnimi vodikovimi vezmi
46
4�4 +� ��������������������!������ �����
Petim najboljšim inhibitorjem z encimskega preizkusa smo dolo�ili aktivnost na živih
mikroorganizmih. Meritve vrednosti MIC je izvedla Andreja Kova�, mag. farm.,
s Fakultete za farmacijo v Ljubljani. Rezultati so zbrani v tabeli IV.
Štiri spojine od petih so zavirale rast seva 8325-4 Staphylococcusa aureusa, od tega
NSC130810 in NSC176327 že pri koncentraciji 32 µg/mL.
Rast seva 1411 Escherichie coli je zavirala le spojina NSC176327, a vsaj ta pri obetavno
nizkih koncentracijah (MIC = 32 µg/mL).
Sev SM1411 E. coli, ki ima zaradi odstranitve gena acrAB zmanjšano sposobnost
aktivnega �rpanja ksenobiotikov iz celice (31), je bil dovzeten za delovanje spojin
NSC130813 (MIC = 64 µg/mL) in NSC176327 (MIC = 8 µg/mL). Ker imata pri nativnem
sevu obe spojini precej zmanjšano aktivnost, lahko sklepamo, da ju je bakterija sposobna
izlo�ati z efluksom.
Spojine NSC86005, NSC48693 in NSC164640 ne zavirajo rasti nobenega od sevov E. coli,
kar nam kaže, da se verjetno niso sposobne prebiti preko celi�ne stene G– bakterij.
�e sklepamo po vplivu na rast S. aureusa, celi�no steno G+ bakterij prehajajo vse
preizkušene spojine razen NSC164640, ki se je že pri encimskem testu merjenja vrednosti
IC50 najslabše odrezala. Tudi na žive bakterije nima opaznega vpliva.
47
Tabela IV — rezultati merjenja minimalnih inhibicijskih koncentracij
MIC (µg/ml) rang koda
NSC strukturna formula IC50
(µmol/L) E. coli 1411
E. coli SM 1411
S. aureus 8325-4
1 86005
�
�
��
�
��
���
�
����
��
��
102 >256 >256 256
2 130813
��
��
� �
�
��
�
162 >256 64 32
19 48693
��
��
�
��
�
1,0 >256 >256 128
56 164640 �
�
�
��
��,
��,
�
�
��
798 >256 >256 >256
123 176327
�
��
��,
70 32 8 32
48
5 ������
Z virtualnim rešetanjem manj kot 2000 spojin smo odkrili pet novih inhibitorjev D-alanil-
D-alanin ligaze, od katerih štirje uspešno zavirajo rast bakterij in so obetavni prekurzorji
za razvoj protimikrobnih u�inkovin z delovanjem na doslej slabo izkoriš�en citoplazemski
tar�ni protein. Spojina NSC48693 ima izjemno nizko vrednost IC50 (1,0 µmolL-1) in je po
mo�i vezave v samem vrhu doslej znanih zaviralcev D-alanil-D-alanin ligaze.
Najboljše rezultate je pri mikrobiološkem preizkusu izkazala spojina NSC176327,
ki prehaja celi�no steno G+ in G– bakterij in bi se lahko razvila v antibiotik širokega
spektra. Možni pristopi k izboljšanju njenih inhibicijskih lastnosti vklju�ujejo zmanjšanje
rigidnosti molekule s prekinitvijo katerega izmed štirih kondenziranih aromatskih obro�ev
v njeni strukturi in pove�anje možnosti interakcij molekule v aktivnem mestu s premišljeno
adicijo polarnih fragmentov na njen skelet.
Spojine NSC48693, NSC86005 in NSC130813 o�itno prehajajo le celi�no steno tipa G+,
vendar so kljub temu lahko dobra osnova za derivatizacijo, ki bi morda razširila tudi njihov
spekter delovanja. Spojina NSC164640 je verjetno premalo lipofilna za uspešno prehajanje
v notranjost bakterijskih celic, zato bi lahko poskušali izboljšati njene sposobnosti
penetracije bioloških membran z bioizosterno zamenjavo polarnih atomov v molekuli, na
primer katerega od kar šestih atomov dušika.
Tudi pri virtualnem rešetanju imamo precej možnosti za izboljšave. AutoDock v zadnji
razli�ici 4.0 omogo�a sidranje z upoštevanjem fleksibilnosti stranskih verig dolo�enih
aminokislin tar�nega proteina. Seveda bi to še podaljšalo �as sidranja, ki je že pri fiksnem
proteinu povpre�no znašal preko dve uri za ligand. Pri sidranju smo uporabljali privzete
nastavitve (razen nekaterih parametrov genetskega algoritma), �eprav bi lahko na primer
s prikrojevanjem energijske funkcije prišli do boljših rezultatov. Lahko bi tudi izbrali
obsežnejšo knjižnico spojin, kar bi pove�alo možnosti za ve�je število raznolikih zadetkov,
a spet podaljšalo trajanje rešetanja.
Z analizo poz aktivnih zaviralcev smo opisali njihove najverjetnejše na�ine vezave v encim
in s tem pustili odprto pot za nadaljnje raziskave mehanizmov inhibicije D-alanil-D-alanin
ligaze. Verjamemo, da bo trud znanstvene skupnosti na tem podro�ju slej ko prej prinesel
rezultate v obliki novega razreda klini�no uporabnih protimikrobnih u�inkovin.
49
6 ,����������
1. Mutschler E, Derendorf H: Drug Actions : Basic Principles and Therapeutic Aspects, Scientific Publishers, Stuttgart, 1995; 515 – 518.
2. Hardman J, Goodman Gilman A, Limbird L: Goodman & Gilman's The Pharmaco-logical Basis of Therapeutics, 9/e, McGraw-Hill, New York, 1996; 1029 – 1165.
3. Labischinski H, Maidhof H: In Bacterial Cell Wall, Elsevier Science B.V., Amsterdam, 1994; 23 – 27.
4. Courvalin P, Davies J: Antimicrobials – Time to Act, Curr. Opin. Microbiol. 2003, 6: 425 – 426.
5. Voet D, Voet J: Biochemistry, Second Edition, John Wiley & Sons, New York, 1996; 268 – 271.
6. Scheffers D, Pinho M: Bacterial Cell Wall Synthesis : New Insights from Localization Studies, Microbiology and Molecular Biology Reviews 2005, 69: 585 – 591.
7. van Heijenoort, J: Recent Advances in the Formation of the Bacterial Peptidoglycan Monomer Unit, Nat. Prod. Rep. 2001, 18: 503 – 515.
8. Walsh C: Enzymes in the D-Alanine Branch of Bacterial Cell Wall Peptidoglycan Assembly, J. Bio. Chem 1989, 264: 2393 – 2396.
9. http://mips.gsf.de/genre/proj/uwe25/Pathways/pw_peptidoglucan.html 10. http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1IOV 11. Lambert M, Neuhaus F: Mechanism of D-Cycloserine Action : Alanine Racemase
from Escherichia coli W, J. Bacteriology 1972, 110: 978. 12. Mullins L, Zawadzke L, Walsh C, Raushel F: Kinetic Evidence for the Formation of
D-Alanyl Phosphate in the Mechanism of D-Alanyl–D-Alanine Ligase, J. Bio. Chem. 1990, 265: 8993 – 8997.
13. Neuhaus F: The Enzymatic Synthesis of D-Alanyl-D-Alanine, J. Bio. Chem. 1967, 237: 778 – 786.
14. Zawadzke L, Bugg T, Walsh C: Existence of Two D-Alanine:D-Alanine Ligases in Escherichia coli: Cloning and Sequencing of the ddlA Gene and Purification and Characterization of DdlA and DdlB Enzymes, Biochemistry 1991, 30: 1673 – 1677.
15. Kova� A, Majce V, Lenarši� R, Bombek S, Bostock J, Chopra I, Polanc S, Gobec S: Diazenedicarboxamides as Inhibitors of D-Alanine-D-Alanine Ligase (Ddl), Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007, 17: 2047 – 2054.
16. Ellsworth B, Tom N, Bartlett P: Synthesis and Evaluation of Inhibitors of Bacterial D-Alanine:D-Alanine Ligases, Chemistry and Biology 1996, 3: 37 – 43.
17. Besong G, Bostock J, Stubbings W, Chopra I, Roper D, Lloyd A, Fishwick C, Johnson A: A De Novo Designed Inhibitor of D-Ala–D-Ala Ligase from E. coli, Angew. Chem. Int. Ed. 2005, vol 44: 2 – 4.
50
18. Liu S, Chang J, Herberg J, Horng M, Tomich P, Lin A, Marotti K: Allosteric Inhibition of Staphylococcus aureus D-Alanine:D-Alanine Ligase Revealed by Crystallographic Studies, PNAS 2006, 103: 15178 – 15182.
19. Triola G, Wetzel S, Ellinger B, Koch M, Hübel K, Rauh D, Waldmann H: ATP Competitive Inhibitors of D-Alanine:D-Alanine Ligase Based on Protein Kinase Inhibitor Scaffolds, Bioorg. Med. Chem. 2008, doi: 10.1016/j.bmc.2008.02.046.
20. Barril X, Soliva R: Molecular Modelling, Mol. Biosyst. 2006, 2: 660 – 670. 21. Kitchen D, Decornez H, Furr J, Bajorath J: Docking and Scoring in Virtual Screening
for Drug Discovery : Methods and Applications, Nature Reviews 2004, 3: 935. 22. http://dtp.nci.nih.gov/branches/dscb/diversity_explanation.html 23. Morris G, Goodsell D, Halliday R, Huey R, Hart W, Belew R, Olson A: Automated
Docking Using a Lamarckian Genetic Algorithm and an Empirical Binding Free Energy Function, J. Computational Chemoistry 1998, 19: 1639 – 1652.
24. Huey R, Morris G, Olson A, Goosell D: A Semiempirical Free Energy Force Field with Charge-Based Desolvation, J. Computational Chemistry 2007, 28: 1145 – 1150
25. http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_algorithm 26. Pettersen E, Goddard T, Huang C, Couch G, Greenblatt D, Meng E, Ferrin T: UCSF
Chimera – A Visualization System for Exploratory Research and Analysis, J. Comput. Chem. 2004, 25: 1605 – 1612.
27. Huey R, Morris G: Using AutoDock 4 with ADT: A Tutorial, 2007, http://autodock.scripps.edu/faqs-help/tutorial/using-autodock-4-with-autodocktools
28. http://autodock.scripps.edu/local_files/screening/NCI-Diversity-AutoDock-0.1.tar.gz 29. Walsh A, Falk P, Thanassi J, Discotto L, Pucci M, Ho H: Comparison of the
D-Glutamate-Adding Enzymes from Selected Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria, J. Bacteriol. 1999, 181: 5395.
30. Miller K, O'Neill A, Chopra I: Response of Escherichia coli Hypermutators to Selection Pressure with Antimicrobial Agents from Different Classes, J. Antimicrob. Chemother. 2002, 49: 925.
31. O'Neill A, Bostock J, Morais Moita A, Chopra I: Antimicrobial Activity and Mechanisms of Resistance to Cephalosporin P1, an Antibiotic Related to Fusidic Acid, J. Antimicrob. Chemother. 2002, 50: 839.
32. Novick R: Properties of a Cryptic High-Frequency Transducing Phage in Staphylococcus aureus, Virology 1967, 33: 155.
33. http://129.43.27.140/ncidb2/
51
7 ����!��
7� ����!��8�������������������������������������������9�� ����#���� ����� ����� ����� ���:�
������2�22222222222222222222222222222A2���&��4���2�����2�����2
�������222222222222222222222222222222A2���������2��������2�������4�����42
4���2��2����222222222222222222222222A24���42��2������2&��������2
��&�����5�42$2$�2'2�2+2+�2 �2%2�2/�2/2'�2��2�2A2��&���2����2�5�42
��2�� ������4���222222222222222222A2&������������2
��2�� ����$���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����$����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����'���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����+���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����+����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ���� ����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����%���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����/����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����/���222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ����'����22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ���������22222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
��2�� ��������222222222222222222222A2����;4�����2�����52��2
������2�� ��������22222222222222222A2�������4�����42��2
��4�����2�� ��������222222222222222A2��4��������2��2
����2��;�-K���0�2
�����2-�E-KF2;-�E�,F2;-�-IIH2
����-2������2222222222222222222222222A2�������2����������4B�2��2������2
0���-2������2222222222222222222222222A2�������20���������2
���9�2,2
��9�-2������2222222222222222222222222A2�������2��9�����42=��������>2��2������2
�4��2E�-2222222222222222222222222222A2����4������24��B�2
04��2,-�-222222222222222222222222222A20���������24��B��&2
�4��2,-�-222222222222222222222222222A2���4���24��B��&2
���4��2,2-�EK�---2
��4���2E�-222222222222222222222222222A2���4�������������B�2
�@���&2�---�-222222222222222222222222A2�@������2&���2����&52
�-��@2-�-2�----2222222222222222222222A2��@2�������2����&582��@2������2�2������42
&����4���2�,-2222222222222222222222A2������2�2����������42��2��������2
&����������42�------22222222222222222A2��@����2������2�2����&52����������42
&������&���������42EK---2222222222222A2��@����2������2�2&���������42
&�������4�2�2222222222222222222222A2������2�2��2����������42��24������2��2��@�2&���������2
&���������������2-�-E2222222222222222A2����2�2&���2��������2
&�����44���������2-�J2222222222222222A2����2�2���44����2
&��D����D�4���2�-22222222222222222222A22
&������95���9�2-�-222222222222222222A2��9�2��������2�2'���952��4���������2
&������95�����2��-2222222222222222222A2����2��������2'���952��4���������2
4���&�2222222222222222222222222222222A24��2�9�2�����2��������42��2(�2��2.(�2
4D���@���42F--22222222222222222222222A2���������42�2/���42T2#��42�����24����92
4D���@�4���2�222222222222222222222222A2���4�������24����44�42�����2�9��&��&2�9�2
4D���@����2�222222222222222222222222A2���4�������2������42�����2�9��&��&2�9�2
4D��9�2��-222222222222222222222222222A24���2�2�����24����924���2��24����2
4D�����9�2-�-�22222222222222222222222A2��D��2�����2��2�9�2
�4�4����9���02-�-H222222222222222222A2���������52�2�������&2�����24����92��2����������2
4���4D�222222222222222222222222222222A24��2�9�2�����2/���42T2#��42��������42
����������������@������2222222222222A2������2�@������2��&���2����&52
&�����2�--222222222222222222222222222A2��2�9�42���5295����2(�;./2���42
����54�422222222222222222222222222222A2�����2�2������2���4���2����54�42
52
7�� ����!���8���� �������������������������
AUB���B�D�2;2
A����G2�B���2������0�23�����22
�!(�+2N2
Q2
2 :F2V2B������B2N2���9�2L2:E2Q82
2 :�2V2B� "/� %B2N2���42L2:E2Q82
2 :�2V2B��B2N2
2 2 @2*L24��4��=:-?2FE?2J>82
2 2 52*L24��4��=:-?2�-?2J>82
2 2 �2*L24��4��=:-?2�J?2J>82
2 2 �**82
2 Q2
!+�2N2
2 @2BL2�82
2 52BL2�82
2 �2BL2�82
2 �2L2�"(�W�X82
2 ��2=�2L2-82�2Y2,�82�**>2N2
2 2 &������2Y2<��������<82
2 2 �2=:�2V2<����<>2����2<����2<2�82
2 2 ��4�2�2=:�2V2<�����<>2N2
2 2 2 ����=<�����2O��<?@>82
2 2 2 ����=<2O��<?5>82
2 2 2 ����=<2O��P�<?�>82
2 2 Q2
2 2 ��4�2�2=:�2V2<���9�<>2����2<���9�2<2���9�82
2 2 ��4�2�2=:�2V2<���4��<>2N2
2 2 2 ����=<O42O�2O4P�<?<���4��<?���4?2<-�EK�---<>82
2 2 Q2
2 2 ��4�2����2:-82
2 Q2
Q2
53
7�� ����!���8���� �������������������������������������
AUB���B�D�2;2
A����G2�B������2������&2
�!(�+2N2
2 +'��@2L2-82
Q2
2 :E2V2B����B2N2��&���2L2:F2Q82
2 B&�����B2N2&�����2L2:F2Q82
2 ==:�2V2B"��B>2TT2=:�2LL2&�����>>2N2���2L2:E2Q82
2 B����54�4B2N2���2L2-2Q82
2 =B�+�1�B2TT2=:E2V2B' �+�B>>2N2+/'2L2:F2Q82
2 =B����-B2TT2=���2UL2->>2N2@W���X2L2:,825W���X2L2:H82�W���X2L2:K2Q82
2 =B��B2TT2=���2UL2->>2N2�W���X2L2:J82�����W���X2L2:I2Q82
2
2 B$�/� ("� B?B�����;������B2N2
2 2 �2==2:�2*2-2>2LL2:�2>2N2
2 2 2 ����2L2:�82��W����X2L2:,82
2 2 2 �!W����X2L2:K82+'W����X2L2:I82
2 2 2 �2=:I232+'��@>2N2+'��@2L2:I82����@2L2:,82Q2
2 2 Q2
2 Q82
2
2 B�������B?B!+�" �ZB2N2�2==2:�2*2-2>2LL2:�2>2N2
2 2 '"W:FX2L2:�82!W:FX2L2:�2Q2Q2
2
!+�2N2
2 N2��2=�2L2�82�2YL2&�����82�**>2N2
2 2 �2=@W�X2Y2�H2CC2@W�X232EF2CC25W�X2Y2E2CC2P2
2 2 22225W�X232�E2CC2�W�X2Y2F�2CC2�W�X232�I>2N2
2 2 2 2 �����W�X2L2< 1�<2
2 2 2 2 Q2
2 2 Q2
2 Q82
2 ����2<OK�2O����F42O2K�E2O2K�E2OF�2OF�2OJ�K&2P2
2 2 O;F42O2K�E2O2K�E2OF�2OF�2OJ�K&2O;F4P�<?P2
2 2 +/'?��&���?!W��W�XX? �!W�X?2'"W��W�XX?P2
2 2 +'W�X?�W��W�XX?�����W��W�XX?!W����@X? �!W'"W����@XX?P2
2 2 '"W����@X?+'W'"W����@XX?�W����@X?�����W����@X82
Q2
54
7�' ����!��'8��������;������#���������������������������������������������������
222-22222+/'22��&���2222222222222!�2222 �!�2'"�2+'�2222222��2222222222!E2222 �!E2'"E2+'E2222222�E22222
222�222JH--,22�����4��5-I-E22;E����22;�J�F�222�22F,22222E�-�2� 222;E����22;�J�F�222�22F,22222E�-�2� 22
222E22�F-J�F22�����4��5�F-�22;EE�FE22;EE�E-222�222�22222�F�F2� 222;�K�,,22;�H�-E222I22FF222�FK�E�2 22
222F22F-KE��22�����4��5�HI,22;�I��H22;�,�F,222�22�J22222,��,2 222;�I��H22;�,�F,222�22�J22222,��,2 22
222�222�KI�I22�����4��5-,J,22;�K�EK22;�F�--222�22E,222E�I�HF2 222;�K�EK22;�F�--222�22E,222E�I�HF2 22
222,22EIEE�F22�����4��5�H,�22;�K�E,22;�,�I,222�222K2222EEK��2 222;���HF22;�E�IJ222�22,K2222�I�-�2 22
222H22FHEJHJ22�����4��5�JF-22;�F�KH22;�E�,,222�22,J2222JE�,�2 222;�F�KH22;�E�,,222�22,J2222JE�,�2 22
222K22FK�JKJ22�����4��5�J,�22;�E�KJ22;�E�,,222�22IJ222�EK�IF2 222;�E�KJ22;�E�,,222�22IJ222�EK�IF2 22
222J222EFIE,22�����4��5-F-�22;�F�-K22;�F�-K222�222�222EH��EK2 222;�E�JH22;�E��-222E22FJ222FK��K�2 22
222I22�--JJ-22�����4��5�-,�22;�K�EH22;���I�222�22�E222EEF�E�2 222;����H22;�E�EI222E22,J2222�E�-F2 22
22�-222�F,KE22�����4��5-�H-22;�E�H�22;�E�E,222�22,�222,�H�EE2 222;�E�H�22;�E�E,222�22,�222,�H�EE2 22
22��222J�-I�22�����4��5-JKJ22;�E�,-22;�E��K222�22KK222HJI�K,2 222;�E�,-22;�E��K222�22KK222HJI�K,2 22
22�E22�-I,-I22�����4��5��-J22;���IF22;���HJ222�22FI22222��KI2� 222;���IF22;���HJ222�22FI22222��KI2� 22
22�F222I-HF-22�����4��5-I�I22;���KH22;���FH222�22H�22222E�FJ2� 222;���KH22;���FH222�22H�22222E�FJ2� 22
22��222,�-K-22�����4��5-HF,22;���KK22;�-�IK222�22�K22222E�F�2� 222;����I22;����H222E22HJ222222F�J2� 22
22�,22FK�HJE22�����4��5�J�,22;���HH22;�����222�22IJ22222E�JF2� 222;���HH22;�����222�22IJ22222E�JF2� 22
22�H22E��FFE22�����4��5�,JJ22;���FK22;�-�IK222�22F,22222��H�2 1�22;�����22;���-�222E22H�22222K�E�2� 22
22�K22E-��F-22�����4��5�,,E22;���-I22;���-F222�22IJ22222K���2� 222;���-I22;���-F222�22IJ22222K���2� 22
22�J222EHH�,22�����4��5-FF�22;���KF22;�-�I�222�22,-222222E�,2� 222;���KF22;�-�I�222�22,-222222E�,2� 22
22�I222�JHIF22�����4��5-H-,22;�E�-K22;�-�JH222�22EJ22222���F2� 222;�E�-K22;�-�JH222�22EJ22222���F2� 22
22E-22�FHKEK22�����4��5�F,,22;�-�JH22;�-�J�222�22IH2222���-�2� 222;�-�JH22;�-�J�222�22IH2222���-�2� 22
22E�222�EFHF22�����4��5-�F,22;�-�K�22;�-�F�222�222K2222���-K2� 222;�-�H�22;�-�,J222E22H�2222�,�KH2� 22
22EE22FK�JKH22�����4��5�J,F22;�-�JJ22;�-�,�222�22JK2222�-�,K2� 222;�-�JJ22;�-�,�222�22JK2222�-�,K2� 22
22EF22FEKK-E22�����4��5�KH�22;���EK22;�-�I�222�222K22222,��I2� 222;�-��,22;�-�FH222F22HK2222EE�-F2� 22
22E�22�E-HJJ22�����4��5�EEI22;�-�,F22;�-�FF222�22,J2222�I���2� 222;�-�,F22;�-�FF222�22,J2222�I���2� 22
22E,22F,��EF22�����4��5�J-H22;�J��K22;�E�HH222�222F2222EI�-J2 222;�H�HE22;�-�FF222E22H,222HHE�EE2 22
22EH222�FKEJ22�����4��5-�HH22;���FK22;�-�FE222�22HK22222��H�2� 222;���FK22;�-�FE222�22HK22222��H�2� 22
22EK22E,,IJ-22�����4��5�H�H22;�E�,K22;�-�F�222�222,222H�F��I2 222;�-�I-22;�-�EI222�22�-2222�-�E,2� 22
22EJ222EFIEE22�����4��5-F-F22;����H22;�-�EF222�22�E22222F�IH2� 222;����H22;�-�EF222�22�E22222F�IH2� 22
22EI222�J-�-22�����4��5-,JH22;�-�EJ22;�-�EE222�22K�2222EJ�I,2� 222;�-�EJ22;�-�EE222�22K�2222EJ�I,2� 22
22F-222�KIE�22�����4��5-,J�22;�-�F�22;�-��H222�22��2222EK�,H2� 222;�-�F�22;�-��H222�22��2222EK�,H2� 22
22F�22FEKK-�22�����4��5�KHE22;�-�,F22;�-��F222�22K-2222�J�II2� 222;�-�,F22;�-��F222�22K-2222�J�II2� 22
22FE22��F�I�22�����4��5��F�22;�-�J�22;�-�-J222�22JJ2222���I�2� 222;�-�J�22;�-�-J222�22JJ2222���I�2� 22
22FF222I-J��22�����4��5-I,H22;�-��K22;�-�-H222�22EJ2222F,�F,2� 222;�-��K22;�-�-H222�22EJ2222F,�F,2� 22
22F�22�E-HJH22�����4��5�EEJ22;�-�-E222;I�II222�22,E2222�,��K2� 222;�-�-E222;I�II222�22,E2222�,��K2� 22
22F,22F-E-�E22�����4��5�HK�22;�-�KI222;I�I�222�22JK2222�E�EH2� 222;�-�KI222;I�I�222�22JK2222�E�EH2� 22
22FH22�-JH-J22�����4��5�-IF22;�-��F222;I�JK222�22HF2222EE�,�2� 222;�-��F222;I�JK222�22HF2222EE�,�2� 22
22FK22��HJ-,22�����4��5��K-22;�-��I22;�-�-E222�22F�2222E-�,I2� 222;�-�FE222;I�J,222E22�E2222EK�E�2� 22
22FJ222�,,KE22�����4��5-,�J22;�-�,E222;I�J-222�22EF2222�I�EI2� 222;�-�,E222;I�J-222�22EF2222�I�EI2� 22
22FI22�,-EJI22�����4��5��-F22;�-�H-222;I�KF222�22HJ2222�H�J,2� 222;�-�H-222;I�KF222�22HJ2222�H�J,2� 22
22�-222IJI-,22�����4��5�-EK222;I�JJ222;I�K�222�22,H22222,K�,2� 2222;I�JJ222;I�K�222�22,H22222,K�,2� 22
22��222I-JEI22�����4��5-I,�22;�-�EI222;I�HI222�22,H2222EJ�JJ2� 222;�-�EI222;I�HI222�22,H2222EJ�JJ2� 22
22�E22FK�JJ-22�����4��5�J,,22;�-�-F222;I�HJ222�22H,22222���H2� 222;�-�-F222;I�HJ222�22H,22222���H2� 22
22�F22�,�,KE22�����4��5��E-22;�-�-H222;I�HK222�22�H2222�E�,E2� 222;�-�-H222;I�HK222�22�H2222�E�,E2� 22
22��222�HE��22�����4��5-E�E222;I�IJ222;I�HH222�22K�2222�J��,2� 2222;I�IJ222;I�HH222�22K�2222�J��,2� 22
22�,22�HF��F22�����4��5��,H22;�-�EE222;I�HH222�22,,2222FE�FE2� 222;�-�EE222;I�HH222�22,,2222FE�FE2� 22
22�H222KI-,-22�����4��5-J�I22;�-�EH222;I�H�222�22IJ2222EI�I�2� 222;�-�EH222;I�H�222�22IJ2222EI�I�2� 22
22�K22,EJ�HJ22�����4��5�I�H22;�-�F-222;I�HF222�22J,2222EJ�EE2� 222;�-�F-222;I�HF222�22J,2222EJ�EE2� 22
22�J222�J�H-22�����4��5-,JJ22;�-��I222;I�H-222�22,,2222FF�JF2� 222;�-��I222;I�H-222�22,,2222FF�JF2� 22
22�I22�-�IJ�22�����4��5�-H�22;�-�-E222;I�,K222�22JH2222�,�EI2� 222;�-�-E222;I�,K222�22JH2222�,�EI2� 22
22,-22�KH,,,22�����4��5�,�,222;I�H,222;I�,�222�22I-2222J��KK2� 2222;I�H,222;I�,�222�22I-2222J��KK2� 22
22,�222,-,HK22�����4��5-HF-222;I�J-222;I�,�222�22FH22222H,��2� 2222;I�J-222;I�,�222�22FH22222H,��2� 22
22,E222,FJIE22�����4��5-HHE222;I�H�222;I�,�222�22I�2222JH�E,2� 2222;I�H�222;I�,�222�22I�2222JH�E,2� 22
22,F22��E,�H22�����4��5��EE22;���K�22;���HH222�222�22222E�HF2� 222;�-�EH222;I�,F222F22E,2222F-�-K2� 22
22,�2222FF,�22�����4��5--F,22;�-�,E222;I�,E222�22�E2222�I��K2� 222;�-�,E222;I�,E222�22�E2222�I��K2� 22
22,,22FK�JJ�22�����4��5�J,H22;�-�-�222;I�,�222�22,F2222�,�JK2� 222;�-�-�222;I�,�222�22,F2222�,�JK2� 22
22,H22�H�H�-22�����4��5��H�222;I�JI222;I��I222�22I,2222,H�KJ2� 2222;I�JI222;I��I222�22I,2222,H�KJ2� 22
22,K222,�EKJ22�����4��5-HHJ222;I�HH222;I��F222�22�E22222JF�H2� 2222;I�HH222;I��F222�22�E22222JF�H2� 22
22,J22�,FHE,22�����4��5���K222;I��F222;I��E222�22IJ222222�EF2� 2222;I��F222;I��E222�22IJ222222�EF2� 22
22,I22E-�,KI22�����4��5�,,F222;I��I222;I��E222�22HF222�-I�J�2� 2222;I��I222;I��E222�22HF222�-I�J�2� 22
22H-222�EJ�H22�����4��5-,�K222;I��,222;I��E222�22IE222��K�H,2� 2222;I��,222;I��E222�22IE222��K�H,2� 22
22H�22�E,E-�22�����4��5�EK�222;I�J�222;I���222�22E,2222H���I2� 2222;I�J�222;I���222�22E,2222H���I2� 22
22HE22�F-JF-22�����4��5�F-E222;I��I222;I���222�22IK222��-�IJ2� 2222;I��I222;I���222�22IK222��-�IJ2� 22
55
22HF22�HI�,F22�����4��5��J�222;I�KF222;I���222�22J,22222K��E2� 2222;I�KF222;I���222�22J,22222K��E2� 22
22H�22��KEK�22�����4��5��J�22;�K�HH222;I�FI222�22F,222��F�HI2 222;�K�HH222;I�FI222�22F,222��F�HI2 22
22H,22H---HK22�����4��5�I�K222;I�IJ222;I�FI222�22H�2222�J�KK2� 2222;I�IJ222;I�FI222�22H�2222�J�KK2� 22
22HH222�FKEH22�����4��5-�H,22;�-��J222;I�FJ222�22KF2222E-�HK2� 222;�-��J222;I�FJ222�22KF2222E-�HK2� 22
22HK22�-KHEJ22�����4��5�I-F222;I�H�222;I�FJ222�22I�2222J,�J�2� 2222;I�H�222;I�FJ222�22I�2222J,�J�2� 22
22HJ222JI��-22�����4��5-IF,22;�-�E,222;I�JH222�22�,2222F-��J2� 2222;I�,-222;I�FJ222F22J�222�-J�EK2� 22
22HI22�-I,IF22�����4��5���-222;I�KE222;I�FK222�22IJ2222K,�-�2� 2222;I�KE222;I�FK222�22IJ2222K,�-�2� 22
22K-222���J-22�����4��5-,FF222;I���222;I�FK222�2�--222�E,�,H2� 2222;I���222;I�FK222�2�--222�E,�,H2� 22
22K�22��KH��22�����4��5��IF22;�-��I222;I�FH222�22F�2222F��-F2� 222;�-��I222;I�FH222�22F�2222F��-F2� 22
22KE22�,�-E-22�����4��5���J22;�-�EH222;I�I-222�22F�2222F-�-J2� 2222;I�,K222;I�FH222E22��22222IH�E2� 22
22KF22�K-,H�22�����4��5��IJ22;�-�HI22;�-�,�222�22F�2222���,K2� 2222;I��-222;I�FH222F22HH222�EJ��F2� 22
22K�22�EE�-,22�����4��5�E,�22;�-�E�222;I�F,222�22HK2222FE�KK2� 222;�-�E�222;I�F,222�22HK2222FE�KK2� 22
22K,22FEK��K22�����4��5�KH-222;I��-222;I�F�222�22H,222�EI���2� 2222;I��-222;I�F�222�22H,222�EI���2� 22
22KH222�F-EJ22�����4��5-��H22;�-�FF222;I�F�222�22FI2222EH�HH2� 222;�-�FF222;I�F�222�22FI2222EH�HH2� 22
22KK22�EHK,K22�����4��5�EJ�222;I�FH222;I�F-222�22K�222�FK�EK2� 2222;I�FH222;I�F-222�22K�222�FK�EK2� 22
22KJ2222IH-J22�����4��5--II222;I�FJ222;I�EK222�22H,222�FF�JI2� 2222;I�FJ222;I�EK222�22H,222�FF�JI2� 22
22KI222���KK22�����4��5-,FE222;I�EH222;I�EF222�22IJ222�HF��E2� 2222;I�EH222;I�EF222�22IJ222�HF��E2� 22
22J-2222KJ��22�����4��5--JJ222;I�H-222;I�E�222�22E�22222I��F2� 2222;I�H-222;I�E�222�22E�22222I��F2� 22
22J�22�-�JE,22�����4��5�-H�22;�-��,222;I�E-222�22F,2222FH�E,2� 222;�-��,222;I�E-222�22F,2222FH�E,2� 22
22JE222F,�JI22�����4��5-�-I22;�-�F-222;I�FI222�22E-2222EJ��H2� 222;�-�-F222;I��I222E22,J2222���JF2� 22
22JF222,KIK,22�����4��5-K--22;�-�K-222;I��I222�22EH2222���FJ2� 222;�-�K-222;I��I222�22EH2222���FJ2� 22
22J�22���,HE22�����4��5�FK�222;I��K222;I�FE222�222I222��F��F2� 2222;I�EE222;I��J222E22I�2222�K,�K2� 22
22J,22�,�JEI22�����4��5��EE22;�-�JJ222;I��J222�22�E2222�-�H�2� 222;�-�JJ222;I��J222�22�E2222�-�H�2� 22
22JH222�KIFJ22�����4��5-,J�22;�-�FF222;I�HJ222�222H2222EH�HI2� 2222;I�,�222;I��K222,22�,222�-��F�2� 22
22JK222�I��K22�����4��5-E,J22;����-22;����-222�222�222222K�F2� 2222;I�K-222;I��H222F22,H2222KK�-�2� 22
22JJ222�F,�F22�����4��5-,EK22;�-���222;I�J�222�222H2222FH�JH2� 2222;I��J222;I��,222E22F,2222��F�E2� 22
22JI22�-,I--22�����4��5�-J-222;I��H222;I���222�2�--222��H�,F2� 2222;I��H222;I���222�2�--222��H�,F2� 22
22I-22��IEFH22�����4��5�E-J222;I��,222;I���222�22F,222�I,�K�2� 2222;I��,222;I���222�22F,222�I,�K�2� 22
22I�22��KFHI22�����4��5��J�222;I���222;I��F222�22,-222�E-��E2� 2222;I���222;I��F222�22,-222�E-��E2� 22
22IE22�FH�HI22�����4��5�F,-222;I�J�222;I�KK222�22�-2222H��F�2� 2222;I�FF222;I��F222E22JK222��,�FF2� 22
22IF22��JF,�22�����4��5�FIH22;�-�F,22;�-�-E222�222�2222E,�J�2� 2222;I�EI222;I��-222�22��222�,,�JE2� 22
22I�222EFE�K22�����4��5-EIH22;�E��J222;I��-222�22,H222K-J�H�2 222;�E��J222;I��-222�22,H222K-J�H�2 22
22I,222�EE,J22�����4��5-�IJ222;I�J�222;I�-I222�22FJ2222H����2� 2222;I�J�222;I�-I222�22FJ2222H����2� 22
22IH222�KKK-22�����4��5-EF�222;I�EI222;I�-H222�22II222�,��EJ2� 2222;I�EI222;I�-H222�22II222�,��EJ2� 22
22IK22FFIH-�22�����4��5�KJH22;�-�-E222;I�-H222�22�,2222�,��I2� 2222;I�IE222;I�-H222E22FK2222,F�,I2� 22
22IJ222FJKFK22�����4��5-�,-222;I�FE222;I�-H222�22�I2222��H�K2� 2222;I�FE222;I�-H222�22�I2222��H�K2� 22
22II22FEJE--22�����4��5�KHH222;I�E�222;I�-,222�22I,222�KH�IH2� 2222;I�E�222;I�-,222�22I,222�KH�IH2� 22
2�--222,HFKJ22�����4��5-HJ�222;I�-I222;I�-,222�22I-222E�H�,J2� 2222;I�-I222;I�-,222�22I-222E�H�,J2� 22
2�-�222I-F��22�����4��5-I�F222;I���222;I�-�222�22�I222�EH�KJ2� 2222;I���222;I�-�222�22�I222�EH�KJ2� 22
2�-E22F-JJ�J22�����4��5�HIJ222;I�EJ222;I�-F222�22H�222�,J�H�2� 2222;I�EJ222;I�-F222�22H�222�,J�H�2� 22
2�-F222H�JK,22�����4��5-K,-222;I�JJ222;J�IF222�222�2222,K�-�2� 2222;I�,E222;I�-�222E22KE222�-,��,2� 22
2�-�222I,,-�22�����4��5-IIF222;I�FH222;I�-�222�22J�222�FJ�FH2� 2222;I�FH222;I�-�222�22J�222�FJ�FH2� 22
2�-,22���H-I22�����4��5���I222;I��K222;I�--222�22K,222��,��K2� 2222;I��K222;I�--222�22K,222��,��K2� 22
2�-H222J�K�K22�����4��5-JHF222;I���222;I�--222�22II2222E-I��2� 2222;I���222;I�--222�22II2222E-I��2� 22
2�-K22�--J,K22�����4��5�-�I22;�-�-,222;I�I,222�22FF2222�E�H,2� 2222;I�EH222;J�IK222E22�F222�HF��F2� 22
2�-J22�-FKKI22�����4��5�-HI222;I�-H222;J�I,222�22HH2222EEK�E2� 2222;I�-H222;J�I,222�22HH2222EEK�E2� 22
2�-I222��K��22�����4��5-�IF222;I��F222;J�I,222�22FF222E-��EK2� 2222;I��F222;J�I,222�22FF222E-��EK2� 22
2��-222H,JEJ22�����4��5-K,I222;I�FK222;J�JF222�222�2222�F,�E2� 2222;I�EK222;J�I,222E22KK222�,I�IF2� 22
2���222EFJFF22�����4��5-F--22;�-�-H222;I�F-222�222K2222���IE2� 2222;I�FE222;J�I�222F22F�222��K��E2� 22
2��E22FFIH��22�����4��5�KJK222;I�-H222;J�IF222�22IK222EEI�EJ2� 2222;I�-H222;J�IF222�22IK222EEI�EJ2� 22
2��F222�K,J-22�����4��5-EEJ222;I��F222;J�IE222�22,�222E-E��E2� 2222;I��F222;J�IE222�22,�222E-E��E2� 22
2���22FE-E�K22�����4��5�KFF222;I�IF222;I�K-222�22EF2222,E�E�2� 2222;J�IJ222;J�IE222E22K,222EHE�J,2� 22
2��,22E-IIF�22�����4��5�,KI222;I��-222;J�I�222�22,K222�EK�I�2� 2222;I��-222;J�I�222�22,K222�EK�I�2� 22
2��H222FKJJ�22�����4��5-��-222;I�FE222;J�I�222�22�I222��H�H�2� 2222;I�FE222;J�I�222�22�I222��H�H�2� 22
2��K222�-�-J22�����4��5-�-K222;J�IH222;J�I-222�22HJ222EK��KJ2� 2222;J�IH222;J�I-222�22HJ222EK��KJ2� 22
2��J222�-�JF22�����4��5-��F222;I�-K222;J�JJ222�22JK222EEF�EI2� 2222;I�-K222;J�JJ222�22JK222EEF�EI2� 22
2��I22��JE-J22�����4��5�E--222;I�KI222;J�JJ222�22EJ2222HH��,2� 2222;I�KI222;J�JJ222�22EJ2222HH��,2� 22
2�E-222FHJE�22�����4��5-�EJ222;I�-�222;J�JJ222�22KJ222E�I��K2� 2222;I�-�222;J�JJ222�22KJ222E�I��K2� 22
2�E�222,,HFH22�����4��5-HJ-222;I�-F222;J�JJ222�22I,222E�-��J2� 2222;I�-F222;J�JJ222�22I,222E�-��J2� 22
2�EE222IEJEJ22�����4��5-IHI222;I��,222;J�JJ222�22IK222�I,�JJ2� 2222;I��,222;J�JJ222�22IK222�I,�JJ2� 22
2�EF22�KHFEK22�����4��5�,�E222;I�EK222;I��H222�22EE222�H��-,2� 2222;I�-I222;J�JK222F22FI222E�,��F2� 22
2�E�22�KHFEJ22�����4��5�,�F222;I�,,222;I�,,222�222�2222II�JE2� 2222;I�-�222;J�JK222F22�F222EF��KI2� 22
2�E,2222E-,E22�����4��5--�J222;I�,K222;J�JK222�22KE2222IH�-K2� 2222;I�,K222;J�JK222�22KE2222IH�-K2� 22
2�EH222E�J,I22�����4��5-F��222;I��-222;J�JK222�2�--222E���JJ2� 2222;I��-222;J�JK222�2�--222E���JJ2� 22
2�EK222�,,KH22�����4��5-,�I222;I��,222;I�FK222�22EH222��K�IH2� 2222;I�-F222;J�JK222E22KE222E�-�IH2� 22
2�EJ222I-KFK22�����4��5-I,-222;J�IF222;J�JH222�22I�222EJ��HF2� 2222;J�IF222;J�JH222�22I�222EJ��HF2� 22
2�EI22�EHK�-22�����4��5�EJF22;�-�I-222;J�J,222�22�F2222�-�E�2� 222;�-�I-222;J�J,222�22�F2222�-�E�2� 22
56
7�( ����!��(8������� ���������������+&�
rang NSC RA (%) MDE2
1 86005 70 -18.34
2 130813 65 -16.02
3 307241 100 -15.35
4 47949 103 -13.00
5 292213 104 -12.98
6 362868 100 -12.55
7 371878 99 -12.55
8 23925 95 -12.40
9 100880 97 -12.29
10 13572 103 -12.25
11 84094 103 -12.17
12 109509 90 -11.68
13 90630 96 -11.36
14 51070 107 -11.16
15 371682 106 -11.11
16 211332 100 -11.04
17 201430 113 -11.03
18 26645 102 -10.91
19 48693 26 -10.86
20 136727 111 -10.84
21 12363 107 -10.58
22 371876 98 -10.54
23 327702 108 -10.36
24 120688 108 -10.33
25 351123 102 -10.33
26 13728 interakcije -10.32
27 255980 114 -10.29
28 23922 91 -10.23
29 48010 105 -10.22
30 47924 101 -10.16
31 327704 106 -10.13
32 113491 99 -10.08
33 90841 107 -10.06
34 120686 105 -9.99
35 302042 104 -9.91
36 108608 96 -9.87
37 116805 99 -9.85
38 45572 103 -9.80
39 150289 108 -9.73
40 98905 103 -9.71
41 90829 101 -9.69
42 371880 89 -9.68
43 154572 103 -9.67
rang NSC RA (%) MDE2
44 16211 95 -9.66
45 163443 108 -9.66
46 79050 115 -9.64
47 528168 98 -9.63
48 48160 106 -9.60
49 101984 108 -9.57
50 176555 97 -9.54
51 50567 107 -9.54
52 53892 112 -9.54
53 112546 102 -9.53
54 3354 103 -9.52
55 371884 89 -9.51
56 164640 58 -9.49
57 54278 107 -9.43
58 153625 97 -9.42
59 201579 100 -9.42
60 42816 101 -9.42
61 125201 100 -9.41
62 130830 91 -9.41
63 169453 99 -9.41
64 117274 100 -9.39
65 600067 99 -9.39
66 13726 interakcije -9.38
67 407628 106 -9.38
68 89110 108 -9.38
69 109593 106 -9.37
70 44480 107 -9.37
71 117614 104 -9.36
72 154020 108 -9.36
73 170561 101 -9.36
74 122405 110 -9.35
75 327447 106 -9.34
76 13028 85 -9.31
77 126757 98 -9.30
78 9608 93 -9.27
79 44477 100 -9.23
80 7814 92 -9.21
81 101825 ni spojine -9.20
82 35489 105 -9.19
83 57975 108 -9.19
84 141562 100 -9.18
85 154829 108 -9.18
86 47938 110 -9.17
rang NSC RA (%) MDE2
87 19147 ni spojine -9.16
88 43513 97 -9.15
89 105900 112 -9.14
90 119236 101 -9.14
91 117369 104 -9.13
92 136469 107 -9.13
93 148354 100 -9.10
94 23217 107 -9.10
95 42258 95 -9.09
96 17770 96 -9.06
97 339601 82 -9.06
98 38737 95 -9.06
99 328200 103 -9.05
100 56378 98 -9.05
101 90311 104 -9.04
102 308848 101 -9.03
103 64875 94 -9.01
104 95501 88 -9.01
105 114609 102 -9.00
106 81747 109 -9.00
107 100857 98 -8.97
108 103779 106 -8.95
109 14711 111 -8.95
110 65828 101 -8.95
111 23833 113 -8.94
112 339614 97 -8.93
113 17580 111 -8.92
114 320217 100 -8.92
115 209931 106 -8.91
116 37881 99 -8.91
117 10408 100 -8.90
118 10483 109 -8.88
119 118208 102 -8.88
120 36824 107 -8.88
121 55636 107 -8.88
122 92828 98 -8.88
123 176327 64 -8.87
124 176328 ni spojine -8.87
125 2052 100 -8.87
126 24859 110 -8.87
127 45576 97 -8.87
128 90737 104 -8.86
129 126710 99 -8.85