ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza

Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Hà Nội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

KHOA Y DƢỢC

ĐẶNG THỊ NGẦN

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƢỢNG

CRYPTOTANSHINON TỪ CÂY ĐAN SÂM (Salvia miltiorrhiza

Bunge.) PHỤC VỤ CÔNG TÁC ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG

DƢỢC LIỆU ĐAN SÂM

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƢỢC HỌC

Khóa : QH.2012.Y

Ngƣời hƣớng dẫn : TS. NGUYỄN HỮU TÙNG

Hà Nội – 2017

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS

Nguyễn Hữu Tùng, giảng viên Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc, Khoa Y

Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội. Thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và dìu dắt em

trong quá trình học tập và làm khóa luận tốt nghiệp. Nhờ có sự chỉ bảo của thầy mà

em đã trưởng thành và cố gắng học hỏi thêm nhiều để hoàn thành được khóa luận tốt

nghiệp này.

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban chủ nhiệm Khoa, các thầy cô trong

Khoa Y Dược đặc biệt là Bộ môn Hóa dược và Kiểm nghiệm thuốc đã giúp đỡ và tạo

điều kiện tốt nhất giúp em hoàn thành khóa luận này.

Em xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED)- Đề tài mã số 106-YS.05-2015.05 đã tài trợ cho em trong quá trình làm

thực nghiệm đề tài.

Cảm ơn những thành viên của lớp K57 Dược học đặc biệt là các bạn Bích, Huệ,

Hào - những người đã đồng hành cùng mình trong suốt thời gian qua.

Cuối cùng, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, những người đã luôn

giúp đỡ, động viên, chia sẻ với con, giúp con có thêm động lực cố gắng mỗi ngày.

Hà Nội, ngày 31 tháng 5 năm 2017

Đặng Thị Ngần

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13C-NMR Carbon (13) Nuclear magnetic resonance

ESI-MS Khối phổ - ion hóa phun mù electron

(Electron Spray Ionisation – Mass Spectrometry)

EtOAc Ethyl acetat

EtOH Ethanol

1H-NMR Proton nuclear magnetic resonance

HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

IR Phổ hồng ngoại (Infrared spectrum)

MeOH Methanol

Mp Điểm nóng chảy

LOD Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ Giới hạn định lượng (Limit of Quantitation)

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

RSD Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SKĐ Sắc ký đồ

TLC Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)

UV Tử ngoại (Ultraviolet)

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình Tên hình Trang

Hình 1.1 Cấu trúc một số abietane diterpenoid 3

Hình 1.2 Cấu trúc một số acid phenolic 4

Hình 1.3 Cấu trúc một số triterpenoid có trong chi Salvia L. 5

Hình 1.4 Cấu trúc cryptotanshinon 8

Hình 1.5 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 15

Hình 2.1 Một số hình ảnh cây đan sâm thu hái tại vườn dược liệu Sa Pa 19

Hình 3.1 Cấu trúc cryptotanshinon 29

Hình 3.2 Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế được 30

Hình 3.3 Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng 31

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic

cryptotanshinon

35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

Bảng 3.1 Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập được 28

Bảng 3.2 Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế được 29

Bảng 3.3 Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế được 31

Bảng 3.4 Chương trình sắc ký HPLC 32

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lượng

cryptotanshinon tinh chế được 33

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính 34

Bảng 3.7 Kết quả phân tích độ lặp lại của phương pháp 36

Bảng 3.8 Kết quả phân tích độ đúng của phương pháp 37

Bảng 3.9 Kết quả phân tích định lượng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa 37

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN…………………………………………………….........2

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM ........................................................................................... 2

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................................ 2

1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm .................................................................... 2

1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm ....................................................................... 5

1.1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền ........................................................ 6

1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON .................................................................... 8

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU .......................... 9

1.3.1. Phương pháp sắc ký ............................................................................................... 9

1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ............................................. 12

1.3.3. Phương pháp phân tích khối phổ (MS) ................................................................ 13

1.3.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................... 14

1.3.5. Phương pháp đo nhiệt độ nóng chảy .................................................................... 18

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 19

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ................................................. 19

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ....................................................................................... 19

2.1.2. Dung môi, hóa chất .............................................................................................. 19

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu ......................................................... 20

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................................... 20

2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học ........................................................................... 20

2.2.2. Xây dựng phương pháp HPLC ............................................................................. 21

2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................................... 22

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 24

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .............................................................................................. 24

3.1.1. Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm ............................................. 24

3.1.2. Xác định cấu trúc của cryptotanshinon ................................................................ 27

3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất ........................................................ 29

3.1.4. Xây dựng phương pháp định lượng bằng HPLC ................................................. 31

3.1.5. Sử dụng phương pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính, định

lượng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai ................................................................ 37

3.2. THẢO LUẬN ................................................................................................................... 38

3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon .................................................... 38

3.2.2. Xây dựng phương pháp phân tích định lượng cryptotanshinon ........................... 38

3.2.3. Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào Cai .... 39

KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1

MỞ ĐẦU

Đan sâm có tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge. (họ Lamiaceae), là một

cây thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc hiện nay được trồng nhiều và sinh trưởng tốt ở

vùng Tây Bắc nước ta. Dược liệu đan sâm (Radix Salviae miltiorrhiza) là rễ phơi khô

hoặc sấy khô của cây đan sâm, thường được dùng để chữa bệnh tim, kinh nguyệt không

đều, phong thấp, thần kinh suy nhược, mất ngủ… Trong y học cổ truyền Trung Quốc,

Việt Nam, Hàn Quốc, đan sâm là thuốc tăng cường tuần hoàn máu, chữa đau nhói ở

ngực và bụng, nhiễm khuẩn da, bồn chồn, chứng to gan lách, đau thắt ngực, đột quỵ

[7,14,20]. Nghiên cứu y học hiện đại cho thấy đan sâm đặc biệt tốt cho tim mạch, làm

giãn mạch và tăng lưu lượng động mạch vành, cải thiện vi tuần hoàn, phòng chống tích

cực tình trạng thiếu máu, làm chậm việc hình thành mảng xơ vữa động mạch [1].

Ở Việt Nam, nghiên cứu về đan sâm đang được quan tâm để phát triển ứng dụng

dược liệu quý này. Các kết quả nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy đan sâm có các

thành phần tanshinon bao gồm dihydrotanshinon I, tanshinonate methyl ester,

trijuganon B, cryptotanshinon, tanshinon IIA và tanshinon I… Trong đó,

cryptotanshinon (1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl- (R) -phenanthro (1,2-b) furan-

10,11-dion) là một trong các thành phần tanshinon chính của đan sâm [25].

Cryptotanshinon màu nâu, không hòa tan trong nước nhưng tan trong một số dung môi

hữu cơ; có nhiều hoạt tính sinh học và dược lý như kháng khuẩn, chống oxy hóa,

chống viêm, chống ung thư,... [3].

Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đan sâm đã được công bố trong nước và quốc

tế, với mục tiêu xây dựng cơ sở khoa học về thành phần hoạt chất dược liệu đan sâm,

đề tài “Nghiên cứu phân lập và định lƣợng cryptotanshinon từ cây đan sâm

(Salvia miltiorrhiza Bunge.) phục vụ công tác đánh giá chất lƣợng dƣợc liệu đan

sâm” được tiến hành với mục tiêu chiết xuất, phân lập và phân tích cryptotanshinon

trong dược liệu đan sâm bao gồm các nội dung nghiên cứu như sau:

- Chiết xuất, phân lập và xác minh cấu trúc cryptotanshinon từ rễ đan sâm thu hái ở

Lào Cai.

- Xây dựng và thẩm định được phương pháp phân tích cryptotanshinon sử dụng

HPLC.

2

CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN

1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐAN SÂM

1.1.1. Đặc điểm thực vật và phân bố

Cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) thuộc chi Salvia, họ Bạc hà

(Lamiaceae) còn gọi là đơn sâm, huyết sâm, xích sâm; cây cỏ sống lâu năm, cao 30-80

cm, toàn thân mang lông ngắn màu vàng trắng nhạt. Rễ nhỏ dài hình trụ, đường kính

0,5-1,5 cm, màu đỏ nâu. Thân vuông trên có các gân dọc. Lá kép, mọc đối 3-5 lá chét,

đặc biệt có thể có 7 lá. Lá chét mọc giữa thường lớn hơn cả. Lá kép có cuống dài,

cuống lá chét ngắn có dìa. Lá chét dài 2-7,5 cm, rộng 0,8-5 cm. Mép lá chét có răng

cưa tù. Mặt trên lá chét màu xanh, có các lông mềm màu trắng, mặt dưới màu xanh

tro, cũng có lông nhưng dài hơn. Gân nổi ở mặt dưới, chia phiến lá thành nhiều múi

nhỏ. Cụm hoa mọc thành chùm ở đầu cành hay kẽ lá, chùm hoa dài 10-20 cm. Hoa

mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường là 5 hoa. Hoa có tràng màu xanh tím nhạt, 2

môi, môi trên trông nghiêng hình lưỡi liềm, môi dưới xẻ 3 thùy, thùy giữa có răng cưa

tròn. Hai nhị ở môi dưới, bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, dài 3 mm, rộng 1,5

mm [1,14].

Salvia miltiorrhiza Bunge. được phân bố rộng rãi ở miền Bắc Trung Quốc. Nó

cũng có mặt tại Nhật Bản [33]. Cây đan sâm Việt Nam có nguồn gốc Trung Quốc thích

hợp với đất cát ẩm, được trồng bằng rễ vào mùa xuân [1,6]. Cây trồng ở trại thuốc Sa

Pa (Viện Dược liệu) thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Cây sinh

trưởng phát triển tương đối tốt, ra hoa quả hàng năm. Một số cây đưa xuống trại thuốc

Tam Đảo (Viện Dược liệu) sinh trưởng kém hơn. Cây trồng tốt nhất vào tháng 2-3 để

đến tháng 11-12 thu hoạch [1]. Mùa hoa từ tháng 5-8 (Tam Đảo), mùa quả tháng 6-9

[14]. Thu hoạch rễ từ cuối mùa thu đến đầu mùa xuân [6].

1.1.2. Thành phần hóa học của cây đan sâm

Thành phần hóa học chính trong cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) là

acid phenolic, diterpenoid, flavonoid và một số thành phần khác. Bộ phận trên mặt đất

của loài này có chứa flavonoid, triterpenoid và monoterpenoid đặc biệt là trong hoa và

lá. Trong khi đó, diterpenoid và acid phenolic lại được tìm thấy chủ yếu ở rễ [31].

3

Các thành phần hoạt chất chính trong rễ của đan sâm đã được chia thành hai

nhóm là tanshinon tan trong lipid và acid phenolic tan trong nước. Đến nay, hơn 20

acid phenolic phân lập từ rễ cây đan sâm đã được nghiên cứu. Các chất có hoạt tính

thân dầu tanshinon diterpenoid, bao gồm tanshinon I, tanshinon IIA, cryptotanshinon,

và vv. Hơn 30 tanshinon và quinon diterpenoid đã được phân lập và sinh tổng hợp [36].

a. Diterpenoid

Các hợp chất diterpenoid là các chất tan trong nước và có hơn 30 loại

diterpenquinon. Thành phần chính trong nhóm abietane diterpenoid là các tanshinon

như tanshinon I, II, III, sau đó đến isotanshinon I, II, isocryptotanshinon và

cryptotanshinon. Tỉ lệ các tanshinon quinon là tanshinon I từ 0,12-0,32%, tanshinon

IIA từ 0,02-0,32%, methylen tanshinquinon là 0,05-0,15% [26] (hình 1.1).

19 R = R1 = H, Δ5(10),6(7),15(16)

22 23 Δ15(16)

20 R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

24

21 R = R1 = OH, Δ15(16)

25 R = R1 = H, Δ5(10),6(7)

19-21.Tanshinon I, II, III 24. Isocryptotanshinon

22-23. Isotanshinon I, II 25. Cryptotanshinon

Hình 1.1. Cấu trúc một số abietane diterpenoid

b. Các dẫn xuất của acid phenolic

Các acid phenolic là thành phần chính trong nhóm chất tan được trong nước của

rễ cây đan sâm. Thành phần chính của nhóm này là acid rosmarinic và các acid

salvianolic từ A- K [30].

4

Hình 1.2. Cấu trúc một số acid phenolic

Acid caffeic đóng vai trò trung tâm trong tác dụng sinh hóa của họ Lamiaceae,

trong đó dạng dimer là quan trọng nhất như acid rosmarinic.

c. Flavonoid

Flavonoid là thành phần có mặt trong bộ phận trên mặt đất của cây đan sâm như

hoa và lá. Gồm flavon, flavonol và các dẫn xuất của chúng [30].

- Flavon và aglycon flavon: thành phần chính là apigenin (5,7,4’- trihydroxyflavon) và

luteolin (5,7,3’, 4’- tetrahydroxyflavon) và các dẫn xuất 6- hydroxylate của chúng.

- Flavon và flavonol glycoside trong đó có các flavon 7-glycoside như apigenin 7-

glucoside (cosmosiin), luteolin 7-glucoside (cinaroside) và các 7-glucuronide tương

ứng của chúng.

5

- Các flavonoid khác như: các anthocyanin là thành phần có mặt rất nhiều trong các

hoa đỏ hay đỏ tía ở các loài thuộc chi Salvia L.

d. Một số thành phần khác

Ngoài ra còn có các thành phần khác như: triterpenoid, β- sitosterol, tanin,

vitamin E, polysaccarid [27].

R R1 R2 R3 R4

1 R=H, R1=R2=Me, R3=H 3 OH OH H Me Me 4

2 R=R1=H, R2=R3=Me 5 OH H H Me Me

1.Acid ursolic 2. Acid oleanolic 3. Anagadiol 4. Taraxerol 5.Germanicol

Hình 1.3. Cấu trúc một số triterpen oid có trong chi Salvia L.

1.1.3. Tác dụng sinh học của cây đan sâm

Hiện nay có nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý của loài Salvia miltiorrhiza

Bunge. Các tác dụng đã được chứng minh bao gồm:

- Làm giãn mạch vành, chống huyết khối, chống thiếu máu cục bộ. Các tác dụng này

do các thành phần tanshinon IIA, acid rosmarinic, danshensuan B, acid salvinolic B,

militron và salvinon. Ngoài ra, đan sâm còn được chứng minh có tác dụng chống đau

thắt ngực [12,26,35].

- Tác dụng làm hạ đường huyết do có chứa thành phần là acid polyphenolic [34].

- Rễ đan sâm có tác dụng hạ lipid máu, ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở tế bào [11,

28].

- Tác dụng an thần do thành phần miltiron, do đó được sử dụng điều trị chứng mất ngủ

[5,28].

6

- Dịch chiết đan sâm có tác dụng chống vi khuẩn, kể cả vi khuẩn Staphylococus kháng

thuốc. Các thành phần như dihydrotanshinon I, hydroxytanshinon II-A, tanshinon II-B,

cryptotanshinon và methyl tanshinat được chứng minh có tác dụng chống vi khuẩn

Staphylococus aureus [1,33,39].

- Chống nấm, tốt cho trường hợp nấm ngoài da, mụn trứng cá, rụng tóc, ngứa và mày

đay [26].

- Hoạt tính chống viêm do thành phần tanshinon IIA có tác động trên hệ miễn dịch[20].

- Hoạt tính chống oxy hóa mạnh gây bởi dihydrotanshinon I [26], acid salvinolic A, B,

acid rosmarinic [1], và các chất thuộc nhóm polysaccarid [27].

- Mang lại lợi ích cho bệnh nhân suy thận mạn tính [26].

- Tanshinon IIA còn có tác dụng chống ung thư [29,31].

- Đan sâm có tác dụng làm mềm và thu nhỏ thể tích của gan và lá lách khi sưng to do

bệnh gan và huyết hấp trùng, có tác dụng an thần, gây ngủ và tác dụng làm giảm các

huyết quản nhỏ [23].

- Ngoài ra, tanshinon trong đan sâm còn có tác dụng lên hormon sinh dục, làm tăng nhẹ

estrogen và androgen trên chuột [29].

1.1.4. Tác dụng và công dụng theo y học cổ truyền

- Tính vị: vị đắng, tính hàn.

- Quy kinh: quy vào 2 kinh tâm, can.

- Tác dụng và công dụng:

+ Hoạt huyết, trục huyết ứ: dùng để trị vô kinh, hành kinh không đều, đau bụng kinh,

bế kinh, sau khi đẻ huyết ứ đọng gây đau bụng; các trường hợp do chấn thương mà cơ

gân sưng tấy đau đớn [6].

+ Dưỡng tâm an thần: dùng trong các bệnh tâm hồi hộp, mất ngủ, suy nhược thần kinh;

dùng trong bệnh co thắt động mạch vành tim, phối hợp với đương quy, táo nhân [6,14].

Ngoài ra còn dùng để chữa bệnh nhồi máu cơ tim, đau thắt ngực, tâm hư phiền nhiệt

[30].

7

+ Bổ huyết: có thể dùng đối với các bệnh thiếu máu, đặc biệt đối với các bệnh mặt

nhợt nhạt, xanh xao của phụ nữ chưa có chồng. Khi dùng với tính chất bổ huyết thì

dùng đan sâm dạng không qua chế biến.

+ Bổ can tỳ: dùng trong các trường hợp gan và lá lách bị sưng to, trị bệnh huyết hấp

trùng đều có hiệu quả [4,6].

+ Giải độc: dùng trong các trường hợp sang lở, mụn nhọt [6].

+ Đây còn được xem là thuốc dùng tốt cho trường hợp đau dạ dày hay viêm vú [14,30].

+ Đan sâm còn được dùng để điều trị các bệnh viêm gan, xơ gan, suy thận mạn tính,

tiểu đường và các biến chứng của tiểu đường [34].

- Liều dùng: 8- 20 g [6].

Chú ý: không dùng chung với Lê lô [23].

8

1.2. TỔNG QUAN VỀ CRYPTOTANSHINON

Cryptotanshinon còn được gọi là cryptotanshinone hoặc tanshinon C, là một

diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây Salvia miltiorrhiza Bunge.,

Hình 1.4. Cấu trúc cryptotanshinon

+ Tên IUPAC: 1,2,6,7,8,9-hexahydro-1,6,6-trimethyl-(R)-phenanthro(1,2-b)furan-

10,11-dione.

+ Công thức phân tử: C19H20O3.

+ Khối lượng phân tử: 296,36 g/mol.

+ Màu sắc: bột màu cam nâu.

+ Điểm nóng chảy: 183°C.

+ Độ tan: cryptotanshinon không hòa tan trong nước, nhưng tan trong dimethyl

sulfoxide, methanol, ethanol, cloroform và ether, và chuyển sang màu đỏ khi tương tác

với acid sulfuric đậm đặc. Cryptotanshinon thuộc dẫn xuất phenanthraquinon, khi tiếp

xúc với ánh sáng sẽ xảy ra phản ứng quang hóa. Ngoài ra, độ hòa tan của

cryptotanshinon thay đổi chút ít giữa pH từ 2 đến pH 8.

+ Độ ổn định : cryptotanshinon cần được bảo vệ tránh ánh sáng và dưới điều kiện khô

mát (2- 8°C).

Cryptotanshinon đã được tổng hợp bởi Hiroshi Kakisawa và Yoshinobu Inouye,

hai nhà hóa học Nhật Bản, vào năm 1969. Tổng hợp các cryptotanshinon mất nhiều

bước, liên quan đến phản ứng của sản phẩm cộng Diels-Alder giữa 3

methylbenzofuran-4,7-quinon và 6,6-dimethyl-1-vinylcyclohexene trong ethanol ở

O

O

O

Tanshinone I (2)Tanshinone IIA (1) Cryptotanshinone (3)

1

2

3 45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

18

O

O

O

1

2

3

45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

1819

O

O

O

1

2

3 45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

18 19

9

nhiệt độ phòng, tiếp theo là quá trình oxy hóa không khí và thêm với acid sulfuric đậm

đặc trong ethanol, xúc tác bởi 5% Pd-C (Palladium trên carbon) [25].

+ Tác dụng sinh học: cryptotanshinon được phân lập từ rễ của cây đan sâm, có hoạt

tính kháng khuẩn mạnh, chống dermatophytic, chất chống oxy hóa, chống viêm và

chống ung thư, hoạt động của cryptotanshinon cũng có thể ức chế các tế bào sản xuất

endothelia endothelin-1 và tạo ra sự khác biệt của một số tế bào như các tế bào gốc

trung mô tủy xương [3].

1.3. TỔNG QUAN MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TRONG NGHIÊN CỨU

1.3.1. Phƣơng pháp sắc ký

Quá trình nghiên cứu phân lập hợp chất từ phân đoạn đã chọn sử dụng phương

pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ silica gel pha thường, pha đảo. Sắc ký lớp mỏng

được dùng để theo dõi vết các chất từ dịch chiết phân đoạn và kiểm tra độ tinh khiết

của các chất phân lập. Đặc điểm chính của những phương pháp sắc ký sử dụng trong

nghiên cứu [31].

a. Sắc ký cột

Sắc ký cột được tiến hành ở điều kiện áp suất khí quyển. Pha tĩnh là những hạt

có kích thước tương đối lớn (50-150 µm), được nạp trong cột thủy tinh. Mẫu chất cần

phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp

mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phái trên cao. Dung môi

giải ly ra khỏi cột ở phần bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn

ra của cột. Phương pháp này thường làm cho quá trình tách bị chậm, hiệu quả thấp so

với sắc ký lỏng cao áp (HPLC). Tuy vậy, sắc ký cột cũng có ưu điểm là pha tĩnh và các

dụng cụ rẻ tiền, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng mẫu tương đối lớn. ¾ Các

bước thực hiện sắc ký cột gồm:

- Lựa chọn chất hấp phụ: pha tĩnh là silicagel loại thường, hợp chất không phân cực

được giải ly khỏi cột trước, hợp chất phân cực được giải ly sau. Với 2 phân tử không

phân cực, phân tử nào có trọng luợng phân tử lớn sẽ có tính phân cực mạnh hơn phân

tử kia, nó bị pha tĩnh giữ lại trong cột nên di chuyển ra khỏi cột chậm hơn so với các

phân tử nhỏ, và cũng có khi nó ở lại lâu hơn trong cột so với phân tử tuy có tính phân

cực.

10

- Lựa chọn dung môi: Mẫu cần sắc ký đuợc hoà tan hoàn toàn trong dung môi phù hợp

với nồng độ 10 mg/ml, gọi là dung dịch mẫu (A). Chuẩn bị 4-6 tấm bản mỏng 2,5x10

cm. Chấm lên những tấm bản này mỗi tấm khoảng 2-5 µl dung dịch (A). Mỗi bản

mỏng được triển khai với một loại dung môi giải ly khác nhau, kế đó phát hiện bằng

đèn UV hay thuốc thử. Với đơn dung môi sẽ dễ dàng thấy được dung môi nào phù hợp.

Từ kết quả đó, tìm một hỗn hợp dung môi, trong đó một dung môi phân cực và một

dung môi kém phân cực thí dụ như ete dầu hỏa (etyl acetat).

- Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột: dùng kẹp giữ cho cột thẳng đứng trên giá, cho

dung môi loại kém phân cực nhất vào khoảng 2/3 chiều cao cột. Cho chất hấp thu dạng

khô vào thẳng trong cột, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa cho vừa gõ nhẹ vào

thành cột. Khi lớp chất hấp thu đạt được chiều cao khoảng 2 cm trong cột, thì mở nhẹ

khoá ở bên dưới để cho dung môi chảy ra, hứng vào một becker trống để bên dưới cột,

dung môi này dẽ được rót lại lên đầu cột. Sau khi nạp xong, cho dung môi chảy qua

chất hấp thu vài lần đến khi chất hấp thu trong cột đồng nhất.

- Nạp mẫu: mẫu ở dạng lỏng cho trực tiếp lên đầu cột sắc ký. Nếu mẫu dạng rắn thì hoà

tan mẫu chất vào trong một lượng nhỏ dung môi, loại dung môi cho khởi đầu sắc ký.

- Hứng và gom dịch rửa giải: quá trình rửa giải, dịch rửa được hứng bằng ống thủy

tinh. Dịch rửa giải trong các ống được gom lại dựa vào kết quả phân tích sắc ký lớp

mỏng [3,9,21,24].

b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Nguyên tắc

Dựa vào hệ số phân tách khác nhau của chất cần phân tích giữa 2 pha: pha động

và pha tĩnh. Chất cần phân tích được hấp phụ (hoặc phân bố, trao đổi ion) trên pha tĩnh,

pha động chạy qua pha tĩnh đồng thời kéo theo chất cần phân tích. Dựa vào hệ số phân

bố khác nhau của mỗi chất đối với pha động và pha tĩnh ta có thể tách riêng từng thành

phần trong hỗn hợp phân tích. Các thành phần sau khi được phân tách riêng biệt khỏi

hỗn hợp được lưu giữ trên pha tĩnh.

Sau đó có thể nhận biết chất cần phân tích bằng ánh sáng thường (nếu các chất

phân tích có màu) hoặc soi huỳnh quang ở các bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc phun

thuốc thử hiện màu, hoặc quét lên bề mặt bản mỏng thiết bị densitometer (một thiết bị

11

đo cường độ phản xạ ánh sáng tử ngoại hoặc khả kiến của chất cần phân tích). Tuỳ

thuộc bản chất của chất cần phân tích ta có thể sử dụng một trong các phương pháp

trên để phát hiện vết chất trong hỗn hợp cần phân tích.

- Các đại lượng đặc trưng

+ Hệ số lưu giữ Rf

Đại lượng đặc trưng cho mức độ dịch chuyển của các chất phân tích là hệ số lưu

giữ Rf. Trị số của nó được tính bằng tỷ lệ giữa khoảng cách di chuyển của chất phân

tích và khoảng cách dịch chuyển của pha động:

R

f

M

=d

Rd

(1)

Trong đó: dR là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm vết phân tích (cm)

dM là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi pha động

(đo trên cùng đường đi của vết, tính bằng cm)

Rf có giá trị dao động giữa 0 và 1

+ Hệ số lưu giữ tương đối Rr:

R,x

r

R,c

=d

Rd

(2)

Trong đó: dR,x : là đường đi của chất phân tích (cm)

dR,c : là đường đi của chất chuẩn (cm)

(Giá trị Rr càng gần 1 thì chất phân tích và chất chuẩn càng đồng nhất)

- Ứng dụng

+ Định tính

Thường dựa vào trị số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn chạy sắc ký trong cùng điều

kiện. Đôi khi do sắc ký không liên tục không xác định được tuyến dung môi pha động,

người ta dùng hệ số lưu giữ tương đối Rr để đặc trưng cho chất phân tích.

12

+ Thử tinh khiết

Dùng TLC để kiểm tra mức độ tinh khiết của các hợp chất thể hiện ở các vết lạ trên

sắc ký đồ

+ Định lượng: Có 2 cách để định lượng các chất trong vết sắc ký:

Cách 1: Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký bằng dung môi thích hợp. Sau khi

làm sạch dịch chiết, định lượng chất phân tích bằng một kỹ thuật thích hợp như phổ

hấp thụ, huỳnh quang, cực phổ... Phương pháp này hiện nay ít dùng vì có nhiều trở

ngại lại mất nhiều thời gian.

Cách 2: Định lượng trực tiếp trên bản mỏng, đo diện tích hay cường độ màu của vết

sắc ký. Hiện nay dùng 2 kỹ thuật:

Densitometer: Chiếu chùm tia vào vết sắc ký và đo cường độ huỳnh quang.

Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số: Quét bản mỏng với hệ thống phân tích hình ảnh,

nhất là camera kỹ thuật số có độ phân giải cao để thu nhận hình ảnh của vết sắc ký. Xử

lý dữ liệu bằng máy tính [3,9,21,22].

1.3.2. Phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR)

a. Nguyên tắc

Nếu hạt nhân nguyên tử có từ tính được đặt trong một từ trường, khi hay đổi từ

trường sẽ dẫn đến hấp thụ năng lượng của sóng vô tuyến và xuất hiện phổ cộng hưởng

từ hạt nhân.

Những hạt nhân nguyên tử có khối lượng là số lẻ và những hạt nhân nguyên tử có

khối lượng là số chẵn nhưng số thứ tự nguyên tử là số lẻ thì có momen từ và cho tín

hiệu NMR. Các hạt nhân nguyên tử có khối lượng và số thứ tự nguyên tử là những số

chẵn thì không có momen từ và không cho tín hiệu NMR. Vị trí của tín hiệu cộng

hưởng từ proton trong phổ NMR phụ thuộc vào mật độ điện tử ở vùng lân cận quanh

proton đó.

13

b. Các đại lƣợng đặc trƣng

- Độ chuyển dịch hoá học

Sự khác nhau về vị trí hấp thụ giữa proton của mẫu phân tích và của chất chuẩn

được gọi là độ chuyển dịch hoá học ()

mau TMS 6

ppm

may

-ν νδ = ×10

ν (3)

Trong đó:

: là độ dịch chuyển hoá học

mau : tần số của mẫu phân tích

TMS : là tần số của mẫu chuẩn tetramethylsilane

may : là tần số làm việc của máy

- Hằng số tương tác spin

Khoảng cách giữa các vạch của tín hiệu bội được biểu hiện bằng Hz, đặc trưng

cho sự tương tác spin gọi là hằng số tương tác spin (J). Trị số J phụ thuộc vào tương

quan không gian và mật độ điện tử ở vùng lân cận của 2 proton tương tác.

- Diện tích dưới tín hiệu

Diện tích dưới tín hiệu tỷ lệ với số lượng proton cho tín hiệu đó. Đường cong

tích phân diện tích dưới tín hiệu cho biết số lượng tương đối của proton cho tín hiệu.

- Ứng dụng của phổ NMR

Bằng cách xác định độ dịch chuyển hoá học , hằng số tương tác J và diện tích

dưới tín hiệu người ta có thể biện giải phổ và kết hợp với các thông tin của các loại

phổ khác như IR, MS từ đó xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ [2,3,22].

1.3.3. Phƣơng pháp phân tích khối phổ (MS)

a. Nguyên tắc

Dùng chùm điện tử có năng lượng trung bình (50 – 100 eV) để bắn phá phân tử

hữu cơ ở môi trường chân không cao (10-3

- 10-6

mmHg). Trong quá trình đó, chất hữu

cơ bị ion hoá và bị phá vỡ thành mảnh. Các ion được tạo thành trong buồng ion hoá,

14

được gia tốc và tách riêng nhờ bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương

ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau tập

hợp lại thành một khối phổ đồ hoặc phổ khối.

b. Ứng dụng của MS

- Xác định các đồng vị: Các nguyên tử đồng vị của cùng một nguyên tố có cùng số điện

tích hạt nhân chỉ khác nhau về số neutron trong nhân đó nên khối lượng nguyên tử

khác nhau. Có thể dùng MS để xác định thành phần các đồng vị của các nguyên tố

trong mẫu.

- Định tính

+ Phân tích khối phổ có thể cho rất chính xác khối lượng các ion phân tử M+, (M+1)

+,

(M+2)+, đây là các đặc trưng quan trọng của hợp chất hoá học. Bên cạnh đó xem xét

thêm các pic đồng vị, tỷ số cường độ của chúng cùng với khối lượng của các mảnh ion

có thể xác định công thức nguyên của chất phân tích.

+ Có thể so sánh phổ nghiên cứu với thư viện phổ có trong máy hoặc phổ nghiên cứu

với phổ chất đối chiếu để khẳng định thành phần định tính của mẫu.

- Xác định công thức cấu tạo: Để xác định công thức cấu tạo của chất nghiên cứu cần

dùng kỹ thuật ion hoá thích hợp phân tách chất nghiên cứu thành nhiều mảnh ion để

làm rõ cấu tạo ghép nối của chúng. Việc biện giải phổ nên phối hợp với phổ NMR và

phổ IR.

- Định lượng: Phân tích định lượng khối phổ tương tự như các kỹ thuật khác dùng cách

thiết lập đường chuẩn hoặc thêm đường chuẩn cùng với đo cường độ vạch phổ để xác

định nồng độ [2,3,22].

1.3.4. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

a. Nguyên tắc

Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp sắc ký tách các chất ra khỏi hỗn

hợp phân tích trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn

dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ trên một chất mang rắn, hay một chất

mang đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình sắc ký lỏng dựa trên cơ

chế hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ.

15

b. Một số thông số đặc trƣng của quá trình sắc ký

Hình 1.5. Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trƣng

-Thời gian lưu :

tR: (Thời gian lưu): là thời gian tính từ khi chất phân tích được tiêm vào hệ thống sắc ký

đến khi được phát hiện ở nồng độ cực đại của nó.

t0 (Thời gian chết): là thời gian cần thiết để pha động chảy qua hệ thống sắc ký

tR’(Thời gian lưu thực): tR

’= tR – t0

(Thời gian lưu là thông tin về mặt định tính của sắc ký đồ với một chất nhất định khi

tiến hành sắc ký trong một điều kiện nhất định).

W : là chiều rộng đáy pic.

W1/2 : là chiều rộng pic đo ở 1/2 chiều cao pic.

- Hệ số dung lượng k’:

Trong thực nghiệm hệ số dung lượng k’ được tính theo công thức:

R R 0 R

0 0 0

' -t t t tk'= = = -1

t t t (4)

Hệ số dung lượng cho biết khả năng phân bố của chất đó vào hai pha, tức là tỷ

lệ giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động tại thời điểm cân

bằng. Nếu k’ nhỏ thì tR cũng nhỏ, chất bị rửa giải gần với thời điểm bơm mẫu do đó làm

16

giảm khả năng tách, nếu k’ lớn quá thì sẽ dẫn đến doãng pic, độ nhạy thấp và thời gian

lưu kéo dài. Trong thực tế k’ nằm trong khoảng 2-5 là tốt nhất.

- Hệ số chọn lọc :

R,B 0B

R,A 0A

' -t tkα= =

' -t tk (k

’B k

’A) (5)

khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ ràng. Để tách riêng hai chất thường chọn

nằm trong khoảng 1,05 đến 2.

- Hiệu lực cột:

Hiệu lực cột được đánh giá thông qua 2 thông số: số đĩa lý thuyết (N) và chiều

cao đĩa lý thuyết (H). Cột sắc ký được coi như có N tầng lý thuyết, ở mỗi tầng sự phân

bố chất tan vào hai pha đạt đến một trạng thái cân bằng. Mỗi tầng được giả định như

một pha tĩnh có chiều cao H.

2

RtN=16

W

(6)

hay

2

R

1/2

tN=5,54

W

(7)

Nếu gọi L là chiều cao cột sắc ký thì chiều cao của đĩa lý thuyết H được tính bằng:

L

H = N

(8)

- Hệ số bất đối AF (tailing factor):

1/20WAF =

2a (9)

Hệ số bất đối AF cho biết mức độ cân đối của pic trên sắc ký đồ.

Trong đó:

W1/20 : là chiều rộng pic đo ở 1/20 chiều cao pic.

17

a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước

tại vị trí 1/20 chiều cao của pic.

Trong phép định lượng thì yêu cầu 0,9 ≤ AF ≤ 2.

Giá trị của AF càng gần 1 thì pic càng cân đối.

- Độ phân giải (resolution)

Độ phân giải đặc trưng cho mức độ tách 2 chất ra khỏi nhau trên một điều kiện

sắc ký. Độ phân giải của 2 pic kề nhau được tính theo công thức:

'R,B R,A R,B R,A B

S 'BB A 1/2B 1/2A

2 - 1,18 -t t t t N α-1 k= = =R

+ + 4 α 1+W W W W k

(10)

Độ phân giải cơ bản đạt được khi RS = 1,5 khi đó 2 pic tách khỏi nhau rõ ràng, chỉ xen

phủ nhau ~ 0,3 %.

Rs = 1,0 : Hai pic chưa tách hẳn còn xen phủ nhau 4%

RS = 0,75: Hai pic chưa tách nhau

c. Ứng dụng của phƣơng pháp HPLC

- Định tính

Dựa vào thời gian lưu, hình dáng pic của mẫu thử và mẫu chuẩn, hoặc chồng

phổ của pic thử và pic chuẩn để định tính chất thử.

- Xác định tạp chất

Dùng để kiểm tra tạp chất trong mẫu, trên sắc ký đồ không có pic tại thời gian

lưu của tạp chất (dùng chất đối chiếu) khi chạy sắc ký trong cùng điều kiện.

- Định lượng

Dựa trên nguyên tắc nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic

của nó. Có 4 phương pháp định lượng được sử dụng:

+ Phương pháp chuẩn ngoại: Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai

mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện. Sau đó đem so

sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic thu được từ mẫu thử với pic của mẫu chuẩn đã biết

nồng độ sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử.

18

+ Phương pháp chuẩn nội: Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất

chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống với thời gian lưu và đáp ứng của

chất cần phân tích. Chất chuẩn thứ hai gọi là chất chuẩn nội. Từ những dữ kiện về diện

tích (hoặc chiều cao ) pic của chuẩn, chuẩn nội, mẫu thử và lượng (hoặc nồng độ) của

chuẩn, chuẩn nội sẽ tính ra nồng độ các chất có trong mẫu thử.

+ Phương pháp thêm chuẩn: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của chất chuẩn

tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong

cùng điều kiện. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa vào sự chênh lệch nồng

độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và sự tăng của diện tích (hoặc chiều cao pic).

+ Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Dựa trên nguyên tắc hàm lượng phần trăm của

một chất trong hỗn hợp nhiều thành phần được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic

của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần trên sắc ký đồ. Phương pháp

này yêu cầu tất cả các thành phần đều được rửa giải và được phát hiện; tất cả các thành

phần đều có đáp ứng detector như nhau [3,13,17,24].

1.3.5. Phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy

- Mỗi chất khác nhau có nhiệt độ nóng chảy khác nhau.

- Đối với chất rắn kết tinh, điểm chảy là một tiêu chuẩn lý học rất quan trọng. Điểm

chảy là tiêu chuẩn để kiểm tra mức độ tinh khiết của một chất. Nếu điểm chảy của 2

loại tinh thể thu được qua 2 lần kết tinh chỉ chênh lệch nhau 0,5oC thì có thể xem sản

phẩm kết tinh đã tinh khiết.

- Nếu một hợp chất kết tinh có điểm chảy còn thấp xa hơn so với điểm chảy lý thuyết

chứng tỏ sản phẩm thu được chưa tinh khiết còn phải tiếp tục kết tinh và tinh chế lại.

- Có hai cách xác định điểm chảy:

+ Đo điểm chảy bằng ống mao quản.

+ Đo điểm chảy bằng dụng cụ điện có lắp kính hiển vi hoặc kính lúp [9].

19

CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu

Hình 2.1. Một số hình ảnh cây đan sâm thu hái tại vƣờn dƣợc liệu Sa Pa

Đối tượng : Rễ đan sâm sử dụng để nghiên cứu chiết tách được thu hái tại Sa Pa

(Lào Cai) tháng 9/2016 và được TS. Phạm Thanh Huyền, Khoa Tài nguyên Dược liệu,

Viện Dược liệu giám định tên khoa học là Salvia miltiorrhiza Bunge., họ Bạc hà

(Lamiaceae). Tiêu bản của mẫu cây (DS2016.01) được lưu tại Viện Dược liệu và Khoa

Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.1.2. Dung môi, hóa chất

- Các dung môi dùng trong chiết xuất, phân lập như ethanol (EtOH), methanol

(MeOH), n-hexan, dicloromethan (CH2Cl2), chloroform (CHCl3), ethyl acetat (EtOAc),

n-Butanol (BuOH) đều đạt tiêu chuẩn công nghiệp.

20

- Dung môi dùng cho phân tích:

+ Methanol (Merck, Đức), acetonitrile (Merck, Đức), nước cất, acid acetic (Merck).

+ Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Nacalai

Tesque Inc., Nhật Bản), silica gel pha đảo ODS-A (50 μm, YMC Co. Ltd., Nhật Bản).

+ Bản mỏng tráng sẵn trên đế nhôm loại pha thường Kieselgel 60 F254 và pha đảo

TLC Silica gel 60 RP-18 F254S (Merck, Damstadt, Đức).

+ Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng

thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% hơ nóng để phát hiện vết chất.

2.1.3. Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu

- Máy Jasco DIP-360 digital polarimeter: đo năng suất quay cực.

- Máy Stuart SMP3 (Sanyo, Nhật Bản): đo điểm nóng chảy.

- Máy AGILENT 1260 Series LC-MS/MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ):

đo phổ khối ion hóa phun mù điện tử (ESI-MS).

- Máy JEOL ECX 400 (Jeol, Nhật Bản): đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một và hai

chiều, sử dụng dung môi CDCl3/CD3OD, chất nội chuẩn là tetramethylsilan (TMS).

- Hệ thống sắc ký HPLC Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Mỹ): phân tích

định lượng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nghiên cứu thành phần hóa học

a. Phƣơng pháp xử lý và chiết xuất

Tiến hành chiết xuất cryptotanshinon theo nguyên tắc chung về chiết xuất dẫn

xuất phenanthraquinon. Lựa chọn quy trình chiết xuất được thực hiện như sau:

- Phương pháp chiết: đun hồi lưu cách thủy.

- Dung môi chiết xuất: ethanol 80%.

- Số lần chiết: 3 lần.

- Thời gian chiết: 4 giờ/ lần.

21

b. Phƣơng pháp phân lập và tinh chế

Tiến hành phân lập bằng các kỹ thuật sắc ký cột

- Cột nhồi silica gel, hệ dung môi hexan – EtOAc.

- Sắc ký cột pha đảo C18, hệ dung môi pha động là MeOH-H2O.

c. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học

Trên cơ sở các số liệu đã được công bố trong tài liệu tham khảo, hợp chất được

xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp hóa lý gồm:

- Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR.

- Phương pháp phổ khối ESI-MS.

2.2.2. Xây dựng phƣơng pháp HPLC

Sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo dược điển Trung

Quốc năm 2010 [8].

a. Lựa chọn điều kiện sắc ký

Dùng phương pháp HPLC pha đảo để tách, định tính, định lượng

cryptotanshinon trong trong rễ cây đan sâm. Cụ thể, khảo sát điều kiện sắc ký như sau:

- Cột sắc ký: Tiến hành khảo sát trên các cột C18 pha đảo.

- Pha động: Qua tham khảo tài liệu, khảo sát các loại pha động với thành phần, tỷ lệ,

tốc độ dòng khác nhau.

- Detector: Lựa chọn sử dụng detector thích hợp trong 3 loại detector UV, FLD, DAD

để đảm bảo vừa phát hiện được được chất phân tích, vừa tiện lợi cho quá trình phân

tích và phù hợp trong điều kiện phòng thí nghiệm.

- Thể tích tiêm mẫu: Khảo sát để lựa chọn thể tích tiêm mẫu phù hợp nhất.

b. Độ đặc hiệu

Độ đặc hiệu tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích

cryptotanshinon theo chương trình khảo sát trên.

22

c. Tính thích hợp hệ thống

Tiêm 6 lần dung dịch cryptotanshinon nồng độ 500 µg/ml vào hệ thống HPLC và tiến

hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.

d. Tính tuyến tính và khoảng nồng độ

Chuẩn bị một dãy dung dịch cryptotanshinon pha trong MeOH có nồng độ 1 –

200 µg/ml. Tiến hành phân tích các mẫu, xây dựng phương trình hồi quy và xác định

hệ số tương quan r.

e. Độ chính xác

Độ chính xác (accuracy) của phương pháp được đánh giá bằng độ đúng và độ lặp lại:

+ Độ đúng (trueness) là giá trị phản ánh độ sát gần của kết quả phân tích với giá trị

thực của mẫu đã biết. Độ đúng thường được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn.

Lượng chất chuẩn thêm vào không nên quá 40% lượng hoạt chất đã có sẵn và tổng

nồng độ lượng hoạt chất có trong mẫu phải nằm trong khoảng tuyển tính của phương

pháp.

Tỷ lệ thu hồi (%) = (hàm lượng tìm thấy / hàm lượng thực cho vào) x 100

+ Độ lặp lại (repeatability): độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD

(%) kết quả phân tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích.

f. Khảo sát vào phân tích định tính, định lƣợng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào

Cai

Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để

phân tích hàm lượng cryptotanshinon trong mẫu dược liệu thu hái ở Sa Pa, Lào Cai.

2.2.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu

Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft excel 2010 với một số công thức tính

toán trong xử lý thống kê kết quả như sau :

Giá trị trung bình:

n

1iixx

n

1

(11)

23

Độ lệch chuẩn: 1nS

1i

2

xxi

(12)

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) 100

x

SRSD

(13)

Trong đó:

x

: giá trị trung bình của hàm lượng hợp chất chính

xi : giá trị của hàm lượng hợp chất chính của mẫu thứ i

n : số thử nghiệm được sử dụng để tính giá trị trung bình về hàm lượng của hợp chất

chính

S : độ lệch chuẩn

RSD : độ lệch chuẩn tương đối

24

CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1.1. Chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ đan sâm

Cryptotanshinon là một diterpene quinon có nguồn gốc từ rễ của cây đan sâm (

Salvia miltiorrhiza Bunge). Tiến hành chiết xuất cryptotanshinon theo nguyên tắc

chung về chiết xuất dẫn xuất phenanthraquinon.

a. Chuẩn bị dƣợc liệu

Dược liệu đan sâm thu hái tại trạm dược liệu Sa Pa (Lào Cai) đã được phơi khô

rồi thái nhỏ.

b. Lựa chọn phƣơng pháp chiết

Sử dụng phương pháp chiết sóng siêu âm. Đây là phương pháp chiết sử dụng

sóng siêu âm có tần số lớn hơn 20Hz, có khả năng tác động mạnh vào dược chất làm

tăng sự thẩm thấu dung môi chiết, tăng hòa tan dược chất, phương pháp này có thể

chiết kiệt, hiệu suất cao.

c. Lựa chọn dung môi chiết

Chọn ethanol làm dung môi chiết vì ethanol hòa tan được cryptotanshinon, rẻ và

không độc.

d. Chiết xuất cryptotanshinon

Mẫu rễ đan sâm (500 g) sau khi rửa sạch, phơi khô, thái nhỏ được ngâm chiết kỹ

bằng dung môi ethanol 80% 3 lần (mỗi lần 1500 ml) sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở

40oC trong 4 giờ. Các dịch chiết ethanol thu được được lọc qua giấy lọc, gom lại và cất

loại dung môi dưới áp suất giảm cho 122 g cao chiết tổng ethanol. Lấy 100 g cao chiết

hòa tan trong nước cất (500 ml) và chiết phân bố bằng Hex, EtOAc và BuOH (mỗi

dung môi 3 lần, mỗi lần 500 ml). Các dịch chiết phân đoạn được cất loại dung môi

dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng Hex (6,1 g), EtOAc (26,4 g) và

BuOH (17,2 g).

25

e. Phân lập cryptotanshinon từ phân đoạn tinh chế đƣợc

Từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực hexan, phân đoạn giàu tanshinon, tiến hành

phân lập sắc ký sử dụng cột nhồi silica gel (50 mm × 300 mm) với hệ dung môi rửa

giải hexane-EtOAc (5:1, v/v, 2500 ml) thu được 7 phân đoạn ký hiệu là F1~F7.

Từ phân đoạn F6 (150 mg), kết hợp chạy sắc ký cột pha đảo C18 (Φ 20 mm ×

400 mm) với hệ pha động MeOH-H2O (3:1, v/v, 400 ml) thu được cryptotanshinon

(bột màu đỏ cam, 45 mg).

26

Quy trình chiết xuất và tinh chế cryptotanshinon từ rễ cây đan sâm

Đan sâm sau sơ chế (500g)

1.Chiết hồi lưu đơn giản (3 lần x 4 giờ/lần).

Dung môi EtOH 70% (1500 ml/lần)

2.Gom dịch chiết, lọc.

3. Cất quay đến khô kiệt.

Cao chiết đan sâm

( 122 g ; 19,2% khối lượng DL khô, cao khô, màu nâu sẫm)

Cao chiết đan sâm (100 g)

Khuếch tán với 500ml H2O

Dịch chiết nƣớc cao đan sâm ( 500ml)

Chiết phân bố lỏng – lỏng ( 3 lần x 500 ml/

lần) bằng Hex, EtOAc, BuOH

Phân đoạn EtOAc ( 26,4g) Phân đoạn Hex ( 6,1g) Phân đoạn BuOH ( 17,2g)

Sắc ký cột silica gel (Φ50mm x 300mm)

Hexane-EtOAc ( 5:1, v/v; 2500ml)

F1 F2 F3 F4 F5 F6(150mg) F7

SKC pha đảo C18 (Φ20mmx400mm)

MeOH-H2O ( 3:1, v/v; 400ml)

Cryptotanshinon (45 mg)

27

3.1.2. Xác định cấu trúc của cryptotanshinon

a. Tính chất hóa lý chung

- Chất bột màu đỏ cam;

- Nhiệt độ nóng chảy : Mp = 182-183oC;

- Góc quay cực riêng: = 90o (c 1,0; CHCl3);

- Phổ UV (MeOH) λmax = 270 nm.

b. Các phƣơng pháp phổ

- Kết quả phổi khối ESI- MS: m/z = 297 [M + H]+

- Kết quả đo cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Sau khi phân lập, hợp chất này được xác định cấu trúc hóa học trên cơ sở các

phương pháp hóa lý bao gồm phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân NMR (Nuclear

Magnetic Resonance) và phổ khối MS (Mass Spectroscopy). Số liệu phổ thu được

được phân tích chi tiết và tổng hợp ở bảng sau:

25

D]α[

28

Bảng 3.1. Kết quả đo phổ NMR của cryptotanshinon phân lập đƣợc

Vị trí δH

(số H; độ bội; J = Hz) δC δC

* [38]

1 3,40 (1H, m)

3,13 (1H, m) 29,7 29,65

2 1,76 (1H, m)

1,68 (1H, m) 19,1 19,09

3 2,16 (1H, m)

1,74 (1H, m) 37,8 37,87

4 - 34,9 34,86

5 - 143,7 143,66

6 7,75 (1H, d, J = 8,0 Hz) 132,6 132,52

7 7,46 (1H, d, J = 7,6 Hz) 122,5 122,50

8 - 128,4 128,46

9 - 126,3 126,32

10 - 152,4 152,39

11 - 184,3 184,26

12 - 175,7 175,69

13 - 118,3 118,32

14 - 170,8 170,71

15 3,49 (1H, dd, J = 9,6, 6,4 Hz) 34,6 34,66

16 4,89 (1H, J = 9,6 Hz)

4,35 (1H, dd, J = 9,2, 6,4 Hz) 81,5 81,46

17 1,24 (3H, d, J = 6,8 Hz) 18,9 18,80

18 1,30 (3H, s, H-18) 31,9 31,89

19 1,32 (3H, s, H-19) 32,0 31,94

29

c. Xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của của hợp chất được minh họa trong hình 3.1

Hình 3.1. Cấu trúc cryptotanshinon

Phân tích phổ 1H và

13C NMR thấy rằng đây là một diterpene tanshinon có

khung 19 cacbon. Phổ khối ESI-MS thể hiện tín hiệu ion tại m/z 297 phù hợp với ion

phân tử của cryptotanshinon là C19H20O3 (M = 296). Theo phân tích nêu trên cùng với

sự phù hợp phổ 1H và

13C với các số liệu công bố [18,19] giúp khẳng định chính xác là

cryptotanshinon.

3.1.3. Đánh giá độ tinh khiết và phân tích tạp chất

a. Đo điểm chảy

Đưa một lượng cryptotanshinon đã được nghiền mịn vào ống mao quản thuỷ

tinh và xác định điểm chảy bằng máy đo điểm chảy. Tiến hành đo điểm chảy, mỗi mẫu

đo 6 lần, xác định điểm chảy trung bình, so sánh với điểm chảy lý thuyết, kết quả là:

Bảng 3.2. Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy của cryptotanshinon tinh chế đƣợc

Lần đo Nhiệt độ bắt đầu chảy (0C) Nhiệt độ chảy hoàn toàn (

0C)

1 182,6 183,1

2 182,4 183,1

3 182,2 183,2

4 182,3 183,3

5 182,5 183,2

6 182,4 183,2

Trung bình 182,4 183,2

RSD (%) 0,071 0,045

O

O

O

Tanshinone I (2)Tanshinone IIA (1) Cryptotanshinone (3)

1

2

3 45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

18

O

O

O

1

2

3

45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

1819

O

O

O

1

2

3 45

6

7

8

910

11

1213

14

15

16

17

18 19

30

Nhận xét: Kết quả đo nhiệt độ nóng chảy cho thấy nhiệt độ nóng chảy trung

bình của cryptotanshinon tinh chế được từ 182,40C đến 183,2

0C là phù hợp với nhiệt

độ nóng chảy của cryptotanshinon theo lý thuyết (từ 1820C đến 183

0C) [25]. Điều này

chứng tỏ cryptotanshinon tinh chế có độ tinh khiết cao. Giá trị RSD thấp (0,071% và

0,045%) cho thấy kết quả đo điểm chảy khá chính xác.

b. Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Trên sắc ký lớp mỏng [bản mỏng pha đảo C18, hệ pha động MeOH-H2O (5:1,

v/v)] kết quả thu được là 1 vệt rõ nét, Rf = 0,28, không có các vệt phụ, chứng tỏ

cryptotanshinon thu được có độ tinh khiết cao.

Hình 3.2. Sắc ký đồ TLC của cryptotanshinon tinh chế đƣợc

c. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sử dụng phương pháp tổng diện tích pic tính toán độ tinh khiết của mẫu phân

tích. Tiến hành sắc ký theo chương trình trên, phân tích các pic phụ (tạp chất) trên sắc

ký đồ (hình 3.3) và tính độ tinh khiết (bảng 3.3):

31

Bảng 3.3. Kết quả phân tích độ tinh khiết của cryptotanshinon tinh chế đƣợc

Cryptotanshinon

Píc cryptotanshinon Píc phụ 1 Píc phụ 2

Thời gian lưu (phút) 12,151 8,810 18,020

Diện tích pic (mAU.s) 27416 90 150

Tỷ lệ (%) 99,13 0,32 0,54

Hình 3.3. Sắc ký đồ của cryptotanshinon và mẫu trắng

Kết quả cho thấy cryptotanshinon tinh chế được có độ tinh khiết cao (> 95%)

phù hợp làm chất chuẩn phân tích, chất chuẩn đối chiếu. Các pic phụ (tạp chất) đều

tách rõ ràng khỏi pic chất.

3.1.4. Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng bằng HPLC

a. Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký

Trên cơ sở phân tích tài liệu tham khảo [10,16] và khảo sát về thành phần pha

động, tỷ lệ dung môi, tốc độ dòng, chúng tôi xây dựng được chương trình sắc ký với

điều kiện tiến hành phân tích:

32

- Hệ thống máy HPLC: Agilent Technologies 1260 Infinity

- Cột sắc ký Eclipse plus C18 (4,6x100 mm; 3,5 µm)

- Detector UV: =270 nm.

- Pha động: Acetonitril (A)–Acetic acid 0,1%/H2O (B), chương trình gradient (bảng

3.4).

- Tốc độ dòng : 0,5 ml/phút.

- Dung môi pha mẫu: methanol.

- Thể tích tiêm 10 l, tiêm mẫu tự động.

- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.

Bảng 3.4. Chƣơng trình sắc ký HPLC

Thời gian

( phút)

A(%)

Acetonitril

B(%)

Acetic acid 0,1%/nƣớc

0-10 65 35

10-20 65-90 35-10

20-25 90 10

25-30 90-100 10-0

30-35 100 0

35-40 100-65 0-35

40-45 65 35

b. Độ đặc hiệu

Tiến hành sắc ký các loại mẫu trắng và mẫu phân tích cryptotanshinon theo

chương trình khảo sát trên, ghi lại sắc ký đồ, xác định thời gian lưu và phổ UV của pic

trong sắc ký đồ. Kết quả cho thấy trên sắc ký đồ của dung môi pha mẫu không xuất

hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của cryptotanshinon

tR = 12,151 phút (hình 3.3). Vậy phương pháp phân tích cryptotanshinon xây dựng

được có độ đặc hiệu cao.

33

c. Thử tính thích hợp hệ thống

Trước khi tiến hành sắc ký, cần xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.

Tiêm 6 lần dung dịch cryptotanshinon nồng độ 500 µg/ml vào hệ thống HPLC và tiến

hành sắc ký theo điều kiện đã chọn ở trên. Ghi lại các sắc ký đồ và xác định giá trị thời

gian lưu, diện tích pic, hệ số đối xứng và số đĩa lý thuyết. Kết quả khảo sát tính thích

hợp của hệ thống sắc ký được thể hiện ở bảng 3.5.

Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký khi định lƣợng

cryptotanshinon tinh chế đƣợc

STT Thời gian lƣu

(phút)

Diện tích pic

( mAU.s) Hệ số bất đối

Số đĩa lý

thuyết

1 11,979 13707 0,96 15538

2 12,043 13745 0,95 15647

3 12,042 13952 0,95 15679

4 12,002 13899 0,95 15566

5 11,999 13875 0,95 15683

6 12,012 13751 0,95 15592

Trung bình 12,013 13821 0,95 15617

RSD ( % ) 0,19 0,66 0,39 0,36

Nhận xét: Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch

chuẩn tương đối (RSD) của các thông số thời gian lưu và diện tích pic trong các phép

thử lần lượt là 0,19 % và 0,66 % đều nhỏ hơn 2 %, các giá trị của hệ số bất đối khá gần

1 (dao động từ 0,95 đến 0,96) thể hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là

15617 thể hiện khả năng tách tốt của cột sắc ký. Như vậy chứng tỏ rằng các điều kiện

sắc ký đã lựa chọn và hệ thống sắc ký HPLC sử dụng là ổn định, phù hợp cho phép

phân tích định tính, định lượng cryptotanshinon trong dược liệu.

34

d. Khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn

Tiến hành khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ với diện tích pic

cryptotanshinon trên chất chuẩn cryptotanshinon.

Chuẩn bị các dung dịch chuẩn có nồng độ 1-200 μg/ml bằng cách pha loãng từ

dung dịch chuẩn gốc ban đầu với các hệ số pha loãng khác nhau. Tiến hành sắc ký các

dung dịch chuẩn (mỗi dung dịch tiêm 3 lần), ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích pic

tương ứng. Xác định phương trình hồi quy tuyến tính, hệ số tương quan tuyến tính giữa

nồng độ chất phân tích và diện tích pic tương ứng trên sắc ký đồ bằng phương pháp

bình phương tối thiểu (bảng 3.6).

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính

Dung dịch Nồng độ ( μg/ml) Diện tích (mAU.s)

1 7,813 902,3264

2 15,625 1560,5706

3 31,250 2918,4019

4 62,500 5280,5347

5 125,000 9522,1641

Phương trình hồi qui Y = 73,2520 X + 488,6700

Hệ số tương quan R2 = 0,9977

35

Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ & diện tích của pic

cyptotanshinon

Nhận xét: Kết quả phương trình hồi quy tuyến tính thu được có hệ số xác định và hệ số

tương quan rất cao, độ tuyến tính chặt (hệ số tương quan R2 = 0,9977 > 0,99) (hình 3.4)

e. Giới hạn phát hiện (LOD), Giới hạn định lƣợng (LOQ)

Giới hạn phát hiện: tiến hành pha loãng mẫu phân tích cryptotanshinon đến khi

tín hiệu của chất phân tích trên sắc ký đồ thu được có tỷ lệ S/N (chiều cao tín

hiệu/nhiễu) đạt khoảng 2-3. Nồng độ xác định được là giới hạn phát hiện (LOD) của

phương pháp ứng với từng chất. Giới hạn định lượng (LOQ): giới hạn định lượng của

phương pháp được xác định dựa trên giới hạn phát hiện: LOQ = 3,3 x LOD.

Kết quả phân tích cho thấy khi nồng độ của cryptotanshinon là 0,49 µg/ml thì

chiều cao pic = 3 lần chiều cao đường nền. Suy ra, xác định giới hạn phát hiện thu

được: LOD = 0,49 µg/ml. Từ đó xác định được giới hạn định lượng LOQ = 1,63 µg/ml

f. Độ chính xác

Độ chính xác là mức độ chụm giữa các kết quả riêng biệt khi lặp lại quy trình

phân tích nhiều lần trên cùng mẫu thử đồng nhất so với giá trị thực, biểu thị bằng giá trị

RSD (%). Độ chính xác bao gồm độ lặp lại, độ đúng.

y = 73.252x + 488.67

R² = 0.9977

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 20 40 60 80 100 120 140

Diệ

n t

ích

pic

(m

AU

.s)

Nồng độ cryptotanshinon (μg/ml)

36

+ Độ lặp lại: Độ lặp lại của phương pháp được biểu thị bằng giá trị RSD (%) kết quả

phân tích các mẫu độc lập trong cùng điều kiện phân tích. Cách tiến hành pha 6 mẫu có

nồng độ 50 µg/ml đo trên hệ thống sắc ký với các thông số đã xây dựng, số liệu thu

được được xử lý dựa vào phương trình hồi quy tuyến tính đã xây dựng ở mục d.

Bảng 3.7. Kết quả phân tích độ lặp lại của phƣơng pháp

STT Nồng độ dung dịch

cryptotanshinon đo (µg/ml)

Diện tích pic

(mAU.s)

Nồng độ khi thay vào đƣờng

chuẩn (µg/ml)

1 50 4218,34 50,92

2 50 4317,72 52,27

3 50 4102,97 49,34

4 50 4193,23 50,57

5 50 4297,75 51,99

6 50 4303,19 52,07

Trung bình 51,20

RSD (%) 2,03

Kết quả ở bảng cho thấy với phương pháp định lượng bằng HPLC đã xây dựng,

độ lệch chuẩn tương đối của các kết quả định lượng khá nhỏ RSD = 2,03 %. Vậy

phương pháp đã xây dựng là chính xác.

+ Độ đúng: Thêm một lượng chính xác dung dịch cryptotanshinon tinh chế được (mẫu

thêm vào) vào dung dịch thử (mẫu đã có cryptotanshinon), sao cho tổng nồng độ sau

khi thêm vẫn nằm trong khoảng tuyến tính của phương pháp. Tiến hành phân tích sắc

ký để khảo sát độ đúng, kết quả được ghi trong bảng 3.8.

37

Bảng 3.8. Kết quả phân tích độ đúng của phƣơng pháp

STT Mẫu đã có (µg) Mẫu thêm vào (µg) Tổng lƣợng tìm lại

(µg)

Tỷ lệ tìm lại

(%)

1 109,65 30 105,20 95,94

2 112,25 30 102,21 91,06

3 109,53 30 105,72 96,52

4 110,60 30 106,58 96,37

5 114,20 30 103,22 90,39

6 113,80 30 104,93 92,21

Trung bình 93,75

RSD (%) 2,40

Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp phân tích đã lựa chọn cho tỉ lệ thu

hồi cao, có độ đúng tốt.

3.1.5. Sử dụng phƣơng pháp phân tích HPLC đã khảo sát vào phân tích định tính,

định lƣợng mẫu đan sâm thu hái ở Sa Pa- Lào Cai

Áp dụng đường chuẩn hồi quy tuyến tính thu được và phương pháp nội suy để

phân tích hàm lượng cryptotanshinon trong mẫu dược liệu thu hái ở Sa Pa sử dụng

trong nghiên cứu đề tài cho kết quả ở bảng 3.9 như sau:

Bảng 3.9. Kết quả phân tích định lƣợng cryptotanshinon trong đan sâm ở Sa Pa

Kết quả Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung

bình

Hàm lƣợng cryptotanshinon trong

cao chiết (% khối lƣợng) 0,090 0,089 0,093 0,091

Hàm lƣợng cryptotanshinon trong

dƣợc liệu khô (% khối lƣợng) 0,022 0,022 0,023 0,022

38

3.2. THẢO LUẬN

3.2.1. Phân lập và xác định cấu trúc cryptotanshinon

- Bằng cách kết hợp các kỹ thuật sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, chúng tôi đã phân lập

được cryptotanshinon trong mẫu cây đan sâm ở Sa Pa, Lào Cai. Từ đây có thể gợi ý qui

trình phân lập và xác định cấu trúc của cryptotanshinon trong phòng thí nghiệm và quy

mô lớn hơn, cụ thể như sau:

+ Bước 1: Chiết xuất cryptotanshinon từ dược liệu đan sâm bằng phương pháp đun hồi

lưu cách thủy ở điều kiện đã xây dựng và chiết phân bố lỏng-lỏng bằng các dung môi

có độ phân cực khác nhau như Hex, EtOA, BuOH thu được các phân đoạn tương ứng.

+ Bước 2: Phân lập cryptotanshinon từ phân đoạn hữu cơ ít phân cực hexan, bằng

phương pháp sắc ký cột với các thông số cột và hệ dung môi pha động như đã chọn thu

được

Hiệu suất thực tế chiết cryptotanshinon trong dược liệu khô: % H = (45.10-3

.100)/500 =

0,015% (~ hàm lượng % cryptotanshinon định lượng trong dược liệu khô bằng phương

pháp HPLC ( mục 3.1.5) là 0,022%) so sánh với tài liệu tham khảo [18] là 0,014%

chứng tỏ phương pháp chiết xuất sử dụng có độ chính xác cao.

- Cryptotanshinon phân lập được có độ tinh khiết cao dựa trên dữ liệu sắc ký lớp mỏng,

đo điểm chảy và HPLC. Cấu trúc hóa học của cryptotanshion được xác định đầy đủ

dựa trên các kỹ thuật phổ như khối phổ và phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Dữ liệu phổ

khối xác định được khối lượng phân tử kết hợp với thông tin chi tiết về phổ 13

C và phổ 1H NMR giúp biện giải được công thức cấu tạo của cryptotanshinon đầy đủ và chính

xác.

3.2.2. Xây dựng phƣơng pháp phân tích định lƣợng cryptotanshinon

Trên cơ sở tham khảo tài liệu và khảo sát thực tế, chọn được điều kiện sắc ký và

đã khảo sát được các thông số theo quy trình:

- Điều kiện đã chọn để tiến hành phân tích:

+ Hệ thống máy: Agilent Technologies 1260 Infinity

+ Cột sắc ký Eclipse plus C18 (4,6 x 100 mm; 3,5 µm)

+ Detector UV-DAD: =270 nm.

39

+ Pha động: Acetonitril (A) – Acetic acid 0,1% /nước (B), chương trình gradient

như bảng 4.

+ Tốc độ dòng : 0,5 ml /phút.

+ Dung môi pha mẫu: methanol.

+ Thể tích tiêm 10 l, tiêm mẫu tự động.

+ Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phòng thí nghiệm.

- Thử tính thích hợp hệ thống: RSD = 0,66%, giá trị của hệ số bất đối khá gần 1 thể

hiện pic khá cân đối, số đĩa lý thuyết trung bình là 15617 thể hiện khả năng tách tốt của

cột sắc ký.

- Khoảng tuyến tích: R2 = 0,9977; 1-200 μg/ml.

- Giới hạn phát hiện: 0,49 μg/ml; giới hạn định lượng: 1,63 μg/ml.

- Độ chính xác: khảo sát độ đúng cho kết quả RSD = 2,40% (n=6), độ lặp lại RSD =

2,03% (n=6).

=> Các thông số thu được cho thấy phương pháp lựa chọn có độ tin cậy cao.

3.2.3. Phân tích cryptotanshinon trong mẫu nghiên cứu đan sâm thu hái ở Lào

Cai

Trên cơ sở các tài liệu thu thập được cho thấy trong nước chưa có công bố nào

phân tích cụ thể về phương pháp định lượng HPLC cryptotanshinon. Trong nghiên cứu

này chúng tôi khảo sát định lượng cryptotanshinon trong mẫu đan sâm ở Sa Pa, Lào

Cai. Kết quả thu được cryptotanshinon có hàm lượng lần đầu tiên được định lượng

trong dược liệu đan sâm ở Việt Nam. Kết quả đóng góp cơ sở khoa học đầy đủ hơn về

thành phần hóa học của dược liệu đan sâm.

Các hợp chất diterpen tanshinon là thành phần hoạt chất chính và được coi là

chất đặc trưng của đan sâm nói riêng và các loài Salvia nói chung [35, 36, 37]. Ở nước

ta hiện nay đan sâm được khảo sát và trồng ở nhiều nơi như Tây Bắc, Phú Thọ, Hà

Nội, Lâm Đồng,….Đan sâm đang được nghiên cứu nhiều và là một trong các cây dược

liệu trong chiến lược phát triển của vùng Tây Bắc. Cryptotanshinon là thành phần quan

trọng của đan sâm bên cạnh các hợp chất tanshinon khác. Việc phân tích định tính,

định lượng cryptotanshinon có đóng góp quan trọng trong việc phân tích chất lượng

40

hoạt chất trong dược liệu đan sâm và các chế phẩm có đan sâm, gợi ý sử dụng làm chất

đánh dấu trong việc quản lý chất lượng dược liệu và các sản phẩm từ đan sâm.

41

KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

KẾT LUẬN

Qua thời gian nghiên cứu đề tài chúng tôi đã thu được các kết quả theo các mục

tiêu nghiên cứu đã đề ra như sau:

1. Bước đầu chiết xuất và tinh chế được cryptotanshinon từ dược liệu đan sâm. Đã tiến

hành xác minh cấu trúc của cryptotanshinon tinh chế được bằng phương pháp phổ

cộng hưởng từ hạt nhân và phương pháp phân tích khối phổ. Kết quả thực nghiệm đã

khẳng định công thức phân tử cũng như cấu trúc của cryptotanshinon tinh chế được là

phù hợp với lý thuyết.

2. Đã xây dựng được phương pháp HPLC để định tính, định lượng và xác định giới hạn

tạp chất liên quan của cryptotanshinon tinh chế được. Kết quả đã định tính được

cryptotanshinon tinh chế được, đã xác định được hàm lượng cryptotanshinon tinh chế

được là 99,13% và giới hạn tổng cộng các tạp chất liên quan của cryptotanshinon tinh

chế được là không quá 5,0%. Đã sử dụng cryptotanshinon tinh chế được làm chất

chuẩn phòng thí nghiệm để định tính, định lượng cryptotanshinon trong được liệu đan

sâm thu hái ở Sa Pa, Lào Cai. Kết quả là trong mẫu dược liệu đan sâm đem kiểm

nghiệm có chứa cryptotanshinon với hàm lượng là 0,022(%) – thành phần này lần đầu

tiên được định lượng trong mẫu dược liệu đan sâm ở nước ta. Đây là cơ sở tiền đề để

nghiên cứu đầy đủ hơn về thành phần hóa học trong các mẫu dược liệu đan sâm trồng

tại Việt Nam, đồng thời định hướng cho các nghiên cứu về tác dụng dược lý của các

tanshinon này.

KIẾN NGHỊ

1. Tiếp tục nghiên cứu về phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần

khác trong loài đan sâm ở Lào Cai và nhiều vùng khác.

2. Khảo sát thêm các tiêu chí để xây dựng cryptotanshinon tinh chế được thành chất

chuẩn phân tích đối chiếu được thẩm định.

3. Thử đánh giá tác dụng sinh học của các nhóm chất và các chất phân lập được cũng

như của dịch chiết loài đan sâm này.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Huy Bích, Bùi Xuân Chương, Đặng Quang Chung, Nguyễn Thượng Dong,

Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn,

Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm

thuốc ở Việt Nam, Tập 1,NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. tr. 732-738.

2. Trần Mạnh Bình (2003), Phân tích cấu trúc các hợp chất hữu cơ, Tài liệu sau

Đại học, Trường Đại học Dược Hà Nội.

3. Bộ môn hoá phân tích Trường Đại học Dược Hà Nội (2006), Hóa phân tích II,

tr. 17, 99-146, 173-222.

4. Bộ Y tế (2008), Y học cổ truyền, NXB Y học, Hà Nội, tr. 198.

5. Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I, NXB Y học, Hà Nội. tr. 255-256.

6. Chevallier Andrew (2012), Dược thảo toàn thư, NXB Tổng hợp thành phố Hồ

Chí Minh, thành phố Hồ Chí Minh. tr. 175-176.

7. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập 1, NXB Y học, tr. 869-

870.

8. Dược điển Trung Quốc (2010). Tập 1. tr. 383-384.

9. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hoá học

cây thuốc, NXB Y học, tr. 8-99, 162-196, 234-242.

10. Đỗ Thị Hà, Nguyễn Minh Khởi, Lê Thị Loan, Trần Thị Hồng Phương (2016),

"Xây dựng phương pháp định lượng tanshinon IIA trong dược liệu đan sâm

trồng ở Việt Nam bằng HPLC-DAD", Tạp chí Dược liệu (21), tr. 50-54.

11. Nguyễn Thị Minh Hằng (2001), "Nghiên cứu tác dụng chống đông máu và hạ

lipid máu của đan sâm và bài thuốc sinh hóa thang", Khóa luận tốt nghiệp dược

sĩ đại học, Đại học Dược Hà Nội.

12. Nguyễn Thị Thu Hòa (2012), "Nghiên cứu tiêu chuẩn cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ

và đan sâm", Luận văn thạc sĩ dược học, Đại học Dược Hà Nội.

13. Vũ Thị Thăng Long (2007), "Nghiên cứu định lượng Tobramycin nguyên liệu

bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)", Khoá luận tốt nghiệp

dược sĩ đại học.

14. Đỗ Tất Lợi (2013), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Hồng Đức, tr.

818-820.

15. Ngô Quốc Luật, Đào Văn Núi, Trần Danh Việt (2014), "Nghiên cứu di thực cây

đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) tại Việt Nam", Tạp chí Dược học 54 (4),

tr. 687-691.

16. Ngô Quốc Luật, Lê Tiến Vinh, Trần Danh Việt, Phương Thiện Thương (2014),

"Đánh giá chất lượng dược liệu đan sâm di thực trồng tại Việt Nam", Tạp chí

Dược học (455), tr. 47-51.

17. Thái Phan Quỳnh Như (2001), Phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu

năng cao (HPLC),Viện kiểm nghiệm Bộ y tế.

18. Phương Thiện Thương, Nguyễn Minh Khởi Nguyễn Thị Kim An, Fumiaki Ito

(2013),"Các tanshinon phân lập từ rễ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.)

di thực và trồng ở Việt Nam", Tạp chí Dược học 53 (1), tr. 44-47.

19. Nguyễn Hữu Tùng, Vũ Đức Lợi, Nguyễn Thanh Hải, Bùi Thanh Tùng, Nguyễn

Tiến Vững, Bùi Hồng Cường (2016),"Một số hợp chất phân lập từ rễ cây đan

sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge.) trồng ở huyện Bắc Hà, tỉnh Lào Cai", Tạp chí

Dược học 56 (4), tr. 43-47.

20. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1,

NXB Khoa học và kỹ thuật, tr. 732-733.

21. Viện Dược liệu (2006), Nghiên cứu thuốc từ thảo dược, NXB khoa học và kỹ

thuật, tr. 199 - 222; 493 - 685.

22. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Bộ Y tế (2007), Đảm bảo chất lượng

thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc, tr. 107 - 113, 216-250.

23. Vụ khoa học và đào tạo, Bộ Y tế (2006), Dược học cổ truyền, NXB Y học, Hà

Nội, tr. 231-232.IJAE, 119(1), 38-43.

24. Vụ khoa học và đào tạo, Bộ Y tế (2007), Kiểm nghiệm dược phẩm, NXB Y học,

tr. 79-82, 84-110.

TIẾNG ANH

25. Chase Mark W. (2009), "An update of the Angiosperm Phylogeny Group

classification for the orders and families of flowering plants: APG III",

Botanical Journal of the Linnean Society (161), tr. 105-121.

26. Chen Junhui, Lee Frank Sen Chun, Li Lei, Yang Baijuan, Wang Xiaoru (2007),

"Standardized extracts of Chinese medicinal herbs: case study of Danshen

(Salvia miltiorrhiza Bunge.)", Journal of Food and Drug Analysis, 15(4), tr.

347.

27. Chinese Herbal Medicines, 5(3), tr. 164-181.

28. Haixue Dai, Mingming Wang, Xiaorong Li, Lijuan Wang, Yuhang Li, Ming

Xue (2012), "Structural elucidation ofin vitroandin vivometabolites of

cryptotanshinone by HPLC–DAD–ESI–MSn".

29. Huang Mingqing, Chen Lidian Xie Youliang, Chu Kedan, Wu Shuisheng, Lu

Jinjian, Chen Xiuping, Wang Yitao, Lai Xiaoping (2012)," Antidiabetic effect

of the total polyphenolic acids fraction from Salvia miltiorrhiza Bunge. in

diabetic rats",Phytotherapy research, 26(6). tr. 944-948.

30. Li Min Hui, Li Qian Quan, Liu Yan Ze, Cui Zhan Hu, Zhang Na, Huang Lu Qi,

Xiao Pei Gen (2013), Pharmacophylogenetic Study on Plants of Genus Salvia L.

from China.

31. Lu Yinrong, Yeap Foo L. (2002), Polyphenolics of Salvia—a review. 59(2). tr.

117- 140.

32. Nicolin Vanessa, Valentini Roberto Fancellu Giovanni (2014), "Effect of

tanshinone II on cell growth of breast cancer cell line type MCF-7 and MD-MB-

231".

33. Sung Hyun Jea, Choi Sun Mi, Yoon Yoosik, An Kyu Suk (1999), "Tanshinone

IIA, an ingredient of Salvia miltiorrhiza Bunge., induces apoptosis in human

leukemia cell lines through the activation of caspase-3", Exp Mol Med 31(4), tr.

174-178.

34. Waldemar Buchwald, Marek Baraniak Bogdan Kedzia (2007), Microbiological

study of extracts of Salvia miltiorrhiza Bunge. roots, 53(4). tr. 63-68.

35. Wang BQ (2010), "Salvia miltiorrhiza: Chemical and pharmacological review

of a medicinal plant", Journal of Medicinal Plants Research 4 (25), tr. 2813-

2820.

36. Wenxing Chen, Guangying Chen Yin Lu and Shile Huang (2013), Molecular

evidence of cryptotanshinone for treatment and prevention of human

cancer,Anticancer Agents Med Chem. tr. 979-987.

37. Xu Yan Yan, Lin Yan Ping Wan Ren Zhong, Yang Ling, Chen Yong, Liu

Chang Xiao (2007), "Recent advance on research and application of Salvia

miltiorrhiza", Asian Journal of Pharmacodynamics and Pharmacokinetics, 7(2).

tr. 99-130.

38. Yasumasa Ikeshiro, Izumi Mase and Yutaka Tomita (1989), "Abietane type

diterphenoids from Salvia miltiorrhiza", Phytochemistry, 28(11). tr. 3139-3141.

39. Zuo Z Zhou L, Chow MS (2005), "Dansen: An overview of its chemistry,

pharmacology, pharmacokinetics, and clinical use", The Journal of Clinical

Pharmacology 45 (12), tr. 1345-1359.

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Một số hình ảnh SKLM của cryptotanshinon

Phụ lục 2 Phổ ESI-MS của cryptotanshinon

Phụ lục 3 Phổ NMR của cryptotanshinon

Phụ lục 4 SKĐ HPLC - UV của cryptotanshinon

Phụ lục 5 SKĐ khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Phụ lục 6 SKĐ thử tính thích hợp hệ thống của phương pháp

Phụ lục 7 SKĐ cao dược liệu đan sâm thu hái ở Sa Pa Lào Cai

Phụ lục 1. Một số hình ảnh SKLM của cryptotanshinon

Bản mỏng pha đảo C18, hệ dung môi MeOH-H2O

Phụ lục 2. Phổ ESI-MS của cryptotanshinon

Phụ lục 3. Phổ NMR của cryptotanshinon

Phổ 13

C NMR (CDCl3, 100 MHz) của cryptotanshinon

Phổ proton 1H NMR (CDCl3, 400MHz) của cryptotanshinon

Phụ lục 4. SKĐ HPLC - UV của cryptotanshinon

Phụ lục 5. SKĐ khảo sát khoảng tuyến tính của đƣờng chuẩn

Phụ lục 6. SKĐ thử tính thích hợp hệ thống của phƣơng pháp

Phụ lục 7. SKĐ cao dƣợc liệu đan sâm thu hái ở Sa Pa Lào Cai