New Ingeniería Metabólica Clase 3: MCA (Análisis del control...

Materia de Especialización

CEBI-E4b

Dra. M. Carolina Di Santo

Lab. Interdisciplinario de Dinámica Celular y

Nano-Herramientas, Departamento de Química

Biológica, FCEN-UBA, IQUIBICEN-CONICET

Carrera de

Especialización en

Biotecnología Industrial

(CEBI)

FCEyN -INTI

Ingeniería Metabólica

Clase 3: MCA (Análisis

del control Metabólico)

Análisis del control Metabólico

Sustrato

(S)

Enzima (E)

Producto

(P)

Niveles de Regulación

• La velocidad de reacción

• El Control Alostérico

dependerá del pH

de las concentraciones intracelulares del sustrato, del

producto y del cofactor

Enzimas claves son reguladas por

activadores e inhibidores alostéricos

• Regulación de la expresión genética la velocidad de síntesis de la enzima

• Regulación endócrina En los organismos multicelulares

Hormonas estimulan o inhiben actividades metabólicas específicas

IM

M. Carolina Di Santo

Metabolito de

Interés

Objetivo:

Sobreproducción

Estrategia 1:

Desrregular la ruta directamente asociada con la síntesis del mismo

Estrategia I1:

Sobreexpresar los genes asociados a la síntesis del producto de interés

Fracasan a menudo

Concepto de Rigidez

Rend (mol P/mol S) =

Las distribuciones de flujos metabólicos en los puntos ramales o nodos del

metabolismo primario (glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos, ruta de

los fosfatos de pentosa) se redireccionan para asegurar un crecimiento

balanceado de la célula


Concepto de Rigidez

“Resistencia inherente del sistema de estudio particular a la

alteración de los flujos metabólicos”

------ “El rendimiento del producto es una función de las particiones o

distribuciones de flujos que ocurren en los nodos de la red”

Nodos flexibles

Nodos rígidos

N

Estrategia: Basta con inhibir el

feedback negativo por P o si P es el

precursor del metabolito deseado

se soluciona el problema. M. Carolina Di Santo

N

Nodo débilmente Rígido

Rama

dominante

Estrategia:

Es preciso retroinhibir la

rama dominante B

Rama

subordinada


Nodo débilmente Rígido

Ejemplo en el ciclo de Krebs

Aún cuando la rama subordinada GLU

esté desrregulada (eliminanándose su

retroinhibición) o GLU sea el

precursor del producto deseado una

fracción significativa del flujo seguirá

entrando a la rama dominante y

limitará el Rendimiento


Estrategia: el rendimiento del producto puede ser

mejorado si se atenúa la actividad enzimática de la rama

dominante ( SucCoA , en el ej.) y se amplifica la

actividad enzimática de la rama subordinada (GLU) lo

suficiente para que canalice el incremento del flujo.

Los nodos débilmente rígidos son

generalmente tratados con técnicas de

mutación-selección


N

+ +


Ejemplo en la glucólisis

Nodo fuertemente Rígido

Estrategia:

La eliminación de la

retroinhibición de ASP y el

bloqueo de la activación de

AcCoA podrían tener algún en

efecto en redireccionar el nodo

PEP


La determinación de la rigidez de los nodos se

realiza solamente por la vía experimental

Se proponen las modificaciones genéticas a

realizar en la célula para lograr el objetivo

de la sobreproducción del producto de

interés


Estrategias en Ingeniería Metabólica


Experimentos de

sobreexpresión de

enzimas glucolíticas

Experimentos

en levaduras

Obj: aumentar

el flujo en la

producción de

etanol

Enzimas

Claves

Glucólisis

Extraído de Rafael Moreno-S´anchez et al., 2008

Journal of Biomedicine and Biotechnology



Journal of Biomedicine and Biotechnology

Flujo Hacia la Formación de Etanol

7 genes

Resultado: “unsuccessful”


Estrategia de suprimir un inhibidor enzimático

Experimentos en levaduras,

Obj: aumentar el flujo en la producción de etanol

Enzima glucolítica HK -------------- Inhibición por Tre6P

Síntesis de Tre6P

G1P Tre6P

E1: Tre6P synthase

E2: Tre6P phosphatase

X Depleción de

genes

Las cepas mutantes, crecimiento celular defectivo y baja producción de

etanol al crecer con glucosa y fructosa en el MC

“Efecto Turbo” Desbalance en el consumo y la producción de ATP


Importante Conclusión

“La sobreexpresión de un paso limitante o de

algunos pasos elegidos arbitrariamente lleva a la

redistribución del Control del flujo Metabólico y

entónces nuevos pasos del camino metabólico se

vuelven limitantes”


Algunos casos de Éxito en la sobreexpresión de enzimas (SE)

SE (23 fold) de 5 genes de la síntesis de Triptofáno en Levaduras (9-fold)

SE de enzimas de síntesis de aa + enzimas mutadas para ser insensibles a

inhibición por producto (Sobreproducción de Trp, Ile, Lys, Val, Thr y

Trealosa y excreción de los metabolitos acelerada) en Corynebacterium

glutamicum

SE de enzimas de síntesis de Manitol (mannitol 1-phosphate

dehydrogenase and mannitol 1-phosphatase) aumento su producción 27-

50 % en cepas de Lactobacilos deficientes en LDH

SE de sorbitol-6P-dehydrogenase (250 fold) en LDH-deficient

Lactobacillus plantarum aumentó 5 veces las producción de Sorbitol

SE de PFK (14 fold) y LDH (3.5 times) aumentó 2-3 times el flujo de la

producción de a. láctico in Lactococcus lactis creciendo en maltosa, y

paralelamente disminuyeron los flujos hacia la producción de etanol y

ácidos secundarios


Journal of Biomedicine and Biotechnology M. Carolina Di Santo

Experimentos de disminución de actividad de enzimas glicolíticas (Downregulation of enzymes to manipulate metabolism)

En el 70 % de

los Tumores

11 Enzimas Glicolíticas (desde HK a LDH)

Varía según el tipo de tumor

-Los experimentos apuntan a disminuir la

expresión de factores de transcripción

asociados a las actividades enzimáticas-

Parásitos

Drug targets for chagas

-Búsqueda de Enzimas Glicolíticas con propiedades

estructurales, cinéticas o regulatorias únicas sin

contraparte en humanos para la síntesis de

inhibidores específicos-

F. Lakhdar-Ghazal, C. Blonski, M. Willson, P. Michels, and J. Perie, “Glycolysis and proteases as targets for the design of new anti-trypanosome drugs,” Current Topics in Medicinal

Chemistry, vol. 2, no. 5, pp. 439–456, 2002.

B. Altenberg and K. O. Greulich, “Genes of glycolysis are ubiquitously overexpressed in 24 cancer classes,” Genomics, vol. 84, no. 6, pp. 1014–1020, 2004.


Teoría del análisis del control Metabólico (MCA)

H. Kacser and J. A. Burns, “The control of flux” Symposia of

the Society for Experimental Biology, vol. 27, pp. 65–104, 1973.

H. Kacser and J. A. Burns, “Molecular democracy: who shares

the controls?” Biochemical Society Transactions, vol. 7, no. 5,

pp. 1149–1160, 1979.

MCA

Establece un marco teórico (matemático) que intenta explicar

los resultados obtenidos en experimentos de sobreexpresión

o supresión de enzimas en un camino metabólico complejo.

Ayuda a identificar estrategias experimentales para la

manipulación de un proceso en un organismo


MCA

Se basa en determinar y cuantificar el grado de control de una

determinada enzima sobre un flujo metabólico o sobre la

concentración de los metabolitos implicados

La aplicación de este análisis intenta evitar los experimentos de

“prueba y error”

Evalúa la estructura del control de un determinado pathway

mediante el uso de algunos parámetros o coeficientes matemáticos

• Coeficiente de Control de Flujo

• Coeficiente de Control de Concentración

• Coeficiente de elasticidad



• El control del flujo metabólico puede ser compartido entre

todas las enzimas que forman parte de una vía metabólica.

• Varias enzimas pueden ejercer un control significativo del flujo.

• La distribución del control del flujo puede variar al producirse

algún cambio en el estado metabólico de la célula o por

cambios en las condiciones experimentales.

• Es posible cuantificar la distribución del control mediante la

aplicación de una perturbación mientras se mide o estudia el

efecto en la variable de interés después de que el sistema ha

alcanzado un nuevo estado estacionario.

• Considera a los sistemas metabólicos como un todo, donde un

cambio en la actividad o en la concentración de una enzima o

de cualquier intermediario será transmitido a través de todo el

sistema

• Coeficiente de Control de Flujo

Es el grado de control que la velocidad (v) de una dada enzima (i ) ejerce sobre un

flujo (J)

Expresa cuanto varía el flujo metabólico J cuando se

aplica un cambio infinitesimal en la concentración de

la enzima i o en su actividad

• Si un pequeño cambio en

vi produce una variación

significativa en J

entónces la enzima i

ejerce un elevado control

sobre le flujo J

Factor de

normalizacion


Teorema de la suma

El valor de cualquier coeficiente de control no es una propiedad individual

de una enzima per se; depende de las actividades de todas las otras

enzimas en la vía metabólica, y de sus coeficientes de control.

Si incluimos todas las enzimas y transportadores del camino

metabólico la sumatoria de todos los Coeficientes de Control

de Flujo es igual a 1



Determinación experimental de Coeficientes de Control

• Adición de enzimas purificadas a homogeneizados de tejido o a

células y posterior cuantificación del cambio de flujo de la vía

medido por la velocidad de producción de algún metabolito

final

• Se debe cuantificar la actividad enzimática endógena y medir el

flujo antes y después de agregar enzima adicional



Es el grado de sensibilidad de una dada enzima (i ) en respuesta a la variación

de alguno de sus ligandos (X= Sustrato, producto o inhibidor alostérico).

La sensibilidad se entiende como su habilidad para cambiar su Vi

• Coeficiente de Control de Concentración

Es el grado de control que una dada enzima (i ) ejerce sobre la concentración de

un metabolito (X)

Es una propiedad de la enzima a

diferencia de los otros coeficientes,

que expresan una propiedad del

sistema


Una enzima con bajo Coef. de elasticidad no puede

modificar su velocidad al cambiar las concentraciones de

S o P en consecuencia tiene un gran control del flujo

metabólico---Enzima Rígida –Nodo Rígido

Relación inversa o Teorema de la Conectividad

Alto CCF -------------Bajo CE

Bajo CCF--------------Alto CE

Existe una conexión entre el coeficiente de elasticidad y

entre el coeficiente de control de flujo


Dificultad: Analizar una por una la ecuación de velocidad de cada

enzima en una ruta metabólica para predecir y explicar el comportamiento

del sistema como un todo.

Modelado de Pathways usando MCA (Modelado Cinético)

• Computing program

• Requires the knowledge of the stoichiometries, rate equations, and Keq

values of each reaction in the pathway (or the Vmax in the forward and

reverse reactions), as well as the intermediary concentrations reached under

a given steady state.

• Some currently used softwares are Copasi (http://www.copasi.org/tiki-

index.php) based on Gepasi (http://www.gepasi.org/); Metamodel; WinScamp,

and Jarnac (both available at http://www.sys-bio.org/); and PySCeS

(http://pysces.sourcesforge.net/). For other programs and links, go to

http://sbml.org/index.psp.


• Es necesario fijar una concentración inicial de metabolito y

marcar como irreversible la remoción de los productos finales

• Excepto para los productos finales (cuya remoción es

irreversible) todo el resto de reacciones se consideran

reversibles, a pesar de que tengan gran Keq (si hay una

reacción irreversible bajo condiciones fisiológicas), luego una

ecuación de velocidad reversible que incluye el Keq es

suficiente para mantener la reacción prácticamente

irreversible.

• Se agrega información sobre los coeficientes de elasticidad

de las enzimas

• El modelado requiere la consideración de todos los datos

experimentales informados e interacciones que se han

descrito para los componentes de una vía específica

Modelado in sílico


Modelado in sílico

- Resultados experimentales a veces difieren del modelo obtenido

Limitaciones

• Los parámetros cinéticos de la vía enzimática y transportadores y los

valores de Keq utilizados provienen de distintos grupos de

investigación, bajo diferentes condiciones experimentales y en

diferentes tipos de células

• Los ensayos cinéticos se llevan a cabo a bajas concentraciones de

enzimas descartando o ignorando interacciones proteína-proteína que

pueden ser relevantes)

• El pH y la temperatura puede no reflejar los valores fisiológicos


Modelado de la glicólisis en

Ambos tipos celulares tienen una glicólisis muy activa y son muy

dependientes de este pathway para el suministro de ATP

Resultados:

En ambos casos las enzimas tradicionalmente consideradas

como limitantes del flujo HK, PFK y PyK no contribuyeron

preponderantemente al control del mismo mientras que el

principal control residía en GLUT (54 % en el parásito y

85-100 % en levaduras)

En levaduras HK ejercía algo del control total (15 %)

En parásitos enzimas NO alostéricas resultaron tener algo de distribución

en el control del flujo (ALDO,GAPDH,PGK)


Ejemplos


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