Neurobiología Neurobiology - UAMassociated protein 1B (MA1B) is expressed in the visual system of...

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Memoria 1997/98 CBMSO 1997/98 Report

Neurobiología

Neurobiology

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MICROTUBULOS MICROTUBULES

Jefe de Línea / Group Leader: Jesús Avila de GradoPersonal Científico Scientific Personnel: Rosario Armas Portela, Javier Díaz Nido, Filip Lim,

Juan José Lucas Lozano, Esteban Montejo de Garcini, Almudena Ramón Cueto, Marina Sánchez García

Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Mar Pérez Martínez, Carlos Sánchez MartínBecarios Predoctorales Graduate Students: Montserrat Arrasate Iragui, Christian González

Billault, Gretchen Lorio García, Laura Sayas Casanova, Mª Auxiliadora Parrales Mena

Técnico de Investigación Technical Assistance: Raquel Cuadros CataláEstudiantes / Undergraduate Students: Evariste DemandeCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Julia García Pérez (CIGB, La Habana. Cuba)

Resumen de Investigación

En el bienio indicado se ha comenzado el análisis de la función de la primera pro-teína asociada a los microtubulos que se expresa in situ en una neurona, la MAP1B,mediante el uso de mutantes en los que esta proteína se expresa deficientemente. Porotra parte, se ha continuado con el estudio de la fosforilación de esta proteína, MAP1B,habiéndose indicado que la proteína quinasa dependiente de prolina que la puedemodificar es fundamentalmente la GSK3, y en determinadas circunstancias la proteínaquinasa cdk5. Estos estudios han sido complementados analizando la localización delas diferentes isoformas fosforiladas de MAP1B en diversas partes del sistema nervioso(central y periférico) de una rata adulta. Simultáneamente a los estudios anteriores seha estudiado la fosforilación de la proteína mayoritaria asociada a los microtubulosdendríticos, la proteína MAP2 habiéndose encontrado que dicha fosforilación puede serregulada por glutamato a través de los receptores NMDA.

Adicionalmente a los estudios de la estructura y función de la proteína microtu-

bular, fundamentalmente en lo que respecta a su implicación en el desarrollo de la mor-

fología de una neurona, se han analizado los cambios que se producen en las proteínas

microtubulares en procesos neurodegenerativos, como por ejemplo la enfermedad de

Alzheimer. En la enfermedad de Alzheimer, la proteína asociada a los microtubulos

conocida como tau se ensambla en unas estructuras aberrantes, los filamentos aparea-

dos helicoidales y en este periodo de tiempo hemos analizado qué factores favorecen

dicho ensamblaje y cuál es la región de la proteína tau a través de la cual se produce la

interacción proteína-protein que da lugar al polímero aberrante. Nuestros resultados

han indicado que los glicosaminoglicanos en forma sulfatada, y otros polianiones, favo-

recen la polimerización de tau, y que la región de interacción tau-tau coincide con la

región de tau que interacciona con los microtubulos. Además hemos observado la

implicación de la proteína kinasa GSK3 en la fosforilación aberrante que se produce en

la proteína tau que se encuentra en los cerebros de pacientes con la enfermedad de

Alzheimer, implicación que ha sido estudiada mediante el uso de sales de litio como

inhibidores específicos de la kinasa.

Por otra parte se ha iniciado, con buenos resultados, un estudio sobre la utiliza-

ción de células de glia envolvente en procesos de regeneración de la médula espinal. En

un primer trabajo se ha demostrado que las células de glia envolvente transplantadas

en el sitio donde se ha producido la lesión medular son capaces de migrar junto con el

axon(es) dañado(s), sugiriendo la regeneración del axon(es), en la distancia analizada

en la médula espinal.

Research Summary

During the last two years we have started the analysis of the function of microtu-

bule associated protein, MAP1B. The interest of this study is to determine the function

of the first MAP that is expressed �in situ� in a neuron. To test that we are doing the

analysis in mutant mice lacking that protein. Also, we have continued the study of

MAP1B phosphorylation. Our results have indicated that the proline directed phosp-

horylation that occurs in MAP1B is mainly achieved by protein kinase GSK3, and in

some conditions, by protein kinase cdk5. These studies have been complemented with

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the analysis of cell localization, in central and peripheral neurons system of an adult rat,

of the different types of MAP1B phosphoisoforms. Simultaneously to the previous stu-

dies we have also analyzed the phosphorylation of the main microtubule associated

protein associated to dendritic microtubules, MAP2. Our studies have indicated that the

phosphorylation of that protein could be regulated by glutamate through NMDA receptors.

Additionally to the structure-function analysis in microtubule proteins, mainly

focused on the involvement of these proteins in regulating neuron morphology, it has

been studied the changes occurring in microtubule proteins during neurogeneration

disorders, for example Alzheimer�s disease. In Alzheimer�s disease, microtubule asso-

ciated protein tau can assemble into aberrant structures known as paired helical fila-

ments. Our analysis has been focused in looking for factors that could favour the abe-

rrant aggregation of tau and in determining the tau region involved in its self aggrega-

tion. Our results have indicated that the presence of sulfated glycosaminoglycans, or

other polyanions, favour tau polymerization and that the tau region involved in pro-

tein-protein interaction essentially coincides with that tau region that binds to microtu-

bules. Also, we have found that tau protein present in the brain of Alzheimer�s disease

patients in hyperphosphorylated form, could be modified by GSK3 protein kinase.

These analyses have been mainly carried out by using a specific inhibitor for that pro-

tein kinase, lithium salts.

On the other hand, we have started with good results an analysis regarding the

use of olfactory ensheating glial cells in processes of neural regeneration in spinal cord.

Our studies have demonstrated that olfactory ensheating glial cells transplanted to the

lesion site are able to migrate together with the damaged axons, and appear to overco-

me any inhibitory influence from the environment, in the central nervous system. Thus,

the olfactory ensheating cells support the regrowth of axons over long distances within

the spinal cord.

Publicaciones / Publications

� García Rocha, M., Avila, J. and Lozano, J. The ζ isozyme of protein kinase C binds

to β tubulin through the pseudo substrate domain. Exp. Cell Res. 230, 1-8 (1997).

� Ramón-Cueto, A. and Avila, J. Differential expression of microtubule-associated

protein IB phosphorylated isoforms in the adult rat nervous system. Neuroscience

77, 485-501 (1997).

� Pigino, G., Paglini, G., Ulloa, L., Avila, J. and Caceres, A. Analysis of the expres-

sion, distribution and function of cyclin dependent kinase (cdk5) in developing

cerebellar macroneurons. J. Cell Sci. 110, 257-270 (1997).

� Avila, J. Modification in proteins related with the onset of Alzheimer�s disease:

Tau phosphorylation, glycation and oxidation Alzheimer�s disease. Current Drugs

2, 141-143 (1997).

� Avila, J. and Colaço, A.L.S. The role of sulfated glycosaminoglycans in

Alzheimer�s disease: a hypothesis. Alzheimer�s Research 3, 77-81 (1997).

� Muñoz Montaño, J.R., Moreno, F.J., Avila, J. and Díaz Nido, J. Lithium inhibits

Alzheimer�s disease-like tau protein phosphorylation in neurons. FEBS Letters

411, 183-188 (1997).

� Avila, J. The use of microtubule poisons on tumor cells. The Cancer J. 10, 315-318 (1997).

� Sánchez, C., Ulloa, L., Montoro, R., López-Barneo, J. and Avila, J. NMDA-gluta-

mate receptors regulate phosphorylation of dendritic cytoskeletal proteins in the

hippocampus. Brain Res. 765, 141-148 (1997).

� Avila, J. and Díaz Nido, J. Phosphorylation of microtubule protein. Encyclop.

Human. Biol. 6, 791-800 (1997).

� Pérez, M., Aloria, K., Zabala, J.C. and Avila, J. A putative β tubulin phosphate-

binding motif is involved in lateral protofilament interactions. Eur. J. Biochem. 248,

840-847 (1997).

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� Arrasate, M., Pérez, M., Valpuesta, J.M. and Avila, J. Role of glycosaminoglycans in

determining the helicity of paired helical filaments. Am. J. Pathol. 151, 1115-1122 (1997).

� Sánchez, C., Díaz Nido, J. and Avila, J. Regulation of a site-specific phosphoryla-

tion of the microtubule associated protein 2 during the development of cultured

neurons. Neuroscience 87, 861-870 (1998).

� Moreno, F.J. and Avila J. Phosphorylation of stathmin modulates its function as a

microtubule depolymerizing factor. Mol. Cell Biochem. 183, 201-209 (1998).

� Vecino, E., Ulloa, L. and Avila, J. The phosphorylated isoform of microtubule

associated protein 1B (MA1B) is expressed in the visual system of the tench (Tinca

tinca, L) during optic nerve regeneration. Neuros. Lett. 245, 93-96 (1998).

� García Pérez, J., Avila, J. and Díaz Nido, J. Implication of cyclin-dependent kina-

ses and glycogen synthase kinase 3 in the phosphorylation of microtubule asso-

ciated protein 1B in developing neuronal cells. J. Neuros. Res. 52, 445-452 (1998).

� Heredia, M., Gascuel, J., Ramón-Cueto, A., Santacano, M., Avila, J., Masson, C.

and Valverde, F. 1.9 E and 4.11.C, two novel monoclonal antibodies against the

olfactory bulb ensheathing glia. Glia 24, 352-364 (1998).

� Ramón-Cueto, A., Plant, G.W., Avila, J. and Bunge, M.B. Olfactory ensheathing

glia promote long distance axonal regeneration in the transfected adult spinal

cord. J. Neurosc. 18, 3803-3815 (1998).

� Ramón-Cueto, A. and Avila, J. Olfactory ensheathing glia: properties and func-

tion. Brain Res. Bull. 46, 175-187 (1998).

� Pérez, M., Valpuesta, J.M., Montejo de Garcini, E., Quintana, C., Arrasate, M.,

López Carrascosa, J.L., Rabano, R., García de Yébenes, J. and Avila, J. Ferritin is

associated to the aberrant tau filaments present in progressive supranuclear

palsy. Am. J. Pathol. 152, 1531-1539 (1998).

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� Pérez, M., Wandosell, F., Colaço, C., Avila, J. Sulphated glycosaminoglycans prevent

the neurotoxicity of a human prion protein fragment. Biochem. J. 335, 369-374 (1998).

� Ledesma, M.D., Pérez, M., Colaço, C. and Avila, J. Tau glycation is involved in

aggregation of the protein but not in the formation of filaments. Cell. Mol. Biol. 44,

1111-1116 (1998).

� Fanarraga, M., Aloria, K., Avila, J. and Zabala, J.C. Characterization of tubulin

isotype-specific antibodies by electrophoretic mobility shift assay. BioTechniques

25, 940-942 (1998).

� Franco, P., Massa, O., García-Rocha, M., Chiaradonna, F., Iaccarino, C., Correas,

I., Mendez, E., Avila, J., Blasi, F. and Stopelli, P. Protein kinase C-dependent

phosphorylation of prourokinase leads to the formation of a receptor competitive

antagonist. J. Biol. Chem. 237, 27734-27740 (1998).

Tesis Doctorales / Doctoral Theses

Carlos Sánchez Martín: �Caracterización de la fosforilación de la proteína asociada a

los microtubulos 2 (MAP2) en su región rica en prolina�. Universidad Autónoma de

Madrid. 1997. Calificación: Apto cum laude.

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry

Proyecto colaboración con Synthelabo y Pharma Mar

Premios y Distinciones / Prizes and Distinctions

Jesús Avila:

� Premio Carmen y Severo Ochoa, 1998

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MECANISMOS DE TRANSDUCCIÓN; MODULACIÓN PORNEUROPEPTIDOS E IMPLICACIONES FARMACOLÓGICAS TRANSDUCTION MECHANISMS; MODULATION BY NEUROPEPTIDES AND PHARMACOLOGICAL IMPLICATIONS

Jefe de Línea / Group Leader: Edgardo CatalánPersonal Científico Scientific Personnel: Félix Hernández, Antonio LirasBecario Predoctoral Graduate Student: María José Pérez-AlvarezTécnico de Investigación Technical Assistance: María Victoria Mora-Gil


El objetivo principal del proyecto de investigación lo constituye el estudio de los

mecanismos de transducción implicados en la acción de la endotelina, así como la

implicación de agentes farmacológicos específicos. Los objetivos particulares de este

proyecto han sido:

Estudio del efecto de la endotelina en sistemas de transducción, especialmente

metabolismo de lípidos y fenómeno de fosforilación-defosforilación.

Los datos obtenidos han confirmado el mecanismo de acción de la endotelina a

través del ciclo PI-PA. Cabe señalar que dentro de esta aproximación al mecanismo de

acción del neuropéptido, se ha iniciado un análisis de los esfingolípidos como otro posi-

ble mecanismo de transducción afectado por la endotelina; datos obtenidos en cerebro

en esfingosina, ceramida y glicoesfingolípidos cerebrales indican la participación direc-

ta de diversos sistemas enzimáticos como la esfingomielinasa y soportan la implicación

de este sistema de esfingolípidos en la acción de la endotelina. Por otra parte, teniendo

en cuenta que ciertos metabolitos de este sistema lipídico (como la esfingosina y cerami-

da) han sido propuestos como segundos mensajeros, se ha iniciado un estudio particu-

lar de estos mediadores bioquímicos.


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Respecto a la fosforilación-defosforilación, un aspecto particular lo ha constituido

la demostración de la participación de la tirosina quinasa y la tirosina fosfatasa en la

acción de la endotelina. De manera específica, estudios de la proteína tirosina fosfatasa

-1C han demostrado que la modulación y regulación por el neuropéptido pueden estar

relacionadas de manera fundamental a los sistemas defosforilantes con la posible par-

ticipación de nucleótidos cíclicos. En orden a establecer una relación entre este fenó-

meno descrito y el fenómeno de adhesión, se han estudiado dos proteínas (p125FAK y

p130Cas) habiéndose establecido que la fosforilación de estas proteínas por acción de la

endotelina tiene lugar mediante receptores tipo B. Estos estudios indican que la

endotelina modularía la fosforilación en tirosina de proteínas específicas, las cuales

pueden estar implicadas en los procesos de adhesión en el sistema nervioso.

Estudio de la funcionalidad de la barrera hematoencefálica principalmente a nivel

de sistemas de transducción.

Se ha continuado el estudio de la barrera hematoencefálica, habiéndose obtenido

nuevos datos acerca del turnover de fosfoinosítidos y su afectación por proteínas fosfo-

rilables y diversos agentes farmacológicos.

Estudios de la participación de mediadores en la acción de la endotelina.

Se ha establecido el papel de ciertos mediadores como PAF y NO en el mecanis-

mo de acción de las endotelinas. De manera particular, se ha analizado el mecanismo

de acción del PAF en el sistema nervioso fundamentalmente a nivel de proteínas especí-

ficas y metabolismo de esfingolípidos.

Estudio de la modulación de los sistemas de transducción mediante agentes

farmacológicos.

Se ha continuado la investigación acerca del modo de acción de nuevas drogas

capaces de afectar sistemas de transducción en el sistema nervioso. Otros sustratos

biológicos (plaquetas) han sido utilizados con fines comparativos. En particular, se ha

estudiado el modo de acción de nuevas moléculas con actividad antitrombótica en sis-

temas enzimáticos como la fosfodiesterasa dependiente de GMP cíclico.

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Research Summary

The main goal of this project is to study the biochemical mechanisms at the trans-

duction level involved in the action of neuropeptides, in particular endothelin, and the

involvement of new pharmacological agents. In this regard, the particular objectives are:

Effect of endothelin on transduction systems, specifically on lipid metabolism and

the phosphorylation-dephosphorylation phenomenon.

Our data have confirmed that the mechanism of action of endothelin involves, at

least in part, the PI-PA cycle. The involvement of sphingolipids in the endothelin signal

transduction mechanism has also been studied. In brain, endothelin evoked variations

on sphingomyelin, ceramide and glycosphingolipids, a phenomenon that is probably

related to sphingomyelinase activity and to glycosphingolipid synthesis. These data

support the idea that the neuropeptide is able to evoke ceramide production in nervous

system, which might account, at least in part, a number of biochemical responses

evoked or mediated by endothelin. Taking into account that other sphingolipid metabo-

lites (as sphingosine and ceramide) have been proposed as second messengers in signal

transduction pathways, we have initiated a particular study on these mediators.

In regard to protein phosphorylation, the involvement of tyrosine kinases as well

as tyrosine phosphatases in the mode of action of endothelin has been confirmed; in

particular, the role of tyrosine phosphatase-1C (related to cyclic nucleotide action) has

been established. Furthermore, we have demonstrated that endothelin regulates the

tyrosine phosphorylation of two proteins, the focal adhesion kinase p125FAK and crk-

associated substrate p130, a fact that indicate that endothelin modulates the tyrosine

phosphorylation of specific proteins, which may be involved in adhesion processes in

the nervous system.

Functioning of the blood-brain barrier mainly at the transduction level.

We have continued the study of the blood-brain barrier; new data have been

obtained on phosphoinositide turnover and on the role of phosphorylated proteins and

several pharmacological agents.

Involvement of mediators in the mechanism of action of endothelin.

The role of mediators such as PAF and NO in the actions of endothelin has been

established. In particular, the mechanism of action of PAF on the nervous system (at

specific proteins and sphingolipid metabolism level) has been analyzed.

d) Modulation of the transduction systems by pharmacological agents.

We have continued the research on the mode of action of new drugs able to affect

transduction systems at the nervous system. Other experimental designs included the

utilization of platelets for comparative purposes. The mode of action of new molecules

with antithrombotic activity has been studied, mainly on enzyme systems such as cyclic

GMP-dependent phosphodiesterase.

Publicaciones/Publications

� Catalán R.E., Gargiulo, L., Martínez, A.M., Calcerrada, M.C. and Liras, A. Protein

tyrosine phosphatase activity modulation by endothelin-1 in rabbit platelets.

FEBS Lett. 400, 280-284 (1997).

� Catalán, R.E., Miguel, B.G., Calcerrada, M.C., Ruiz, S. and Martínez, A.M.

Sphingolipids increase calcium concentration in isolated rat liver nuclei. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 238, 347-350 (1997).

� Catalán, R.E., Calcerrada, M.C., Miguel, B.G. and Martínez, A.M. Mechanism of

arachidonic acid-induced Ca2+ mobilization in liver nuclei. J. Lipid Med. Cell

Signal. 17, 167-174 (1997).

� Catalán, R.E., Martínez, A.M., Aragonés, M.D., Lombardía, M., Calcerrada, M.C.

and Garde, E. Regulation of PAF-induced platelet responses by cyclic nucleotides.

Platelets 8, 147-154 (1997).

� Catalán, R.E., Martínez, A.M., Aragonés, M.D. and Lombardía, M. Involvement of

cyclic GMP in the mode of action of a new antithrombotic agent PCA-4230; inhi-

bition of the platelet cyclic GMP dependent phosphodiesterase. Thromb. Res. 87,

547-557 (1997).

� Catalán, R.E. Phosphatidylinositol pathways. In �Introduction to the Blood-Brain

Barrier�. W.M. Pardridge (ed), Cambridge University Press, pp. 330-337 (1998).

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BASES MOLECULARES DE LA NEUROTRANSMISIÓN MEDIADA POR AMINOÁCIDOS MOLECULAR BASIS OF THE AMINO ACID MEDIATED NEUROTRANSMISSION

Jefes de Línea / Group Leaders: Cecilio Giménez, Carmen Aragón Personal Científico Scientific Personnel: Beatriz López-Corcuera, Francisco ZafraBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Arjan Geerlings Becarios Predoctorales Graduate Students: Rodrigo Martinez, Luis Olivares, Julia Ponce, Irene

Poyatos, Enrique SaleroTécnico de Investigación Technical Assistance: Enrique NúñezCientífico Visitante Visiting Scientific: Raquel Pérez Sen (Universidad Complutense de

Madrid)Estudiantes de Programas InternacionalesUndergraduate Students from international programs: Thomas Dickmeis (Albert-Ludwigs-Universitat of

Freiburg); Damien Thompson (Michigan State University).

Resumen de Investigación (C. Aragón)

La glicina es un neurotransmisor inhibidor en médula espinal y tallo cerebral. En

estas dos regiones actúa sobre el receptor postsináptico de glicina sensible a estricnina.

El segundo papel de la glicina es potenciar la acción del glutamato, el más importante

neurotransmisor excitador en corteza e hipocampo, sobre receptores del tipo NMDA.

Para llevar a cabo cualquiera de estas funciones, es necesario que los niveles de glicina

extracelulares se mantengan bajo límites muy estrechos de concentración. Esto se lleva

a cabo mediante la actuación de los transportadores de glicina de alta afinidad, depen-

dientes de sodio y cloruro y localizados en la membrana plasmática de las neuronas o


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los procesos gliales adyacentes. Alteraciones en cualquiera de las dos funciones de la

glicina antes mencionadas dan como consecuencia desórdenes en la actividad neuro-

muscular, o bien alteraciones en la función cognitiva.

Los objetivos del grupo están centrados en el estudio, a nivel molecular, de los

transportadores de glicina GLYT1 y GLYT2; concretamente el estudio de la relación

estructura/función y la regulación de estas proteínas en el SNC.

Con respecto a la relación estructura/función, hemos generado clones de líneas

celulares de mamífero que sobreexpresan de forma estable GLYT1 y GLYT2 con objeto

de estudiar, de forma comparativa, sus características bioquímicas y electrofisiológicas

utilizando técnicas de patch-clamp. Hemos podido demostrar diferencias funcionales

entre GLYT1 y GLYT2. Este último es estrictamente dependiente de cloruro, y presenta

una mayor cooperatividad respecto al sodio que GLYT1. Esta mayor dependencia de sodio

en GLYT2 también se manifiesta por la mayor dependencia de voltaje que presentan las

corrientes de entrada generadas por el funcionamiento de GLYT2 respecto a GLYT1.

Por otra parte, hemos estudiado la distribución subcelular de las isoformas

GLYT1a y GLYT1b mediante transfección de cultivos de neuronas de hipocampo y pos-

terior microscopía de inmunofluorescencia, observándose una localización exclusiva-

mente dendrítica de estas proteínas. Mediante mutaciones puntuales y delecciones rea-

lizadas en dominios intracelulares de los transportadores, hemos identificado dos moti-

vos di-leucina en el carboxilo terminal, y el extremo amino terminal, como determinan-

tes estructurales responsables de la distribución polarizada de GLYT1. La funcionalidad

de estos motivos se ha analizado igualmente en células epiteliales polarizadas MDCK.

Mediante técnicas de microscopía electrónica, se ha determinado con precisión la

expresión subcelular de GLYT2 que aparece concentrado en agregados a lo largo de la

membrana axonal. Además, se ha demostrado que GLYT2 es un marcador de neuronas

glicinérgicas, y que la alta concentración de glicina que se encuentra en estas neuronas

se debe al trabajo del transportador GLYT2.

En cuanto a la regulación de los transportadores hemos demostrado que la expre-

sión glial de GLYT1 depende de factores procedentes de la neurona.

En la actualidad, el interés del grupo está centrado en la identificación y localiza-

ción de dominios y residuos de GLYT1 y GLYT2 implicados en su función (sitios de

unión a glicina, sodio y cloruro), que a su vez expliquen las propiedades diferenciales

de ambos transportadores. Para abordar este objetivo estamos generando transporta-

dores quiméricos entre GLYT1 y GLYT2, y mutantes puntuales en residuos localizados

en dominios susceptibles de estar implicados en estas funciones.

Todo ello permitirá desarrollar compuestos que interactuando con sitios concre-

tos de la proteína, modifiquen su actividad y, por tanto, modulando la neurotransmi-

sión mediada por glicina, puedan actuar como agentes terapéuticos anticonvulsivantes,

antiepilépticos, antiespásticos o sedantes.

Resumen de Investigación (C. Giménez)

La Apolipoproteína E (apoE) es una proteína bien caracterizada, de 299 aminoá-

cidos que está involucrada en el transporte y la regulación del colesterol en plasma, y

en el metabolismo de los lípidos. En humanos, apoE presenta tres isoformas: E2 (cys112,

cys158); E3 (cys112, arg158); y E4 (arg112, arg158), codificadas por un mismo gen localizado

en el cromosoma 19. Estudios genéticos han demostrado que apoE es un factor de ries-

go en enfermedades cardiovasculares y en enfermedades neurodegenerativas, especial-

mente la enfermedad de Alzheimer. Estos datos genéticos, junto con otros clínicos y

bioquímicos han demostrado la implicación de apoE en procesos de regeneración y

reparación celular, especialmente en el SNC. Los niveles de expresión de la apoE pare-

cen estar asociados a las situaciones clínicas citadas anteriormente.

El gen APOE esta sometido a una regulación compleja por factores hormonales,

nutricionales, específicos de tejido y del desarrollo ontogénico. En el sistema nervioso,

la proteína se sintetiza en células de glía. En gran medida, los niveles de expresión pare-

cen estar regulados transcripcionalmente por la actividad de diversos elementos de la

región promotora del gen APOE. Experimentos previos de nuestro laboratorio han per-

mitido la identificación de dos sitios de unión del factor de transcripción AP2 en la

región proximal del promotor que estarían implicados en la regulación de la expresión

de APOE por cAMP. En la actualidad, hemos iniciado la búsqueda de otros sitios den-

tro de esta región promotora que pudieran ser importantes para la regulación de la

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expresión del gen. La identificación de factores de transcripción con capacidad de unión

al promotor se está realizando mediante la técnica del híbrido simple en células de leva-

dura. De esta manera hemos identificado un sitio de unión para el factor de transcrip-

ción USF (región -80), de la familia HLH, y otro para las proteínas con �dedos de zinc�

ZIC1 y ZIC2. Estos sitios de unión se han confirmado mediante la técnica de retardo en

gel de electroforesis (EMSA). Además, estos experimentos nos han permitido identifi-

car otros sitios adicionales para unión de las proteínas ZIC. Experimentos funcionales

en los que se utilizan diversas construcciones del promotor unido al gen reporter luci-

ferasa nos indican que mientras USF tiene un efecto modesto sobre la actividad del

promotor, ZIC1 y, especialmente, ZIC2 son fuertes estimuladores del mismo. Las proteí-

nas de la familia ZIC desempeñan un papel importante en durante el desarrollo tempra-

no del sistema nervioso. En el adulto se concentran en el cerebelo, pero también parecen

inducirse en las células de glía en respuesta a ciertas señales. En la actualidad investiga-

mos si algunos de los procesos fisiológicos atribuidos a ZIC están mediados por APOE.

Research Summary (C. Aragón)

Glycine is an inhibitory neurotransmitter in the spinal cord and the brain stem. In

these regions glycine acts on the postsynaptic glycine receptors sensitive to strychnine.

Glycine is also able to potentate the action of glutamate, the main excitatory neuro-

transmitter in the cortex and the hippocampus, on the postsynaptic NMDA glutamate

receptors. For both glycine functions, the extracellular levels of glycine must be finely

regulated. The uptake of glycine through sodium and chloride dependent, high-affinity

specific transporters located both in the plasma membrane of neurons and the fine glial

processes, provides a way of clearing the extracellular space of neuroactive substances.

Dysfunction in any of the mentioned glycine roles in neurotransmission would lead to

neurological disorders associated with excessive musculoskeletical activity, or in cog-

nitive functions.

The aim of the group is to study, at the molecular level, the structure/function

relationship and the regulation of the GLYT1 and GLYT2 glycine transporters from CNS.

We have generated clonal cell lines stably expressing GLYT1 and GLYT2 in order

to comparatively examine their biochemical and electrophysiological features. By using

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patch-clamp techniques, we have demonstrated functional differential properties bet-

ween GLYT1 and GLYT2. A sigmoidal sodium dependence of the glycine uptake indi-

cates the involvement of more than one sodium in the transport cycle. We suggest a

more cooperative behavior for sodium in GLYT2 than in GLYT1.

The subcellular distribution of the glycine transporters isoforms GLYT1a and

GLYT1b has been also studied in cultures of fully polarized hippocampal neurons. By

immunofluorescent microscopy we show that both GLYT1 isoforms are targeted to

dendrites but not to axons. Site directed mutagenesis experiments allowed the identifi-

cation of two di-leucine motifs in the carboxyl terminus of the protein involved in the

polarization of GLYT1 to dendrites. Deletion experiments in the very amino terminal

region of the protein give additional sorting information for this glycine transporter.

The functionality of these motifs has been also analyzed in polarized MDCK cells.

By electronic microscopy techniques we have shown the subcellular expession of

GLYT2 which appears as clausters through the axonal membrane. On the other hand, it

has been demonstrated that GLYT2 is a reliable marker for glycinergic neurons, and

that the high content of glycine observed in some neurons is indeed achieved by the

concentrative task performed by GLYT2.

As far as the regulation properties of the transporters is concern, we have

demonstrated a neuronal dependency of the GLYT1 expression in glial cells.

Currently, the interest of the group is focused in the identification of structural

domains of GLYT1 and GLYT2 involved in its differential functionality (binding sites

for glycine, sodium and chloride). For this purpose, we are generating chimeric trans-

porters between GLYT1 and GLYT2 and site-directed mutants in residues located in

structural domains putatively involved in the transport process. Besides, it will provi-

de a way to develop new selective glycine transporter inhibitors that can act as specific

drugs with potential anticonvulsant, sedative, antiepileptic, and antispastic effects.

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Research Summary (C. Giménez)

Apolipoprotein E (apoE) is a well characterized 299 amino acid protein that par-

ticipates in the regulation of plasma cholesterol and lipid metabolism. In humans, apoE

has three major protein isoforms: E2 (cys112, cys158); E3 (cys112, arg158); and E4 (arg112,

arg158), that are encoded by a single gene on chromosome 19. Genetic studies have

shown that apoE is a risk factor for cardivascular and neurodegenerative diseases, spe-

cially Alzheimer disease. These genetic data, together with additional clinical and bio-

chemical data, have demonstrated the involvement of apoE in repair and regeneration

cellular processes, specially in the CNS. The levels of expression of apoE seem to be

associated with the risk to develop the former mentioned clinical conditions, specially

Alzheimer disease.

The APOE gene is under a complex regulation of developmental, hormonal, die-

tary and tissue specific factors. In brain, the synthesis take place in astrocytic cells. The

expression levels seem to be transcriptionally regulated by an array of regulatory ele-

ments in the promoter region of the APOE gene. Previous experiments from our labo-

ratory allowed the identification of two binding sites for the transcription factor AP2

located in the proximal region of the promoter. These sites could be involved in the

regulation by cAMP of the apoE expression. Currently, we have initiated a search of

additionally regulatory elements in this region of the promoter that would be important

for the regulation of expression of this gene. Search of transcription factors with binding

ability to this region of the promoter is being performed by the one-hybrid technique in

yeast cells. We have identified a binding site for the HLH transcription factor USF (-80

region) and another one for the zinc finger proteins ZIC1 and ZIC2. These sites have

been confirmed by electrophoretic mobility shift assays (EMSA). In addition EMSA stu-

dies reveal additional binding sites for ZIC proteins. Functional assays with a variety of

promoter-luciferase constructs indicate that whereas USF has a moderate effect on the

promoter activity, ZIC1 and specially ZIC2 are strong stimulators of the promoter. ZIC

proteins are known to play an important role in the early development of the nervous

system. In the adults life they are mainly expressed in the cerebellum, but are also regu-

lated in glial cells in response to some signals. Whether any of the physiological pro-

cesses attributed to ZIC proteins are mediated by apoE is currently under investigation.

191


� Poyatos., I., Ponce, J., Aragón, C., Giménez, C. and Zafra, F. The glycine trans-

porter GLYT2 is a reliable marker for glycinergic neurons. Mol. Brain. Res. 49, 63-

70 (1997).

� Spike, R.C., Watt, C., Zafra, F. and Tood, A.J. An ultrastructural study of the gly-

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porter GLYT1 expression in glial cells. Glia 20, 155-162 (1997).

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ne topology of the glycine transporter GLYT1. J. Biol. Chem. 272, 1211-1217 (1997).

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transporter in human small intestine. J. Physiol. (London) 504, 147-148 (1997).

� Ponce, J., Poyatos, I., Aragón, C., Giménez, C. and Zafra, F. Characterization of the

5´region of the rat brain glycine transporter GLYT2 gene: Identification of a novel

isoform. Neurosci. Letters 242, 25-28 (1998).

� Giménez, C. Composición y estructura de la membrana neuronal. Bases molecu-

lares de su fisiología y su patología. Rev. Neurol. 26, 232-239 (1998).

� Aragón, C. y Giménez, C. Mecanismos que regulan la disponibilidad de neuro-

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� Zafra, F. Neurotrofinas: supervivencia, diferenciación, regeneración y plasticidad

de las neuronas. Rev. R. Acad. Cienc. Exact. Fis. Nat. 91, 285-2296 (1998).

192

� C. Aragón and B. López-Corcuera. Purification, Hydrodynamic Properties and

Glycosylation Analysis of a Glycine Transporter. Methods Enzymol. 296, 3-17

(1998).

� López-Corcuera, B., Martínez-Maza, R., Núñez, E., Roux, M., Supplisson, S. and

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transporters. J. Neurochem. 71, 2211-2219 (1998).

� Murga, C., Zafra, F. and Mayor, F. Jr. The subcellular distribution of b-adrenergic

receptor kinase 1 (GRK2) in rat brain. Neuroscience 87, 631-637 (1998).

Colaboraciones con la Industria / Collaborations with Industry

Synthelabo Recherche (L.E.R.S.). Francia

193

BASES MOLECULARES DE LA ADAPTACIÓN AL EJERCICIO MOLECULAR BASES OF THE ADAPTATION TO EXERCISE

Jefe de Línea / Group Leader: Rafael Manso MartínezBecarios Predoctorales Graduate Students: Beatriz González Alonso, Raquel Hernando

Sebastián

Resumen de Investigación.

El interés investigador del laboratorio se centra en la caracterización de los facto-

res y mecanismos moleculares implicados en la inducción de cambios adaptativos por

el entrenamiento. Aunque el músculo esquelético constituye el principal objeto de

interés investigador, también se han desarrollado algunos estudios en miocardio e

hígado. Uno de los objetivos del laboratorio es explicar el fundamento molecular de la

selectividad y especificidad de las respuestas adaptativas musculares al entrenamien-

to. Mientras que la actividad contráctil muscular puede aportar los elementos necesa-

rios para proporcionar selectividad, una aproximación al fundamento molecular de la

especificidad implica caracterizar los estímulos inductores, su relación con la actividad

contráctil muscular y los cambios neuroendocrinos que desencadena la actividad física,

que conducen a la activación de los sistemas respiratorio y cardiovascular, así como los

mecanismos de recepción y transducción mediante los que la fibra muscular modifica

finalmente su fenotipo.

La caracterización de la respuesta celular de estrés como fundamento universal

de los mecanismos de preservación de las células de las agresiones del entorno y de la

tolerancia a nuevas agresiones, junto con las evidencias de que el ejercicio físico desen-

cadena una respuesta celular de estrés en fibras musculares y en otros tejidos, propor-

cionan verosimilitud a la hipótesis de que las proteínas de choque térmico o de estrés

(HSPs) pudieran jugar un importante papel como mediadoras de las respuestas adap-

tativas al entrenamiento. El trabajo de nuestro laboratorio en los últimos años se ha diri-


gido a comprobar esta hipótesis tratando de definir la forma de participación de las

HSPs en los procesos adaptativos tisulares. Para ello, se han estudiado las cinéticas de

inducción de la síntesis y la acumulación de HSPs tras ejercicio agudo en dos tipos de

músculo con diferente grado de implicación en la actividad locomotriz, en miocardio y

en hígado, y se ha analizado la forma en que el entrenamiento modifica la respuesta de

estrés al ejercicio y los niveles de expresión de HSPs. Las evidencias de que el ejercicio

físico puede modular la expresión de HSPs, actuando de forma específica de tipo de

músculo, han abierto una serie de interrogantes relativas a la relación entre las carac-

terísticas del ejercicio agudo y el tipo de entrenamiento y la especificidad de los cam-

bios inducidos en la respuesta celular de estrés y en los niveles de expresión de HSPs,

respectivamente, que están siendo objeto de estudio en el laboratorio considerando por

separado el papel del patrón de impulsos nerviosos que activan el músculo y del entor-

no endocrino como elementos determinantes de cambios adaptativos al entrenamiento.

Además de su potencial interés para comprender las bases moleculares de la adaptabi-

lidad muscular, el estudio de la regulación de los niveles de expresión de HSPs por el

ejercicio físico, la actividad neural y el sistema endocrino puede aportar una valiosa

información para caracterizar el fundamento molecular de la relación existente entre el

ejercicio físico y la salud y establecer sus posibles límites.

Research Summary

The research interest of the laboratory is directed towards an understanding of

the molecular mechanisms involved in the adaptive changes induced by physical exer-

cise. Although skeletal muscle was the main object of study, some of the investigations

were performed in myocardium and liver. One of our research aims is to characterize

the factors and processes involved in defining the selectivity and specificity of skeletal

muscle adaptations to exercise training. While contractile activity itself can provide the

necessary elements to understand selectivity, an approximation to the molecular foun-

dations of specificity implies characterizing the adaptive stimuli, their relationship with

the contractile activity of muscle or with the neuroendocrine changes induced by phy-

sical exercise that trigger the activation of the respiratory and cardiovascular systems,

as well as the mechanisms of reception and transduction that enable muscle fibers to

transform adaptive stimuli into changes in their phenotype.

194

195

The characterization of the cellular stress response as a universal mechanism of

cellular protection from environmental aggressions, and heat-shock or stress proteins

(HSPs) as the molecules responsible for preserving cells from stress and preparing them

to survive new environmental challenges, together with experimental evidence that

physical exercise induces a cellular stress response in skeletal muscle and other tissues,

provides a reasonable basis to the notion that HSPs might have a fundamental role in

mediating the adaptive responses to exercise training. The work of our laboratory in the

last few years has been directed to test this hypothesis, trying to define the way in

which HSPs are involved in the adaptive processes. We have analyzed the kinetics of

induction of stress protein synthesis and accumulation following exercise in different

muscle types variously involved in the locomotive process, in myocardium and in liver.

We have investigated the way in which exercise training modulates the stress response

to exercise and the expression levels of stress proteins. The experimental evidence accu-

mulated, indicating that exercise training may modulate the expression of stress pro-

teins, acting in an individual, muscle type-specific fashion, opened a number of ques-

tions concerning the possible relationship between the characteristics of acute exercise

and exercise training regimes and the specificity of the stress response and stress pro-

tein expression levels, respectively, that are being the object of recent studies, conside-

ring the pattern of nerve impulses that activate the muscle and the endocrine environ-

ment as separate factors that contribute to define the adaptive process. In addition to its

potential interest in getting a deeper understanding of the mechanisms of adaptation to

exercise, studying the regulation of the stress response and of HSP expression levels by

physical exercise, the pattern of neural activity and the hormonal status could be useful

to unravel the molecular bases of the relationship between physical exercise and health,

and of its possible limitations.

196


� Hernando, R. and Manso, R. Muscle fibre stress in response to exercise: Synthesis,

accumulation and isoform transitions of 70 kDa heat-shock proteins. Eur. J.

Biochem. 243, 460-467 (1997).

� Hernando, R., González, B., Delicado, M.L. y Manso, R. Inducción de la síntesis

de proteínas de estrés en fibras musculares y en células hepáticas tras ejercicio

agudo. Serie Icd, Investigación en Ciencias del Deporte 18, 11-37 (1998).

� Hernando, R., Ferrández, M. D., de la Fuente, M., Díaz, A.E y R. Manso. Efecto de

los esteroides anabólico androgénicos nandrolona y estanozolol sobre la actividad

del eje hipotálamo-hipofisario-gonadal y la función linfocitaria. Serie Icd,

Investigación en Ciencias del Deporte 18, 43-60 (1998)

� Hernando, R y Manso, R. La respuesta de estrés de las fibras del músculo esquelé-

tico tras el ejercicio. Ibérica: Actualidad tecnológica 413, 517-521 (1998)


Raquel Hernando Sebastián: �Respuesta de estrés de las fibras musculares por el ejer-

cicio agudo y su adaptación por el entrenamiento: Control neural y hormonal�.

Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación: Apto cum laude.

197

SEÑALIZACIÓN CELULAR MEDIADA POR RECEPTORES DESIETE DOMINIOS TRANSMEMBRANA Y PAPEL FISIO-PATOLÓGICO DE SUS MECANISMOS DE REGULACIÓN SIGNAL TRANSDUCTION MEDIATED BY SEVEN TRANSMEMBRANE DOMAIN RECEPTORS AND PHYSIOLOGI-CAL ROLES OF RECEPTOR REGULATORY MECHANISMS

Jefe de Línea / Group Leader: Federico Mayor, jr.Personal Científico Scientific Personnel: Anna M. Aragay, Ana Ruiz-GómezBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Esperanza Morato, Cristina Murga, Petronila

Penela, Catalina Ribas Becarios Predoctorales Graduate Students: Ana Elorza, M. Carmen Jiménez, Susana SarnagoEstudiantes Undergraduate Students: Sandra Peregrín, Antonio SobradoTécnico de investigación Technical Assistance: Ramón Campos


Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) median las acciones de una granvariedad de mensajeros que controlan la diferenciación, proliferación y función celular.Una característica general de estos receptores es que su acción está controlada median-te complejos mecanismos de regulación que modulan la eficacia de la transducción dela señal, y que son la base de los procesos de desensibilización o tolerancia. Las quina-sas de receptores acoplados a proteínas G (GRKs) y las proteínas moduladoras deno-minadas arrestinas desempeñan un papel esencial en los procesos de rápida fosforila-ción, desacoplamiento, internalización y reciclaje de GPCR activados. Por otra parte,datos recientes sugieren la participación directa de GRKs y arrestinas en procesos deseñalización desde GPCR a las cascadas de quinasas mitogénicas, por lo que estas pro-teínas reguladoras emergen, además, como componentes esenciales de la transducciónde señales mediada por estos receptores.


Este papel esencial sugiere que cambios en la expresión y/o actividad de GRKs y

arrestinas afectarán a la eficacia de la señalización mediada por GPCR y podrían tener

transcendencia fisiopatológica. El desarrollo de esta hipótesis requiere profundizar en

los mecanismos moleculares de regulación de la funcionalidad y de los niveles de estas

proteínas, así como en sus principales cometidos fisiológicos. En este contexto, los prin-

cipales objetivos de nuestro laboratorio son:

1) Un mejor conocimiento de las funciones celulares de GRKs y arrestinas. En este

sentido, nuestro laboratorio ha descrito el papel clave de la quinasa GRK2 en la

internalización de receptores β-adrenérgicos y otros GPCR, así como identificado

nuevos sustratos celulares de GRK2 que no son GPCR activados, como las fosduci-

nas. Por otra parte, estamos estudiando la participación de GRKs y arrestinas en la

activación de MAPK por GPCR.

2) Identificar los principales mecanismos y señales que regulan la actividad y gobier-

nan la expresión de estas proteínas. Este estudio se está abordando a varios nive-

les, que incluyen la interacción de GRK2 con proteínas de anclaje a diversas locali-

zaciones subcelulares, la fosforilación de GRKs por otras proteínas quinasas, la

modulación de la actividad transcripcional del promotor del gen GRK2 humano y

el complejo y activo control de los niveles intracelulares de GRKs y arrestinas por

diversas vías proteolíticas.

3) Estudiar el posible papel y relevancia de GRKs y arrestinas en la función y disfun-

ción de dos sistemas fisiológicos concretos de gran importancia clínica: el sistema

cardiovascular y la regulación de la respuesta inflamatoria. En lo que respecta al

sistema cardiovascular, el laboratorio lidera un proyecto europeo Biomed que

investiga el papel de GRKs y arrestinas en la función y disfunción del sistema car-

diovascular, dado que alteraciones en los niveles de GRK2 son un factor importan-

te en pacientes con fallo cardiaco congestivo, hipertensión y otras patologías. Por

otra parte, la alta expresión de GRKs en leucocitos y los recientes datos de diversos

laboratorios, incluido el nuestro, que indican la participación de GRKs y arrestinas

en la modulación de receptores de quimioquinas, sugieren que estas proteínas

reguladoras desempeñan un importante papel en la respuesta celular y migratoria

de diversos tipos celulares a las quimioquinas. El desarrollo de estos objetivos es de

gran interés para identificar nuevas dianas farmacológicas y métodos diagnósticos,

así como para proponer nuevas estrategias terapéuticas.

198

199

Además de este tema principal, nuestro laboratorio colabora con otras líneas del

CBMSO en el estudio de la relación entre sistemas de transducción y la expresión y fun-

ción de proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer, como las presenilinas y

la apolipoproteína E.

Research Summary

G protein-coupled receptors (GPCR) mediate the actions of a wide variety of mes-

sengers which modulate cell differentiation, proliferation and function. A general fea-

ture of GPCR is the existence of complex mechanisms which regulate signal transduc-

tion efficacy, and which underlie key physiological processes such as desensitization or

tolerance. G protein-coupled receptor kinases (GRKs) and a family of proteins termed

arrestins play an essential role in the rapid phosphorylation, uncoupling, internaliza-

tion and recycling of GPCR that takes place upon activation by agonists. On the other

hand, recent data suggest a direct participation of GRKs and arrestins in GPCR-media-

ted MAPK activation, thus emerging as key components of the GPCR signal transduc-

tion machinery. Such central role suggests that changes in the expression levels and/or

activity of GRKs and arrestins may affect the efficacy of GPCR signalling and be of pat-

hophysiological relevance. The testing of this hypothesis requires a better knowledge of

the molecular mechanisms of regulation of the levels and functionality of GRKs and

arrestins, as well as about their main physiological roles. In this context, the main objec-

tives of our laboratory are:

1) To better understand the cellular functions of GRKs and arrestins. In this regard,

our laboratory has reported a key role for GRK2 in the internalization of β-adre-

nergic and other GPCR, as well as identified new cellular substrates for GRK2, dif-

ferent from activated GPCR, such as the phosducins. On the other hand, we are currently

investigating the participation of GRKs and arrestins in the GPCR-MAPK pathway.

2) To identify the main mechanisms and signals governing the activity and expression

levels of these proteins. This issue is being addressed along a variety of lines of

research, including the interaction of GRK2 with anchoring proteins in several sub-

cellular locations, the phosphorylation of GRKs by other protein kinases, the

modulation of the transcriptional activity of the human GRK2 promoter and the

complex and active regulation of the cellular levels of GRKs and arrestins by diffe-

rent proteolytic pathways.

3) To investigate the role of GRKs and arrestins in the function and disfunction of two

main physiological models: the cardiovascular system and the regulation of the

inflammatory response. Our laboratory leads a Biomed project on the role of GRKs

and arrestins in cardiovascular function and disease, given the fact that changes in

GRK2 levels appear to be a key factor in conditions such as congestive heart failu-

re, hypertension, and other vascular pathologies. On the other hand, the high

expression levels of GRKs and arrestins in leukocytes and recent data from our

laboratory indicating the participation of these proteins in chemokine receptor

regulation, suggest that GRKs and arrestins play an important role in the cellular

and migratory response of several cell types to chemokines. A better understan-

ding of the role of GRKs and arrestins in these physiological conditions would help

to identify new potential drug targets and diagnostic methods and to suggest novel

therapeutic strategies.

In addition to this main theme, our laboratory collaborates with other groups of

our Institute in the study of relationships between signal transduction pathways and

the expression and function of proteins involved in Alzheimer�s disease, such as prese-

nilins and apolipoprotein E.


� Ruiz-Gómez, A. and Mayor, F. Jr. β-adrenergic receptor kinase (GRK2) colocali-

zes with β-adrenergic receptors during agonist-induced receptor internalization.

J. Biol. Chem. 272, 9601-9604 (1997).

� Murga, C., Esteban, N., Ruiz-Gómez, A. and Mayor, F. Jr. The basal subcellular

distribution of β-adrenergic receptor kinase is independent of G-protein βγ subu-

nits. FEBS Letters 409, 24-28 (1997).

� Murga, C., Penela, P., Zafra, F. and Mayor, F. Jr. The subcellular and cellular dis-

tribution of G protein-coupled receptor kinase 2 in rat brain. Neuroscience 87, 631-

637 (1998).

200

201

� Mayor, F. Jr., Penela, P. and Ruiz-Gómez, A. Role of G protein-coupled receptor

kinase 2 and arrestins in β-adrenergic receptor internalization. Trends in

Cardiovascular Medicine 8, 1050-1738 (1998)

� Aragay, A. M., Ruiz-Gómez, A., Penela, P., Sarnago, S., Elorza, A., Jiménez-Sainz,

M.C. and Mayor, F. Jr. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2): mechanims

of regulation and physiological functions. FEBS Letters 430, 37-40 (1998).

� Mellado, M., Rodríguez-Frade, J.M., Aragay, A., del Real, G., Martín, A.M., Vila-

Coro, A.J., Serrano, A., Mayor, F. Jr. and Martínez-A, C. The chemokine monocy-

te chemotactic protein 1 triggers janus kinase 2 activation and tyrosine phosp-

horylation of the CCR2B receptor. J. of Immunology 161, 805-813 (1998).

� Ozaita, A., Escribá, P.V., Ventayol, P., Murga, C., Mayor, F. Jr. and. García-Sevilla,

J. A. Regulation of G protein-coupled receptor kinase 2 in brains of opiate-treated

rats and human opiate addicts. J. Neurochem. 70, 1249-1257 (1998).

� Aragay, A.M., Mellado, M., Frade, J.M.R., Martín, A.M., Jiméndez-Sainz, M.C.,

Martínez-A., C. and Mayor, F. Jr. Monocyte chemoattractant protein-1-induced

CCR2B receptor desensitization mediated by the G protein-coupled receptor

kinase 2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2985-2990 (1998).

� Penela, P., Ruiz-Gómez, A., Castaño, J.G. and Mayor, F. Jr. Degradation of the G

protein-coupled receptor kinase 2 by the proteasome pathway. J. Biol. Chem. 272,

35238-35244 (1998).


Petronila Penela: �Expresión de las proteínas reguladoras βARK-1 (GRK2) y β-arresti-

na-1 en distintos estadíos de desarrollo. Modulación a nivel transcripcional y de degra-

dación proteolítica�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:

Sobresaliente cum laude.

202

Premios y Distinciones/Prizes and Distinctions

Federico Mayor, Jr.:

� Premio anual de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

(Octubre 1997).

203

NEUROTRANSMISION Y DESARROLLO NEUROTRANSMISSION AND DEVELOPMENT

Jefe de Línea / Group Leader: Galo RamírezPersonal Científico Scientific Personnel: Ana BaratBecario Postdoctoral Postdoctoral Fellow: Milagros Ramos Becario Predoctoral Predoctoral Fellow: Javier S. BurgosTécnico de InvestigaciónTechnical Assistance: José Luis García-MiraCientíficos Visitantes Visiting Scientists: Diogo Gomes de Souza, Carla I. Tasca (Universidad

Federal de Rio Grande do Sul. Brasil)


Durante estos dos años nuestro grupo ha trabajado en el análisis de las interac-

ciones de los nucleótidos de guanina (GNs) con los receptores ionotrópicos de gluta-

mato. Se sabe que las diversas subunidades de dicha familia de receptores, clonadas

hasta la fecha, contienen una breve secuencia de aminoácidos, en uno de los dominios

extracelulares, que reconoce a los nucleótidos de guanina. Esta secuencia (que ha sido

relacionada con el llamado p-loop, zona de reconocimiento típica de proteínas que unen

nucleótidos -como las GTPasas-, aunque esta relación es cuando menos dudosa) forma

además parte del propio sitio de reconocimiento de los agonistas de glutamato por lo

que los GNs son capaces de desplazar e impedir el acceso de dichos agonistas al recep-

tor. Los GNs constituyen así una familia de antagonistas potenciales del glutamato.

En este contexto hemos demostrado por primera vez el efecto protector del GMP

frente a las lesiones causadas por las excitotoxinas quinolinato y kainato in vivo y ex vivo y,

en contraste, el efecto agonista parcial de algunos análogos del GTP en estos mismos modelos.


Los objetivos de este proyecto de investigación, a medio y largo plazo son:

a) Profundizar en el conocimiento de los mecanismos de interacción entre los GNs

y los receptores de glutamato y las condiciones estructurales para definir el carácter

agonista/antagonista de dichos nucleótidos.

b) Estudiar la capacidad neuroprotectora de los GNs antagonistas de glutamato

en diversos paradigmas experimentales de excitotoxicidad in vivo, ex vivo y en cultivo.

c) Utilizar el GMP, un GN no activo en señalización (en contraste con el GTP y el

GDP), para modelización molecular de compuestos heterocíclicos antagonistas del glu-

tamato, de baja toxicidad, para su posible uso terapéutico como neuroprotectores.

Research Summary

We are working on the analysis of the interactions of guanine nucleotides (GNs)

with ionotropic glutamate receptors. It is already known that the different ionotropic

glutamate receptor subunits cloned so far contain a short amino acid sequence respon-

sible for the recognition of GNs, as shown by directed mutagenesis. This sequence,

which has been tentatively related to the p-loop nucleotide-recognition motif, is also part

of the glutamate recognition site so that GNs block the access of agonists to the recep-

tor, thus behaving as potential antagonists of glutamate.

In this context we have recently demostrated the ability of GMP to act as a neu-

roprotector against quinolinate- and kainate-induced neuronal lesions, both in vivo and

ex vivo, and the partial agonistic behavior of some GTP analogs in these same models.

The medium- and long-term objectives of this project are:

a) To improve our understanding of the interaction of GNs with glutamate recep-tors, specially of the structural properties underlying the agonistic/antagonistic beha-vior of GNs.

b) To further analyze the neuroprotective capacity of several GN derivatives indifferent experimental paradigms involving neurotoxicity.

c) Using GMP as a model molecule, to design heterocyclic compounds with anta-

gonistic activity towards glutamate and low intrinsic toxicity.

204

205


� Rubin, M.A., Medeiros, A.C., Rocha, P.C.B., Livi, C.B., Ramírez, G. and Souza,

D.O. Effect of guanine nucleotides on [3H]glutamate binding and on adenylate

cyclase activity in rat brain membranes. Neurochem. Res. 22, 181-187 (1997).

� López, R., López-Gallardo, M., Medina, J.I., Ramos, M., Ramírez, G. and Prada, C.

A Streptomyces fradiae protease dissociates structurally preserved neurons and

glial cells from the embryonic and adult central nervous system of vertebrates. J.

Neurosci. Meth. 73, 9-16 (1997).

� Ramos, M., Souza, D.O. and Ramírez, G. Specific binding of [3H]GppNHp to

extracellular membrane receptors in chick cerebellum: possible involvement of

kainic acid receptors. FEBS Lett. 406, 114-118 (1997).

� Malcon, C., Achaval, M., Komlos, F., Partata, W., Sauressig, M., Ramírez, G. and

Souza, D.O. GMP protects against quinolinic acid-induced loss of NADPH-diap-

horase-positive cells in the rat striatum. Neurosci. Lett. 225, 145-148 (1997).

� Alcalde, E., Roca, T., Barat, A., Ramírez, G., Goya, P. and Martínez, A. Molecular

modeling of (E)-1-Alkyl-4(3)-[2-(1H-azolyl)vinyl]-pyridinium salts and evalua-

tion of their behavior towards choline acetyltransferase. Bioorg. Med. Chem. 5, 949-

954 (1997).

� Tasca, C.I., Cardoso, L.F., Martini, L.H., Ramírez, G. and Souza, D.O. Guanine

nucleotides inhibit cGMP accumulation induced by metabotropic glutamate

receptor activation. Neurochem. Res. 23, 183-188 (1998).

� Regner, A., Ramírez, G., Belló-Klein, A. and Souza, D. Effects of guanine nucleo-

tides on glutamate-induced chemiluminiscence in rat hippocampal slices submit-

ted to hypoxia. Neurochem. Res. 23, 523-528 (1998).

� Burgos, J.S., Barat, A., Souza, D.O. and Ramírez, G. Guanine nucleotides protect

against kainate toxicity in an ex-vivo chick retinal preparation. FEBS Lett. 430,

176-180 (1998).

206


Galo Ramírez:

� Miembro del Bureau de la Asamblea Europea de la Ciencia y la Tecnología

(ESTA) / Member of the Bureau of the European Science and Technology

Assembly (ESTA). 1997.

207

MECANISMOS DE ENVEJECIMIENTO YNEURODEGENERACIÓN MECHANISMS OF AGEING AND NEURODEGENERATION

Jefe de Línea / Group Leader: Jorgina SatrústeguiPersonal Científico Scientific Personnel: Elena Bogónez, Jose M. Carrascosa, Alberto

Martinez-SerranoBecarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Araceli del Arco, Ana Villa Becarios Predoctorales Graduate Students: Gema Alvarez, Santiago Cavero, Yasmin Fermín,

Maria Isabel García-Simón, Juan Carlos Molero, Francisco Javier Rubio, Francisca Ruiz

Técnicos de Investigación Technical Assistance: Belen Huesa, Bárbara Sesé Científico VisitanteVisiting Scientist: Miguel Hernández-Carrasquilla (Conserjería de

Salud, Comunidad Autónoma de Madrid)


Nuestro laboratorio está interesado en le estudio de los mecanismos moleculares

del envejecimiento y la neurodegeneración en el sistema nervioso central y en el estu-

dio de la resistencia a la insulina durante la vejez.

Respecto del primero de estos estudios, trabajos previos de nuestro laboratorio

mostraron que la capacidad de regulación de los niveles intracelulares de calcio se dete-

riora en las neuronas durante el envejecimiento. Como la función neuronal está deter-

minada por los niveles de calcio celular, un deterioro en la regulación de la concentra-

ción de este segundo mensajero puede tener consecuencias fisiopatológicas en la función

cerebral a edades avanzadas y también puede constituir un factor de riesgo dependien-

te de la edad para la neurodegeneración. Por ello, estamos intentando averiguar cuales

son los mecanismos moleculares responsables del deterioro en la regulación del calcio


208

celular durante el envejecimiento y sus posibles consecuencias en neurodegeneración.

Como encontramos que el envejecimiento afecta severamente a la regulación mitocon-

drial de calcio, estamos centrándonos en el papel de la mitocondria en estos procesos.

Uno de los aspectos que más nos interesa es identificar las proteínas responsables

del transporte o de la regulación de calcio in mitocondrias. La(s) proteína(s) responsa-

bles de la captura y eflujo de calcio en mitocondrias se desconocen. En los últimos años

hemos purificado un transportador de calcio de mitocondrias de hígado de rata que

tenía actividad de intercambio Ca2+/H+ tras su reconstitución en proteoliposomas.

Además, hemos identificado una nueva subfamilia de transportadores mitocondriales

caracterizada por tener dominios de unión de calcio. Hemos clonado al primer miem-

bro de esta subfamilia, que hemos llamado Aralar, de corazón humano. Aralar es una

proteína mitocondrial que une calcio y está presente sólo en tejidos excitables (corazón,

músculo y cerebro). De acuerdo con la distribución de cargas en sus dominios trans-

membrana, Aralar puede funcionar como un transportador de aniones dependiente de

Ca2+ Estamos empleando distintos abordajes (expresión de Aralar entera o de formas

truncadas en levaduras y células de vertebrados, ver también mas abajo) para estudiar

la actividad transportadora de esta proteína así como su papel en la función y supervi-

vencia neuronales.

Se sabe ahora que la mitocondria participa activamente en apoptosis y posible-

mente en otros procesos de muerte celular mediante la liperación de citocromo c y otros

factores apoptogénicos al citosol. Así, en los últimos años, hemos estudiado el papel de

la mitocondria en dos procesos que conducen a la muerte neuronal: la excitotoxicidad

del glutamato y la exposición al beta-amiloide, el péptido que se acumula en las placas

seniles características de la enfermedad de Alzheimer. Estos estudios se realizan usan-

do cultivos neuronales primarios como modelo y bajo la dirección de la Doctora E.

Bogónez. Estamos estudiando los sucesos tempranos que desencadenan la muerte neu-

ronal en estos paradigmas, la activación de caspasas, el papel de la provisión de sus-

tratos respiratorios a la mitocondria como medio de modulación de la muerte neuronal

por necrosis o apoptosis y la posible implicación de un megacanal mitocondrial res-

ponsable de la llamada �transición de permeabilidad�.

Desde el descubrimiento de la existencia de células neurales madre multipotentes

en el cerebro embrionario y adulto en roedores, estas células, por sus propiedades, han

sido utilizadas en el diseño de estrategias de terapia génica en modelos de neurode-

genración del sistema nervioso, así como también para estudiar el desarrollo del siste-

ma nervioso de mamíferos. Desde el punto de vista biotecnológico, ha habido también

un gran esfuerzo orientado a la generación controlada de neuronas, astrocitos y oligo-

dendrocitos plenamente diferenciados en cultivo. En nuestro laboratorio, bajo la di-

rección del Dr. A. Martínez-Serrano, hemos comenzado a desarrollar procedimientos

que utilizan células de origen humano, con el objetivo de acercar estas estrategias al

escenario de la clínica. Como primer paso, hemos desarrollado la metodología necesa-

ria para expandir células madre de cerebro humano, así como para inmortalizarlas y

generar líneas celulares con las mismas propiedades que las células primarias, de gran

utilidad para estudios bioquímicos y de biología molecular, así como para llevar a cabo

transplantes en el cerebro. En el momento presente, hemos generado y aislado una

colección de líneas celulares con estas propiedades de multipotencialidad, que están

siendo objeto de estudio y de nuevas modificaciones genéticas encaminadas a su uso

futuro para terapia génica. Por otra parte, dado que estas líneas son capaces de generar

células humanas maduras pertenecientes a los tres linajes celulares del SNC (neuronas,

astrocitos, oligodendrocitos), estamos explorando cómo instruir a estas células para

controlar y dirigir su programa de diferenciación en un sentido u otro, según las nece-

sidades. Finalmente, estamos desarrollando modelos en cultivo para el estudio de pro-

cesos de muerte neuronal, así como la participación de la proteína Aralar en homeos-

tasia de calcio, funcionalidad y supervivencia neuronal.

En relación al estudio de la resistencia a insulina asociada al proceso de envejeci-

miento, dirigido por el Dr. J.M. Carrascosa, durante los últimos años se han analizado

diversas modificaciones en la cascada de transmisión de la señal insulínica en adipoci-

tos de rata. Después de demostrar que el receptor de insulina de los adipocitos proce-

dentes de ratas viejas posee una menor actividad quinasa in vitro, se ha orientado el tra-

bajo hacia el análisis de procesos moleculares posteriores a la estimulación del receptor

que pudieran estar a su vez alterados, contribuyendo a la marcada insensibilidad a la

hormona característica de estas células en los animales envejecidos. Para ello se empleó

209

210

el vanadato, un compuesto que ejerce efectos similares a la insulina tales como la esti-

mulación del transporte de glucosa, la translocación del transportador GLUT 4, o la

activación de las MAP quinasas, sin inducir la autofosforilación y subsiguiente activa-

ción del receptor insulínico. Nuestros datos indican la existencia de alguna alteración

en la vía de transducción de la señal insulínica a un nivel posterior a la estimulación de

PI-3 quinasa, que impide una completa activación del transporte de glucosa durante el

envejecimiento. Sin embargo, de los datos relativos a la estimulación de las MAP qui-

nasas puede concluirse que la mayoría de los procesos moleculares involucrados en la

señal hormonal permanecen perfectamente activos en las células de los animales viejos.

Durante el último año hemos comenzado a analizar los efectos lipogénicos y anti-

lipolíticos de la insulina utilizando un abordaje experimental similar al descrito.

Igualmente, hemos comenzado una línea de investigación sobre la posible implicación

de las MAP quinasas en la estimulación de dichos procesos utilizando la línea celular

adipocitaria 3T3-L1 como modelo experimental.

Research Summary

Our laboratory is interested in the study of the molecular mechanisms of ageing

and neurodegeneration in the central nervous system, and in the study of insulin resis-

tance in ageing.

With regards to the first of those studies, previous work from our laboratory has

shown that the ability to regulate intracellular calcium levels in neurons becomes

impaired during ageing. Since neuronal function is finely tuned to intracellular calcium

levels, an impaired calcium regulation may have pathophysiological consequences in

brain function in old age and it may also become an age-dependent risk factor for neu-

rodegeneration. Thus, we are currently trying to understand what are the molecular

mechanisms whereby calcium regulation is altered during ageing and its possible con-

sequences in neurodegeneration. Since we found that calcium handling by neuronal

mitochondria was severely affected by ageing, we are focusing on the role of mito-

chondria in these processes.

One of our main interests is to identify the proteins responsible for calcium trans-

port and/or calcium regulation in mitochondria. The protein(s) responsible for uptake

and efflux of calcium in mitochondria are yet unknown. In the last years we have puri-

fied a calcium transporter from rat liver mitochondria that was shown to have Ca2+/H+

exchange activity after reconstitution in proteoliposomes. In addition, we have also

identified a new subfamily of mitochondrial metabolite carriers characterized by the

presence of calcium binding domains. The first member of this subfamily, that we

named Aralar, was cloned from human heart. Aralar is a mitochondrial protein that

binds calcium and is present only in excitable tissues (heart, muscle and brain).

According to the charge distribution within its putative transmembrane domains,

Aralar may function as a Ca2+-dependent anion carrier. We are employing different

approaches (expression of wild type and truncated Aralar in yeast and in cells from ver-

terbrates) to study the carrier activity of this protein and its role in neuronal function

and survival.

It is now known that mitochondria participates actively in apoptosis and possibly

other cell death processes by releasing cytochrome c and other apoptogenic factors to

the cytosol. Thus, in the past few years, we have also studied the role of mitochondria

in two processes that lead to neuronal death: glutamate excitotoxicity and the exposu-

re to beta-amyloid, the peptide that accumulates in senile plaques characteristic of

Alzheimer�s disease. These studies are carried out using primary neuronal cultures as

model systems and under the direction of Dr. E. Bogonez. We are currently studying

the early events that trigger cell death in these paradigms, the activation of caspases, the

role of metabolite supply to mitochondria as means of regulation of cell death by necro-

sis or apoptosis and the possible involvement of a mitochondrial megachannel respon-

sible for the so called �permeability transition�.

Since the discovery and identification of multipotent neural stem cells in the

embryonic and adult rodent brain, these cells, and their inherent properties, have been

exploited for the design of ex vivo gene therapy strategies in models of CNS degenera-

tion, and also for the study of CNS development. On the more biotechnological side,

there has been also a major effort oriented to develop procedures for the tailored in

vitro generation of mature neurons, astrocytes and oligodendrocytes. In our laboratory

211

212

and under the direction of Dr. A. Martinez-Serrano, we have set up the methodology

needed to expand human derived neural stem cells in culture, and also immortalize

them, to generate cell lines useful for biochemistry and molecular biology studies, while

retaining optimal properties for their transplantation to the brain. At present we have

isolated a collection of cell lines of multipotential characteristics, that are being the sub-

ject of further genetic manipulations aimed at their future use for gene therapy. On the

other hand, since these multipotential stem cells can generate human neurons, astrocy-

tes and oligodendrocytes, we are exploring how to instruct these cells to follow specific

developmental programs. Finally, we are setting up in culture models where to study

aspects related to neuronal cell death, and the participation of Aralar protein in calcium

homeostasis, neuronal function and health.

With regards to the study of insulin resistance during ageing, in the last years we

have studied the modifications of the insulin signal transduction cascade in adipocytes

under the direction of Dr. J.M. Carrascosa. After having shown that adipocytes from old

rats have a decreased insulin receptor kinase activity in vitro, we focused our research

in the identification of possible postreceptor alterations that could in turn contribute to

the dramatically depressed insulin sensitivity of these cells. In order to do that we used

vanadate, an agent that elicits an insulin-like stimulation of glucose transport activity,

GLUT 4 carrier translocation, and MAP kinase function, without inducing insulin

receptor autophosphorylation and activation. Our data indicate the presence of an alte-

ration of insulin signal transduction downstream of PI-3 kinase in the pathway leading

to the stimulation of glucose transport during ageing. However, it appears that most

molecular events involved in the hormonal signal transduction are fully active in the

cells from aged rats.

During the last year we have focused our research interest in the lipogenic and

antilipolytic actions of insulin in adipocytes using a similar approach to that previously

mentioned. Equally, we are exploring the possible role of MAP kinase on those path-

ways using the adipocyte cell line 3T3-L1 as experimental model.

213


� Rosenblad, C., Martinez-Serrano, A. and Björklund, A. GDNF promotes sprou-

ting of spared nigrostriatal dopaminergic afferents and induces recovery of func-

tion in a rat model of Parkinson´s disease. Neuroscience 82, 129-137 (1997).

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� Escriva, F., Agote, M., Rubio, E., Molero, J.C., Pascual-Leone, A.M., Andres, A.,

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� Martínez-Serrano, A. and Snyder, E.Y. Immortalized neural stem-like cells for

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Tuszynski M, Kordower J y Bankiewicz J, eds. Academic Press, San Diego, CA

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� Molero, J.C., Martinez, C., Andres, A., Satrustegui, J. and Carrascosa, J.M.

Vanadate fully stimulates Insulin Receptor Substrate-1 associated Phosphatidyl

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� Villa, A., García-Simón, M.I., Blanco, P., Sesé, B., Bogónez, E., and Satrústegui, J.

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with calcium transport activity. Biochim Biophys Acta 1373, 347-359 (1998).

214

215

� Carrascosa, J.M., Ramos, P. Molero, J.C. and Herrera, E. Changes in the kinase

activity of the insulin receptor account for an increased insulin sensitivity of

mammary gland in late pregnancy. Endocrinology 139, 520-526 (1998).


Juan Carlos Molero Navajas: �Bases moleculares de la resistencia a la isulina con el

envejecimiento. Alteraciones en la estimulación del transporte de glucosa y de la acti-

vidad MAP-quinasa en el adipocito de rata�. Universidad Autonoma de Madrid. 1997.

Calificación: Apto cum laude.

216

NEUROPATOLOGÍA MOLECULAR DE LA ENFERMEDAD DEALZHEIMERMOLECULAR NEUROPATHOLOGY OF ALZHEIMER�S DISEASE

Jefe de Línea / Group Leader: Fernando Valdivieso Personal Científico Scientific Personnel: Jesús Vázquez Becarios Postdoctorales Postdoctoral Fellows: Mª Jesús Bullido, María RecueroBecarios Predoctorales Graduate Students: Jesús Aldudo, Mª Jesús Artiga, Pilar Cazorla, Miguel

Angel García, Elena SerranoTécnicos de Investigación Technical Assistance: Ester Romero, Isabel Sastre


La enfermedad de Alzheimer, causa más frecuente de demencia senil, se presen-

ta de forma tanto familiar como esporádica. Estudios genéticos han permitido identifi-

car tres genes, los de la proteína precursora del amiloide (APP), la presenilina-1 (PS-1)

y la presenilina-2 (PS-2), mutaciones en los cuales causan enfermedad de Alzheimer

presenil transmitida de forma autosómica dominante. Sin embargo, la mayoría de los

casos de enfermedad de Alzheimer son de tipo senil y no se ajustan a un patrón de

herencia mendeliano. El alelo ε4 de la apolipoproteína E (APOE, gen; ApoE, proteína)

está asociado con un incremento en el riesgo de desarrollar la enfermedad de

Alzheimer. A pesar de la amplia evidencia de que éste constituye el principal factor

genético de riesgo para la enfermedad de Alzheimer senil, tanto familiar como esporá-

dica, es también claro que el alelo ApoE4 no es necesario ni suficiente para causar la

enfermedad, por lo que deben existir otros factores, genéticos o ambientales, implica-

dos en la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer.


Nuestro grupo ha realizado una búsqueda de variantes genéticas en la región pro-

motora del gen APOE (nucleótidos -1019 a +407), encontrando tres sitios polimórficos

nuevos (-491, -427 y -219) y uno descrito anteriormente (+113). La comparación de los

distintos alelos polimórficos en ensayos de transfección transitoria de células de hepa-

toma y astrocitoma humano mostró diferencias en su actividad transcripcional.

Además, el estudio de las proteínas nucleares que se unen a estas zonas polimórficas

del promotor APOE mostró diferencias en la afinidad de la unión debido a las diferen-

cias alélicas.

Hemos determinado que una de estas variantes (-491A) está asociada con un

incremento en el riesgo de enfermedad de Alzheimer, y que dicha asociación es inde-

pendiente del alelo ApoE4. Asimismo, el estudio del riesgo asociado a los haplotipos (-

491/-427) y de su actividad transcripcional mostró que el riesgo de padecer la enfer-

medad de Alzheimer correlaciona con la actividad transcripcional del promotor. Estos

trabajos sugieren que los polimorfismos en el promotor APOE pueden incrementar el

riesgo para la enfermedad de Alzheimer alterando los niveles de ApoE en el cerebro.

Se han descrito numerosas mutaciones causantes de enfermedad de Alzheimer en

el gen PS-1; dichas mutaciones producen las formas más agresivas de la enfermedad.

Las mutaciones patogénicas en PS-1 son muy heterogéneas y son responsables de la

mayoría de los casos de enfermedad de Alzheimer autosómica dominante. Nuestro

grupo ha desarrollado un método basado en la electroforesis en geles de gradiente des-

naturalizante, que permite el análisis mutacional de todos los exones codificantes y de

la región promotora del gen PS-1. El análisis por este método de una colección de

pacientes con enfermedad de Alzheimer presenil nos ha permitido identificar tres nue-

vas mutaciones en la región codificante (Met233Leu, Leu282Arg y Ala409Thr); además

hemos identificado una nueva mutación en el promotor proximal (-280C/G) que pro-

duce cambios significativos en la actividad transcripcional del gen en líneas celulares de

origen neuronal o astrocítico, pero no en células de origen hepático, sugiriendo que la

región -280 del promotor PS-1 contiene elementos que regulan la transcripción del gen

específicamente en células del tejido nervioso.

217

Research Summary

Alzheimer�s disease, the most common cause of dementia in the elderly, exists in

both familial and sporadic forms. Genetic studies have led to the identification of three

genes, amyloid precursor protein (APP), presenilin-1 (PS-1), and presenilin-2 (PS-2),

which, when mutated, can cause autosomal dominant forms of familial Alzheimer�s

disease. However, these three genes are responsible for only a small fraction of

Alzheimer�s disease cases, while the vast majority of patients with Alzheimer�s disease

present with a late age at onset and shows non-Mendelian inheritance pattern. The ε4

allele of apolipoprotein E (APOE, gene; ApoE, protein) has been associated with an

increased risk of developing Alzheimer�s disease. Despite the evidence implicating

ApoE4 as the single most important genetic determinant of susceptibility to sporadic

and late-onset familial Alzheimer�s disease so far identified, it is apparent that the

ApoE4 allele alone is neither necessary nor sufficient to cause the disease. This implies

the existence of other genetic or environmental factors in the pathogenesis of

Alzheimer�s disease.

We have screened for genetic variability in the proximal promoter region of

APOE (nucleotides -1017 to +406) and found three new polymorphic sites (-491, -427

and -219) and a previously described one (+113) within this region. Comparison of the

polymorphic alleles linked to a luciferase reporter gene and transfected into human

hepatoma and astrocitoma cells demonstrated different transcriptional efficiencies.

Furthermore, analysis of nuclear proteins that specifically bind to the upstream regula-

tory region of the APOE gene revealed differences in affinity for DNA binding proteins

due to nucleotide variations.

We found that one of these variants (-491A) is associated with risk for dementia

of the Alzheimer type and that this association is independent of ApoE4 status. In vitro

studies suggested that the APOE regulatory region polymorphism may increase risk for

Alzheimer�s disease by altering the level of ApoE expression. Study of the transcriptio-

nal activity of the haplotypes defined by combination of the -491 and -427 alleles indi-

cates that the risk for late-onset Alzheimer´s disease correlates with the transcriptional

activity of the APOE gene.

218

219

Many different mutations causative of Alzheimer�s disease have been found in

the PS-1 and are associated with the most aggressive forms of the disease. The patho-

genic mutations of PS-1 are very heterogeneous and are responsible for most cases of

autosomal dominant early-onset Alzheimer disease. We have developed a method

based on denaturing gradient gel electrophoresis, which allows the mutational analysis

of all the coding exons and the proximal promoter of PS-1. The analysis by this metho-

dology of early-onset Alzheimer�s disease patients has resulted in the finding of three

new mutations (Met233Leu, Leu282Arg and Ala409Thr) within PS-1 coding region and

a mutation in the PS-1 proximal promoter (-280C to G) that, interestingly, provokes sig-

nificant changes in the transcriptional activity of the gene in cell lines of neuronal and

astrocytic, but not hepatic origin, strongly suggesting that the region around -280 of

PS-1 promoter contains a regulatory element which control its transcription specifically

in neural cells.


� Haas, C., Aldudo, J., Bullido, M.J., de Miguel, C., Vázquez, J. and Valdivieso, F.

Proteolysis of Alzheimer´s disease amyloid protein precursor by activated Factor

Xa. Biochim.Biophys.Acta 1443, 85-94 (1997).

� Haas, C., Cazorla, P., de Miguel, C., Valdivieso, F. and Vázquez, J. Apolipoprotein

E forms stable complexes with full-length, recombinant Alzheimer´s disease β-

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� Aldudo, J., Bullido, M.J., Frank, A. and Valdivieso, F. Presenilin-1 genotype [2/2]

is associated with late-onset Alzheimer�s disease in Spanish patients. Alzheimer�s

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� Fernández-Shaw, C., Marina, A., Cazorla, P., Valdivieso, F. and Vázquez, J. Anti-

brain spectrin immunoreactivity in Alzhemier´s disease: Degradation of spectrin

in an animal model of cholinergic degeneration. J. Neuroimmunol. 77, 91-98 ( 1997).

� Artiga, M.J., Bullido, M.J., Sastre, I., Recuero, M., García, M.A., Aldudo, J.,

Vázquez, J. and Valdivieso, F. Allelic polymorphisms in the transcriptional regu-

latory region of apolipoprotein E gene. FEBS Letters 421, 105-108 (1998).

� Bullido, M.J., Artiga, M.J., Recuero, M., Sastre, I., García, M.A., Aldudo, J.,

Lendon, C., Han, S.W., Morris, J.C., Frank, A., Vázquez,, J., Goate, A. and

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poprotein E gene associated with risk for Alzheimer´s dementia. Nature Genetics

18, 69-71 (1998).

� Aldudo, J., Bullido, M.J., Arbizu, T., Oliva, R. and Valdivieso, F. Identification of

a novel mutation (Leu282Arg) of the human presenilin-1 gene in Alzheimer´s

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� Artiga, M.J., Bullido, M.J., Frank, A., Sastre, I., Recuero, M., García, M.A.,

Lendon, C., Han, S.W., Morris, J.C., Vázquez, J., Goate, A. and Valdivieso, F. Risk

for Alzheimer´s disease correlates with transcriptional activity of the APOE gene.

Hum. Mol. Genet. 7, 1887-1892 (1998).

� Roks, G., Cruts, M., Bullido, M.J., Backhovens, H., Artiga, M.J., Hofman, A.,

Valdivieso, F., Van Broeckhoven, C. and Van Duijn, C.M. The -491 A/T poly-

morphism in the regulatory region of APOE and early-onset Alzheimer�s disease.

Neurosci. Lett. 258, 65-68 (1998).

� Aldudo, J. , Bullido, M.J., Frank, A. and Valdivieso, F. Missense mutation E318G

of the Presenilin-1 gene appears to be a non-pathogenic polymorphism. Ann.

Neurol. 44, 985-986 (1998).


Pilar Cazorla: �Estudio de las interacciones moleculares entre proteínas implicadas en

la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calificación:

Apto cum laude.

220

221

Ana Isabel Marina: �La espectrina en la enfermedad de Alzheimer�. Universidad

Autónoma de Madrid. 1997.Calificación: Apto cum laude.

María Jesús Artiga: �Polimorfismos en la región reguladora del gen APOE y su asocia-

ción con la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.

Calificación: Apto cum laude.

Miguel Angel García: �Mecanismos de regulación transcripcional del gen APOE y su

relación con la enfermedad de Alzheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998.

Calificación: Sobresaliente cum laude.

Jesús Aldudo: �Análisis mutacional del gen de la presenilina-1 y su asociación con la

enfermedad de Azlheimer�. Universidad Autónoma de Madrid. 1998. Calificación:

Sobresaliente cum laude.


Fernando Valdivieso:

� Premio Nacional de Investigación sobre la Enfermedad de Alzheimer �Ciudad de

Zamora� 1998.

222

BASES MOLECULARES DE LA PLASTICIDAD NEURONALMOLECULAR BASIS OF NEURONAL PLASTICITY

Jefe de Línea / Group Leader: F. Javier Díez GuerraBecarios Predoctorales Graduate Students: Noa Martín Cófreces, Paloma Rodríguez Sánchez,

Pedro Tejero Díez, Eva Yus NájeraTécnico de Investigación Technical Assistance: Pedro Torrico Pardo


El correcto funcionamiento del sistema nervioso depende de la capacidad neuro-

nal para adaptarse a distintas situaciones de su entorno. Esta capacidad se manifiesta

durante el desarrollo -en la generación y especificación de los circuitos neuronales bási-

cos-, durante la regeneración que sigue al daño neuronal -promoviendo la formación de

nuevos contactos sinápticos- y durante el aprendizaje y la función memorística -con-

trolando el remodelamiento y la eficacia de los contactos sinápticos en redes neurona-

les. La comprensión de los mecanismos moleculares en los que se fundamenta la plas-

ticidad neuronal es un objetivo básico para la neurobiología. Su consecución abriría

enormes expectativas en la investigación clínica relacionada con la regeneración fun-

cional después de lesiones medulares, y con el desarrollo de tratamientos preventivos

y paliativos de mayor eficacia para neuropatías que, como las epilepsias, se caracterizan

por neurodegeneración masiva asociada a hiperexcitabilidad.

En la actualidad, el esfuerzo de nuestra línea de investigación se centra, por un

lado, en el desarrollo de modelos experimentales �in vitro� que permitan el análisis

molecular de los mecanismos responsables de la plasticidad neuronal y, por otro, en el

estudio de la fisiología molecular de dos proteínas específicas de tejido nervioso -GAP-

43 y Neurogranina-, cuya implicación en fenómenos de plasticidad neuronal está

ampliamente documentada.


Los modelos experimentales se desarrollan a partir de cultivos de neuronas de

hipocampo de rata -cultivos primarios- y de rodajas de hipocampo procedentes de rata

neonatal -cultivos organotípicos. Los cultivos primarios se mantienen a baja densidad

durante periodos prolongados -3-4 semanas- gracias a su co-cultivo con astrocitos en

soportes independientes. Los cultivos organotípicos se establecen sobre membranas de

celulosa. Ambos sistemas permiten estudios a medio-largo plazo, imprescindibles para

analizar los fenómenos de plasticidad neuronal, hasta ahora inabordables en otras pre-

paraciones. Asimismo, permiten alterar farmacológicamente la actividad neuronal y

realizar un seguimiento mediante sondas fluorescentes.

El estudio bioquímico de GAP-43 y Neurogranina se concreta en el análisis de su

modificación post-traduccional (fosforilación, palmitoilación, etc), distribución subce-

lular e interacción con otras proteínas, como pasos previos para situar su actividad en

un contexto más amplio de transducción intracelular de señales. Paralelamente, se estu-

dia el efecto de la expresión de GAP-43 y Neurogranina sobre la morfología celular, la

adhesión y motilidad celular sobre diferentes sustratos, el dinamismo de microtúbulos

y microfilamentos y el tráfico intracelular de membranas. Estos aspectos se analizan

tanto en cultivos primarios de neuronas como en líneas celulares que expresan GAP-

43 o Neurogranina de forma inducible.

Research Summary

The nervous system normal operation depends on the ability of neurones to adapt

to changing environment conditions. This ability shows up during development -in the

generation and specification of basic neural circuits -, during regeneration following

injury -promoting sprouting and development of new synaptic contacts- and during

learning and memory function -modifying synaptic efficiency and remodelling.

Understanding the molecular mechanisms underlying neuronal plasticity is a major

goal in the area of neurobiology. Its achievement would open great hopes in clinic rese-

arch related to functional regeneration after spinal cord damage, and the development

of better preventive and palliative treatments of several brain diseases, such as epilep-

sies, which feature massive hyperactivity-linked neurodegeneration.

223

224

At the moment, our research effort is directed, on one side, to the development of

experimental �in vitro� models which allow the molecular analysis of the mechanisms

responsible of neuronal plasticity and, on the other side, to the study of the molecular

physiology of two neural-specific proteins -GAP-43 and Neurogranin-, whose involve-

ment in neuronal plasticity phenomena has been widely documented.

The experimental models developed are cultures of rat hippocampal neurones -

primary cultures- and cultures of slices obtained from neonatal rat hippocampi -orga-

notypic cultures. Primary cultures are seeded at very low density and maintained

during prolonged periods �3 to 4 weeks- by means of a co-culture technique with

astrocytes. Organotypic cultures are set up and maintained on cellulose membranes.

Both systems allow to conduct medium and long-term studies, which are indispensable

to analyse neuronal plasticity phenomena, till now out of reach for other preparations.

Moreover, they allow pharmacological manipulation of neuronal activity and its moni-

toring using fluorescent probes.

The biochemical study of GAP-43 and Neurogranin is focused on the analysis of

their post-translational modifications (phosphorylation, acylation, etc), their subcellular

distribution and interaction with other proteins, as obligated steps before these proteins

could be mapped in intracellular signalling cascades. At the same time, we are studying

the effect of GAP-43 and Neurogranin expression on cellular morphology, on cellular

adhesion and motility on several substrates, on the dynamics of microtubule and micro-

filament cytoskeleton and on intracellular membrane traffic. These studies are now

being carried out on primary neuronal cultures and on GAP-43 or Neurogranin expres-

sing cell lines under the control of inducible promoters.

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� Rodríguez-Sánchez, P., Tejero-Díez, P. and Díez-Guerra, F.J. Glutamate stimula-

tes Neurogranin Phosphorylation in Cultured Hippocampal Neurones.

Neuroscience Letters 221, 137-140 (1997).

� Tejero-Díez, P., Rodríguez-Sánchez, P. and Díez-Guerra, F.J. NGF Y bFGF alteran

la fosforilación y localización subcelular de GAP-43. Revista de Neurología 25 (147),

1715 (1997).

� Rodríguez-Sánchez, P., Lorenzo, P.I., Tejero-Díez, P., Bernal, J. and Díez-Guerra,

F.J. La expresión de Neurogranina en células PC12 produce alteraciones morfolo-

gicas similares a las inducidas por NGF. Revista de Neurología 25 (147), 1767 (1997).

� Díez Guerra, F.J. Proteínas implicadas en la liberación de neurotransmisores por

exocitosis. Revista de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales

(España) 91, 239-253 (1998).


Pedro Tejero Díez: �Implicación de GAP-43 en la orientación y avance del cono de cre-

cimiento en neuronas de hipocampo en cultivo. Análisis de su fosforilación y localiza-

ción subcelular�. Universidad Autónoma de Madrid. 1997. Calficación: Apto cum laude.

Neurobiología Neurobiology - UAMassociated protein 1B (MA1B) is expressed in the visual system of...

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