/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 34, 2, pp. 339-354, 1975 3 3 9

Printed in Great Britain

Neuralation et migration nucleaire intercinetiquechez des embryons de poulet

ParPAUL-EMIL MESSIER1 ET C. AUCLAIR

Department d'Anatomie, Universite de Montreal

SUMMARY

Neurulation and interkinetic nuclear migration in the chick embryo

Neurulation and interkinetic nuclear migration were studied in cells of the forming neuraltube of chick embryos submitted to a variety of treatments. Our results show that cyto-chalasin B (5 /tg/ml) does not protect microtubules against disruption occurring after 3h at2°C nor does it prevent their repolymerization once they are cold-disrupted. However,db-cAMP protects microtubules against such cold disruption. We indicate that the inhibitoryeffect of cytochalasin B on interkinetic nuclear migration cannot be ascribed to an effect onmicrotubules.

INTRODUCTION

Dans plusieurs epitheliums embryonnaires (e.g. placodes nasales, placodesoptiques, fosses nasales, tubules mesonephrotiques, segment epais de la paroide coelome, etc. (Sauer, 1936, 1937)) les noyaux interphasiques sont animesd'un mouvement migratoire. Sauer, en 1936, decrivait deja ce processus de lamigration nucleaire intercinetique dans le tube neural chez l'embryon de poulet.Le processus fut definitivement confirme par les etudes de Langman, Guerrant& Freeman en 1966.

Selon Langman, Guerrant & Freeman (1966) 97,5 % des cellules nouvellementformees dans le tube neural chez l'embryon de poulet presentent leurs regionsapicales reliees entre elles par des complexes de jonction (elles forment lefeuillet neuro-epithelial proprement dit) alors que seulement 2,5 % des jeunescellules sont libres dans l'epithelium et pourraient etre a l'origine des neuro-blastes. De plus, dans ces cellules attachees par leur apex en un edifice tissulairecoherent, la phase S qui est la plus longue du cycle cellulaire (5 h), produit uneaccumulation de noyaux qui tous se retrouvent a la base de l'epithelium neural.

Nous avons deja etudie le phenomene de la migration nucleaire intercinetiquechez des embryons de poulet en voie de neurulation et fait ressortir l'importancedu role joue par les microtubules dans ces mouvements (Messier, 1972; Messier& Auclair, 1973). D'autre part, recemment, nous avons montre (Messier &Auclair, 1974) que la cytochalasine B, que Ton sait etre un inhibiteur de la1 Adresse de Vauteur: Departement d'Anatomie, Faculte de Medecine, Universite de Montreal,C.P. 6128, Montreal, P.Q. Canada.

340 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

neurulation (Karfunkel, 1972) s'avere aussi etre un puissant inhibiteur de lamigration nucleaire intercinetique. La suggestion que les microtubules sont liesa la migration nucleaire intercinetique et les donnees qui indiquent que cesorganites interviennent dans d'autres deplacements de structures (Watterson,1965; Dahlstrom, 1968; Holmes & Choppin, 1968; Schliwa & Bereiter-Han,1974) imposent que soit poussee plus loin l'etude des effets de la cytochalasine Bet que soit apportee une attention particuliere a la possibilite de son action surles microtubules. A cette fin, nous avons utilise la cytochalasine B dans desconditions qui bloquent la migration nucleaire intercinetique et avons tachede repondre aux questions suivantes: (1) la cytochalasine B est-elle une droguestabilisatrice, protege-t-elle les microtubules contre les effets degradants dufroid, (2) la drogue empeche-t-elle la repolymerisation des microtubules dejadegrades par le froid, (3) Faction d'un agent stabilisateur ou protecteur desmicrotubules (i.e. qui empeche leur degradation a 2 °C) peut-elle faire echec al'actioninhibitrice de la cytochalasine B sur la migration nucleaire intercinetique ?

MATERIEL ET METHODES

Tous les embryons de poulet, Gallus domesticus, ont ete incubes in ovo a38 °C jusqu'aux stades 1 a 7 paires de somites; stades 7 a 9 selon la table deHamburger & Hamilton (1951). Ensuite, tous furent explantes sur des milieux deculture prepares selon la methode de Spratt (1950) de facon a ce que leur feuilletectodermique repose sur le milieu. Des embryons servant de temoins ont eteincubes in vitro a 38 °C pour une duree maximale de 6 h. D'autres subirent lestraitements suivants.

Traitements

(1) Apres 1 h d'incubation a 38 °C (recuperation apres l'explanation) 25embryons, explantes sur des milieux normaux, ont ete portes dans une chambrerefrigeree a 2 °C et maintenus au froid pendant 3 h. Leur fixation a eu lieu acette temperature avec des produits froids.

(2) Dix embryons, explantes sur des milieux contenant 5 /tg/ml de cytochala-sine B, ont ete incubes pendant 2 h a 38 °C pour permettre a la drogue de biendiffuser dans les specimens. Us furent ensuite portes a 2 °C pendant 3 h et fixesa cette temperature.

(3) Seize embryons ont ete places sur des milieux contenant 5/tg/ml decytochalasine B et incubes 2 h a 38 °C. Par la suite, ils furent portes a 2 °Cpendant 3 h et finalement reportes a 38 °C pour 1 h.

(4) Plus de 35 embryons ont ete explantes sur des milieux enrichis de N6,O2-dibutyryle adenosine 3',5' cyclique monophosphate (db-cAMP) aux concentra-tions de 0-01, 0-1, 0-5, 1, 2, 10, 25 mM et 1 M. TOUS furent incubes a 38 °C pourune duree allant de 4 a 6 h.

(5) Quarante-six embryons ont ete explantes sur des milieux de culture

Neurulation et migration nucleaire chez le poulet 341

contenant du db-cAMP a des concentrations variant de 0,1 a 25 mM et furentincubes 1 h a 38 °C. Par la suite, ils ont ete portes dans une chambre refrigereea 2 °C, maintenus au froid pendant 3 h et fixes a cette temperature. Nous avonsrealise ici qu'une concentration de 0,5 HIM en db-cAMP suffisait a proteger lesmicrotubules des effets nocifs du froid. Cette concentration est done la seulequi fut utilisee par la suite.

(6) Finalement, 23 embryons ont ete explantes sur des milieux contenant ala fois de la cytochalasine B (5 /*g/ml) et du db-cAMP (0,5 mM) et ils furentincubes a 38 °C pendant 3 h.

Suite aux differents traitements, les embryons ont ete fixes au glutaraldehyde1,25 % dans un tampon phosphate pendant 60 min et surfixes pendant 1 h autetroxyde d'osmium 1 % dans le meme tampon. Une fois la deshydratation dansles alcools completee, les specimens ont ete enrobes dans l'Epon. Les coupesfines ont ete confectionnees a l'Ultrotome LKB et colorees dans une solutionaqueuse d'acetate d'uranyle 1 % pendant 20 min puis au citrate de plomb. Lestissus ont ete examines avec un microscope electronique Siemens 1A et unappareil Philips 200. Pour la microscopie photonique, des sections d'un /imd'epaisseur ont ete confectionnees et colorees au bleu de toluidine 1 % ensolution aqueuse.

RESULTATS

Le present travail confirme nos resultats publies recemment (Messier &Auclair, 1974) a l'effet que la cytochalasine B inhibe la neurulation chezl'embryonde poulet et qu'elle bloque la migration nucleaire intercinetique dans les cellulesde 1'epithelium neural. Cet arret du deplacement des noyaux, leur accumulationdesordonnee dans l'epaisseur du feuillet neuro-epithelial et le largage de nom-breuses cellules dans la neurocoele provoquent des changements d'importancevariable dans Failure generale du neuroepithelium (Fig. 3B).

Exposition a 2 °C

Nous avons deja decrit les effets de l'exposition d'embryons a 2 °C (Auclair& Messier, 1974). Nous ne rappelons ici que ce qui a trait au present titre asavoir qu'apres 3 h d'exposition a cette basse temperature (1) les cellules de1'epithelium neural des embryons sont depourvues de microtubules (Fig. 1 A)et (2) ces cellules, qui normalement sont de forme asymetrique, prennent, dansces conditions, une forme arrondie. Lors de ce traitement, la forme generale dutube neural comme elle apparait sur des sections transversales en fin de traite-ment, est fort variable. Chez certains embryons les perturbations physiologiquescausees par le froid et l'arrondissement provoque des cellules laissent le tubeneural inchange alors que chez d'autres, on observe une deterioration plus oumoins poussee de Failure generale du neuroepithelium.

P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

FIGURE 1

(A) Portions des cellules provenant d'un embryon expose a 2°C pendant 3 h. On yremarque que les microtubuies ne sont plus visibles dans le cytoplasme. x 60000.(B) Portion de deux cellules provenant d'un embryon d'abord place sur un milieucontenant de la cytochalasine B (5 /̂ g/ml) et incube 2 h a 38 °C et ensuite porte a 2°Cpendant 3 h et fixe a cette temperature. On y remarque que la cytochalasine n'a pasempeche la degradation des microtubuies. x 43 000.

Neurulation et migration nucleaire chez le poulet 343

Exposition a 2 °C sur milieux contenant de la cytochalasine B

Nous avons voulu savoir si la cytochalasine pouvait stabiliser, proteger lesmicrotubules contre la degradation qui s'effectue lorsque les embryons sontportes au froid. A cette fin, des embryons ont ete places sur des milieux con-tenant de la cytochalasine et incubes pendant 2 h a 38 °C. Par la suite, lesspecimens furent portes a 2 °C pendant 3 h et fixes a cette temperature. Dansces conditions on assiste, tout comme si la cytochalasine etait absente desmilieux, a la disparition des microtubules (Fig. 1B). Apres cetraitement, Failuregenerale de l'epithelium neural affiche des modifications qui sont en tout pointcomparables a celles observees apres une simple exposition a 2 °C.

Exposition a 2°C et report a 38 °C sur milieux contenant de la cytochalasine B

Pour voir si la cytochalasine pouvait empecher le retour des microtubulesdepolymerises par les basses temperatures, des embryons ont ete places sur desmilieux contenant de la cytochalasine, incubes 2 h a 38 °C, portes a 2 °Cpendant 3 h et ramenes ensuite a 38 °C pour 1 h. Dans les cellules du tube neuralde ces embryons, on a toujours releve la presence de microtubules normalementconstitues (Fig. 2 A). II en decoule que la drogue n'empeche pas la repoly-merisation des microtubules qui ont ete degrades lors de l'exposition au froid.Ce traitement perturbe l'aspect general de l'epithelium. En effet, tout comme si lacytochalasine B avait ete utilisee seule et a la meme concentration, l'inductiondu largage des cellules dans la neurocoele et l'arret des mouvements nucleairescontribuent a deteriorer, mais d'une facon erratique, l'image habituelle del'epithelium neural.

Incubation sur milieux riches en db-cAMP

Aux concentrations les plus faibles (0,01 a 0,5 mM) le db-cAMP n'a pasmontre d'effet detectable sur le rythme de la croissance des jeunes embryonsmis en experience. La morphologie generale des embryons etait comparable acelle des temoins (Fig. 2B) et les caracteres histologiques de leur tube neuraletaient identiques a ceux releves chez les specimens normaux. L'activite mitotiquea semble normale et la migration nucleaire intercinetique n'a pas ete affecteecomme en temoignaient les noyaux en division qui n'etaient observes qu'al'apex des cellules. Par contre, a la concentration de 25 mM, le db-cAMP aretarde la segmentation du mesoderme en somites. En effet, dans ces conditions,on ne comptait plus que deux nouvelles paires de somites acquises en 4 hd'incubation alors que chez les temoins, mis en experience au meme moment,on comptait regulierement quatre nouvelles paires de somites apres le memetemps d'incubation. Macroscopiquement ces specimens affichaient des defautsde neurogenese et de somitogenese (Fig. 2C). Chez ces embryons traites a laplus forte concentration, on a toujours eu l'impression d'observer plus de

22 EMB 34

344 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

Neurulation et migration nucleaire chez le poulet 345

microtubules (Fig. 2D), mais ces impressions n'ont pas encore ete controlees parune analyse objective.

Exposition a 2 °C sur milieux riches en db-cAMP

Pour verifier si l'AMP cyclique pouvait avoir quelqu'effet protecteur sur lesmicrotubules, un certain nombre de specimens ont ete places sur des milieuxcontenant du db-cAMP. Ces embryons subirent une incubation d'une heure a38 °C et furent ensuite portes, sur la meme milieu, a 2 °C pendant 3 h. Nousavons experiments avec plusieurs concentrations allant de 0,01 a 25 IHM. A laplus faible concentration le db-cAMP commence deja a montrer un effetprotecteur de la degradation des microtubules. Aux concentrations les plusfortes, on observait quelquefois de la cytolyse. Cependant, a la concentration de0,5 mM, le db-cAMP n'a montre aucun effet nefaste sur l'ensemble des ultra-structures cellulaires et cette dose suffisait a empecher la depolymerisation desmicrotubules (Fig. 3 A) qui normalement aurait due etre complete apres 3 h a2 °C. Dans ces conditions, les cellules conservent leur forme asymetrique, maisl'aspect general de 1'epithelium nous est toujours apparu comparable a ce queTon observait lorsque les embryons n'etaient traites qu'au froid.

Incubation a 38 °C sur milieux contenant cytochalasine B (5 jug I ml) et db-cAMP(0,5 mm)

Les embryons incubes pendant 3 h a 38 °C sur des milieux contenant a lafois la cytochalasine B et le db-cAMP presentaient des cellules a peine differentesde celles qu'on observe chez des specimens traites pour la meme duree a lacytochalasine B seulement. Les microtubules cytoplasmiques etaient bienevidents (Fig. 4B). Souvent, on a eu l'impression que la cytochalasine B n'alteraitque fort peu les microfilaments apicaux et leur arrangement en faisceau(Fig. 4A).

Chez ces embryons, la cytochalasine B jouait comme a l'accoutumee sonrole d'inhibiteur de la migration nucleaire intercinetique comme en temoigne

FIGURE 2

(A) Portion de 1'epithelium neural d'un embryon explante sur un milieu enrichi decytochalasine B, expose a 2°C puis reporte a 38 °C sur un milieu identique. On yvoit que la presence de la cytochalasine B dans le milieu n'a pas empeche larepolymerisation des microtubules degrades par le froid. x 60000.(B) Image d'un embryon de poulet entier cultive in vitro sur un milieu additionnede db-cAMP a la concentration de 0-5 mM. La morphologie de cet embryon est en toutpoint comparable a celle de nos temoins. x 75.(C) Image d'un embryon de poulet entier cultive in vitro sur un milieu contenantdu db-cAMP a la concentration de 25 mM. Tous les embryons ainsi traites affichaientdes defauts de neurogenese et de somitogenese. x 75.(D) Portions de cellules provenant du tissu neural d'un embryon explante sur unmilieu de culture contenant du db-cAMP a la concentration de 25 mM. Dans cesconditions, nous observons une plus grande abondance de microtubules. x 44000.

346 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

Neuruiation et migration nucleaire chez le poulet 347

la presence de noyau en division dans les parties medianes et externes derepithelium neural (Fig. 4C), ce qui est contraire a ce qui s'observe chez desembryons normaux (Fig. 3C).

Suite a ce type de traitement, Failure generale du neuroepithelium a toujoursete comparable a ce qui fut observe apres des traitements a la cytochalasine Bseule.

DISCUSSION

Nos resultats indiquent (Tableau 1) que le db-cAMP protege efficacement lesmicrotubules des cellules de repithelium neural contre une depolymerisation quidevrait normalement se realiser lors de l'exposition d'embryons au froid.Cependant le db-cAMP, administre seul, ne semble pas affecter les fonctionsmicrotubulaires car il n'a jamais empeche le phenomene de la migration nucleaireintercinetique de s'exercer normalement. Des resultats, accordant des proprietesstabilisatrices au db-cAMP, ont deja ete obtenus avec des cultures de neuro-blasteme de souris par Kirkland & Burton (1972). De plus, notre observation,pour subjective qu'elle soit, d'une plus grande abondance de microtubules dansles cellules d'embryons traites au db-cAMP (25 mM) est en accord avec lesdonnees de Roisen, Murphy & Braden (1972) qui montrent que le db-cAMPinduit l'assemblage des microtubules a partir d'un pool de sous-unites dansdes cellules ganglionnaires d'embryons de poulet ages de 8,5 jours.

De tous les traitements que nous avons pratiques, seule l'addition de db-cAMP couple a la cytochalasine B semble avoir uneffet sur les microfilaments.En effet, en presence de db-cAMP (0,5 mM) la cytochalasine B n'est pas toujoursparvenue a deteriorer entierement l'association en faisceau de ces microfilaments,association qui, normalement, est detruite lorsque la cytochalasine B estadministree seule (Messier & Auclair, 1974). Dans ce sens, d'ailleurs, nousavons remarque, de fac.on toute incidente, qu'une concentration de 5 /^g/ml decytochalasine B, qui a elle seule inhibe totalement la segmentation du mesodermeen somites, permettait de voir, chez un certain nombre d'embryons traites,

FIGURE 3

(A) Portion de l'epithelium neural d'un embryon explante sur un milieu de cultureadditionne de db-cAMP (0-5 ITIM) et porte a 2°C pendant 3 h. La presence desmicrotubules (fleches) indique que le db-cAMP les a proteges contre la degradationpar le froid. x 60000.(B) Trois heures d'exposition a la cytochalasine B (5 /*g/ml) inhibe la migrationnucleaire intercinetique. Les figures mitotiques s'accumulent (fleches) dans l'epaisseurde Fepithelium et plusieurs cellules sont larguees dans la neurocoele. Ce traitement,qui toujours altere profondement l'allure generale du neuroepithelium, l'affecte ades degres divers quel que soit l'age du specimen, x 900.(C) Microphotographie d'une coupe transversale au grand axe d'un embryon normal.On y voit la forme asymetrique des cellules de meme que des figures mitotiques(fleches) typiquement localisees pres de la neurocoele. x 900.

348 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

Neurulation et migration nucleaire chez le poulet 349

Tableau 1. Tableau recapitulatifdes divers traitements

MigrationTraitements nucleaire Microtubules

Jntercinetique

J. 38°C + +2. 38 + 2°C3. CB(38 + 2°C)4. CB(38 + 2 + 38°C) - +5. db-cAMP38°C + +6. db-cAMP(38 + 2°C) - +7. CB + db-cAMP38°C - +

La cytochalasine B (CB) qui n'empeche pas la depolymerisation des microtubules (3) nileur repolymerisation apres exposition a 2°C (4) inhibe la migration nucleaire intercinetiquemalgre la presence du db-cAMP (7), qui lui est un agent protecteur des microtubules (6).

1'addition d'une paire de somites en une heure d'incubation et ceci lorsque lesspecimens etaient incubes sur des milieux contenant a la fois la cytochalasine(5 /'g/ml) et le db-cAMP (0,5 mM). Ces observations sont a rapprocher destravaux de Miranda, Godman, Deitch & Tanenbaum (1974) qui suggerent queles effets de la cytochalasine D sur la contraction cytoplasmique pourrait etreconditionnes par la teneur en AMP cyclique cellulaire et rapprocher aussi deceux de Puck, Waldren & Hsie (1972) qui ont montre que le db-cAMP diminuaitsensiblement le pouvoir qu'a la cytochalasine B d'induire des petites cloches(zeiotic blebs) a la surface des cellules. Nos observations, qui suggerent unecorrelation inverse entre la reponse a la cytochalasine et le taux intracellulaired'AMP cyclique (Miranda et ah 1974), font presentement Pobjet d'une analysespecifique.

Au cours des cinquante dernieres annees, l'etude souvent repetee de la plaquemedullaire a donne naissance a un certain nombre d'hypotheses liees au meca-

FIGURE 4

(A) Fort grossissement des regions apicales de cellules de l'epithelium neural d'unembryon explante sur un milieu contenant a la fois de la cytochalasine B et dudb-cAMP. Dans ces conditions, on a souvent remarque la presence de filaments en-core associes en faisceau. Faisceau de filaments (grandes fleches), filaments intacts(petites fleches). x 80000.(B) Dans les cellules du tube neural d'embryons traites a la fois a la cytochalasine Bet au db-cAMP les microtubules sont toujours presents, x 44000.(C) Microphotographie d'une coupe transversale au grand axe d'un embryon ouTon apercoit des mitoses (fleches) situees a la base et dans les regions medianes del'epithelium neural. Chez cet embryon traite a la fois a la cytochalasine B et au db-cAMP, il y a inhibition de la migration nucleaire intercinetique. Cet arret desdeplacements nucleaires et le largage excessif des cellules dans la neurocoelecontribuent a modifier Pallure generale de Fepithelium lui conferant ici un aspect enV. x900.

350 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

nisme de son invagination. Deja, en 1924, Giersberg rejetait la possibilityqu'interviennent mecaniquement (par des poussees) les tissus voisins de repi-thelium neural. Toutefois, une etude plus recente de Schroeder (1970) indiquequ'au nombre des forces en jeu au moment de la neurulation chez Xenopuslaevis, il faut compter avec les poussees des myotomes et de l'ectoderme epider-mique. D'autre part, on n'evoque plus aujourd'hui la question des gradiantsd'hydratation (Brown, Hamburger & Schmitt, 1941) et Ton doit a Gillette (1944)d'avoir montre qu'a elle seule Pactivite mitotique ne pouvait expliquer lesmouvements qui entrainent la neurulation. En fait, aujourd'hui, c'est a la cellulede repithelium neural que Ton accorde l'essentiel du role qui doit etre joueaftn que s'invagine la plaque medullaire (Burnside, 1973). Et, c'est au seinmeme de cette cellule qu'on cherche a deceler les forces qui sont capablesd'induire les deformations cellulaires observees au cours de la neurulation.

Deux series d'observations supportent l'idee que ces cellules possedent enelles la capacite de changer de forme, de s'allonger. Premierement, Holtfreter(1947) a montre que des cellules isolees de la plaque neurale de salamandreconservaient leur forme etiree et meme qu'elles continuaient a s'allonger lorsquemises en culture. Deuxiemement, Adler (1971) a montre que des cellules neuro-epitheliales dissociees et mises en culture commencent par former des agregatsde cellules de formes irregulieres, mais que bientot apparaissent des formationsen placodes constitutes de cellules allongees dont certaines presentent l'aspectclassique en col de bouteille. L'observation de ces masses de cellules dissociees,isolees des tissus avoisinants et qui se rassemblent ensuite en un tissu quis'invagine, porte logiquement a considerer comme intrinseque aux cellules cettecapacite de deformation.

La question done qui se pose maintenant est de savoir quels sont les agentscytoplasmiques de la deformation cellulaire. Pour la majorite des auteurs lesmicrotubules (Messier, 1969; Schroeder, 1970; Karfunkel, 1971; Burnside,1973) interviendraient pour forcer, ou maintenir, Pelongation cellulaire alorsqu'un anneau de filaments apicaux (Baker & Schroeder, 1967; Schroeder, 1970;Karfunkel, 1972; Burnside, 1973) etranglerait les apex cellulaires donnantorigine a des cellules a long col etroit. Or, cote microtubules, il est fort probableen effet (Auclair & Messier, 1974) qu'il existe une correlation entre la presencedes microtubules et la forme allongee des cellules de l'epithelium neural toutcomme ce type de correlation semble aussi exister dans bon nombre d'autressystemes (Byers & Porter, 1964; Tilney, 1968). Mais, ceci dit, il reste encore asavoir comment ces structures tubulaires en arrivent a allonger les cellules.Burnside (1973) offre trois interpretations possibles du mecanisme d'action desmicrotubules et favorise celle qui a trait au transport cytoplasmique coordonnequi tend a diriger les constituants cellulaires vers la base des cellules. Cependant,l'auteur neglige la question de la migration nucleaire intercinetique. En 1973,nous suggerions (Messier & Auclair, 1973) que le phenomene de la migrationnucleaire intercinetique, qui provoque une accumulation de noyaux a la base

~Nemulation et migration nucleaire chez le poulet 351

de Pepithelium neural, pourrait fort bien, a cause des deformations des basescellulaires qu'il entraine, etre une des forces determinantes dans l'induction dela forme cellulaire {bottle-shaped) qui force la plaque medullaire a s'invaginer(Messier, 1974). Or, ces mouvements nucleaires sont tributaires des micro-tubules (Messier & Auclair, 1973) et Phypothese que favorise Burnside (1973)sur le role des microtubules dans les cellules de Taricha est compatible avecces mouvements migratoires. Du reste, Zwaan & Hendrix (1973) et Hendrixet Zwaan (1974) dans leurs etudes de Finvagination des placodes optiqueschez Pembryon de poulet, mettent l'accent sur le role de la migration nucleaireintercinetique comme agent des deformations cellulaires qui entraine l'invagina-tion dans cet epithelium.

En resume, nous croyons que l'invagination de la plaque medullaire pourraitetre consequente a Pelargissement des bases cellulaires qu'occasionnent lesnoyaux qui s'accumulent dans les portions externes de l'epithelium. Cetteaccumulation de noyaux decoule directement de la migration nucleaire inter-cinetique, un phenomene qui nous semble lie a la presence des microtubules.Ces considerations n'excluent en rien la possibility qu'interviennent d'autresattributs des cellules. Par exemple, l'endocytose, ou la resorption de membranedu cote apical, aurait aussi pour effet d'augmenter Pasymetrie cellulaire(Lof berg, 1974) et l'ensemble des dispositifs d'attachements cellulaires pourrait,en plus d'assurer a l'epithelium sa cohesion, jouer un role actif dans la morpho-genese neurale. Cette intervention des dispositifs d'accrochage dans la morpho-genese a deja ete discutee par Weiss (1961) de meme que par Gustafson &Wolpert (1963) qui insistent sur leur importance pour l'invaginationd'epitheliums et finalement par Adler (1971) qui en demontre experimentalementPimportance dans l'invagination de tissu neural.

Nos considerations, cependant, remettent en cause le mecanisme d'action desmicrofilaments. En effet, bien que dans nos specimens les microfilamentsfussent morphologiquement intacts et meme si leur association en faisceaun'etait pas toujours alteree, la cytochalasine B parvenait chaque fois (meme enpresence de db-cAMP) a bloquer la migration nucleaire intercinetique. Evidem-ment, malgre que dans ces conditions on obtienne encore des images de faisceauxintacts de microfilaments, il ne peut etre exclu qu'un nombre critique de fais-ceaux aient ete detruits. Au sujet des microfilaments, il faut souligner qu'iln'existe aucune preuve directe a Peffet que, dans nos specimens, ces micro-filaments soient contractiles. Toutefois, il est permis d'entretenir la presomptionqu'ils le soient (Huxley, 1973), compte tenu de la grande variete de types cellu-laires ou Pon a reussi a 'decorer' specifiquement de semblables filaments a lameromyosine lourde (Spooner et al. 1973; revue dans Huxley, 1973). Parailleurs, on n'a pas, non plus, de preuve directe de Paction de la cytochalasineB sur ces microfilaments.

Nous demontrons ici que la cytochalasine B n'a pas d'effet direct sur lesmicrotubules, qu'elle ne favorise ni leur degradation ni leur stabilisation. Par

352 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

contre, la drogue, que certains auteurs accusent de detruire les microfilaments(Wessells et al. 1971) bloque la migration nucleaire intercinetique. Or, meme sila cytochalasine B detruisait les microfilaments ou leur organisation en faisceauou leur 'fonction' dans les cellules de nos specimens (ce qui n'est pas du toutevident) on aurait, compte tenu de leur position perpendiculaire a la directiondes mouvements, grande peine a s'expliquer pourquoi les noyaux, qui sontrefoules a la base des cellules n'obeissent pas a la tendance normale de remontervers l'apex des cellules une fois la contrainte qu'imposent les microfilamentsdisparue. En fait, le raisonnement inverse semble plus facilement applicable.En effet, les travaux de Miranda et al. (1974) montrent que chez plusieurs typescellulaires la cytochalasine, loin de detruire les microfilaments, a pour effetd'induire une contraction tonique generate soutenue. Si la cytochalasine Bproduisait un effet semblable dans nos specimens elle pourrait alors, par lacontrainte qu'elle impose sur l'ensemble du cytoplasme, rendre difficile ascensionnormale des noyaux.

En definitive, la cytochalasine B dont les effets sont des plus controverses(Burnside, 1972; Miranda et al. 1974) inhibe la migration nucleaire intercinetiquesans affecter morphologiquement les microtubules et elle exerce son action parune voie qui nous est encore inconnue.

RESUME

La neurulation et le phenomene de la migration nucleaire intercinetique ont ete etudiedans les cellules de l'epithelium neural d'embryons de poulet en voie de neurulation etsoumis a une serie de conditions experimentales.

Les resultats indiquent que la cytochalasine B (5 /*g/ml) ne protege pas les microtubulescontre la degradation que produit une exposition de 3h a 2°C et qu'elle n'empeche pas larepolymerisation des microtubules lorsqu'ils ont ete degrades par le froid. Par contre ledb-cAMP protege les microtubules contre la degradation par le froid. On demontre quel'action inhibitrice de la cytochalasine B sur la migration nucleaire intercinetique ne peutetre attribute a un effet de la drogue sur les microtubules.

L'un des auteurs (PEM) est Scholar du Conseil de recherches medicales du Canada. Cetravail a ete subventionne par le Conseil de recherches medicales du Canada et par le Ministerede la Sante et du Bien-etre Social, section RODA. Nous remercions Mme G. Anglade etMile Basset pour leur aide technique, M. Leveille pour son travail photographique et MileAdolphe pour son travail secretarial.

REFERENCES

ADLER, R. (1971). Ultrastructural changes associated with an invagination phenomenonin embryonic neural aggregates. Expl Cell Res. 68, 395-403.

AUCLAIR, C. & MESSIER, P. E. (1974). Microtubules et morphologie des cellules du tubeneural chez l'embryon de poulet. Revue can. Biol. 33, 33-44.

BAKER, P. C. & SCHROEDER, T. E. (1967). Cytoplasmic filaments and morphogenetic move-ment in the amphibian neural tube. Devi Biol. 15, 432-450.

BROWN, M. G., HAMBURGER, V. & SCHMITT, F. O. (1941). Density studies on amphibianembryos with special reference to the mechanism of organizer action. / . exp. Zool. 88,353-372.

Neurulation et migration nucleaire chez le poulet 353BURNSIDE, B. (1972). Cytochalasin B: problems in interpreting its effect on cells. Devi Biol.

27, 443-446.BURNSIDE, B. (1973). Microtubules and microfilaments in Amphibian neurulation. Amer.

Zool. 13, 989-1006.BYERS, B. & PORTER, K. R. (1964). Oriented microtubules in elongating cells of the developing

lens rudiment after induction. Proc. natn. Acad. ScL, U.S.A. 52, 1091-1099.DAHLSTROM, A. (1968). Effect of colchicine on transport of amine storage granules in sym-

pathetic nerves of rat. Europ. J. Pharmacol. 5, 111-113.GIERSBERG, H. (1924) Beitrage zur entwicklungs physiologie der phibien. Wilhem Roux Arch.

EntwMech. Org. 103, 387-401.GILLETTE, R. (1944). Cell number and cell size in the ectoderm during neurulation (Ambly-

stoma maculatum). J. exp. Zool. 96, 201-222.GUSTAFSON, T. & WOLPERT, L. (1963). The cellular basis of morphogenesis and sea urchin

development. Int. Rev. Cytol. 15, 139-214.HAMBURGER, V. & HAMILTON, H. L. (1951). A series of normal stages in the development of

chick embryo. / . Morph. 88, 49-92.HENDRIX, R. W. & ZWAAN, J. (1974). Cell shape regulation and cell cycle in embryonic lens

cells. Nature, Lond. 247, 145-147.HOLMES, K. V. & CHOPPIN, P. W. (1968). On the role of microtubules in movement and

alignment of nuclei in virus-induced syncytia. / . Cell Biol. 39, 526-543.HOLTFRETER, J. (1947). Observations on the migration aggregation and phagocytosis of

embryonic cells. / . Morph. 80, 25-55.HUXLEY, H. E. (1973). Muscular contraction and cell motility. Nature, Lond. 243, 445-449.KARFUNKEL, P. (1971). The role of microtubules and microfilaments in neurulation in

Xenopus. Devi Biol. 25, 30-56.KARFUNKEL, P. (1972). The activity of microtubules and microfilaments in neurulation in

the chick. / . exp. Zool. 181, 289-302.KIRKLAND, W. L. & BURTON, P. R. (1972). Cyclic adenosine monophosphate-mediated

stabilization of mouse neuroblastoma cell neurite microtubules exposed to low tem-perature. Nature, Lond. 240, 205-207.

LANGMAN, J., GUERRANT, R. L. & FREEMAN, B. G. (1966). Behaviour of neuroepithelial cellsduring closure of the neural tube. / . comp. Neurol. 127, 399-412.

LOFBERG, J. (1974). Studies on cell morphogenesis during amphibian neurulation. ActaUniversitatis Upsaliensis 319, 1-5.

MESSIER, P. E. (1969). Effects of /?-mercaptoethanol on the fine structure of the neural platecells of the chick embryo. / . Embryol. exp. Morph. 21, 309-329.

MESSIER, P. E. (1972). The occurrence of nuclear migration under thiol treatment effectivein inhibiting neurulation. / . Embryol. exp. Morph. 27, 577-584.

MESSIER, P. E. (1974). Mecanisme de la neurulation; une hypothese. Ass. Canad. Francaisepour rAdvancement des Sciences Aleme Congres, Quebec.

MESSIER, P. E. & AUCLAIR, C. (1973). Inhibition of nuclear migration in the absence ofmicrotubules in the chick embryo. /. Embryol. exp. Morph. 30, 661-671.

MESSIER, P. E. & AUCLAIR, C. (1974). Effect of cytochalasin B on interkinetic nuclear migra-tion in the chick embryo. Devi Biol. 36, 218-223.

MIRANDA, A. F., GODMAN, G. C, DEITCH, A. D. & TANENBAUM, S. W. (1974). Action ofcytochalasin D on cells of established lines. I. Early events. / . Cell Biol. 61, 481-500.

PUCK, T. T., WALDREN, C. A. & HSIE, A. W. (1972). Membrane dynamics in the action ofdibutyryl adenosine 3':5'-cyclic monophosphate and testosterone on mammalian cells.Proc. natn. Acad. Sci., U.S.A. 69, 1943-1947.

ROISEN, F. J., MURPHY, R. A. & BRADEN, W. G. (1972). Dibutyryl cyclic adenosine mono-phosphate stimulation of colcemid-inhibited axonal elongation. Science, N. Y. Ill, 809-811.

SAUER, F. C. (1936). The interkinetic migration of embryonic epithelial nuclei. /. Morph.60, 1-11.

SAUER, F. C. (1937). Some factors in the morphogenesis of vertebrate embryonic epithelia./ . Morph. 61, 563-579.

354 P-E. MESSIER ET C. AUCLAIR

SCHLIWA, M. & BEREITER-HAHN, J. (1974). Pigment movements in fish melanophores:morphological and physiological studies. Cell Tiss. Res. 151, 423-432.

SCHROEDER, T. E. (1970). Neurulation in Xenopus laevis. An analysis and model based uponlight and electron microscopy. / . Embryol. exp. Morph. 23, 427-462.

SPOONER, B. S., ASH, J. F., WRENN, J. T., FRATER, R. B. & WESSELLS, N. K. (1973). Heavymeromysin binding to microfilaments involved in cell and morphogenetic movements.Tissue and Cell 5, 37-46.

SPRATT, N. T. (1950). Nutritional requirements of the early chick embryo. J. exp. Zool.114, 375-402.

TILNEY, L. G. (1968). The assembly of microtubules and their role in the development of cellform. Devi Biol. suppl. 2, 63-102.

WATTERSON, R. L. (1965). Structure and mitotic behavior of the early neural tube. Tn Organo-genesis, pp. 129-159. New York: Holt, Rinehart and Winston.

WEISS, P. (1961). Guiding principles in cell locomotion and cell aggregation. Expl Cell Res.suppl. 8, 260-281.

WESSELS, N. K., SPOONER, B. S., ASH, J. F., BRADLEY, M. O., LUDUENA, M. A., TAYLOR,E. L., WRENN, J. T. & YAMADA, K. M. (1971). Microfilaments in cellular and develop-mental processes. Science, N.Y. Ill, 135-143.

ZWAAN, J. & HENDRIX, R. W. (1973). Changes in cell and organ shape during early develop-ment of the ocular lens. Am. Zool. 13, 1039-1049.

{Regu le 11 Fevrier 1975, revise le 1 Avril 1975)