nAChR and signal transduction

Neuromuscular junction and nervous system

Central nervous system

ACh

SSActivation

(ms)

Desensibilisation(s-min)

B A

D

ACh

100 pA

2 s

B A

A D

A BD B

Function of nAChRs

The « cys-loop » receptor superfamily 

GABAA

GABAC

Glycine

5HT3A,BnAChR

Anionic

Cationic

AChBP (2001)

Bacterial (2005)

putative homologs

No channel

Na+

ACh

C C C C

AChBP

Functions as apH-activated ion channel

pH 5

1s

1nA

Open

Closed

1

4500290240

16011697

66

MW

0 10 30 100DSP(M)

2

3

5

Cross-linking

(DSP, M)

1-mer

2-mer

3-mer4-mer5-mer

Displays aPentameric Structure

Bocquet, Prado de Carvalho, Cartaud, Neyton, Le Poupon Taly, Grutter, Changeux, Corringer, Nature, 2007

Prokaryotic origin of « cys-loop » receptors Homolog from the cyanobacterium Gloeobacter violaceus

C C

Prokaryotes Eukaryotes

T T T TM M M MECD

T T T TM M M MECDPBP

TM

TM

cacheMCPT T T TM M M MECD

T T TM M MECD cytoplasm

TM

family 1

family 2

family 4

family 2,3,4(Cyhu)

family 1,2

family 1,3,4

Natural history of « cys-loop » receptors

family 3

family 4

Miyazawa et al. (2003) Nature 423, 949-955

Brejc et al. (2001) Nature 411, 269-276

AChBP

2.7 Å

Torpedo

4.0 Å

Structure of « cys-loop » receptors

La superfamille à « cys-loop »

4

GABA-A

GABA-C

Gly

nACh

5-HT3

A,B

Cationic Anionic

Nicotine:AddictionNeuroprotectionParkinsonAnalgesiacognition

Barbituratesbenzodiazepines:AnxiolyticsAnesthetics

Superfamily of « cys-loop » receptors

General AnestheticsEthanol

Éléménts de pharmacologie clinique des récepteurs cys-loop:

1- le récepteur nicotinique de la jonction neuro-musculaire et lesSyndromes myasthéniques congénitaux

2- les récepteurs nicotiniques centraux et la dépendance à la nicotine

3- les récepteurs GABAA centraux et l’action de benzodiazépines

1- Le récepteur nicotinique de la jonction neuro-musculaire et les

Syndromes myasthéniques congénitaux

Nicotinic acetylcholine receptors (nAChR)at the neuromuscular junction

ACh

Na+

Agonistes

Agonistespartiels

Antagonistescompétitifs

Bloquantsnon-compétitifs

acétylcholine(ACh)

Curare

Chlorpromazine

nicotine

Pharmacologie du nAChR musculaire

alpha-toxines

la jonction neuro-musculaire

La jonction neuro-musculaire par microscopie electronique

acetylcholine axis of quasi-symmetry

cleft

cytoplasm

synaptic

high affinity site for non-competitive blockers

NH2

M1 M2 M3 M4

Le récepteur de la jonction neuro-musculaire

Syndromes myasthéniques« Perte d’expression »

Récessif

nAChRfétal

nAChRadulte

Procédure expérimentale

Culture +/- nicotine Marquage

[35S]-méthionine

Chasse Milieu froid

Solubilisation

Immunoprécipitation

Biosynthèse et maturation des nAChRs de Torpille

Marquage métabolique méthionine 35S

Biosynthèse et maturation des nAChRs de Torpille

Marquage métabolique méthionine 35S immunoprécipitation anti

Quantification des intermédiaires de biosynthèse

immunoprécipitation anti

Le modèle séquenciel d’assemblage du nAChR de Torpille

Green and Claudio, 1993

5 minutes

sensible au triton

sensible au triton

5 heures24 heures

résistant au triton

Syndromes myasthéniques « Fast-channel »

MEPC: miniature endplate potential

Récessif, traitement inhibiteurs de la choline-estérase

La jonction neuro-musculaire « Fast-channel »

Syndromes myasthéniques « Slow-channel » Dominant, traitement: Quinidine

La jonction neuro-musculaire « Slow-channel »

Le cas du T264P

1M ACh

Phénotype L pour le mutant T264P

L*10000000

Reconstitution des évènements unitaires par le modèle MWC (Stoic), à 0,3 M ACh

Ion conductingpathway

Synapticdomain

Transmembranedomain

membrane

Ion conductingpathway

B A D

2- les récepteurs nicotiniques centrauxet la dépendance à la nicotine

QuickTime™ et undécompresseur codec YUV420

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Effects multiples de la nicotine

ACh

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

ACh

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

Liaison

Nicotine

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

Na+

K+

Activation50 s

2 s

membrane

100

0

Courant (pA)

Désensibilisation10ms-min

membrane

Réticulumendoplasmique

Nicotine chroniqueHeures-jours

Augmentation ou« up-régulation »

Heures-jours

Diversité des nAChRs

Homomeric

Heteromeric

Muscle-type

CNS

1s

ACh

ACh

ACh

EC50(ACh) 115M EC50(Nic) 10 M

EC50(ACh) 0.7M EC50(Nic) 1.0 M

EC50(ACh) 14M

Faiblement up-regulés

Hautement up-régulés

Thalamus

Hypothalamus

Amygdala

Striatum

Olfactorybulb

CortexHippocampus

MedialHabenula

LocusCoeruleus

Spinal Cord

Raphe Nuclei

Substantia NigraVentral Tegmental area

Interpeduncularnucleus

Cerebellum

Modified from Gotti et al, TIPS 2006

Distribution régionale des nAChRS dans le cerveau

souris knock-out 2 et dépendance à la nicotine

50 mV10 s

2+/+

2-/-

Nicotine 0,5 M

20 pA

10 s

Nic 100 M

2+/+ 2-/-

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (non compressé)

sont requis pour visionner cette image.

souris knock-out 2 et planification du comportement

The reward pathway for nicotine addiction

Maskos et al, Nature 2005

Lentiviral re-expressionof

Dopaminergic neurons (VTA)

WT2 KO2VTA

Injection stéréotaxiquede lentivirus re-exprimant

la sous-unité

QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

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QuickTime™ et undécompresseur TIFF (LZW)

sont requis pour visionner cette image.

Nic

otin

e el

icit

eddo

pam

ine

rele

ase

WT 2KO 2VTA

WT2KO2VTA

La ré-expression de 2 dans la VTA restore la libération de dopamine et l’autoadministration à la nicotine

Role of nAChR molecular properties in brain signaling?

Role of ACh affinity & desensitizationin brain signaling and nicotine action?

SSB

D

A

cholinergicinter

Pedoculo pontainPPTg

VTANAcc

Role of up-regulation in chronic nicotine action?

Time (h)0 250

40

Nic

otin

e (n

g/m

l)

From Jensen et al, J. Med. Chem, 2005

Pathologies liées aux nAChRs

Cellular and molecular dissection of the mechanism of up-regulation

Perry et al. , JPET 1999.

Prefrontal cortex Temporal cortex

Up-régulation des nAChRsUp-régulation des nAChRspar la nicotine chronique chez le fumeurpar la nicotine chronique chez le fumeur

liaison deliaison de 3 3H-nicotineH-nicotine

FumeurFumeur

Non-fumeurNon-fumeur

E.R.

Protéasome

Golgi

Surface

Nucleus

Up-regulation du nAChR Up-regulation du nAChR human dans HEK293 human dans HEK293Epibatidine binding

0

104

0 10-7 10-6 10-5 10-4 10-3

[Nicotine] (M)

Electrophysiologie

0 10-6 10-3

[Nicotine] (M)

ACh 30mM

ACh 1mM

N

N

?

Nicotine

Biosynthèse et traffic des récepteurs Biosynthèse et traffic des récepteurs

Chasse (heure)

Marquage métaboliqueAnti-2 mAb290 immunoprecipitation

0 0.7 1.5 3 9 24

espècesHigh-mannose

End

o-H

PN

Gas

e-F

espècesComplexes

End

o-H

PN

Gas

e-F

E.R.

Golgi

Surface

Nucleus

La nicotine: un facilitateur maturationnel des nAChRsSallette et al, Neuron 2005, Corringer et al, J. Physiol 2006

Pulse Chase

Chasse (h)

0 0,75 1,5 3 9 24

+ Nicotine

N

N

E.R.

Proteasome

Golgi

Surface

Nucleus

Nicotine

B C D E

37 11564 90 106

FA

1 2 3 1 2

1Up-

regu

latio

n ra

tio

5

NH2

HOOC

Nicotine - + - +

[3 H]E

piba

tidi

neB

indi

ng

100

i j

Nicotine

i j

Un microdomaine critiqueUn microdomaine critiquePour l’up-régulation des nAChRsPour l’up-régulation des nAChRs

AChNicotine

SSActivation(ms)

Desensibilisation(s-min)

B A

D

“Up-régulation”(heures-jours)

Nicotinechronique

Na+

K+

60Å

ACh40Å

70Å

100

Å

3- les récepteurs GABAA centrauxet l’action de benzodiazépines

Les effecteurs allostériquesdes récepteurs GABAA

effecteurs allostériques positifs et négatifs

GABA

GABA

benzo

GABA flunitrazepan muscinol

Site des benzodiazépines

GABA benzoA,B,C

D,E,F A,B,C

D,E,F

Explorations fonctionnellespar génétique chez la souris

KO= knock-out (délétion)

KI= Knock-in (mutation) loopA, insensible au diazepam

3: N265M, insensible aux anesthésiques généraux

Institut Pasteur

Pierre Benoit

Nicolas Bocquet

Sébastien Bohler

Jean-Pierre Changeux

Isabelle Cloëz-Tayarani

Anne Devillers-Thiéry

Naïla Even

Régis Grailhe

Thomas Grutter

Nicolas Le Novère

Chantal Le Poupon

Stéphanie Pons

Lia Prado de Carvalho

Jérome Sallette

Martine Soudant

Antoine Taly

Laboratoire de Neurobiologie ENSLaboratoire de Neurobiologie ENSJacques Neyton

Biologie Cellulaire des MembranesBiologie Cellulaire des MembranesInstitut Jacques MonodInstitut Jacques Monod

Jean Cartaud

RemerciementsRemerciements