Molecular Genetics of Thiobacillus Ferrooxidans

7/30/2019 Molecular Genetics of Thiobacillus Ferrooxidans

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M I C R O B I O L O G I C A L R E V I E W S , M a r . 1 9 9 4 , p . 3 9 - 5 50 1 4 6 - 0 7 4 9 / 9 4 / $ 0 4 . 0 0 + 0C o p y r i g h t 1 9 9 4 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

M o l e c u l a r G e n e t i c s o f T h i o b a c i l l u s f e r r o o x i d a n sDOUGLAS E . R A W L I N G S ' * AN D TOMONOBU KUSANO2

D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , U n i v e r s i t y o f C a p e T o w n , R o n d e b o s c h 7 7 0 0 , S o u t h A f r i c a , 'a n d L a b o r a t o r y o f P l an t G en e t i c E n g i n e e r i n g , B i o t e c h n o l o g y I n s t i t u t e ,A k i t a P r e f e c t u r a l C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e , O h g a t a , A k i t a 0 1 0 - 0 4 , J a p a n 2

INTRODUCTION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .PHYSIOLOGY OF T . F E R R O O X I D A N S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Why S t u d y t h e M o l e c u l a r G e n e t i c s o f T . f e r r o o x i d a n s ? .NATURAL PLASMIDS FROM T . F E R R O O X I D A N S . . . . . . . . .P l a s m i d p T F 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P l a s m i d p T F - F C 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .C o m p a r i s o n o f P l a s m i d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .CLONING AND EXPRESSION OF GENES FROM T . F iG e n e s I n v o l v e d i n N i t r o g e n M e t a b o l i s m . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G l u t a m i n e s y n t h e t a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .N i t r o g e n a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .n t r A s i g m a f a c t o r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .n t r B C g e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G e n e s I n v o l v e d i n F i x a t i o n o f C a r b o n D i o x i d e . . . . . . . . . . . . . .r e c A G e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .l e u B G e n e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .G e n e s A s s o c i a t e d w i t h R e s i s t a n c e t o M e r c u r y . . . . . . . . . . . . . . .G e n e s I n v o l v e d i n E n e r g y P r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .I r o n o x i d a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .( i ) F e ( I I ) o x i d a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .( i i ) R u s t i c y a n i n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .P r o t o n - t r a n s l o c a t i n g AT P s y n t h a s e g e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . .R e p e a t e d S e q u e n c e s , I S e l e m e n t s , a n d T r a n s p o s i t i o n . . .P h e n o t y p i c S w i t c h i n g w i t h i n T . f e r r o o x i d a n s . . . . . . . . . . . . . . . . . . .A d d i t i o n a l G e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .rRNA g e n e s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .R N a s e P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .S u l f u r a s s i m i l a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .GENE TRANSFER S T U D I E S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .C o n j u g a t i o n S y s t e m s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .E l e c t r o p o r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .CONCLUSIONS AND FUTURE R E S E A R C H . . . . . . . . . . . . . . . . . . .ACKNOWLEDGMENTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .RFERENCE1S .

INTRODUCTIONC o n s i d e r a b l e i n t e r e s t h a s b e e n s h o w n i n T h i o b a c i l l u s f e r -r o o x i d a n s b e c a u s e o f i t s us e i n i n d u s t r i a l m i n e r a l p r o c e s s i n ga n d i t s u n u s u a l p h y s i o l o g y . The m a j o r c o n t r i b u t i o n o f T .f e r r o o x i d a n s t o m e t a l e x t r a c t i o n i s i t s a b i l i t y t o a t t a c k s u l f i d e -c o n t a i n i n g m i n e r a l s a n d c o n v e r t t h e i n s o l u b l e s u l f i d e s o fm e t a l s s u c h as copper, l e a d , z i n c , o r n i c k e l t o t h e i r s o l u b l em e t a l s u l f a t e s . The t h r e e m e t a l s r e c o v e r e d i n t h e l a r g e s tq u a n t i t i e s t h r o u g h d i r e c t or i n d i r e c t b a c t e r i a l a c t i o n are cop-

per ( 1 5 ) , u r a n i u m ( 8 8 ) , a n d , more r e c e n t l y , g o l d ( 8 3 ) .I n d u s t r i a l b i o l e a c h i n g processes a re n o t c a r r i e d o u t u n d e rs t e r i l e c o n d i t i o n s , a n d as a r e s u l t T . f e r r o o x i d a n s s e l d o m i f evergrows as a pure c u l t u r e . M o s t c o m m e r c i a l b i o l e a c h i n g opera-t i o n s a re c a r r i e d o u t w i t h a c o n s o r t i u m o f h i g h l y a c i d o p h i l i c ,c h e m o l i t h o t r o p h i c b a c t e r i a w h i c h may i n c l u d e T . f e r r o o x i d a n s ,

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . P h o n e : ( 2 1 ) 6 5 0 3 2 61 . F a x : ( 2 1 ) 6 5 0 4 0 2 3 .E l e ct r o n i c m a i l a d d r e s s : D o u g @ m i c r o . u c t . a c . z a .

T h i o b a c i l l u s t h i o o x i d a n s , L e p t o s p i r i l l u m f e r r o o x i d a n s , a n d a c i -d o p h i l i c h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a b e l o n g i n g t o t h e genus A c i -d i p h i l i u m ( 4 1 , 6 3 ) . A l t h o u g h T . f e r r o o x i d a n s i s c o n s i d e r e d t o b et h e most i m p o r t a n t member o f t h e c o n s o r t i u m , m i x e d c u l t u r e so f b a c t e r i a are o f t e n more e f f i c i e n t a t ore d e c o m p o s i t i o n t h a ni s T . f e r r o o x i d a n s a l o n e . The a b o v e b a c t e r i a are a l l m e s o p h i l i c ,a n d as a r e s u l t , when c o n t r o l i s p o s s i b l e t h e i n d u s t r i a l b i o o x i -d a t i o n o f ores i s c a r r i e d o u t a t t e m p e r a t u r e s b e l o w 4 5 C .At t e m p e r a t u r e s g r e a t e r t h a n 4 5 C , s e v e r a l o t h e r t y p e s o fb a c t e r i a i n c l u d i n g t h e m o d e r a t e l y t h e r m o p h i l i c " T h i o b a c i l l u sTH" s t r a i n s a n d v a r i o u s S u l f o b a c i l l u s s p e c i e s d o m i n a t e ( 9 2 ) . Ateven h i g h e r t e m p e r a t u r e s , e x t r e m e l y t h e r m o p h i l i c a r c h a e b a c -t e r i a s u c h as S u l f o l o b u s a n d A c i d i a n u s s p e c i e s are f o u n d . Thesegroups o f b a c t e r i a a re a l s o a b l e t o r a p i d l y a t t a c k a v a r i e t y o fores. H o w e v e r , t h e r e a re c u r r e n t l y no i n d u s t r i a l processes t h a td e l i b e r a t e l y us e t h e s e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a .The b i o o x i d a t i o n r e a c t i o n s and p r o p o s e d mechanisms f o rt h e b i o l e a c h i n g o f a number o f m i n e r a l s h a v e a l r e a d y beenr e v i e w e d a n d w i l l n o t b e c o v e r e d a g a i n h e r e ( 1 5 , 6 5 , 8 4 ) .

3 9

V o l . 5 8 , N o . 1

. . 3 9. . 4 0. 4 1. . 4 1. . 4 1. . 4 1. . 4 3. . 4 3. . 4 3. . 4 3. v 4 4. . 4 4. . 4 5. . 4 5. . 4 5. . 4 6. . 4 6. . 4 6. . 4 7. . 4 7

, 4 l

......4 8

......4 8

......4 9

......4 9

......4 9

......4 9

......4 9

......4 9

......5 0Ca....0....1C 1

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I......................................................................................

I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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4 0 RAWLINGS AND KUSANOL i k e w i s e , n u m e r o u s p o p u l a r a n d s c i e n t i f i c a r t i c l e s o n t h ei n d u s t r i a l u s e o f T . f e r r o o x i d a n s - d o m i n a t e d c u l t u r e s h a v e b e e np u b l i s h e d ( 1 6 , 8 9 ) .

PHYSIOLOGY OF T . FERROOXIDANST . f e r r o o x i d a n s i s a g r a m - n e g a t i v e , r o d - s h a p e d b a c t e r i u mt h a t h a s a p h y s i o l o g y w h i c h i s w e l l s u i t e d f o r g r o w t h i n a ni n o r g a n i c m i n i n g e n v i r o n m e n t . I t o b t a i n s i t s c a r b o n b y f i x i n ga t m o s p h e r i c c a r b o n d i o x i d e a n d i s o b l i g a t e l y a u t o t r o p h i c ( 6 4 ) .A n u m b e r o f e a r l y r e p o r t s o n i t s a b i l i t y t o g r o w h e t e r o t r o -p h i c a l l y a r e c o n s i d e r e d t o b e e r r o n e o u s . T . f e r r o o x i d a n s c u l -

t u r e s a r e n o t o r i o u s l y d i f f i c u l t t o f r e e f r o m a s s o c i a t e d h e t e r o -t r o p h i c b a c t e r i a b e l o n g i n g t o t h e g e n u s A c i d i p h i l i u m a n d i t i st h e g r o w t h o f t h e s e b a c t e r i a t h a t w a s m i s t a k e n f o r g r o w t h o f T .f e r r o o x i d a n s ( 4 1 ) . O n e s t r a i n h a s b e e n r e p o r t e d t o g r o wm i x o t r o p h i c a l l y i n t h e p r e s e n c e o f i r o n a n d g l u c o s e ( 8 ) b u t i ng e n e r a l , o r g a n i c c o m p o u n d s i n h i b i t g r o w t h ( 2 , 1 4 3 ) . F o r m i ca c i d c a n r e p l a c e c a r b o n d i o x i d e a s t h e c a r b o n s o u r c e i n m o s t ,b u t n o t a l l , T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s e x a m i n e d ( 1 0 0 ) . H o w e v e r ,t h e c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a t e m u s t b e k e p t l o w t h r o u g h t h e u s eo f a c h e m o s t a t . One s t r a i n , ATCC 2 1 8 3 4 , w a s p a r t i c u l a r l ye f f i c i e n t a t c o n s u m i n g f o r m i c a c i d .N o t o n l y i s t h e b a c t e r i u m a u t o t r o p h i c , b u t a l s o i t i s c a p a b l eo f f i x i n g a t m o s p h e r i c n i t r o g e n ( 8 5 ) . A l l 1 5 T . f e r r o o x i d a n ss t r a i n s e x a m i n e d h a v e t h e g e n e s f o r n i t r o g e n f i x a t i o n ( 9 8 , 1 0 5 ) .D i a z o t r o p h y i s t h e r e f o r e l i k e l y t o b e a g e n e r a l p r o p e r t y o ft h e s e b a c t e r i a .E n e r g y i s o b t a i n e d b y t h e o x i d a t i o n o f e i t h e r f e r r o u s i o n s t of e r r i c o r r e d u c e d - s u l f u r c o m p o u n d s t o s u l f u r i c a c i d . T h eb a c t e r i u m i s a c i d o p h i l i c w i t h a n o p t i m u m pH w i t h i n t h e r a n g epH 1 . 5 t o 2 . 5 . I t g r o w s b e s t i n a n a e r o b i c e n v i r o n m e n t w i t ho x y g e n a s a n e l e c t r o n a c c e p t o r . I f o x y g e n i s l a c k i n g a n dr e d u c e d - s u l f u r c o m p o u n d s o r f o r m a t e i s u s e d a s t h e e l e c t r o nd o n o r , f e r r i c i o n s c a n s e r v e a s t h e e l e c t r o n a c c e p t o r ( 2 2 , 9 9 ,1 3 6 , 1 3 7 ) . O t h e r c o m p o u n d s b e s i d e s i r o n a n d s u l f u r may b eo x i d i z e d . T h r e e T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s , i n c l u d i n g t h e t y p e s t r a i nATCC 2 3 2 7 0 , g r o w i n a b a s a l - s a l t s m e d i u m w h e n i n c u b a t e d i nt h e p r e s e n c e o f CO2 a n d 0 2 a n d w i t h H 2 a s t h e s o l e e n e r g ys o u r c e ( 3 1 ) . T h e r e a r e a l s o r e p o r t s t h a t T . f e r r o o x i d a n s c a ng r o w v i a t h e d i r e c t o x i d a t i o n o f U0 2 i n t h e p r e s e n c e o f i r o n( 2 7 ) a n d t h a t i t p o s s e s s e s a m o l y b d e n u m - o x i d i z i n g e n z y m e( 1 3 5 ) .M o s t i s o l a t e s o f T . f e r r o o x i d a n s h a v e r e m a r k a b l y m o d e s tn u t r i t i o n a l r e q u i r e m e n t s . A e r a t i o n o f a s a m p l e o f i r o n p y r i t e i na c i d i f i e d w a t e r i s s u f f i c i e n t t o s u p p o r t g r o w t h a t t h e e x p e n s e o ft h e p y r i t e . T h e p y r i t e p r o v i d e s t h e e n e r g y s o u r c e a n d t r a c ee l e m e n t s ; t h e a i r p r o v i d e s t h e c a r b o n , n i t r o g e n , a n d o x y g e n ;a n d t h e a c i d i f i e d w a t e r p r o v i d e s t h e g r o w t h e n v i r o n m e n t . T .f e r r o o x i d a n s i s u b i q u i t o u s i n t h e e n v i r o n m e n t . I t m a y b e r e a d i l yi s o l a t e d f r o m s o i l s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m t h e v i c i n i t y o f p y r i t i co r e d e p o s i t s o r f r o m s i t e s o f a c i d m i n e d r a i n a g e t h a t a r ef r e q u e n t l y a s s o c i a t e d w i t h c o a l w a s t e o r m i n e d u m p s .I n a d d i t i o n t o i t s u n i q u e p h y s i o l o g y , T . f e r r o o x i d a n s h a so t h e r f e a t u r e s t h a t m a k e i t s u i t a b l e f o r u s e i n b i o m i n i n go p e r a t i o n s . One o f t h e s e i s i t s i n h e r e n t r e s i s t a n c e t o h i g hc o n c e n t r a t i o n s o f m e t a l l i c a n d o t h e r i o n s ( 1 4 2 ) . F o r e x a m p l e ,t h e b a c t e r i u m h a s b e e n r e p o r t e d t o b e c a p a b l e o f g r o w t h i nmedium c o n t a i n i n g Z n 2 + ( 1 2 0 g / l i t e r ) , N i 2 + ( 7 2 g / l i t e r ) , C o 2 +( 3 0 g / l i t e r ) , C u 2 + ( 5 5 g / l i t e r ) , U308 ( 1 2 g / l i t e r ) , a n d F e 2 + ( 1 6 0g / l i t e r ) ( 1 4 0 ) . A n o t h e r f e a t u r e i s t h e r e m a r k a b l e a d a p t a b i l i t y o ft h e o r g a n i s m w h e n f a c e d w i t h a d v e r s e g r o w t h c o n d i t i o n s .P r e v i o u s l y s e n s i t i v e s t r a i n s h a v e b e e n a d a p t e d t o h i g h c o n c e n -t r a t i o n s o f a r s e n i c ( 1 1 6 ) a n d c o p p e r ( 4 5 ) , l o w e r - t h a n - o p t i m u mpH ( 1 4 8 ) , a n d a n u m b e r o f o t h e r f a c t o r s . T h e m e c h a n i s m o fa d a p t a t i o n i s p o s s i b l y d u e t o t h e a c c u m u l a t i o n o f a d v a n t a g e o u s

T . p e r o m e t a b o l l e 'R h o d o c y o l u e g o l a t l n o o u e

P . . t e s t o e t e r o l ' V l t r e o o e l l l a e t e r c o r a r l aF I G . 1 . T h e 1 6 S rRNA r e l a t i o n s h i p s o f s e v e r a l T h i o b a c i l l u s i s o l a t e sw i t h i n t h e P a n d - y s u b d i v i s i o n s o f t h e P r o t e o b a c t e r i a . L M 2 , F 2 2 1 ,ATCC 2 3 2 7 0 ( t y p e s t r a i n ) , ATCC 1 9 8 5 9 , L p , a n d PH a r e c l a s s i f i e d a ss t r a i n s o f T . f e r r o o x i d a n s , w h i l e DSM 6 1 2 a n d ATCC 1 9 3 7 7 ( t y p es t r a i n ) a r e s t r a i n s o f T . t h i o o x i d a n s . R e d r a w n f r o m r e f e r e n c e 7 8 w i t hp e r m i s s i o n o f t h e p u b l i s h e r .

m u t a t i o n s u n d e r s e l e c t i v e c o n d i t i o n s , b u t t h i s h a s n o t b e e ne s t a b l i s h e d . S c h r a d e r a n d H o l m e s h a v e s u g g e s t e d ( 1 2 7 ) t h a tt h e r e may a l s o b e o t h e r m e c h a n i s m s w h i c h c o n t r i b u t e t o t h er a p i d a d a p t a t i o n o f t h e b a c t e r i u m t o h a r s h c o n d i t i o n s ( s e e t h es e c t i o n on r e p e a t e d s e q u e n c e s a n d p h e n o t y p i c s w i t c h i n g ) .N o t a l l i s o l a t e s o f b a c t e r i a t h a t a r e r e f e r r e d t o a s Tf e r r o o x i d a n s a r e g e n e t i c a l l y c l o s e l y r e l a t e d . H a r r i s o n ( 4 1 ) c a r -r i e d o u t a s y s t e m a t i c s t u d y o f a l a r g e n u m b e r o f T . f e r r o o x i d a n ss t r a i n s a n d r e p o r t e d t h a t t h e G+C c o n t e n t o f t h e i r DNA c o u l dv a r y f r o m 5 5 t o 6 5 m o l % . On t h e b a s i s o f i n t e r s t r a i n h y b r i d -i z a t i o n s t u d i e s , h e d i v i d e d T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i n t o s e v e nd i f f e r e n t DNA h o m o l o g y g r o u p s . I n l a t e r s t u d i e s , S S ( 7 9 ) a n dp a r t i a l 1 6 S ( 7 8 ) rRNA s e q u e n c e s w e r e u s e d t o p h y l o g e n e t i c a l l yc o m p a r e s t r a i n s o f T . f e r r o o x i d a n s w i t h e a c h o t h e r a n d o t h e ra c i d o p h i l e s ( F i g . 1 ) . On t h e b a s i s o f t h e 1 6 S rRNA d a t a , m o s tT . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s , i n c l u d i n g r e p r e s e n t a t i v e s f r o m t h r e e o fH a r r i s o n ' s h o m o l o g y g r o u p s , w e r e p l a c e d i n t o a s e p a r a t ep h y l o g e n e t i c c l u s t e r . An e x c e p t i o n w a s t h e T . f e r r o o x i d a n ss t r a i n m - 1 , w h i c h was c l e a r l y d i f f e r e n t f r o m t h e m a i n g r o u p i n g .When t h e p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p o f T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n sw i t h o t h e r g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a w a s i n v e s t i g a t e d , t h e m a i nc l u s t e r f i t t e d b e s t i n t o t h e , B s u b d i v i s i o n ( 1 5 2 ) o f t h e P r o t e o b a c -t e r i a . I n c o n t r a s t , s t r a i n m - 1 a p p e a r e d t o f a l l w i t h i n t h eP r o t e o b a c t e r i a y s u b d i v i s i o n . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h e t w o T .t h i o o x i d a n s s t r a i n s e x a m i n e d i n t h e 1 6 S rRNA s t u d y , i n c l u d i n gt h e t y p e s t r a i n ATCC 1 9 3 7 7 , w e r e g r o u p e d t o g e t h e r w i t h t h em a i n T . f e r r o o x i d a n s c l u s t e r ( 7 8 ) . T h e r e i s c l e a r l y s u f f i c i e n tv a r i a t i o n a m o n g b a c t e r i a t h a t c a r r y t h e name T . f e r r o o x i d a n s ,f o r t h e m t o b e s u b d i v i d e d i n t o s e v e r a l s p e c i e s w i t h i n t h e g e n u s .T h e g e n u s T h i o b a c i l l u s a l s o i n c l u d e s m a n y n e u t r o p h i l i c , f a c u l -t a t i v e l y a u t o t r o p h i c b a c t e r i a w h i c h , b e c a u s e t h e y h a v e t h e

M I C R OB I OL . R E V .

1 . Fatuparue1 . 1 11.


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MOLECULAR GENETICS OF T . FERROOXIDANS 4 1same genus d e s i g n a t i o n , are f r e q u e n t l y m i s t a k e n t o b e c l o s e l yr e l a t e d t o T . f e r r o o x i d a n s . T h e 1 6 S rRNA sequence d a t a a n dp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e " n e u t r o p h i l i c t h i o b a c i l l i "a re so d i f f e r e n t f r o m t y p i c a l a c i d o p h i l i c , o b l i g a t e l y a u t o t r o p h i cT . f e r r o o x i d a n s a n d T . t h i o o x i d a n s i s o l a t e s t h a t t h e y s h o u l d n o tb e c o n s i d e r e d t o b e m e m b e r s o f t h e same genus.

Why S t u d y t h e M o l e c u l a r G e n e t i c s o f T . f e r r o o x i d a n s ?I n s p i t e o f i t s s u i t a b i l i t y f o r g r o w t h i n a n i n o r g a n i c m i n i n ge n v i r o n m e n t , T . f e r r o o x i d a n s d o e s h a v e l i m i t a t i o n s . T h e s e aren o t r e a d i l y a p p a r e n t i n l o w - r a t e o p e r a t i o n s s u c h as t h e l e a c h -i n g o f ore d u m p s or h e a p s b u t b e c o m e more o b v i o u s i nh i g h - r a t e processes s u c h a s t h e v a t l ea ch i ng o f g o l d - b e a r i n ga r s e n o p y r i t e c o n c e n t r a t e s ( 1 4 6 ) . One o f t h e most n o t i c e a b l el i m i t a t i o n s i s t h e s l o w d o u b l i n g t i m e o f t h e b a c t e r i u m . S i n c et h e o r g a n i s m s d o n o t s e t t l e ( l i k e a sewage s l u d g e ) , t h e r e i s nor e a d y means o f r e c y c l i n g a n d t h e minimum r e t e n t i o n t i m e i n al e a c h i n g v a t i s r e s t r i c t e d b y t h e l o w g r o w t h r a t e o f t h e b a c t e r i a .An e m p i r i c a l a p p r o a c h t o s o l v i n g t h i s p r o b l e m i s t h r o u g h t h eo p t i m i z a t i o n o f f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n s s u c h as t h e r a t e o fa e r a t i o n , t h e c o n c e nt r at i o n o f CO2 a n d 02i n t h e a i r , temper-a t u r e , p H , a n d t h e a d d i t i o n o f n u t r i e n t s s u c h as NH4' a n dP 0 4 3 - . A more f u n d a m e n t a l a p p r o a c h i s t o i n c r e a s e o uru n d e r s t a n d i n g o f t h e n u t r i t i o n a n d energy g e n e r a t i o n m e c h a -n i s m s o f t h e b a c t e r i u m ' s h i g h l y d e m a n d i n g c h e m o a u t o l i t h o t r o -p h i c way o f l i f e . T h i s a p p r o a c h i n c l u d e s t h e d e v e l o p m e n t o f t h eg e n e t i c s y s t e m s n e e d e d t o carry o u t some o f t h e p h y s i o l o g i c a ls t u d i e s a n d t o g e n e t i c a l l y m a n i p u l a t e c o m m e r c i a l s t r a i n s i fr e q u i r e d . M o s t s t u d i e s on t h e m o l e c u l a r g e n e t i c s o f T . f e r r o o x i -d a n s h a v e b e e n c a r r i e d o u t w i t h t h e s e o b j e c t i v e s i n m i n d .

NATURAL PLASMIDS FROM T . FERROOXIDANSA n u m b e r o f surveys o f t h e occurrence o f n a t u r a l p l a s m i d si n s t r a i n s o f T . f e r r o o x i d a n s i s o l a t e d f r o m d i f f e r e n t p a r t s o f t h ew o r l d h a v e b e e n m a d e . M a r t i n e t a l . ( 8 6 ) r e p o r t e d t h a t 1 1 o f 1 5

s t r a i n s o r i g i n a t i n g m o s t l y f r o m t h e U n i t e d S t a t e s a n d B u l g a r i ac o n t a i n e d o ne t o f i v e p l a s m i d s per s t r a i n r a n g i n g i n s i z e f r o m7 . 4 t o 7 5 k b p . I n a survey o f more t h a n 1 0 0 s t r a i n s f r o m s i xJ a p a n e s e m i n i n g s i t e s , 73% were f o u n d t o carry o ne or morep l a s m i d s r a n g i n g i n s i z e f r o m 2 . 0 t o 3 0 k b p ( 1 3 1 ) . P l a s m i d sh a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n s t r a i n s f r o m S o u t h A f r i c a ( 1 0 9 ) ,I t a l y a n d M e x i c o ( 1 4 5 ) , C h i l e ( 1 2 4 ) , a n d C a n a d a ( 8 7 ) . I n t h eC a n a d i a n s t u d y , o ne t o f o u r p l a s m i d s o f 1 8 . 6 t o 6 5 k b p wered e t e c t e d i n n i n e T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h eAgnew L a k e u r a n i u m m i n e , n o r t h e rn O n t a r i o . An a t t e m p t t oc o r r e l a t e t h e presence o f a p l a s m i d o f a p a r t i c u l a r s i z e w i t h a ni n c r e a s e i n u r a n i u m r e s i s t a n c e was m a d e . T h e s e w o r k e r s f o u n dt h a t t h e f o u r s t r a i n s w h i c h e x h i bi t e d t h e h i g h e s t r e s i s t a n c e t oUO22+ a l l c o n t a i n e d a p a r t i c u l a r 2 0 - k b p p l a s m i d . I n o ne s t r a i nt h e d i s a p p e a r a n c e o f t h e 2 0- k b p p l a s m i d o c c u r r e d t o g e t h e rw i t h a r e d u c t i o n i n u r a n i u m r e s i s t a n c e ( 8 7 ) . H o w e v e r , t h i se v i d e n c e i s c i r c u m s t a n t i a l a n d i n s u f f i c i e n t t o prove a c a u s a lr e l a t i o n s h i p . O t h e r a t t e m p t s h a v e b e e n ma de t o c o r r e l a t e t h epresence o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g p l a s m i d s w i t h m e t a l r e s i s t a n c e ,b u t t h e s e h a v e n o t b e e n s u c c e s s f u l . P ar t o f t h e p r o b l e m i s t h a tw i t h o u t a s e l e c t a b l e m a r k e r , c u r i n g s t r a i n s o f t h e i r n a t u r a lp l a s m i d s i s very d i f f i c u l t a n d no a t t e m p t s a t c u r i n g h a v e b e e ns u c c e s s f u l . A l t h o u g h t h e occurrence o f p l a s m i d s i s c l e a r l yw i d e s p r e a d among s t r a i n s o f T . f e r r o o x i d a n s , no p h e n o t y p e h a sy e t b e e n a s c r i b e d t o a ny T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d .S e v e r a l T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s h a v e b e e n c l o n e d i n E s c h -e r i c h i a c o l i . T h e s e i n c l u d e two p l a s m i d s f r o m t h e u r a n i u m -r e s i s t a n t ATCC 3 3 0 2 0 s t r a i n ( 4 4 ) ; one f r o m t h e a r s e n i c -r e s i s t a n t FC s t r a i n ( 1 1 1 ) ; a 2 0 - k b p p l a s m i d t h a t h a s b e e n f o u n d

i n T f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i s o l a t e d f r o m many d i f f e r e n t p a r t s o fI t a l y , S a r d i n i a , a n d B u l g a r i a ( 1 0 9 , 1 4 5 ) ; a n d f o u r p l a s m i d s f r o mT . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i s o l a t e d i n J a p a n ( 1 3 1 ) . I n o n e s t u d yf o u r r e c o m b i n a n t T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s w e r e t r a n s f o r m e di n t o E . c o l i a n d t h e r e s i s t a n c e o f t h e t r a n s f o r m a n t s t o A g + ,A s 3 + A s s + Cd2, C o 2 + C r 6 + , C u 2 + , H g + , L i + , Mo6, N i ,S b 3 + , T e 4 + , U 6+ , Z n 2 + , a n d e i g h t a n t i b i o t i c s w a s d e t e r m i n e d( 1 1 3 ) . T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d s d i d n o t a f f e c t t h e t o l e r a n c e o ft h e t r a n s f o r m a n t s t o t h e m e t a l i o n s o r c o n f e r r e s i s t a n c e t o a n yo f t h e a n t i b i o t i c s .Some f u n c t i o n s o f T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s h a v e b e e n e x -p r e s s e d i n E . c o l i . R a w l i n g s e t a l . ( 1 1 1 ) r e p o r t e d t h a t a p l a s m i di s o l a t e d f r o m T . f e r r o o x i d a n s w a s c a p a b l e o f r e p l i c a t i o n i n E .c o l i a n d t h a t t h r e e o f f o u r r e c o m b i n a n t p l a s m i d s w e r e m o b i -l i z e d b e t w e e n E . c o l i s t r a i n s ( 1 1 5 ) b y a c o r e s i d e n t I n c Pp l a s m i d , s u c h a s R P 4 . Two T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s h a v e b e e ns t u d i e d i n s o m e d e t a i l .

P l a s m i d p T F 1P l a s m i d p T F 1 i s a 6 . 7 - k b , m o b i l i z a b l e p l a s m i d t h a t w a so r i g i n a l l y c l o n e d i n t o p B R 3 2 2 f r o m T . f e r r o o x i d a n s ATCC3 3 02 0 b y H o l m e s e t a l . ( 4 4 ) . A 2 . 8- k bp r e g i o n w h i c h i s r e q u i r e df o r m o b i l i z a t i o n h a s b e e n l o c a t e d a n d s e q u e n c e d b y D r o l e t e ta l . ( 3 3 ) . Two p r o t e i n s , t h e 4 2 . 6 - k D a MobL a n d t h e 1 1 . 4 - k D aM o b S , t h a t w e r e e s s e n t i a l f o r m o b i l i z a t i o n w e r e i d e n t i f i e d a n dt h e e x a c t p o s i t i o n o f t h e n i c k s i t e w i t h i n t h e o r i T r e g i o n w a sd e t e r m i n e d . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f MobL a n d MobSw e r e 4 9 a n d 53% s i m i l a r t o t h e Mo bA a n d MobC p r o t e i n s o ft h e b r o a d - h o s t - r a n g e I n c Q p l a s m i d s , r e s p e c t i v e l y . MobL w a sa l s o r e l a t e d ( 4 5 % a m i n o a c i d s e q u e n c e s i m i l a r i t y ) t o t h ep r e s u m p t i v e Mob p r o t e i n o f p l a s m i d p S C 1 0 1 . An e x a m i n a t i o no f t h e t r a n s c r i p t i o n a n d r e g u l a t i o n o f t h e mobL a n d mobSp r o m o t e r s i n E . c o l i w a s c a r r i e d o u t . P r i m e r e x t e n s i o n e x p e r -i m e n t s i n d i c a t e d t h a t t h e mobL a n d mobS g e n e s w e r e t r a n -s c r i b e d f r o m a s e t o f d i v e r g e n t u 7 0 - t y p e p r o m o t e r s l o c a t e dw i t h i n t h e o r i T r e g i o n ( 3 2 ) . MobL b u t n o t MobS w a s f o u n d t os p e c i f i c a l l y b i n d t o a 4 2 - b p f r a g m e n t o f s i n g l e - s t r a n d e d DNAw h i c h i n c l u d e d a p o t e n t i a l s t e m - l o o p s t r u c t u r e a n d t h e o r i Tn i c k s i t e .A 1 . 3 - k b p r e g i o n o f p T F 1 w h i c h b e a r s s o m e r e s e m b l a n c e t ot h e r e p l i c o n o f p S C 1 0 1 a n d w h i c h c o n t a i n s a n o p e n r e a d i n gf r a m e ( O R F ) w h o s e p r e d i c t e d p r o d u c t h a s s t r u c t u r a l s i m i l a r i t yt o t h e D N A - b i n d i n g K f r A p r o t e i n o f p l a s m i d RK2 h a s b e e ni d e n t i f i e d ( 8 0 ) .

P l a s m i d p T F - F C 2P l a s m i d p T F - F C 2 i s a 1 2 . 2 - k b , b r o a d - h o s t - r a n g e , h i g h l ym o b i l i z a b l e p l a s m i d t h a t w a s p r e s e n t i n t h e a r s e n i c - r e s i s t a n t Tf e r r o o x i d a n s FC i s o l a t e d i n S o u t h A f r i c a . T h i s s t r a i n i s ad o m i n a n t member o f a m i x e d b a c t e r i a l c u l t u r e t h a t i s u s e di n d u s t r i a l l y i n t h e b i o o x i d a t i o n o f a g o l d - b e a r i n g a r s e n o p y r i t e

c o n c e n t r a t e ( 1 4 6 ) . P l a s m i d p T F - F C 2 i s p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n gb e c a u s e f e w s m a l l b r o a d - h o s t - r a n g e p l a s m i d s a r e k n o w n . T h ee n t i r e p T F - F C 2 p l a s m i d h a s r e c e n t l y b e e n s e q u e n c e d a n dc o n s i s t s o f t h r e e r e g i o n s : a r e p l i c o n r e g i o n , a m o b i l i z a t i o nr e g i o n , a n d a t r a n s p o s o n - l i k e e l e m e n t ( 1 0 8 ) . The r e p l i c a t i o na n d m o b i l i z a t i o n r e g i o n s h a v e b e e n s t u d i e d i n d e t a i l .T h e r e p l i c o n c o n s i s t s o f f i v e o r s i x g e n e s a n d a n o r i V r e g i o nw h i c h i s r e q u i r e d i n c i s ( F i g . 2 ) . T h e o r i V r e g i o n h a s b e e nl o c a t e d t o a 1 8 4 - b p f r a g m e n t w h i c h i n c l u d e s t h r e e t a n d e mp e r f e c t l y r e p e a t e d 2 2 - b p s e q u e n c e s ( 2 9 ) . T h i s r e g i o n i s c l e a r l yr e l a t e d t o t h e o r i V o f t h e b r o a d - h o s t - r a n g e I n c Q p l a s m i d s( R S F 1 0 1 0 , R 1 1 6 2 , a n d R 3 0 0 B ) w h i c h h a v e 3 . 5 p e r f e c t l y c o n -s e r v e d 2 0 - b p s e q u e n c e s s e p a r a t e d b y 2 - b p n o n c o n s e r v e ds p a c e r s e q u e n c e s ( 8 2 ) . I f t h e t w o s e t s o f r e p e a t e d s e q u e n c e s

V O L . 5 8 , 1 9 9 4


4/17

4 2 RAWLINGS AND KUSANOp r o t e o b a c t e r i aB

E c o R I1 0 0 0 0 I

Pv u 6 0 0 0

p T F - F C 2

. 2 2 ~ A 1- ~ c~ 4 0 0 0.repB ~ ~ ~ A p a I

F I G . 2 . P h y s i c a l a n d g e n e t i c map o f p T F - F C 2 , a b r o a d - h o s t - r a n g e ,m o b i l i z a b l e p l a s m i d i s o l a t e d f r o m T . f e r r o o x i d a n s . R e g i o n s r e q u i r e df o r r e p l i c a t i o n a n d m o b i l i z a t i o n , a s w e l l a s a t r a n s p o s o n - l i k e e l e m e n t ,a r e s h o w n. B lo c k s l a b e l e d I R r e p r e s e n t t h e i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e st h a t b o r d e r a t r a n s p o s o n - l i k e e l e m e n t a n d w h i c h h a v e a 3 8 - o f - 3 8 a n d3 7 - o f - 3 8 m a t c h t o t h e I R s e q u e n c e s o f T n 2 l . M o d i f i e d f r o m r e f e r e n c e1 0 8 w i t h p e r m i s s i o n o f t h e p u b l i s h e r .

i n c l u d i n g t h e s p a c e r s a r e a l i g n e d , t h e r e i s 60 % DNA h o m o l o g yb e t w e e n t h e m . T h e r e i s a l s o a s t r i k i n g 75% DNA h o m o l o g yb e t w e e n t h e 1 1 5 b p o f DNA i m m e d i a t e l y a d j a c e n t t o t h er e p e a t e d s e q u e n c e s o f p T F - F C 2 a n d t h e I n c Q p l a s m i d s ( 2 9 ) .I n t h e I n c Q p l a s m i d R 1 1 6 2 , t w o d i s t i n c t d o m a i n s , c o n t a i n e d o na d j a c e n t 3 7 0 - a n d 2 1 0 - b p H p a I I f r a g m e n t s a r e r e q u i r e d i n c i sf o r p l a s m i d r e p l i c a t i o n ( 6 7 ) . T h e s e t w o d o m a i n s a r e a b l e t od i r e c t p l a s m i d r e p l i c a t i o n e v e n w h e n t h e d i s t a n c e b e t w e e nt h e m i s i n c r e a s e d . T h e e x t e n s i v e h o m o l o g y b e t w e e n t h e 1 8 4 - b po r i V d o m a i n o f p T F - F C 2 a n d R i 1 6 2 i s c o n t a i n e d e n t i r e l yw i t h i n t h e 3 7 0 - b p H p a I I f r a g m e n t . P l a s m i d p T F - F C 2 , t h e r e -f o r e , d o e s n o t a p p e a r t o h a v e a r e q u i r e m e n t f o r a d o m a i ne q u i v a l e n t t o t h e 2 1 0 - b p H p a I f r a g m e n t o f t h e I n c Q p l a s m i d s .T h e r e p e a t e d s e q u e n c e s o f t h e o r i V h a v e b e e n s h o w n t o b er e s p o n s i b l e f o r i n c o m p a t i b i l i t y a n d c o p y n u m b e r c o n t r o l i n t h eI n c Q p l a s m i d s ( 8 2 ) a n d i n c o m p a t i b i l i t y i n p T F - F C 2 ( 2 9 ) .A l t h o u g h t h e r e p e a t e d s e q u e n c e s o f t h e t w o p l a s m i d s w e r e60 % h o m o l o g o u s , n o i n c o m p a t i b i l i t y b e t w e e n t h e t w o t y p e s o fp l a s m i d w a s d e t e c t e d .T h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e r e p l i c o n s o f p T F - F C 2 a n d t h eI n c Q p l a s m i d s e x t e n d s t o t h r e e o f t h e p r o t e i n s r e q u i r e d f o rr e p l i c a t i o n . I n t h e I n c Q p l a s m i d s , t h e RepA p r o t e i n f u n c t i o n sa s a h e l i c a s e , RepB a c t s a s a n o r i V s p e c i f i c p r i m a s e , a n d RepCi s a p r o t e i n t h a t b i n d s s p e c i f i c a l l y t o t h e 2 0 - b p d i r e c t l y r e p e a t e ds e q u e n c e s o f t h e o r i V ( 4 0 ) . When t h e Rep p r o t e i n s f r o mp T F - F C 2 a n d t h e I n c Q p l a s m i d R S F 1 0 1 0 w e r e a l i g n e d , t h e r ew a s 4 3 , 2 6 , a n d 60 % a m i n o a c i d s e q u e n c e i d e n t i t y b e t w e e n t h eR e p A , R e p B , a n d RepC p o l y p e p t i d e s , r e s p e c t i v e l y ( 2 8 , 3 0 ,1 2 6 ) . A l t h o u g h t h e p e r c e n t a g e i d e n t i t y o f t h e RepB p r o t e i n sw a s l o w e r t h a n t h e o t h e r t w o , D o r r i n g t o n e t a l . ( 2 8 ) s h o w e dt h a t t h e p T F - F C 2 RepB p r o t e i n f u n c t i o n e d a s a p r i m a s e w h i c hw a s r e q u i r e d f o r t h e i n i t i a t i o n o f r e p l i c a t i o n a t t h e o r i V o fp T F - F C 2 . I n s p i t e o f t h e r e l a t e d n e s s b e t w e e n t h e R e p p r o t e i n s

- B a c t e r o l d e s & r e l a t i v e s

a r c h a e a e u c a r y aF I G . 3 . P h y l o g e n e t i c t r e e o f t h e e u b a c t e r i a b a s e d o n 1 6 S rRNAs e q u e n c e s . B r a n c h l e n g t h s a r e p r o p o r t i o n a l t o e v o l u t i o n a r y d i s t a n c e s ,w i t h s e p a r a t e b r a n c h e s s h o w n f o r t h e o t , , , - y , a n d 8 g r o u p s o fp r o t e o b a c t e r i a . R e d r a w n f r o m r e f e r e n c e 1 7 w i t h p e r m i s s i o n o f t h ep u b l i s h e r .

o f t h e t w o p l a s m i d s , a n I n c Q p l a s m i d w a s u n a b l e t o c o m p l e -m e n t r e p A , r e p B , o r r e p C m u t a n t s o f p T F - F C 2 ( 2 8 , 3 0 ) .T h e e x t e n t o f t h e h o s t r a n g e o f p T F - F C 2 h a s n o t y e t b e e nt e s t e d b e y o n d t h e g r a m - n e g a t i v e p r o t e o b a c t e r i a ( p r e v i o u s l yc a l l e d p u r p l e b a c t e r i a ) . T h e s e b a c t e r i a w e r e d i v i d e d i n t o f o u rg r o u p s , a x , P , y , a n d 8 , o n t h e b a s i s o f f e a t u r e s o f t h e i r 1 6 SRNA s e q u e n c e s ( F i g . 3 ) ( 1 5 2 ) . P l a s m i d p T F - F C 2 h a s b e e nf o u n d t o b e c a p a b l e o f r e p l i c a t i o n i n a t l e a s t o n e r e p r e s e n t a t i v eo f e a c h o f t h e f o u r g r o u p s : R h i z o b i u m m e l i l o t i , A c i d i p h i l i u mf a c i l i s ( 1 9 ) , a n d A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s o f t h e a t g r o u p ;T h i o b a c i l l u s n o v e l l u s a n d b y i m p l i c a t i o n T . f e r r o o x i d a n s o f t h ei g r o u p ; E . c o l i , S a l m o n e l l a t y p h i m u r i u m , P s e u d o m o n a s a e r u g i -n o s a , P s e u d o m o n a s p u t i d a , a n d K l e b s i e l l a p n e u m o n i a e o f t h e yg r o u p ; a n d M y x o c o c c u s x a n t h u s o f t h e 8 g r o u p ( 3 4 ) .T h e m o b i l i z a t i o n r e g i o n o f p T F - F C 2 i s l o c a t e d o n a 3 . 5 - k bDNA f r a g m e n t a n d c o n s i s t s o f a n o r i T a n d f i v e mob g e n e sa r r a n g e d i n t w o o p e r o n s o n e i t h e r s i d e o f t h e o r i T ( 1 1 9 ) . T h et w o o p e r o n s a r e d i v e r g e n t l y t r a n s c r i b e d f r o m t w o p r o m o t e r sl o c a t e d w i t h i n t h e o r i T r e g i o n , mobA a n d mobB i n o n ed i r e c t i o n a n d m o b C , m o b D , a n d mobE i n t h e o t h e r ( F i g . 2 ) .T h r e e o f t h e Mob p r o t e i n s ( M o b A , M o b C , a n d MobD) a r ee s s e n t i a l f o r m o b i l i z a t i o n w h i l e t h e r e m a i n i n g t w o ( M o b B a n dMobE) a f f e c t m o b i l i z a t i o n f r e q u e n c y . An u n e x p e c t e d f i n d i n gw a s t h a t t h e m o b i l i z a t i o n r e g i o n o f p T F - F C 2 w a s c l e a r l ya l t h o u g h s o m e w h a t d i s t a n t l y r e l a t e d t o t h e T r a I r e g i o n o f t h eb r o a d - h o s t - r a n g e c o n j u g a t i v e I n c P p l a s m i d s RP4 a n d R 7 5 1( 1 6 0 ) ( F i g . 4 ) . F o u r o f t h e Mob p r o t e i n s h a d s i g n i f i c a n t a m i n oa c i d s e q u e n c e h o m o l o g y ( 2 6 t o 3 3% i d e n t i t y ; 4 4 t o 51%s i m i l a r i t y ) t o f o u r o f t h e p r o t e i n s o f t h e T r a I r e g i o n o f t h e I n c Pp l a s m i d s . T h e a p p r o x i m a t e s i z e a n d r e l a t i v e p o s i t i o n i n g o f t h ep r o t e i n s w i t h r e s p e c t t o t h e o r i T w a s a l s o s i m i l a r .T h e r e a r e , h o w e v e r , some d i f f e r e n c e s . T h e TraM p o l y p e p -t i d e o f RP4 h a s n o d e t e c t a b l e h o m o l o g y w i t h t h e MobEp r o t e i n o f p T F - F C 2 . P l a s m i d R K 2 , w h i c h i s v e r y s i m i l a r o ri d e n t i c a l t o R P 4 , e n c o d e s a p r i m a s e ( t r a G g e n e p r o d u c t ) w h i c hi s r e q u i r e d f o r s p e c i f i c p r i m i n g a t t h e o r i T ( 1 5 3 ) . I n c o n t r a s t ,p r i m i n g o f r e p l i c a t i o n a t t h e p T F - F C 2 o r i T i n E . c o l i d i d n o tr e q u i r e a p l a s m i d - e n c o d e d p r i m a s e ( 1 2 0 ) , a n d t h i s f u n c t i o n i sp r e s u m a b l y p r o v i d e d b y t h e h o s t c e l l .T h e t h i r d d i s t i n c t r e g i o n o f p T F - F C 2 w a s a t r a n s p o s o n - l i k ee l e m e n t ( F i g . 2 ) . T h i s r e g i o n w a s b o r d e r e d b y t w o i d e n t i c a l3 8 - b p i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e s w h i c h h a d a 3 7 - o f 3 8 - b p a n d

M I C R OB I OL . R E V .


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MOLECULAR GENETICS OF T . FERROOXIDANS 4 3m o bS m o bLr- n Ip T F 1

o r i T

s t r A s t r B o r I V mobC m o bA repB E F repA repCRSF1010 r -i i I- r i**41 S u lI U

pTF-FC2

RP 4( T r a l r e g i o n )

o r i Tmo b E

ORF4 m o b E m o b D m o b C m o b B m o bA repB 3ORFsT * | 4 . 4 .. o r i T

t r a M , t r a L t r a K Z t r a.o.r-o r i T

r e pA repC 'o r i V

t r a l t r a G

t r a HF I G . 4 . C o m p a r i s o n b e t w e e n t h e m o b i l i z a t i o n a n d r e p l i c a t i o n r e g i o n s o f f o ur p l a s m i d s . R e g i o n s o f s i g n i f i c a n t s e q u e n c e s i m i l a r i t y a r e s h o w n b yb r o k e n p a r a l l e l l i n e s . T h e mob g e n e s o f t h e T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d p T F 1 h a v e c l e a r s i m i l a r i t y w i t h t h e mob g e n e s o f R S F 1 O I O , a b r o a d - h o s t - r a n g e ,m o b i l i z a b l e I n c Q p l a s m i d . T h e r e p g e n e s o f t h e T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d p T F - F C 2 h a v e s e q u e n c e s i m i l a r i t y w i t h t h e r e p g e n e s o f R S F 1 I 1 O , w h e r e a st h e m o b i l i z a t i o n r e g i o n o f p T F - F C 2 i s c l e a r l y r e l a t e d t o t h e T r a l r eg i o n o f t h e b r o a d - h o s t - r a n g e I n c P p l a s m i d R P 4 .

3 8 - o f 3 8 - b p m a t c h t o t h e l e f t - a n d r i g h t - h a n d i n v e r t e d r e p e a t so f T n 2 ] ( a m e rc u ry r e s i s t a n c e t r a n s p o s o n ) , r e s p e c t i v e l y ( 3 8 ,1 0 8 ) . W i t h i n t h e s e b o r d e r s were s e v e r a l O R F s , one w i t hs i m i l a r i t y t o t h e MerR r e g u l a t o r y p r o t e i n o f t h e m e r c u r yr e d u c t a s e o p e ro n ( 1 3 4 ) a n d a n o t h e r w i t h s i m i l a r i t y t o t h e cmlA( c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s t a n c e ) gene p r o d u c t o f T n ] 6 9 6 o f p l a s -m i d R 1 0 3 3 f r o m P . a e r u g i n o s a ( 1 1 ) . H o w e v e r , t h e s y n t h e s i s o fp o l y p e p t i d e s f r o m t h e s e ORFs b y a n E . c o l i - d e r i v e d p r o t e i ns y n t h e s i s s y s t e m c o u l d n o t b e d e t e c t e d . No e q u i v a l e n t o f t h em e rc u ry r e d u c t a s e gene, m e r A , was p r e s e n t i n t h e DNAsequence; no r d i d t h e presence o f t h e t r a n s p o s o n l i k e e l e m e n tr e s u l t i n a n i n c r e a s e i n c h l o r a m p h e n i c o l r e s i s t a n c e i n E . c o l i( 1 0 7 ) . A l s o w i t h i n t h e i n ve rt e d r e p e a t b o r d e r s were two o t h e rORFs w h i c h when t r a n s l a t e d h a d 8 8 % a m i n o a c i d i d e n t i t y t ot h e 8 5% o f N - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e T n 2 l r e s o l v a s e ( t p n R ) a n d78 % i d e n t i t y t o 15 % o f t h e C t e r m i n u s o f t h e T n 2 l t r a n s p o s a s e( 1 3 0 ) . The t r a n s p o s o n - l i k e e l e m e n t o f p T F - F C 2 i s a p p a r e n t l yd e f e c t i v e i n t r a n s p o s i t i o n a n d m e rc u ry r e s i s t a n c e b e c a u s e o fl o s s o f genes, p e r h a p s f r o m a n a n c e s t r a l Tnp+ Mer+ t r a n s p o -son. T h e r e i s s t i l l no p h e n o t y p e f o r t h e T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i dp T F - F C 2 .

C o m p a r i s o n o f P l a s m i d sI t i s c u r i o u s t h a t t h e o n l y two T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s t h a th a v e b e e n s t u d i e d i n a ny d e t a i l were i s o l a t e d f r o m s t r a i n so r i g i n a t i n g f r o m d i f f e r e n t p a r t s o f t h e w o r l d ( J a p a n a n d S o u t hA f r i c a ) , b u t b o t h h a d f e a t u r e s w h i c h r e s e m b l e d t h o s e o f t h eI n c Q p l a s m i d s . I n t h e case o f p T F 1 , t h e s i m i l a r i t y was t o t h em o b i l i z a t i o n p r o t e i n s t h a t f u n c t i o n i n c o n j u g a t i o n w h e r e a s i np T F - F C 2 t h e s i m i l a r i t y was t o t h e p r o t e i n s i n v o l v e d i n p l a s m i dDNA r e p l i c a t i o n ( F i g . 4 ) . P l a s m i d p T F - F C 2 appears t o b e a

n a t u r a l h y b r i d h a v i n g r e p l i c a t i o n f u n c t i o n s l i k e t h o s e o f t h eI n c Q p l a s m i d s a n d a m o b i l i z a t i o n r e g i o n l i k e t h o s e o f t h e I n c Pp l a s m i d s .A l t h o u g h T . f e r r o o x i d a n s p l a s m i d s r e m a i n c r y p t i c , s t u d i e sw i t h b o t h pTF1 a n d p T F - F C 2 h a v e i n d i c a t e d t h a t s e v e r a lp l a s m i d m ob a n d re p genes a re e x p r e s s e d i n E . c o l i a n d s e v e r a lo t h e r g r a m - n e g a t i v e b a c t e r i a . P l a s m i d s i s o l a t e d from T . f e r -r o o x i d a n s h a v e b e e n u s e d i n t h e c o n s t r u c t i o n o f c l o n i n g v e c t o r s( 4 6 , 1 1 2 , 1 1 4 ) a n d a t l e a s t t h r e e p l a s m i d s b a s e d on T . f e r r o o x i -

d a n s p l a s m i d s h a v e b e e n u s e d t o t r a n s f o r m a T . f e r r o o x i d a n si s o l a t e ( 7 5 , 1 3 1 ) .CLONING AND EXPRESSION O F G ENE S FROMT . FERROOXIDANS

An i m p o r t a n t a p p r o a c h t o s t u d y i n g t h e g e n e t i c s o f T .f e r r o o x i d a n s i s t o c l o n e a n d e x a m i n e t h e e x p r e s s i o n o f T .f e r r o o x i d a n s g e n e s i n o t h e r b a c t e r i a . T h e a d v a n t a g e o f c l o n i n gg e n e s f r o m a g e n e t i c a l l y u n c h a r a c t e r i z e d b a c t e r i u m i n t o w e l l -c h a r a c t e r i z e d s p e c i e s s u c h a s E . c o l i o r S a l m o n e l l a s p e c i e s i st h e a v a i l a b i l i t y o f a l a r g e v a r i e t y o f d e f i n e d m u t a n t s . T h i sp e r m i t s t h e a n a l y s i s o f g e n e f u n c t i o n a n d r e g u l a t i o n b yc o m p l e m e n t a t i o n . A d i s a d v a n t a g e t o t h i s a p p r o a c h i s t h a td e t a i l e d s t u d i e s o f c l o n e d g e n e s i n a h e t e r o l o g o u s b a c k g r o u n dmay n o t a c c u r a t e l y r e p r e s e n t t h e s i t u a t i o n i n t h e o r i g i n a lb a c t e r i u m . F u r t h e r m o r e , g e n e s w h i c h a r e n o t p r e s e n t i n b a c -t e r i a s u c h a s E . c o l i b u t w h i c h a r e i m p o r t a n t i n t h e m e t a b o l i s mo f T . f e r r o o x i d a n s c a n n o t b e s t u d i e d i n t h i s w a y . T h i s w o u l da p p l y t o g e n e s s u c h a s t h o s e i n v o l v e d i n i r o n o r s u l f u ro x i d a t i o n . S t u d i e s o f T . f e r r o o x i d a n s g e n e s i n d e f i n e d m u t a n t so f h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a h a v e n e v e r t h e l e s s c o n t r i b u t e d g r e a t l yt o o u r k n o w l e d g e o f t h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f T . f e r r o o x i d a n s .G e n e s I n v o l v e d i n N i t r o g e n M e t a b o l i s m

A l t h o u g h T f e r r o o x i d a n s i s d i a z o t r o p h i c a n d v e r y e f f i c i e n t a ts c a v e n g i n g n i t r o g e n f r o m t h e a t m o s p h e r e , t h e a v a i l a b i l i t y o fn i t r o g e n a n d t h e e n e r g y r e q u i r e d f o r i t s f i x a t i o n may l i m i tb a c t e r i a l g r o w t h a n d a d v e r s e l y a f f e c t t h e e f f i c i e n c y o f l e a c h i n go p e r a t i o n s . T h e s t u d y o f n i t r o g e n m e t a b o l i s m i n T . f e r r o o x i -d a n s i s t h e r e f o r e o f b o t h f u n d a m e n t a l a n d a p p l i e d i n t e r e s t .G l u t a m i n e s y n t h e t a s e . U n d e r c o n d i t i o n s o f n i t r o g e n l i m i t a -t i o n i n b a c t e r i a w h i c h a r e a b l e t o f i x n i t r o g e n , g l u t a m i n es y n t h e t a s e ( G S ) p l a y s a c e n t r a l r o l e a s i t c a t a l y z e s one o f t h em a i n r e a c t i o n s b y w h i c h a m m o n i a i s a s s i m i l a t e d ( 1 4 4 ) .

L - G l u t a m a t e + N H 4 + + ATP -> L - g l u t a m i n e + ADP + P iT h e GS e n z y m e a n d t h e r e g u l a t i o n o f i t s s t r u c t u r a l g e n e( g i n A ) h a v e b e e n m o s t e x t e n s i v e l y s t u d i e d i n E . c o l i a n d o t h e re n t e r i c b a c t e r i a . I n t h e s e b a c t e r i a t h e g l n A g e n e i s p a r t o f a

*I I . . . I IV O L . 5 8 , 1 9 9 4


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4 4 RAWLINGS AND KUSANOE . c o l i

g i n A P IcAMP g i n A P I

b i n d i n g s i t entrCb i n d i n g s i t e s

ginAi n i t i a t i o nterminationcodons

ginLG (ntrBC)

T . ferrooxidans

g i n A PcAMP

b i n d i n g site ntrCb i n d i n g sites

ginAi n i t i a t i o n Rho in d e p en d en t

termination terminator\codons /odons Z Z " i t r B C genes not present

F I G . 5 . C o m p a r i s o n o f t h e a r r a n g e m e n t o f c o n t r o l e l e m e n t s a n dgenes w i t h i n t h e ginA oper on o f E . c o l i a n d T . f e r r o o x i d a n s . T h eg l n A p I I ( C T G G C A C N 5 T 1 ' G C A ) t y p e p r o m o t e r a n d g l n L G ( n t r B C )genes are m i s s i n g f r o m t h e T . f e r r o o x i d a n s operon. N t r C - b i n d i n g s i t e so v e r l a p t h e g l n A p I p r o m o t e r .

c o m p l e x operon ( g l n A L G ) w h o s e t r a n s c r i p t i o n i s r e g u l a t e d b yt h e p r o d u c t s ( N R I , N R I I ) o f t h e n t r C ( g l n G ) a n d n t r B ( g l n L )genes, r e s p e c t i v e l y ( 9 1 ) . I n E . c o l i s y n t h e s i s o f t h e enzyme i su n d e r t h e c o n t r o l o f two p r o m o t e r s ( F i g . 5 ) ( 1 1 8 ) . P r o m o t e rg l n A P I i s o f t h e & 7 0 t y p e , i s r e s p o n s i b l e f o r l o w - le v el p r o d u c -t i o n o f G S , a n d i s s u b j e c t t o c a t a b o l i t e r e p r e s s i o n b y t h e c y c l i cA M P - c a t a b o l i t e a c t i v a t o r p r o t e i n ( C A P ) c o m p l e x . E x p r e s s i o nf r o m p r o m o t e r g i n A P I I i s d e p e n d e n t o n c r 4 w h i c h i s t h ep r o d u c t o f t h e n t rA ( r p o N, g i n F ) gene a n d i s r e q u i r e d f o r t h et r a n s c r i p t i o n o f p r o m o t e r s t h a t h a v e a c h a r a c t e r i s t i c - 2 4a n d -12 consensus r e c o g n i t i o n e l e m e n t (CTGGCAC-N5-T[GCA). T r a n s c r i p t i o n f r o m g i n A P I , i s r e g u l a t e d b y n i t r o g e na n d r e q u i r e s t h e p h o s p h o r y l a t e d n t r C gene p r o d u c t f o r f u l le x p r e s s i o n ( 6 1 ) .To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e g l n A gene f r o m a n a c i d o p h i l i ca u t o t r o p h was s i m i l a r t o t h o s e o f g r a m - n e g a t i v e h e t e r o t r o p h s ,t h e T . f e r r o o x i d a n s g i n A gene was c l o n e d , s e q u e n c e d a n d i t se x p r e s s i o n i n E . c o l i s t u d i e d ( 5 , 1 1 0 ) . The u p s t r e a m r e g i o n o ft h e T . f e r r o o x i d a n s gene c o n t a i n e d s e v e r a l p u t a t i v e U 7 0 _ t y p ep r o m o t e r s b u t no a 5 4 _ t y p e p r o m o t e r was i d e n t i f i e d . Theu p s t r e a m r e g i o n a l s o h a d a sequence r e s e m b l i n g t h e CAP-b i n d i n g consensus sequence a n d a t l e a s t two N t r C - b i n d i n gs i t e s t h a t o v e r l a p w i t h t h e g l n A P I p r o m o t e r . L i k e E . c o l i , t h e T .f e r r o o x i d a n s g l n A gene was f o l l o w e d b y a R h o - i n d e p e n d e n tt e r m i n a t o r . The T . f e r r o o x i d a n s GS was a b l e t o c o m p l e m e n t E .c o l i GS d e l e t i o n m u t a n t s a n d t h e p r o d u c t i o n o f t h e T . f e r r o o x i -d a n s GS wa s r e g u l a t e d b y n i t r o g e n l e v e l s i n E . c o l i ( 6 ) . The T .f e r r o o x i d a n s GS wa s a l s o r e g u l a t e d a t t h e p r o t e i n l e v e l b y a na d e n y l y l a t i o n m e c h a n i s m s i m i l a r t o t h a t o f t h e f a m i l y E n -t e r o b a c t e r i a c e a e .I n c o n t r a s t t o t h e e n t e r i c b a c t e r i a , t h e T . f e r r o o x i d a n s g l n Agene was n o t l i n k e d t o t h e e q u i v a l e n t o f t h e n t r B C genes. T h en u c l e o t i d e sequence o f t h e gene i m m e d i a t e l y d o w n s t r e a m h a sb e e n d e t e r m i n e d ( 6 6 ) , a n d t h e T . f e r r o o x i d a n s n t r B C genesh a v e b e e n c l o n e d ( s e e b e l o w ) . B o t h s t u d i e s h a v e c o n f i r m e dt h a t i n t h e case o f T . f e r r o o x i d a n s t h e g l n A genes a n d t h e n t r B Cgenes are u n l i n k e d .N i t r o g e n a s e . N i t r o g e n - f i x i n g b a c t e r i a possess a n i t r o g e n a s eenzyme w h i c h c a t a l y z e s t h e r e d u c t i o n o f a t m o s p h e r i c n i t r o g e nt o a m m o n i a . M a c k i n t o s h ( 8 5 ) was t h e f i r s t t o r e p o r t t h a t T .f e r r o o x i d a n s wa s a b l e t o f i x n i t r o g e n b y d e m o n s t r a t i n g t h e

i n c o r p o r a t i o n o f ` 5 N 2 l a b e l i n t o c e l l u l a r m a t e r i a l . U s i n g t h e Kp n e u m o n i a e n i t r o g e n a s e s t r u c t u r a l g e n e s ( n i f H D K ) a s a p r o b e ,P r e t o r i u s e t a l . ( 9 8 ) r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f n i f g e n e s i n f i v ed i f f e r e n t T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s . T h e n i f H D K g e n e s f r o m T .f e r r o o x i d a n s ATCC 3 3 0 2 0 w e r e c l o n e d a n d s e q u e n c e d ( 9 7 , 9 8 ,1 0 5 ) . T h e r e a r e t w o c l e a r l y i d e n t i f i a b l e s e q u e n c e s u p s t r e a m o ft h e n i f H g e n e w h i c h a r e e s s e n t i a l f o r t h e c o n t r o l o f g e n ee x p r e s s i o n ( 9 7 ) . T h e s e a r e a u 5 4 - d e p e n d e n t p r o m o t e r a n d ab i n d i n g s i t e f o r t h e N i f A a c t i v a t o r a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 b pu p s t r e a m f r o m t h e t r a n s l a t i o n s t a r t . I n a d d i t i o n , i n t e g r a t i o nh o s t f a c t o r h a s b e e n s h o w n t o b i n d t o t h e DNA s e q u e n c eb e t w e e n t h e " 5 4 - d e p e n d e n t p r o m o t e r a n d t h e N i f A - b i n d i n gs i t e , t h e r e b y i n d u c i n g DNA b e n d i n g ( 4 9 ) . T h i s b e n d i n g i st h o u g h t t o b r i n g t h e N i f A e n h a n c e r i n t o c o n t a c t w i t h t h e RNAp o l y m e r a s e a t t h e r 5 4 p r o m o t e r . E x a m i n a t i o n o f t h e T . f e r -r o o x i d a n s p r o m o t e r r e g i o n r e v e a l e d a u 5 4 - d e p e n d e n t p r o m o t e ra n d a p a i r o f t a n d e m c o n s e n s u s N i f A - b i n d i n g s i t e s u p s t r e a mf r o m t h e s t a r t o f t h e n i f H g e n e . H o o v e r e t a l . ( 4 9 ) d e m o n -s t r a t e d t h a t E . c o l i i n t e g r a t i o n h o s t f a c t o r w a s a b l e t o b i n d t ot h e T . f e r r o o x i d a n s n i f H p r o m o t e r r e g i o n . T h e T . f e r r o o x i d a n sn i f H p r o m o t e r w a s t h e r e f o r e v e r y s i m i l a r t o t h e n i f H p r o m o t e r sc o m m o n l y f o u n d i n t y p i c a l h e t e r o t r o p h i c b a c t e r i a .T h e n i f H D K g e n e s a n d t h e n i f H g e n e i n p a r t i c u l a r h a v e b e e ns e q u e n c e d f r o m a l a r g e n u m b e r o f n i t r o g e n - f i x i n g b a c t e r i a . Ana l i g n m e n t a n d c o m p a r i s o n o f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h en i f H D K g e n e p r o d u c t s w i t h t h o s e f r o m o t h e r b a c t e r i a h a si n d i c a t e d t h a t t h e n i t r o g e n a s e o f T . f e r r o o x i d a n s i s m o s t c l o s e l yr e l a t e d t o i s o l a t e s o f t h e g e n u s B r a d y r h i z o b i u m ( 1 0 6 , 1 5 8 ) . T h i si s i n t e r e s t i n g a s 1 6 S rRNA s e q u e n c i n g d a t a c l e a r l y p l a c e s T .f e r r o o x i d a n s i n t o t h e 3 - g r o u p o f p r o t e o b a c t e r i a w h e r e a s t h eb r a d y r h i z o b i a a r e m e m b e r s o f t h e a - g r o u p .An i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f T . f e r r o o x i d a n s p h y s i o l o g y i s t h a tw h e n t h e b a c t e r i u m o b t a i n s i t s e n e r g y b y t h e o x i d a t i o n o ff e r r o u s i r o n , o x y g e n i s t h e f i n a l e l e c t r o n a c c e p t o r a n d t h eo r g a n i s m i s a n o b l i g a t e a e r o b e . N i t r o g e n a s e e n z y m e s a r e ,h o w e v e r , o x y g e n l a b i l e , a n d c e l l s h a v e e l a b o r a t e s y s t e m s t op r o t e c t t h e i r n i t r o g e n a s e f r o m o x y g e n ( 9 6 ) . When M a c k i n t o s h( 8 5 ) d e m o n s t r a t e d n i t r o g e n f i x a t i o n b y T . f e r r o o x i d a n s , s h eu s e d f e r r o u s i r o n a s a n e n e r g y s o u r c e a n d f o u n d t h a t t h e s u p p l yo f o x y g e n w a s c r i t i c a l . O x y g e n h a d t o b e p r o v i d e d i n l i m i t e dq u a n t i t i e s , s u f f i c i e n t t o a l l o w e n o u g h i r o n o x i d a t i o n t o p r o v i d et h e e n e r g y f o r N 2 f i x a t i o n b u t i n s u f f i c i e n t t o i n h i b i t n i t r o g e n a s ea c t i v i t y . An u n d e r s t a n d i n g o f ho w T . f e r r o o x i d a n s i s a b l e t or e s o l v e t h e r e q u i r e m e n t o f o x y g e n f o r e n e r g y g e n e r a t i o n , b u ti t s a b s e n c e f o r N 2 f i x a t i o n h a s s t i l l t o b e e l u c i d a t e d . F e r r i c i r o nh a s b e e n s h o w n t o a c t a s a n e l e c t r o n a c c e p t o r d u r i n g t h eo x i d a t i o n o f r e d u c e d - s u l f u r c o m p o u n d s a n d i n t h e a b s e n c e o fo x y g e n ( 1 3 7 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t N 2 f i x a t i o n o c c u r s d u r i n gs u l f u r - f e r r i c i r o n r e s p i r a t i o n , b u t t h i s h a s n o t y e t b e e n t e s t e d .n t r A s i g m a f a c t o r . A t t e m p t s t o c l o n e t h e T . f e r r o o x i d a n s n t r Ag e n e b y t h e c o n v e n t i o n a l m e t h o d w h i c h i n v o l v e s t h e c o m p l e -m e n t a t i o n o f E . c o l i n t r A m u t a n t s f o r t h e a b i l i t y t o g r o w o nm i n i m a l m e d i u m p l u s a r g i n i n e ( 1 4 1 ) f a i l e d . B e r g e r e t a l . ( 9 )d e v i s e d a c l o n i n g s t r a t e g y b a s e d o n t h e ( 5 4 - d e p e n d e n t e x p r e s -s i o n o f t h e f o r m a t e - h y d r o g e n - l y a s e p a t h w a y ( 1 0 ) . T h i s f e r m e n -t a t i v e p a t h w a y r e s u l t s i n t h e e v o l u t i o n o f H2 a n d CO2 f r o mf o r m a t e a n d E . c o l i n t r A m u t a n t s a r e u n a b l e t o p r o d u c e g a s . Ac o s m i d g e n e b a n k w a s t r a n s f o r m e d i n t o a n E . c o l i n t r A m u t a n t ,a n d t h e t r a n s f o r m a n t s w e r e e x a m i n e d f o r t h e a b i l i t y t o p r o d u c eg a s b y u s i n g a n a g a r o v e r l a y t e c h n i q u e ( 9 ) . T h i s p r o c e d u r er e s u l t e d i n t h e c l o n i n g o f t h e T . f e r r o o x i d a n s n t r A g e n e .S e q u e n c i n g d a t a s h o w e d t h a t t h e T . f e r r o o x i d a n s n t r A g e n eh a d 4 9 a n d 50% a m i n o a c i d i d e n t i t y t o t h e c 5 4 o f K p n e u -m o n i a e a n d R . m e l i l o t i , r e s p e c t i v e l y ( 9 ) . An ORF ( O R F 1 ) f o ra p r o t e i n 2 4 1 a m i n o a c i d s w a s s i t u a t e d 1 2 b p u p s t r e a m o f t h eT . f e r r o o x i d a n s n t r A g e n e . T h i s p r o t e i n s h o w e d 55% a m i n o a c i d

M I C R O B I O L . R E V .


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MOLECULAR GENETICS OF T . FERROOXIDANS 4 5s e q u e n c e i d e n t i t y t o a n e q u i v a l e n t p r o t e i n l o c a t e d i m m e d i a t e l yu p s t r e a m o f t h e n t r A g e n e o f R . m e l i l o t i ( 1 ) . T h e l i n k a g e o fO R F 1 t o n t r A h a s a l s o b e e n r e p o r t e d f o r K p n e u m o n i a e a n d S .t y p h i m u r i u m a n d t h e r e f o r e a p p e a r s t o b e a s t r u c t u r a l f e a t u r eo f t h e n t r A l o c u s o f b a c t e r i a o f v e r y d i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a lt y p e s . A l t h o u g h O R F 1 h a s a c l e a r l y d i s c e r n i b l e A T P - b i n d i n gs i t e , t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f ORF1 a n d t h e reason f o r i t sl i n k a g e t o n t r A are u n k n o w n .A l a c Z r e p o r t e r g e n e f u s e d t o s e v e r a l C r 5 4 - d e p e n d e n t p r o -m o t e r s wa s u s e d t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e c l o n e d T . f e r r o o x i d a n sn t r A g e n e p r o d u c t wa s a b l e t o p r o m o t e c 5 4 - d e p e n d e n t t r a n -s c r i p t i o n i n E . c o l i n t r A m u t a n t s . C o m p l e m e n t a t i o n wa s h o w -ever p a r t i a l a n d i n s u f f i c i e n t t o p e r m i t g r o w t h o f an E . c o l i n t r Am u t a n t o n m i n i m a l m e d i u m p l u s a r g i n i n e .n t r B C g e n e s . T h e n t r B C g e n e s f r o m s e v e r a l b a c t e r i a s u c h a sA z o t o b a c t e r v i n e l a n d i i h a v e b e e n c l o n e d b y t h e s i m p l e t e c h -n i q u e o f t r a n s f o r m i n g a g e n e b a n k i n t o an E . c o l i n t r C m u t a n tf o l l o w e d b y s e l e c t i o n f o r g r o w t h on m i n i m a l m e d i u m p l u sa r g i n i n e ( 1 4 1 ) . An a t t e m p t t o us e t h i s t e c h n i q u e t o c l o n e t h e T .f e r r o o x i d a n s n t r B C g e n e s wa s n o t s u c c e s s f u l . A T . f e r r o o x i d a n sn i f H g e n e f u s e d t o a l a c Z r e p o r t e r g e n e a n d w h i c h wa s s h o w nt o b e a c t i v a t e d i n t h e p r e s e n c e o f a n t r C g e n e wa s u s e d i n s t e a d( 6 6 ) . S e v e r a l p l a s m i d c l o n e s were i s o l a t e d w h i c h i n c r e a s e de x p r e s s i o n o f t h e n i f H - l a c Z r e p o r t e r f u s i o n . N u c l e o t i d e s e -q u e n c i n g c o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f t h e n t r B C g e n e s . G e n e st h a t a re n o r m a l l y s u b j e c t t o r e g u l a t i o n b y N t r B a n d N t r C werea l s o r e g u l a t e d b y t h e c l o n e d T . f e r r o o x i d a n s n t r B C g e n ep r o d u c t s i n E . c o l i .

G e n e s I n v o l v e d i n F i x a t i o n o f C a r b o n D i o x i d eT . f e r r o o x i d a n s o b t a i n s i t s c e l l u l a r c a r b o n b y t h e f i x a t i o n o fc a r b o n d i o x i d e v i a t h e C a l v i n c y c l e . T h e k e y e n z y m e i n t h i sc y c l e i s D - r i b u l o s e - 1 , 5 - b i p h o s p h a t e c a r b o x y l a s e ( R u B P C a s e ) .T h e R u B P C a s e f r o m T . f e r r o o x i d a n s h a s b e e n r e p o r t e d t o b e o ft h e f o r m I t y p e , a h e x a d e c a m e r c o m p o s e d o f e i g h t l a r g es u b u n i t s ( L S U ) a n d e i g h t s m a l l s u b u n i t s ( S S U ) s i m i l a r t o t h o s eo f h i g h e r p l a n t s a n d most p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i a ( 4 8 ) . T h ea p p a r e n t Km v a l u e s f o r t h e e n z y m e p r e p a r e d f r o m T . f e r r o o x i -d a n s T o r m a wa s s i m i l a r t o t h o s e f r o m p l a n t s a n d a l g a e b u tf o u r - t o f i v e f o l d l o w e r t h a n t h o s e o f most o t h e r b a c t e r i a .R e c e n t l y , S h i v e l y e t a l . ( 1 3 3 ) p r o b e d t h e c h r o m o s o m e o f s i x T .f e r r o o x i d a n s i s o l a t e s w i t h p r o b e s d e r i v e d f r o m A n a c y s t i s n i d u -l a n s r b p c L g e n e f o r t h e f o r m I e n z y m e a n d a p a r t o f t h eR h o d o s p i r i l l u m r u b r u m r b p L g e n e f o r t h e f o r m I I e n z y m e .H y b r i d i z a t i o n s i g n a l s f r o m r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o f d i f f e r e n ts i z e s were o b t a i n e d f o r b o t h p r o b e s a n d T . f e r r o o x i d a n s mayt h e r e f o r e p o s s e s s b o t h f o r m I a n d f o r m I I t y p e s o f R u B P C a s e .K u s a n o e t a l . ( 7 3 ) i s o l a t e d t h e T f e r r o o x i d a n s r b c L - r b c Sg e n e s b y u s i n g a h y b r i d i z a t i o n p r o b e f r o m C h r o m a t i u m v i n o -sum . T h e c l o n e d T . f e r r o o x i d a n s g e n e s were n o t e x p r e s s e d i n E .c o l i u n l e s s p l a c e d u n d e r t h e c o n t r o l o f a s t r o n g t a c p r o m o t e r .T h i s r e s u l t e d i n t h e s y n t h e s i s i n E . c o l i o f a n e n z y m e w i t hr i b u l o s e b i p h o s p h a t e - d e p e n d e n t C 0 2 - f i x i n g a c t i v i t y w h i c h h a da h e x a d e c a m e r i c f o r m l i k e t h a t o f t h e n a t i v e T . f e r r o o x i d a n sR u B P C a s e . T h e n e w l y c l o n e d T . f e r r o o x i d a n s r b c L - r b c S g e n e swere u s e d t o i d e n t i f y a n d c l o n e a s e c o n d s e t ( r b c L 2 - r b c S 2 ) o fR u B P C a s e g e n e s f r o m t h e same T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n . B o t hs e t s o f g e n e s were s e q u e n c e d ( 7 5 ) a n d f o u n d t o b e a b s o l u t e l yi d e n t i c a l . T h e p e r f e c t n u c l e o t i d e s e q u e n c e c o n s e r v a t i o n e x -t e n d e d f r o m n u c l e o t i d e - 1 6 4 , t h r o u g h t h e c o d i n g a n d i n t e r -g e n i c r e g i o n s o f b o t h s u b u n i t s a n d u p t o 9 0 b p p a s t t h et e r m i n a t i o n c o d o n , a t o t a l o f 2 . 0 k b . T h e DNA s e q u e n c e sf u r t h e r u p - or d o w n s t r e a m were s u b s t a n t i a l l y d i f f e r e n t . N o r t h -ern ( R N A ) b l o t a n d p r i m e r e x t e n s i o n e x p e r i m e n t s w i t h mRNAi s o l a t e d f r o m T f e r r o o x i d a n s i n d i c a t e d t h a t t h e r b c L l - r b c S l

a n d / o r r b c L 2 - rb c S 2 g e n e s w e r e c o t r a n s c r i b e d a l t h o u g h nor e g i o n w i t h a l l t h e e l e m e n t s a n d s p a c i n g o f a ( u 7 0 - t y p e c o n s e n -s u s p r o m o t e r c o u l d b e i d e n t i f i e d . Amino a c i d s e q u e n c e a l i g n -m e n t w i t h p r e v i o u s l y s e q u e n c e d LSU a n d SSU f r o m o t h e rb a c t e r i a s h o w e d t h a t t h e T . f e r r o o x i d a n s RuBPCase w a s muchm o r e c l o s e l y r e l a t e d t o t h e RuBPCase o f t h e p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m C . v i n o s u m ( L S U , 8 5 . 5 % i d e n t i t y ; S S U , 5 9 . 8 %i d e n t i t y ) t h a n t o t h e e n z y m e f r o m a n y o t h e r p h o t o s y n t h e t i cb a c t e r i u m , n o n p h o t o s y n t h e t i c a u t o t r o p h , a l g a , o r p l a n t . Ther b c L a n d r b c S g e n e s h a v e b e e n c l o n e d a n d s e q u e n c e d f r o m ad i f f e r e n t s t r a i n o f T . f e r r o o x i d a n s i s o l a t e d i n C h i l e ( 1 0 1 ) . I na d d i t i o n , p a r t o f t h e LSU o f a t h i r d T . f e r r o o x i d a n s i s o l a t e wa sc l o n e d a n d s e q u e n c e d b y PCR ( 4 3 ) . A l l t h e d a t a i n d i c a t e d t h a tt h e T . f e r r o o x i d a n s r b c g e n e s h a v e a c l o s e r p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p t o t h e p h o t o s y n t h e t i c b a c t e r i u m C . v i n o s u m t h a nt o t h e c h e m o a u t o t r o p h i c b a c t e r i u m A l c a l i g e n e s e u t r o p h u s .R e c e n t l y , a r e g u l a t o r y g e n e , r b c R , w a s f o u n d u p s t r e a m o f t h er b c L l g e n e ( 7 2 ) . T h e g e n e e n c o d e s a p ro t e i n o f 3 0 9 a m i n oa c i d s a n d i s t r a n s l a t e d d i v e r g e n t l y w i t h r e s p e c t t o r b c L l . G e lm o b i l i t y s h i f t a s s a y s , DNA f o o t p r i n t i n g , a n d s i t e - d i r e c t e dm u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t T . f e r r o o x i d a n s R b c R ,p r o d u c e d i n E . c o l i , b i n d s s p e c i f i c a l l y t o o v e r l a p p i n g p r o m o t e re l e m e n t s o f t h e r b c R a n d r b c L l g e n e s . The RbcR p r o t e i n i st h o u g h t t o b e a member o f t h e L y s R f a m i l y o f p o s i t i v et r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r s ( 4 2 ) .

r e c A G e n eT h e RecA p r o t e i n o f E . c o l i p l a y s a n e s s e n t i a l r o l e i n t h ei n d u c t i o n o f DNA r e p a i r ( t h e SOS r e s p o n s e ) f o l l o w i n g d a m -a g e b y UV o r c h e m i c a l a g e n t s ( 1 4 9 ) . I t i s a l s o r e q u i r e d f o rh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n , d u r i n g w h i c h i t i s a b l e t o f a c i l i t a t et h e A T P - d e p e n d e n t a s s i m i l a t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d DNA i n t oh o m o l o g o u s d o u b l e - s t r a n d e d DNA a s w e l l a s t h e p a i r i n g a n de x c h a n g e o f d u p l e x DNA. T h e RecA p r o t e i n i s t h e p r o d u c t o ft h e r e c A g e n e , w h i c h i s s u b j e c t t o n e g a t i v e c o n t r o l b y t h e l e x Ag e n e p r o d u c t . G e n e s t h a t a r e r e p r e s s e d b y LexA h a v e c l e a r l yi d e n t i f i a b l e p r o m o t e r s e q u e n c e s ( 1 4 9 ) .T h e r e c A g e n e f r o m T . f e r r o o x i d a n s h a s b e e n i s o l a t e d a n ds e q u e n c e d , a n d i t s a b i l i t y t o c a r r y o u t R e c A - a s s o c i a t e d a c t i v i -t i e s i n E . c o l i h a s b e e n s t u d i e d ( 1 0 3 , 1 0 4 ) . T . f e r r o o x i d a n s RecAwa s a b l e t o c o m p l e m e n t d e f e c t s i n DNA r e p a i r a n d g e n e t i cr e c o m b i n a t i o n i n a n E . c o l i s t r a i n f r o m w h i c h t h e r e c A g e n eh a d b e e n d e l e t e d . A l t h o u g h some RecA f u n c t i o n s w e r e r e -s t o r e d t o o n l y 15% o f t h e a c t i v i t y i n t h e w i l d - t y p e E . c o l i p a r e n ts t r a i n , t h e T . f e r r o o x i d a n s RecA p r o t e i n e x h i b i t e d b o t h DNAr e p a i r - a s s o c i a t e d a n d r e c o m b i n a t i o n a c t i v i t i e s . T h i s i n c l u d e dt h e i n d u c t i o n o f p h a g e X f e c m u t a n t s a n d t h e i n d u c t i o n o f t h er e c A g e n e o f t h e E . c o l i H B 1 0 1 r e c A m u t a n t s t r a i n . I n t h eH B 1 0 1 m u t a n t t h e r e c A g e n e i s n o t s u b j e c t t o n o r m a l i n d u c t i o nb y DNA d a m a g e ; h o w e v e r , i n t h e p r e s e n c e o f t h e T . f e r r o o x i -d a n s r e c A g e n e , i n d u c t i o n o f t h e d e f e c t i v e E . c o l i r e c A g e n ef o l l o w i n g DNA d a m a g e wa s r e s t o r e d ( 1 0 3 ) . T h e c l o n e d T .f e r r o o x i d a n s r e c A g e n e wa s e x p r e s s e d i n E . c o l i o n l y f r o m av e c t o r p r o m o t e r . No s e q u e n c e s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e L e x A -b i n d i n g s i t e c o u l d b e i d e n t i f i e d u p s t r e a m o f t h e T . f e r r o o x i d a n sr e c A c o d i n g s e q u e n c e . T h i s i n d i c a t e d t h a t e i t h e r a d i f f e r e n tt y p e o f p r o m o t e r s e q u e n c e must b e p r e s e n t o r , u n l i k e E . c o l i o rP . a e r u g i n o s a , t h e T f e r r o o x i d a n s g e n e i s n o t t h e f i r s t g e n e o f at r a n s c r i p t i o n a l u n i t . T h e c l o n i n g o f t h e T . f e r r o o x i d a n s r e c Ag e n e s h o u l d f a c i l i t a t e t h e c o n s t r u c t i o n o f m u t a n t s v i a m a r k e re x c h a n g e . No a t t e m p t s t o c o n s t r u c t m u t a n t s o f t h i s t y p e h a v ey e t b e e n m a d e . R e c e n t l y , p a r t i a l s e q u e n c i n g o f t h e r e g i o nd o w n s t r e a m o f t h e T . f e r r o o x i d a n s r e c A g e n e h a s r e v e a l e d ar e g i o n w i t h s e q u e n c e h o m o l o g y t o t h e g e n e f o r a l a n y l - t R N As y n t h e t a s e , a l a S ( 3 9 ) . T h i s l i n k a g e b e t w e e n t h e T . f e r r o o x i d a n s

V O L . 5 8 , 1 9 9 4


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4 6 RAWLINGS AND KUSANOr e c A a n d a la S g e n e s i s s i m i l a r t o t h a t i n E . c o l i , R m e l i l o t i , a n dR h i z o b i u m l e g u m i n o s a r u m .

I e u B G e n eT h e T . f e r r o o x i d a n s l e u B g e n e , w h i c h e n c o d e s t h e 3 - i s o p r o -

p y l m a l a t e d e h y d r o g e n a s e e n z y m e o f t h e l e u c i n e b i o s y n t h e s i sp a t h w a y , w a s c l o n e d b y c o m p l e m e n t a t i o n o f a n E . c o l i l e u Bm u t a n t ( 5 0 ) . E x p r e s s i o n o f l e u B i n E . c o l i a p p e a r e d t o b e f r o ma T . f e r r o o x i d a n s p r o m o t e r a n d w a s r e p r e s s e d b y l e u c i n e . T h eg e n e w a s s e q u e n c e d a n d h a s a p p r o x i m a t e l y 50% a m i n o a c i ds e q u e n c e i d e n t i t y w i t h b a c t e r i a a s d i v e r s e a s S . t y p h i m u r i u m ,B a c i l l u s s u b t i l i s , T h e r m u s a q u a t i c u s , a n d L a c t o c o c c u s l a c t i s , a sw e l l a s t o t h e y e a s t s C a n d i d a u t i l i s a n d S a c c h a r o m y c e s c e r e v i -s i a e ( 6 0 ) . T h e e n z y m e w a s p u r i f i e d a n d h a s c h a r a c t e r i s t i c ss i m i l a r t o t h e e q u i v a l e n t e n z y m e f r o m S . t y p h i m u r i u m a n dT h e r m u s a q u a t i c u s , e x c e p t t h a t i t h a s a b r o a d e r s u b s t r a t es p e c i f i c i t y a n d w a s a b l e t o u t i l i z e D - m a l a t e a n d L - m a l a t e i na d d i t i o n t o 3 - i s o p r o p y l m a l a t e ( 6 0 ) .G e n e s A s s o c i a t e d w i t h R e s i s t a n c e t o M e r c u r y

M e r c u r y i s h i g h l y t o x i c t o most s t r a i n s o f T f e r r o o x i d a n s , a n di t s presence i n ore d e p o s i t s may i n h i b i t c o m m e r c i a l l e a c h i n go p e r a t i o n s . C i n n a b a r ( H g S ) i s t h e m a j o r m e r c u r y - b e a r i n gm i n e r a l i n n a t u r e , a n d t h e presence o f c i n n a b a r h a s b e e ns h o w n t o i n h i b i t p y r i t e o x i d a t i o n b y m e r c u r y - s e n s i t i v e T .f e r r o o x i d a n s s t r a i n s b u t n o t b y a m e r c u r y - r e s i s t a n t s t r a i n ( 4 ) .M e r c u r y r e s i s t a n c e i s t h e r e f o r e i m p o r t a n t i n some b i o l e a c h i n gp r o c e s s e s .T h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f t h e b a c t e r i a l mercury r e s i s t a n c es y s t e m h a s r e c e n t l y b e e n r e v i e w e d ( 1 3 4 ) . I n g e n e r a l t h er e s i s t a n c e m e c h a n i s m i s b a s e d o n t h e r e d u c t i o n o f m e r cu r i c( H g 2 + ) i o n s t o v o l a t i l e e l e m e n t a l mercury ( H g o ) . T h i s i sc a r r i e d o u t b y a mercury r e d u c t a s e enzyme, w h i c h i s t h ep r o d u c t o f t h e merA gene. A l s o i n v o l v e d a re t w o or t h r e e o t h e rgenes ( m e r T , m e r P , a n d m e r C ) , w h o s e p r o d u c t s are i n v o l v e d i nmercury t r a n s p o r t , a n d a r e g u l a t o r y gene ( m e r R ) , w h o s ep r o d u c t b i n d s m er c ury a n d a c t s b o t h as a r e p r e s s o r ( i n t h ea b s e n c e o f H g 2 + ) or a n i n d u c e r ( i n t h e presence o f H g 2 + ) .T h e presence o f mercury r e d u c t a s e a c t i v i t y i n c e l l e x t r a c t s o fa m e r c u r y - v o l a t i l i z i n g s t r a i n o f T . f e r r o o x i d a n s wa s f i r s t d e m -o n s t r a t e d b y O l s e n e t a l . ( 9 4 ) . I n a f o l l o w - u p s t u d y , t h e enzymef r o m T . f e r r o o x i d a n s was p u r i f i e d a n d s h o w n t o b e s i m i l a r i ns t r u c t u r e a n d f u n c t i o n t o t h e m e r c u r i c r e d u c t a s e i s o l a t e d f r o mo t h e r b a c t e r i a l sources ( 1 4 ) . S h i r a t o r i e t a l . ( 1 3 2 ) r e p o r t e d t h a t5 o f 1 0 T f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i s o l a t e d i n J a p a n were r e s i s t a n tt o more t h a n 0 . 5 p L g o f m e r c u r i c c h l o r i d e per m l . ChromosomalDNA f r o m t h r e e o f t h e s e r e s i s t a n t s t r a i n s h y b r i d i z e d t o ap r o b e p r e p a r e d f r o m t h e T n 5 0 1 mer genes. T h i s p r o b e wa su s e d t o i s o l a t e a p l a s m i d c l o n e t h a t e n c o d e d p r o t e i n s o f 5 6 a n d1 6 k D a . T h e 5 6 - k D a p r o t e i n wa s f o u n d t o h a v e 7 8 a n d 77%sequence i d e n t i t y w i t h mercury r e d u ct a s e o f T n 5 0 1 a n d R 1 0 0( 5 5 ) , w h e r e a s t h e 1 6 - k D a p r o t e i n wa s s h o w n t o f u n c t i o n a s amercury t r a n s p o r t p r o t e i n , M e r C , a n d h a d 55% sequencei d e n t i t y t o t h e merC gene p r o d u c t o f R 1 0 0 ( 7 1 ) . A l t h o u g h t h ec l o n e d T . f e r r o o x i d a n s merC a n d merA genes were s y n t h e s i z e dc o n s t i t u t i v e l y i n E . c o l i , p r i m e r e x t e n s i o n a n a l y s i s w i t h mRNAi s o l a t e d f r o m T . f e r r o o x i d a n s i n d i c a t e d t h a t t h e two genes werec o t r a n s c r i b e d as a n i n d u c i b l e operon i n t h e i r n a t u r a l h o s t ( 5 3 ) .A merR r e g u l a t o r y gene wa s n o t p h y s i c a l l y l i n k e d t o t h e merCa n d m e r A genes as i s t y p i c a l f o r o t h e r mercury r e s i s t a n c es y s t e m s . I n s t e a d , two d i s t i n c t m e r R genes were f o u n d moret h a n 6 k b d i s t a n t f r o m t h e m e r C - m e r A operon ( 5 4 ) . The twomerR genes were more t h a n 3 k b a p a r t a n d were s e p a r a t e d b yf i v e p o t e n t i a l O R F s . Two o f t h e s e ORFs were i d e n t i f i e d asf u n c t i o n a l merC g e n e s , t w o o t h er s a p p e a r e d t o b e t r u n c a t e d

merR2 P 2 m e r C 2 A m e r A 2 A t n s A A m e r A l m e r C i I P n m e r R II

i3URF-P 3 m er C m er AI UF I G . 6 . A r r a n g e m e n t o f t h e m er g e n e s on t h e c h r o m o s o m e o f T .f e r r o o x i d a n s E - 1 5 . F u n c t i o n a l m e r C ( t r a n s p o r t ) a n d m e r A ( m e r c u r yr e d u c t a s e ) g e n e s a r e t r a n s c r i b e d f r o m P 3 a n d a r e n o t l i n k e d t o a m e r R( r e g u l a t o r ) g e n e . Two r e g u l a t o r g e n e s , m e r R I a n d m e r R 2 , a r e l o c a t e di n s e p a r a t e o p e r o n s a n d a r e t r a n s c r i b e d i n T . f e r r o o x i d a n s f r o mp r o m o t e r s P l a n d P 2 . A g e n e d u p l i c a t i o n a p p e a r s t o h a v e o c c u r r e ds u c h t h a t a t r u n c a t e d , n o n f u n c t i o n a l Tn7 t n s A 4 ( t r a n s p o s a s e ) g e n e i ss a n d w i c h e d b e t w e e n t w o t r u n c a t e d , i n a c t i v e m e r A g e n e s w h i c h a r ef l a n k e d b y m e r C l a n d m e r C 2 g e n e s w h i c h a r e f u n c t i o n a l i n E . c o l i .

m e r A g e n e s , a n d t h e f i f t h h a d 59% i d e n t i t y t o 9 8 a m i n o a c i d so f t h e N t e r m i n u s o f t h e t r a n s p o s o n Tn7 t r a n s p o s a s e . T h eg e n e s w e r e a r r a n g e d w i t h a t w o f o l d a x i s o f s y m m e t r y s u c h t h a tt h e t r u n c a t e d Tn7 t r a n s p o s a s e w a s i n t h e c e n t e r b o r d e r e d o ne i t h e r s i d e b y a t r u n c a t e d m e r A g e n e , a m e r C g e n e , a n d a m e r Rg e n e ( F i g . 6 ) . B o t h m e r R g e n e s w e r e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e i nT . f e r r o o x i d a n s , a n d t h e t w o m e r C g e n e s b o t h a p p e a r e d t o b ef u n c t i o n a l i n E . c o l i .T h e g e n e s a s s o c i a t e d w i t h m e r c u r y r e s i s t a n c e o f T f e r r o o x i -d a n s E - 1 5 t h e r e f o r e d i f f e r f r o m t h o s e o f o t h e r b a c t e r i a i ns e v e r a l i m p o r t a n t r e s p e c t s . T h e g e n e s a r e l o c a t e d o n t h ec h r o m o s o m e r a t h e r t h a n o n a p l a s m i d , a n d t h e o p e r o n s t r u c -t u r e i s v e r y d i f f e r e n t . A c l u e t o t h e d u p l i c a t i o n o f t h e d i s l o c a t e dm e r R a n d m e r C g e n e s m a y b e p r o v i d e d b y t h e t r u n c a t e d ORFt h a t h a s h o m o l o g y t o a T n 7 - l i k e t r a n s p o s a s e ( 5 4 ) . T h e m e r c u r yr e s i s t a n c e g e n e s m a y h a v e b e c o m e i n s e r t e d i n t o t h e c h r o m o -s o m e a s t h e r e s u l t o f a m u l t i p l e t r a n s p o s i t i o n e v e n t . E v i d e n c ei n s u p p o r t o f t h i s i s t h a t t h e c o d o n u s a g e p a t t e r n f o r t h ef u n c t i o n a l m e r A g e n e i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e m e r c u r y r e s i s -t a n c e t r a n s p o s o n T n S 0 1 a n d p l a s m i d R 1 0 0 b u t s u b s t a n t i a l l yd i f f e r e n t f r o m o t h e r T . f e r r o o x i d a n s c h r o m o s o m a l g e n e s ( 5 5 ,1 1 7 ) . T h e a r r a n g e m e n t o f t h e m e r c u r y r e s i s t a n c e g e n e s i no t h e r T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n s i s u n k n o w n .I t i s i n t e r e s t i n g t h a t a n o t h e r m e r R g e n e w a s i d e n t i f i e d o n t h eb r o a d - h o s t - r a n g e p l a s m i d p T F - F C 2 i s o l a t e d i n S o u t h A f r i c a .T h i s p l a s m i d d o e s n o t h a v e a n y o t h e r m e r g e n e s , a n d i t i sp o s s i b l e t h a t t h i s m e r R g e n e e i t h e r i s n o t f u n c t i o n a l o r i s ar e g u l a t o r y g e n e o f a y e t t o b e i d e n t i f i e d c h r o m o s o m a l r e s i s -t a n c e d e t e r m i n a n t . S i l v e r a n d W a l d e r h a u g ( 1 3 4 ) p r o d u c e d ap h y l o g e n e t i c t r e e o f s e q u e n c e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n MerRp r o t e i n s f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s . A s m a y b e e x p e c t e d , t h e t w o T .f e r r o o x i d a n s c h r o m o s o m a l MerRs w e r e t h e m o s t d i f f e r e n tMerR s e q u e n c e s f r o m g r a m - n e g a t i v e s o u r c e s , w h e r e a s t h ep r e d i c t e d M e r R - l i k e s e q u e n c e f r o m t h e p T F - F C 2 p l a s m i d w a ss t i l l m o r e d i f f e r e n t f r o m a n y o f t h e MerRs f r o m e i t h e rg r a m - n e g a t i v e o r g r a m - p o s i t i v e s o u r c e s .

G e n e s I n v o l v e d i n E n e r g y P r o d u c t i o nA m a j o r c h a l l e n g e t o m o l e c u l a r b i o l o g i s t s who w o r k w i t h T .f e r r o o x i d a n s a n d r e l a t e d c h e m o a u t o l i t h o t r o p h i c b a c t e r i a i s t os t u d y t h e s t r u c t u r e , e x p r e s s i o n , a n d r e g u l a t i o n o f t h e g e n e sa s s o c i a t e d w i t h t h e p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s t h a t h a v emade t h e s e b a c t e r i a i n d u s t r i a l l y i m p o r t a n t . T h e s e a r e t h eg e n e s t h a t s y n t h e s i z e t h e p r o t e i n s r e q u i r e d f o r t h e o x i d a t i o n o fo r e s a n d , p a r t i c u l a r l y , t h o s e i n v o l v e d i n t h e o x i d a t i o n o f i r o n

a n d s u l f u r c o m p o u n d s . B e c a u s e i r o n a n d s u l f u r c o m p o u n d s a r e

M I C R O BI O L. R E V .


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MOLECULAR GENETICS OF T . FERROOXIDANS 4 7o x i d i z e d p r i m a r i l y t o g a i n e n e r g y , a s t u d y o f t h e m o l e c u l a rb i o l o g y o f t h e p r o c e s s o f e n e r g y p r o d u c t i o n i s r e l e v a n t .R e l a t i v e l y f e w b a c t e r i a c a n o x i d i z e s u l f u r , a n d e v e n f e w erc a n o x i d i z e i r o n . T h e r e a r e n o d e f i n e d m u t a n t s w i t h m u t a t i o n si n i r o n o r s u l f u r o x i d a t i o n p a t h w a y s , a n d o n l y r u d i m e n t a r yg e n e t i c s y s t e m s f o r s o m e s t r a i n s h a v e b e e n d e v e l o p e d . T h i sm e a n s t h a t s c r e e n i n g g e n e b a n k s b y c o m p l e m e n t a t i o n o fm u t a n t s i s n o t y e t p o s s i b l e . F u r t h e r m o r e , u n t i l r e c e n t l y , n oDNA p r o b e s f o r i r o n a n d s u l f u r o x i d a t i o n g e n e s e x i s t e d .I d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n s i n v o l v e d i n i r o n a n d s u l f u ro x i d a t i o n i s i t s e l f a c h a l l e n g e . I t h a s , h o w e v e r , b e e n s h o w n t h a ti f t o t a l p r o t e i n i s e x t r a c t e d f r o m a T . f e r r o o x i d a n s s t r a i n g r o w no n e i t h e r a n i r o n o r s u l f u r m e d i u m a n d t h e t w o p r o t e i n p r o f i l e sa r e c o m p a r e d , c l e a r d i f f e r e n c e s a r e s e e n ( 9 0 , 9 5 ) . Somep r o t e i n s a r e p r o d u c e d w h e n t h e b a c t e r i u m i s g r o w n o n i r o n b u tn o t o n s u l f u r , a n d o t h e r s a r e s y n t h e s i z e d o n l y w h e n t h eb a c t e r i u m i s g r o w n o n s u l f u r . O n c e t h e s e i r o n - o r s u l f u r -i n d u c e d p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d , t h e y c a n b e p u r i f i e d a n da n t i b o d i e s c a n b e r a i s e d . A l t e r n a t i v e l y , a s h o r t s t r e t c h o f t h ea m i n o a c i d s e q u e n c e c a n b e d e t e r m i n e d a n d a DNA o l i g o n u -c l e o t i d e h y b r i d i z a t i o n p r o b e c a n b e s y n t h e s i z e d . T h e s e a n t i -b o d i e s o r o l i g o n u c l e o t i d e s m a y b e u s e d t o s c r e e n T . f e r r o o x i -d a n s g e n e b a n k s .T . f e r r o o x i d a n s c a n g r o w o n a v a r i e t y o f r e d u c e d - s u l f u rc o m p o u n d s , a n d t h e e n z y m o l o g y o f t h i s p r o c e s s h a s b e e ns t u d i e d i n a n e f f o r t t o w o r k o u t t h e o x i d a t i o n p a t h w a y ( 6 2 , 6 8 ) .T h e r e i s s t i l l m u c h t o b e d o n e b e f o r e t h e p a t h w a y i s r e s o l v e d ,a n d l i t t l e i s k n o w n o f t h e m o l e c u l a r g e n e t i c s o f t h e s u l f u ro x i d a t i o n p a t h w a y i n t h i s b a c t e r i u m o r o t h e r t h i o b a c i l l i . B e -c a u s e n o g e n e s o f t h e s u l f u r o x i d a t i o n p a t h w a y s h a v e b e e ni d e n t i f i e d o r c l o n e d , t h i s w i l l n o t b e d i s c u s s e d f u r t h e r . C o n s i d -e r a b l y m o r e i s k n o w n a b o u t t h e m e c h a n i s m o f i r o n o x i d a t i o n .I r o n o x i d a t i o n . S e v e r a l o f t h e c o m p o n e n t s i n v o l v e d i n t h eo x i d a t i o n o f i r o n b y T . f e r r o o x i d a n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d ( 1 2 ,5 1 ) . T h e s e i n c l u d e a 9 2 - k D a o u t e r m e m b r a n e p o r i n ( 9 0 ) , as m a l l b l u e c o p p e r p r o t e i n c a l l e d r u s t i c y a n i n , a n u n c e r t a i nn u m b e r o f c y t o c h r o m e s o f t h e c a n d a t y p e s , a n d a n F e ( I I )o x i d a s e . A d i a g r a m o f t h e l i k e l y s p a c i a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e nt h e s e c o m p o n e n t s i s s h o w n i n F i g . 7 . T h e r e d o x p o t e n t i a l o f t h eF e 2 + / F e 3 + r e d o x c o u p l e i s 0 . 7 7 V , w h e r e a s t h a t o f t h e e l e c -t r o n - a c c e p t i n g O 2 / H 2 0 c o u p l e i s 0 . 8 2 V a t pH 7 a n d 1 . 1 2 V a tpH 3 . 2 . S i n c e t h e i n t e r n a l pH o f T . f e r r o o x i d a n s c e l l s i sa p p r o x i m a t e l y 6 . 5 , t h e a m o u n t o f e n e r g y a v a i l a b l e i f t h et e r m i n a l r e d u c t i o n o f 0 2 t o o k p l a c e i n t h e m o r e a c i d i ce n v i r o n m e n t o u t s i d e t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i s c o n s i d e r -a b l y g r e a t e r t h a n i f t h i s r e a c t i o n t o o k p l a c e i n t h e c y t o p l a s m .T h i s p o s s i b i l i t y o f o x y g e n b e i n g r e d u c e d o u t s i d e t h e c e l l w a sf i r s t s u g g e s t e d b y C o x a n d B r a n d ( 2 4 ) a n d i s s u p p o r t e d b y t h es t u d i e s o f Y a m a n a k a a n d c o w o r k e r s , w h o p u r i f i e d c y t o c h r o m ec 5 5 2 a n d f o u n d i t t o b e r e d u c e d b y a m e m b r a n e f r a c t i o n o f T .f e r r o o x i d a n s m o r e r a p i d l y a t pH 3 . 0 t h a n pH 6 . 5 ( 1 2 5 ) .S u b s e q u e n t l y t h e y

Molecular Genetics of Thiobacillus Ferrooxidans

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