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Microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescenceEtude des dynamiques intracellulaires

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Outils d’étude des interactions moléculaires dans la cellule

Techniques de marquage :ImmunofluorescenceHybridation in situ fluorescenteSondes fluorescentes (colorants, indicateurs …)Macromolécules couplées à des fluorochromesIncorporation de précurseurs fluorescentsExpression de protéines « tagées »

Expression de protéines chimériques fluorescentes(fusion avec la GFP et ses variants)

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AvantagesSpécificité de la détectionMarquages multiples et simultanéesHaute sensibilité de la détectionSensibilité à l’environnement physique et chimiqueBonne résolution spatialeExcellente résolution temporelle

ProblèmesBruit de fond (auto-fluorescence, fluorochromes libres,

sondes liées de façon non spécifique)Photoblanchiment : perte de fluorescence liée à l’oxydation

(défaut pouvant être exploité)Possible phototoxicité : création de radicaux libres, cassure ADN….


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L’imagerie par microscopie de fluorescence permet de co-localiser des signaux fluorescents dans les limites de la résolution spatiale (0,3µm)

Donc une co-localisation de molécules ne signifie pas nécessairement interaction ! Comment détecter des interactions ?

Une interaction entre macromolécules peut mener à des changements de :•Mobilité et dynamique des molécules•Propriétés spectrales et physico-chimiques des fluorophores associés•Distance entre molécules

Ces changements peuvent êtres détectés par les F-techniques suivantes :FRAP : recouvrement de fluorescence après photoblanchimentFLIP : perte de fluorescence induite par photoblanchimentFCS : spectroscopie à corrélation de fluorescenceFLIM : Image de déclin de fluorescenceFRET : transfert d’énergie de fluorescence par résonance

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F.R.A.P.Fluorescence

Recovery After

Photobleaching

Compartiment

Molécules fluorescentes

Molécules éteintesZone de blanchiment

La courbe de recouvrement permet de calculer :•La mobilité relative•La fraction de molécules mobiles et immobiles•Le coefficient de diffusion•Le temps de résidence

temps

Impulsion LASER

f(t) = c – a e-t/t

fraction immobile

Principe :Une région (un compartiment) cellulaire est exposée à une forte impulsion lumineuse.Les molécules fluorescentes dans cette région deviennent non-fluorescentes (photoblanchiment).

L’étude de la redistribution des molécules fluo. et non-fluo. est effectuée à intervalle régulier

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Exemple d’expérience de FRAPMitochondries dans un cardio-myocyte de Rat

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FRETFörster Resonance Energy Transfer

Etude de l’inter-action physique de protéines partenaires

Limitation de détection de proximité de protéines = 0,02µmó Résolution optique des microscopes photoniques

Le FRET permet de dépasser cette limite

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From : Zeiss

Transfert d’énergie :ü fluorophore donneur,ü fluorophore accepteur,ü Proximité (1-10nm).

FRET : Förster Resonance Energy Transfer

CFP YFP

ex

FRET

em

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Distance > 10nm Distance : 1-10nm

Superposition :ü spectre d’émission donneur,ü spectre d’excitation accepteur.

FRET : Förster Resonance Energy TransferImportance de la proximité <10nm

CFP YFP

exFRET

em

CFP YFP

ex

em

CFP YFP

ex

em

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Transfert d’énergie :ü fluorophore donneur,ü fluorophore accepteur,ü Proximité (1-10nm).

Donneur/Accepteur

CFP/YFPBFP/GFPGFP/RhodamineFITC/Cy3

Superposition :ü spectre d’émission donneur,ü spectre d’excitation accepteur.


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Contrôle du FRET par photoblanchiment de l’accepteur

FRET : avant blanchimentde l’accepteur donneurÞ - accepteurÝ


CFP YFP

ex

FRET

em

FRET : après blanchimentde l’accepteur

pas d’accepteur- donneur Ý

CFP YFP

ex

em

CFP YFP

ex

em

photoblanchiment

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YC2 = Modèle d’étude :pour la visualisation dela concentration de Calciumdans des cellules vivantes

YC2 = indicateur interne de la concentration en Ca++

YC2 = protéine de fusion: CFP (Cyan Fluorescence Protein)

: YFP (Yellow Fluorescence Protein): CaM (Calmodulin = protéine de liaison du Ca++): M13 (Calmodulin-binding site)

Transfection des cellules avec YC2 From : A. Miyawaki, RIKEN, Wako, Japan


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Analyse spectrale vs spectres de référence

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Analyse spectrale en fonction du tempsnm

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Analyse spectrale vs spectres de référence

temps

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FLIMFluorescence Lifetime Imaging

MICROSCOPIE DE FLUORESCENCE RESOLUE DANS LE TEMPS

… mesure du déclin de fluorescence …

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… rappels : caractéristiques de la fluorescence !

L’intensité de fluorescence d’une solution est proportionnelle :

• à l’intensité d’excitation,

• à la concentration du fluorophore,

• à son coefficient d’extinction molaire (propriété intrinsèque de la molécule),

• à son rendement quantique.

Rendement quantique

rapport du nombre de photons émissur le nombre de photons absorbés par un fluorophore.

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La durée de ½ vie d’un fluorochrome est une mesure directe du rendement quantique

« fluorescence lifetime » :durée pendant laquelle un fluorophore demeure dans un état excité~ indicateur du temps disponible pour l ’observation des événements relatifs à cette molécule

… rappels : caractéristiques de la fluorescence !

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Deux approches existent :

Ö technique du déclin de fluorescence(time domain)

Ö technique de phase et modulation(frequency domain)

(d’après Bastiaens et Squire, 1999)

Fluorescence Lifetime Imaging

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Le déclin de fluorescence au coursdu temps dans une populationuniforme de molécules excitées untemps très bref est une fonctionexponentielle indépendante de laconcentration.

Fluorescence Lifetime Imaging

I(t) = I(o) • e(-t/t)

avec :I(t) : intensité de fluorescence mesurée au temps t,I(o) : intensité de fluorescence observée immédiatement après excitation, ett : durée de vie du fluorochrome.

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Extinction de fluorescence ?L’extinction de fluorescence comprend au sens large tout phénomène diminuant l’intensité de fluorescence.

« Photobleaching» (photoblanchiment) ó FRAPperte de fluorescence par hyper-excitation lumineuse

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« Fading» = diminution de fluorescence sur une longue période sans nécessairement d’excitation (simple oxydation)

« Photobleaching» (photoblanchiment) ó FRAPperte de fluorescence par hyper-excitation lumineuse

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« quenching »transfert d’énergie vs environnement

«FRET »Manifestation radiative du « quenching » du donneur

« photobleaching »hyper-excitation lumineuse

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«FRET »Manifestation radiative du « quenching » du donneur

Profile multi-exponentiel dans un mélange

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Principe=> répéter la mesure du temps de retard d’émission d’un photon unique par rapport à une impulsion d’excitation=> construction de l’histogramme du nombre de photons comptés vs temps de retard

Conditions expérimentalesimpulsions de 500 mW pendant ~ 10ps et espacées de 240/250 nssoit 4 106 mesures en 1s (largement suffisant pour obtenir l ’histogramme cumulé!)

Time-Correlated Single Photon Counting : TCSPC

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Time-Correlated Single Photon Counting : TCSPCPrincipe=> répéter la mesure du temps de retard d’émission d’un photon unique par rapport à une impulsion d’excitation=> construction de l’histogramme du nombre de photons comptés vs temps de retard=> mesure de la durée de vie de la fluorescence de l ’échantillon

L ’histogramme des retards des photons uniques comptés correspond alors au déclin de fluorescence.

Durée de vie de fluorescencePour une population hétérogène de molécules fluorescentes, considérons le temps moyen de décroissance de la population de molécules excitées simultanément.

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Exemple de résultat comparatif : la famille des protéines G


EBFP 2,7 ns & 0,4ns(0,15 & 0,85)

EGFP 2,6 nsEYFP 3,1 nsECFP 3,4 ns & 1,3ns

(0,6 & 0,4)DsRed 3,5 ns

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Les valeurs des durées de vie calculées sont 1111 ns; 500 ns; 333 ns; 270 ns; 217 ns et 185 ns

pour respectivement 0, 20, 40, 60, 80 et 100 % O2/N2

Exemple : inhibition des durées de vie du Ru(phen) par l'oxygène ?


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Exemple : noyau en présence d’éthidium bromide à différentes concentrations d ’incubation : 0,4, 1 et 10 µg/ml comparé avec une solution d’ADN de phage l ?


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Microscopie de fluorescenceFLIM … Fluorescence Lifetime Imaging

Exemple : noyau en présence d ’éthidium bromide à différentes concentrations d ’incubation : 0,4, 1 et 10 µg/ml comparé avec une solution d ’ADN de phage l ?


Forte proportion d éthidium libre dans le noyau

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Exemple : double marquageADN : HoechstTubulin : Alexa 488

Time and Space-Correlated Single Photon Counting : T CSPC-

Image : intensités de fluorescence

Image : intensitésdes durées de vie

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...permet un suivi quantitatif du FRET avec une grande sensibilité, via les changements induits dans la durée de vie de fluorescence du donneur.

Multiples intérêts de la technique :

… outil puissant pour l ’étude intra-cellulaire et sub-cellulaire des interactions moléculaires, des réactions métaboliques et de transfert d ’énergie .

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FCS…FCMFluorescence Correlation SpectroscopyFluorescence Correlation Microscopy…

spectroscopie par corrélation de fuorescence.

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From :Petra Schwille & Elke Haustein

Objectif ?La FCS rend compte des fluctuations rapides de fluorescence au cours du temps dans un volume de mesure très petit de l’ordre du femtolitre (10-15l).

Mécanismes à l’origine de fluctuation de fluorescence ?

- Réactions chimiques ou photophysiques entre molécules => modifications de la taille des particules.

FCS … Fluorescence Correlation Spectroscopy

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From :Petra Schwille & Elke Haustein

Matériel exploitable ?

in situ sur cellules vivantes et adhérentes.


solutions

Volume intra-cellulaire intra-nucléaire Surface

membranaire

Méthode bien adaptée dans les systèmes comportant une densitéfaible de molécules fluorescentes.

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En association avec la microscopie confocale :- volume focal ~ 0,2 femtolitre (plus petit que la bactérie E.Coli)- (sub-nanomalaire 10-9M < concentrations < micromolaire 10-6M)

LSM + FCS => FCMInstrumentation : association avec la microscopie confocale

LSM 510-MetaConfocor2


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Expérimentation envisageable ?

Expérimentation envisageables ?- estimation des constantes de diffusion (coefficient de mobilité) de macromolécules dans différents environnements,- analyse d’interactions moléculaires (ADN/protéine, protéine/protéine, acide nucléique/sonde nucléique …) et estimation de constantes de cinétique,- étude des modifications conformationnelles ou environnementales (pH, viscosité, compartimentation …),- étude de variations de concentrations locales … … … … … …

Matériel exploitable ?- solutions,- in situ sur cellules vivantes et adhérentes.


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Principe

- la fluorescence émise par les molécules dans le volume focal est enregistrée photon par photon au cours du temps,

- si l’on fait l’hypothèse de « puissance d’excitation constante », les fluctuations du signal de fluorescence à un instant donné sont définies comme les déviations du signal par rapport au signal moyen au cours du temps,

- construction de la fonction d’auto-corrélation :

l’auto-corrélation consiste à comparer l’écart de la fonction de fluorescence f(t) par rapport à la valeur moyenne temporelle avec elle-même décalée d’un certains temps t.

Point d’inflexion =Cte de diffusion


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Microscopie de fluorescenceFluorescence fluctuation curve

Autocorrelation curve

lag

lagR(lag)=k(lag) . S[I(t).I(t+lag)]]

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Microscopie de fluorescenceFCS … Fluorescence Correlation SpectroscopyExemple 1 : analyse de diffusion différentielle

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D41

Exemple 2 : changements de conformation de protéinesFCS … Fluorescence Correlation Spectroscopy

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Exemple 3 : influence du pH sur les propriétés de diffusion de la GFP => outil de mesure de pH locaux.

La GFP utilisée comme un Ph-mètre intra-cellulaire !


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Exemple 4 : étude d’inter-actions moléculaires

les 2 molécules ont des tailles très différentes il suffit que la plus petite molécule soit fluorescente=> Méthode d’auto-corrélation


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D44

Exemple 5 : cinétique de réaction enzymatique

Coupure de ADN double-brin par l’endonucléase de restriction EcoRI.

Les constantes de diffusion des deux partenaires sont proches, les deux molécules doivent marquées avec des fluorochromes différents

=> Méthode de cross-corrélation


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Random motion simulation Noisy deterministic motion

Autocorrelationcurves

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Drosophilaovocyte

Labelling GFP-RAB6

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Filtered sequence both in spatial and temporal domains

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ICS analysis

Regions of interest(R.O.I.)

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Microscopie de fluorescenceModels and interpretation

Need to expand models in order to integrate the case of trains of particles

En posant les modèles d’autocorrélation suivants :

diffusion : G τ( ) =1

1 +ττD

et

transport : G τ( ) =−

τ

τv

⎛

⎝ ⎜ ⎜

⎞

⎠ ⎟ ⎟

2

eon peut caractériser la balance entre comportement brownien et comportement déterministe(transport ou autree). Pour cela, à partir des temps caractéristiques τD et τv , on va définir unelongueur caractéristique Lcar, au delà de laquelle le transport devient prépondérant par rapportà la diffusion.

diffusion : τD =r2

4D→ D =

r2

4τDtransport : τ D =

rv→ v =

rτv

⎫

⎬ ⎪ ⎪

⎭ ⎪ ⎪

→ Lcar =Dv

=r4τ v

τD

avec D la constante de diffusion, v la vitesse de déplacement, et r le diamètre de l’élément demesure.

Using theoretical autocorrelation models

With D the constant of diffusion, v the flow speed and r the diameter of the basic measurement element (pixel)

Its possible to characterize the balance between the brownian and desterministic components in order to define an transport efficiency. Using the characeristic times tD and tv, we can define a new value that we call characteristic length Lcar beyond which the deterministic flow takes over free diffusion in terms of transport efficiency

and

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Matière transportée

0,0%

10,0%

20,0%

30,0%

40,0%

50,0%

60,0%

70,0%

80,0%

90,0%

100,0%

A B C Cbis D E

région

diffluxautre

Temps caractéristiques

0

100

200

300

400

500

600

700

A B C Cbis D E

régions

seco

nd

es

TauDTauV

Lcar

0,0000

0,1000

0,2000

0,3000

0,4000

0,5000

0,6000

0,7000

0,8000

A B C Cbis D E

région

micrometres

Lcar

Great Lcar -> deterministicLow Lcar -> diffusive

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