Método Diagnostico

Corynebacterium Diphtheriae

Para el diagnóstico etiológico de la enfermedad respiratoria se requieren muestras de hisopados de fauces y nasofaríngeos y/o trozos de membrana.

Si se sospecha difteria cutánea las muestras deben ser de piel, garganta y nasofaríngea.

Los hisopos utilizados para la toma de muestras son los habituales: hisopos estériles con punta de algodón, dacrón o alginato de calcio.

Muestra

Toma de la Muestra

La faringe debe estar claramente visible y bien iluminada. Deprimir la base de la lengua con baja lengua e hisopar la garganta, sin tocar saliva ni mucosas laterales. Frotar vigorosamente cualquier membrana, o área inflamada, presionando ligeramente con el hisopo y ejerciendo un movimiento de rotación. Si existe alguna membrana, levantar el borde e hisopar por debajo de la misma, para acceder a los microorganismos diftéricos localizados más profundamente. Es recomendable, además, enviar un trozo de membrana. Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la coloración de Gram y la coloración de azul de metileno de Löeffler.

Insertar el hisopo flexible de alambre de cromo o acero inoxidable en la nariz, a través del orificio nasal, más allá de la parte anterior de la narina. Introducir suavemente el hisopo en la nariz hasta encontrar resistencia a nivel de los cornetes (no debe utilizarse la fuerza para salvar algún tipo de obstrucción). Rotar el hisopo sobre la mucosa nasal. Realizar extendidos en 2 portaobjetos. Dejar secar al aire y fijar por calor. Realizar la coloración de Gram y la coloración de azul de metileno de Löeffler.

- Hisopado Nasofaríngeo

Limpiar con solución salina estéril y remover el material adherido a la lesión. Presionar el hisopo firmemente dentro de la misma.

Muestra Cutánea

Cultivo

Medio Agar Sangre Cistina Telurito (ASCT). Medio Löeffler (ML). Se aconseja para la observación de la morfología bacteriana. Agar Sangre (AS). Caldo Todd Hewitt (CTH) con 3 % de sangre.

MEDIOS DE CULTIVO

Frotis

- Coloración de Gram Bacilos pleomórficos gram positivos, dispuestos en forma de letras chinas y en empalizada, posibles formas cocobacilares, más predominantes en cultivos viejos. Los frotis directos de garganta muestran mucho menos pleomorfismo; los microorganismos son generalmente más cortos y se tiñen más uniformemente que los cultivados

Coloración de Azul de Metileno de Löeffler

Bacilos rectos o levemente curvos, frecuentemente, se deforman en forma de clavas en uno o ambos extremos y no se tiñen con uniformidad sino que muestran gránulos (metacromáticos color rojo púrpura) o barras que se colorean más profundamente. Pueden mostrar diversas formas: en clava, granular, en barra, en cuña y de coloración intensa.

Colonias

Aspecto de las Colonias

Medio Agar Sangre Cistina Telurito Corynebacterium diphtheriae reduce el telurito del medio a telurito metálico, el cual precipita y produce el desarrollo de colonias negras, gris acero, de 1 a 3 mm de diámetro

Medio Agar Sangre Cistina Telurito Corynebacterium diphtheriae reduce el telurito del medio a telurito metálico, el cual precipita y produce el desarrollo de colonias negras, gris acero, de 1 a 3 mm de diámetro

Aspecto de las Colonias

- Medio de Löeffler Luego de 24 horas de incubación a 37 ºC, las colonias tienen alrededor de 1mm de diámetro y son circulares, de superficie lisa y borde entero. Son cremosas, fácilmente emulsionables en agua o solución fisiológica y convexas, con centro ligeramente elevado. Después de 48-72 hs. de incubación, las colonias se agrandan, el centro se hace más elevado y la periferia sigue siendo plana y más transparente que el centro.

- Medio Agar Sangre C. diphtheriae var. intermedius: más pequeñas, planas, cremosas, transparentes, no hemolíticas. C. diphtheriae var. mitis y C. diphtheriae var. gravis: más grandes, convexas, débil beta hemólisis.

- Medio Agar Tinsdale Este medio de cultivo se utiliza para la detección de la enzima cistinasa y es de utilidad para la identificación presuntiva de C. diphtheriae.

El medio agar Tinsdale contiene telurito y cistina. La cistinasa produce sulfuro de hidrógeno a partir de la cistina, el cual reacciona con el telurito formando un “halo marrón difuso” alrededor de una colonia negra, luego de incubar a 37 ºC durante 24-48 hs. Otras especies de corinebacterias pueden dar colonias negras, pero sin la formación del halo marrón

Prueba de Toxigenicidad: Método de Inmunoprecipitación de Elek

En el agar se deben observar líneas blancas de precipitación, que aparecen aproximadamente a 10 mm del borde de la tira de papel de filtro, formando un ángulo de 45º, respecto de la línea de crecimiento. Estas bandas indican que la toxina producida, por el aislamiento en estudio, ha reaccionado con la antitoxina homóloga

La aparición de líneas de precipitación, en forma de arco entre el control positivo y la cepa cuya toxicidad se está probando, indican que ésta es productora de toxina. Las cepas no toxigénicas no forman líneas de precipitación. Después de 48 horas de incubación, pueden aparecer líneas de precipitación inespecíficas, debido a otros antígenos solubles que pueden ser producidos por cepas toxigénicas y no toxigénicas, por lo cual la placa no debe incubarse más de 48 horas.

Pruebas especificas

La reacción de Schick

Es una intradermoreaccion con toxina difterica que permite detectar la presencia de anticuerpo neutralizantes La lectura se la realiza a los 4 o 5 días y la presencia de Edema con necrosis refleja la ausencia de anticuerpos neutralizados

La prueba de Schick es un procedimiento que permite determinar si un individuo es susceptible de padecer difteria, al valorar el grado de respuesta inmune del sujeto contra Corynebacterium diphtheriae, patógeno responsable de la enfermedad.1 Esta prueba, recibe su nombre del pediatra húngaro, aunque nacionalizado estadounidenseBéla Schick (1877–1967), que desarrolló esta técnica entre 1910 y 1911