MASTER RAD - pmf.ni.ac.rs · Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka...
Transcript of MASTER RAD - pmf.ni.ac.rs · Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka...
UNIVERZITET U NIŠU
PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET
DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU
Biološka aktivnost i varijabilnost hemijskog sastava
etarskog ulja Pinus mugo (Pinaceae)
MASTER RAD
Kandidat: Mentor:
Jelena Stojanović 185 Dr Zorica S. Mitić
Niš, 2017.
UNIVERSITY OF NIŠ
FACULTY OF SCIENCE AND MATHEMATICS
DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY
Biological activity and variability of chemical composition
of the essential oil of Pinus mugo (Pinaceae)
MASTER THESIS
Candidate: Mentor:
Jelena Stojanović 185 Dr. Zorica S. Mitić
Niš, 2017.
BIOGRAFIJA KANDIDATA
Jelena Stojanović rođena je 18. oktobra 1993. godine u Vranju, gde 2008. godine
završava osnovnu, a 2012. godine gimnaziju „Bora Stanković“ sa odličnim uspehom.
Prirodno-matematički fakultet u Nišu upisuje 2012. godine na Departmanu za biologiju i
ekologiju. Osnovne akademske studije završava 2015. godine i iste godine upisuje Master
akademske studije, smer Biologija, koje u predviđenom roku završava.
ZAHVALNICA
Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru doc. dr Zorici Mitić na razumevanju,
strpljenju, nesebičnoj pomoći i savetima koje mi je pružila tokom izrade i pisanja master
rada. Takođe, najlepše se zahvaljujem i članovima Komisije za ocenu master rada prof. dr
Gordani Stojanović i prof. dr Petru Marinu.
Veliku zahvalnost dugujem i prof. dr Bojanu Zlatkoviću na dragocenoj pomoći u
sakupljanju biljnog materijala kao i doc. dr Snežani Jovanović na pomoći u realizaciji
hemijskih analiza. Zahvaljujem se i prof. dr Vladimiru Ranđeloviću na izradi geografske
karte distribucije koja prati ovaj master rad.
Na kraju, posebnu zahvalnost dugujem dragim ljudima oko sebe bez kojih ne bih
mogla da ostvarim svoje zamisli, a posebno sam zahvalna svojoj porodici i prijateljima na
pruženoj podršci, motivaciji i ljubavi.
Beskrajnu zahvalnost dugujem svojoj majci, osobi koja mi je bila najveća podrška u
životu.
Veliko Hvala!
SAŽETAK
U master radu je analiziran hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-
destilacijom iz četina Pinus mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina). Rezultati su
upoređeni sa literaturnim podacima o sastavu ulja krivulja poreklom iz različitih organa
biljke. Etarsko ulje četina P. mugo sa pomenutog područja odlikuje dominacija monoterpena
(75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim komponentama. Sledeći
najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i bornil-acetat, detektovani su
u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa druge strane, germakren D
(5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru
seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta
detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo
konstatovati da postoji velika varijabilnost hemijskog sastava ulja koje potiče iz različitih
organa, ali istovremeno i iz različitih delova areala pomenute vrste. Međutim, u većini
dosadašnjih istraživanja utvrđeno je da monoterpeni predstavljaju dominantnu grupu
jedinjenja u etarskom ulju krivulja, bez obzira na tip organa iz kojeg je ulje izolovano (četine,
izdanci ili šišarke) ili poreklo biljnog materijala (populacija iz prirode ili botanička bašta). U
odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje P. mugo
je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. Do sada je utvrđeno da poseduje
značajan antibakterijski (naročito protiv Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i
Streptococcus agalactiae) i antioksidativni potencijal, dok se sa druge strane odlikuje
potpunim odsustvom larvicidne aktivnosti protiv moljca duvana Spodoptera litura.
Ključne reči: Pinus mugo, etarsko ulje, varijabilnost, biološka aktivnost
ABSTRACT
This master paper includes analysis of chemical composition of essential oils isolated
from needles of Pinus mugo from the territory of Kosovo and Metohija (Šar-planina) by
hydrodistillation. The results were compared to literature data on composition of P. mugo
essential oils collected from different plant organs. The essential oil of P. mugo needles from
the study area was characterized by dominance of monoterpenes (75.7%) with δ-3-carene
(21.3%) and α-pinene (18.0%) as the main components. The next group of the most abundant
monoterpenes, limonene + β-phellandrene, terpinolene and bornyl acetate, was detected in
moderate concentrations (7.6, 5.5 and 5.1%, respectively). On the other hand, germacrene D
(5.6%) and (E)-caryophyllene (5.0%) represent the most important metabolites within the
sesquiterpene fraction which forms 21.9% of studied oil. Manoyl oxide was the only
diterpene component, detected in concentration lower than 1%. According to the existing
studies it may be concluded that there is high variability in chemical composition of oils
collected from different organs, but also from different parts of range of P. mugo. However,
the results of most previous studies indicated that monoterpenes are the dominant group of
compounds in the essential oil of P. mugo, regardless of the type of organ from which the oil
was extracted (needles, twigs or cones) or origin of plant material (wild population or from
botanical garden). In comparison to other pine species, available literature data indicate that
essential oil of P. mugo was relatively poorly studied from the aspect of biological activity.
So far there is evidence of significant antibacterial (especially against Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae) and antioxidant
potential, while on the other hand there was a complete absence of any larvicide activity
against tobacco cutworm Spodoptera litura.
Keywords: Pinus mugo, essential oil, variability, biological activity
SADRŽAJ
1. UVOD .................................................................................................................................... 1
1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo ............................................................................ 1
1.1.1. Habitus i anatomija .................................................................................................. 1
1.1.2. Stanište i distribucija ................................................................................................ 1
1.1.3. Privredni značaj........................................................................................................ 3
1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja ................................................................................... 4
1.2.1. Fizičke osobine ........................................................................................................ 5
1.2.2. Hemijski sastav ........................................................................................................ 6
1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja .......................................................... 6
1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova ................................................ 7
2. CILJEVI RADA ................................................................................................................... 9
3. MATERIJAL I METODE ................................................................................................ 10
3.1. Biljni materijal .............................................................................................................. 10
3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija) ..................................................................... 11
3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja ........................................................................ 11
3.4. Identifikacija komponenti ............................................................................................. 12
4. REZULTATI I DISKUSIJA ............................................................................................. 13
4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo ......................................................................... 13
4.1.1. Etarsko ulje četina .................................................................................................. 13
4.1.2. Etarsko ulje izdanaka ............................................................................................. 23
4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka................................................................................. 23
4.1.4. Etarsko ulje šišarki ................................................................................................. 24
4.2. Biološka aktivnost etarskog ulja P. mugo ..................................................................... 30
4.2.1. Antimikrobna aktivnost ......................................................................................... 30
4.2.2. Insekticidna aktivnost ............................................................................................ 31
4.2.3. Antioksidativna aktivnost ...................................................................................... 31
5. ZAKLJUČCI ...................................................................................................................... 33
6. LITERATURA ................................................................................................................... 35
Jelena Stojanović Master rad
1
1. UVOD
1.1. Opšte karakterisitke vrste Pinus mugo
1.1.1. Habitus i anatomija
Pinus mugo Turra (Pinaceae) - krivulj, planinski bor, klekovina je žbun retko viši od 3
(-4) m, sa krivim, ukošenim deblom, jednim ili više (slika 1.1). Kora je sivosmeđa, sa
nepravilnim ljuspama. Mlade grančice gole, svetlozelene, kasnije smeđe do crnkastosive.
Pupoljci su jako smolasti, dugi do 6 mm, sa kratkim vrhom. Četine po dve, traju 3-6 godina,
gusto stojeće, povijene na grani, malo uvrnute, tamnozelene, duge 3-8 cm, široke 2 mm.
Smoni kanali subepidermalno, 2-6 na preseku. Epidermalne ćelije palisadnog oblika, dva puta
više nego što su široke. Muške resolike šišarke (mikrostrobilusi) duge do 15 mm, na
prošlogodišnjem izbojku. Ženske šišarke (makro-, megastrobilusi) su jajolike do jajoliko-
konične, duge 2-6 cm, široke 1.5-2 cm. Apofize rombične do kvadratne, piramidalne ili
ravne. Grbica (umbo) izrazita, uokvirena tamnim prstenom. Zreli semeni zameci dugi do 5
mm, sa 2-3 puta dužim krilastim dodatkom. Oprašivanje je anemofilno, muški i ženski
strobilusi se pojavljuju VI-VII meseca, semeni zameci sazrevaju krajem druge godine
(Jovanović, 1992).
1.1.2. Stanište i distribucija
Habitus krivulja odražava teške, u prvom redu klimatske, uslove pod kojima on živi;
to su granični uslovi za život šumskog drveća, sa kratkim vegetacionim periodom (3-4
meseca) (slika 1.1). Na Suvoj planini se javlja u fitocenozi Sorbo-Pinetum mugo B. Jov.,
1953. Na Prokletijama (Koprivnik, Streočke planine) krivulj raste u fitocenozi Wulfenio-
Pinetum mugo M. Jank. et Bog., 1967. na kiselom humusno-silikatnom zemljištu, Pinetum
mugo serpentinicum M. Jank., 1982. i nekim drugim (Jovanović, 1992).
Jelena Stojanović Master rad
2
Slika 1.1. P. mugo sa Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; foto: Zlatković, 2016).
Jelena Stojanović Master rad
3
Prema Flori Evrope (Gaussen et al., 1993) i Atlasu Flore Evrope (Jalas i Suominen,
1972), P. mugo je endemičan za Evropski kontinent i može se naći na planinama srednje
Evrope, Balkanskog poluostrva, i centralnog dela Apeninskog poluostrva. Pripadnost flornom
elementu: Srednjo-južnoevropski planinski (temp-submerid) – subalp-alp (Jovanović, 1992).
Na slici 1.2 je prikazana distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa prema
Hamerník i Musil (2007): P. mugo sensu stricto (=var. mugo) i P. x pseudopumilio (=var.
pumilio).
Za područje Srbije, Jovanović (1992) navodi sledeće lokalitete: istočna Srbija - Suva
planina (Trem), Stara planina (Tri čuke, Tri kladenca); Metohija – Prokletije (Koprivnik,
Lumbardska planina, Nedžinat, Derviš kom, Đaravica, Juničke planine), Žljeb, Hajla, Maja
Rusolija, Mokra planina, Paštrik, Koritnik, Ošljak, Kodža Balkan; Kosovo – Šar-planina
(ispod Jažinačkog jezera, Jelovarnik), Ostrovica.
1.1.3. Privredni značaj
S obzirom na to da raste i na staništima gde druge drvenaste vrste ne uspevaju, veoma
je značajan kao pionirska vrsta i čuvar zemljišta na starim, visokim planinskim terenima. Kao
"armatura" snežnih masa služi kao zaštita od lavina (zaštitne šume). Drvo sa
crvenkastosmeđom srčevinom i žućkastom beljikom, tvrdo i teško pogodno je za rezbarstvo i
Slika 1.2. Distribucija žbunastih taksona P. mugo kompleksa: mu (tamno zelena površina) –
P. mugo Turra (sensu stricto); pp (ljubičasta površina) – Pinus x pseudopumilio; svetlo
zelena površina predstavlja nesigurni deo areala (Hamerník i Musil, 2007).
Jelena Stojanović Master rad
4
gorivo (na planinskim pašnjacima). Iz četina se dobija etarsko ulje, koje se koristi u
kozmetičkoj industriji. Krivulj je korišćen u protiverozionim radovima i hortikulturi
(Jovanović, 1992).
1.2. Opšte karakteristike etarskog ulja
Etarska ulja predstavljaju specifične, najčešće tečne produkte biljnih tkiva. To su više
ili manje složene smeše isparljivih monoterpena, seskiviterpena i fenilpropanska jedinjenja
(Kovačević, 2004).
Etarska ulja su uglavnom lako pokretljive, mirisne tečnosti; pojedina su na sobnoj
temperaturi viskozna ili čvrste konzistencije. Glavni sastojci etarskih ulja su monoterpeni,
seskviterpeni i u manjoj meri derivati fenilpropana. To su različiti ugljovodonici (zasićeni ili
nezasićeni), alkoholi, fenoli, estri, aldehidi, ketoni, epoksidi ili karboksilne kiseline. Etarska
ulja su smeše oko 20-200 sastojaka. Ovi sastojci su, na osnovu koncentracije u etarskom ulju,
podeljeni na: glavne (20-95%), sporedne (1-20%) i zastupljene u tragovima (ispod 1%).
Etarska ulja su uglavnom produkti kopnenih biljaka (Embryophyta). Biljke koje
sadrže etarska ulja nazivaju se aromatičnim biljkama. Ove biljke su raspoređene u preko
pedeset familija, a najpoznatije su aromatične biljke familija Pinaceae, Cupressaceae,
Lauraceae, Zingiberaceae, Myrtaceae, Rutaceae, Lamiaceae, Apiaceae i Asteraceae. Etarska
ulja su lokalizovana u različitim delovima biljaka (korenu, rizomu, stablu, kori, semenu,
listovima, cvetovima i plodovima). Interensantno je da za jednu istu vrstu sastav etarskih ulja
varijabilan za različite organe, što zavisi od uslova sredine.
Prinosi etarskih ulja se obično kreću između 0.2 i 2.0%, mada postoje znatna
odstupanja. U zavisnosti od sadržaja etarskog ulja koji može da varira (prinos izuzetno
cenjenog ružinog ulja često ne prelazi 0.03%, dok prinos nekih drugih ulja može dostizati i
do 20%, npr. etarsko ulje karanfilića) biljke su podeljene u red bogatih ili siromašnih uljem
(Gašić, 1985).
Ove mirisne tečnosti nastaju u biljkama aktivnošću endogenih i egzogenih sekretornih
tkiva, koja se mogu javiti u obliku pojedinačnih ćelija u parenhimskim tkivima, žlezdanog
epitela šupljina ili kanala. Mada sekretorne ćelije nekada mogu biti organizovane i u
specijalne strukture, žlezde i žlezdane dlake.
Jelena Stojanović Master rad
5
Biološka funkcija etarskih ulja povezana je sa atraktantnim delovanjem na insekte,
čime je obezbeđeno prenošenje polena i oprašivanje biljaka. Sa druge strane, veoma je
značajna i uloga etarskih ulja u zaštiti biljaka od napada insekata i životinja, herbivora.
Takođe, gotovo sva ulja više ili manje intenzivno sprečavaju razvoj mikroorganizama, i tako
suzbijaju širenje infekcija na biljkama u kojima nastaju. Interesantni su i podaci o specifičnim
efektima ulja jedne biljke, koje prelazi u podlogu i inhibira klijanje semena drugih biljaka
(alelopatija). Neka etarska ulja sprečavaju klijanje sopstvenih semena i obezbuđuju životni
prostor svake individue. Stara je teorija, koja samo delimično može biti prihvaćena, da biljke
sintezom i odavanjem ovih isparljivih produkata stvaraju specifičnu mikroklimu, koja ih štiti
od prekomerne transpiracije u različitim nepovoljnim uslovima (Kovačević, 2004).
1.2.1. Fizičke osobine
Na sobnoj temperaturi, etarska ulja su najčešće tečnosti, ređe imaju viskoznu ili
polučvrstu konzistenciju (Kovačević, 2004). Lako su pokretljiva, bezbojna, žuta ili
žutozelena; pojedina su specifično obojena (npr. etarsko ulje cimeta i karanfilića
smeđecrveno). Droge sa proazulenima daju destilacijom vodenom parom plavo ili zeleno
obojena etarska ulja (npr. plava etarska ulja daju Matricariae flos, Absinthii herba i Millefolii
herba). Miris etarskih ulja potiče od sastojaka sa kiseoničnim funkcionalnim grupama. On je
intenzivan čak i kada su ovi sastojci zastupljeni u niskom procentu (etarsko ulje limuna)
(Petrović et al., 2009).
Etarska ulja su lipofilna, rastvaraju se u nepolarnim organskim rastvaračima, etanolu,
mastima i masnim uljima. Generalno, etarska ulja se ne rastvaraju u vodi. U stvari, samo mali
broj sastojaka ulja je rastvorljiv; ovakvi proizvodi nazivaju se aromatične vode.
Kao tečnosti, etarska ulja su definisana nekim fizičkim konstantama. Relativna
gustina ulja može biti manja ili veća od 1; ipak neuporedivo je manji broj etarskih ulja čija je
relativna gustina veća od 1. Kao parametar kvaliteta, značajne su vrednosti indeksa refrakcije
i ugla skretanja ravni polarizovane svetlosti. Kao specifična karakteristika definisana je i
rastvorljivost etarskog ulja u etanolu određenog razblaženja.
Specifičnost ove grupe biljnih proizvoda je da nemaju tačno definisanu temperaturu
ključanja. Pošto su to smeše različitih jedinjenja, svako od njih isparava na svojoj temperaturi
ključanja. Tako, etarska ulja frakciono ključaju u intervalu od 150-350 °C (Kovačević, 2004).
Jelena Stojanović Master rad
6
1.2.2. Hemijski sastav
Etarska ulja su složene mešavine dve različite klase jedinjenja: terpena i
fenilpropanskih derivata. U okviru terpenske frakcije, zastupljeni su isparljivi mono- i
seskviterpeni.
Monoterpeni se javljaju u obliku acikličnih (linearnih), mono- i bicikličnih, alifatičnih
i aromatičnih struktura. Na osnovu uvedenih funkcionalnih grupa, sastojci ulja mogu biti
ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, ketoni, kiseline, estri, fenoli, etri, oksidi, peroksidi,
epoksidi.
U okviru frakcije seskviterpena, formirane su još raznovrsnije strukture osnovnog
skeleta; zbog dužine lanaca C atoma veća je mogućnost različitih ciklizacija. I ova grupa
terpena javlja se u obliku ugljovodonika, oksida, alkohola, ketona i estara.
U etarskim uljima su aromatični, fenilpropanski sastojci (C6-C3) zastupljeni u manjim
količinama. Postoje i izuzeci, kada glavninu ulja čine upravo ovakva jedinjenja. Najčešće su
to aril- ili propenilfenoli (eugenol, anetol) i aldehidi (cimetni aldehid). Ovakva jedinjenja su
uglavnom prisutna u etarskom ulju biljaka iz familija Apiaceae i Myrtaceae. Kao sastojci
etarskih ulja sreću se i C6-C1 jedinjenja, kao što je vanilin i derivati antranilne kiseline.
Tokom destilacije, iz biljne sirovine mogu predestilisati i različita alifatična jedinjenja
manje molekulske mase (zasićeni i nezasićeni ugljovodonici, alkoholi, aldehidi, estri, laktoni)
koji se rastvaraju u etarskom ulju i postaju njegov sastavni deo. Takođe, kod nekih droga koje
su izložene fermentaciji ili torefakciji, na primer, male količine prisutnog etarskog ulja
postaju obogaćene sumpornim i azotnim jedinjenjima koja nastaju tokom tih specifičnih
procesa; time se formira specifična aroma ovakvih droga (seme kafe, kakaovca; Kovačević,
2004).
1.2.3. Varijabilnost sadržaja i sastava etarskog ulja
Kao što je slučaj i s drugim sekundarnim metabolitima biljaka, i produkcija etarskih
ulja je genetski definisana. Samo do nekih granica, genetska kontrola je podložna uticajima
endogenih i egzogenih faktora. Ne postoje opšta pravila, tako da neke biljne vrste u različitim
klimatskim uslovima i različitim delovima sveta proizvode približne količine etarskog ulja,
gotovo identičnog sastava. S druge strane, pojedinačne jedinke u okviru iste populacije
Jelena Stojanović Master rad
7
biljaka mogu sintetisati međusobno različita etarska ulja. Ovakva varijabilnost biljnog
genoma, omogućava pojavu različitih hemijskih rasa (hemotipova biljaka), kao i mogućnost
izdvajanja visokoproduktivnih linija, i njihovo vegetativno kloniranje.
Najvažniji faktori koji mogu uticati na sastav etarskog ulja neke vrste (jedinke) su:
• genotip,
• fenofaza ontogenetskog razvoja, što je veoma značajno za definisanje optimalnog
vremena prikupljanja biljnog materijala,
• ekološki faktori (faktori sredine),
• način obrade biljne sirovine,
• način izolacije etarskog ulja.
Temperatura, vlažnost i aeracija zemljišta, mineralne soli u podlozi, nadmorska
visina, dužina izloženosti svetlu i kvalitet svetlosti, vlažnost vazduha i vazdušna strujanja,
mogu da utiču na promenljivost količine etarskog ulja u biljnom materijalu.
Svaka obrada aromatične sirovine (sušenje, usitnjavanje, ekstrakcija) uslovljava
delimičan gubitak etarskog ulja i promene njegovog sastava. Procesom industrijske
ekstrakcije uvek se dobija oko 20% manje ulja nego u laboratorijskim uslovima (Kovačević,
2004).
1.2.4. Upotreba i biološke aktivnosti etarskog ulja borova
Prema Dervendzi (1992), etarsko ulje borova (Pini aetheroleum) najviše se koristi u
narodnoj medicini za lečenje respiratornih infekcija praćenih kašljem, bronhitisom,
bronhijalnom astom, efizemom, traheitisom, sinuzitisom, laringitisom, faringitisom i
influencom. Pored toga, etarska ulja borova široko se koriste kao aditivi u prehrambenoj i
industriji alkoholnih pića. U mnogim proizvodima namenjenim za čišćenje, ulja borova
poznata su kao osvežavajuća i dezinfekciona sredstva. Takođe, ova ulja intenzivno se koriste
u farmaceutskoj, kozmetičkoj i parfimerijskoj industriji.
Na osnovu pregleda literaturnih podataka, možemo reći da etarsko ulje borova
poseduje čitav niz bioloških aktivnosti:
Jelena Stojanović Master rad
8
• antibakterijsku i antifungalnu (Toroglu, 2007; Kolayli et al., 2009; Politeo et
al., 2011; Karapandzova et al., 2011; Šarac et al., 2014);
• akaricidnu (Macchioni et al., 2002);
• larvicidnu i repelentnu aktivnost protiv Diptera (Culicidae): Aedes albopictus
(Koutsaviti et al., 2015), Aedes aegypti i Culex quinquefasciatus
(Fayemiwo et al., 2014);
• herbicidnu aktivnost protiv Phalaris canariensis, Trifolium campestre i
Sinapis arvesis (Amri et al., 2014).
• antiagregantnu (antitrombocitnu; Tognolini et al., 2006);
• antikancerogenu (Hoai et al., 2015);
• antioksidativnu (Ustun et al., 2012).
Jelena Stojanović Master rad
9
2. CILJEVI RADA
Osnovni naučni ciljevi ovog istraživanja mogu se predstaviti u nekoliko teza:
1. Određivanje hemijskog sastava etarskog ulja četina poreklom iz jedne autohtone
populacije P. mugo sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina)
2. Poređenje dobijenih rezultata sa literaturnim podacima o hemijskom sastavu
etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih organa biljke: četine, izdanci i
šišarke
3. Određivanje varijabilnosti sastava etarskog ulja P. mugo
4. Upoznavanje sa biološkim aktivnostima etarskog ulja P. mugo
Jelena Stojanović Master rad
10
3. MATERIJAL I METODE
3.1. Biljni materijal
Biljni materijal (sveže četine) P. mugo sakupljen je u jednoj autohtonoj populaciji na
području Kosova i Metohije (Šar-planina, Ostrovica; tabela 3.1). Geografski položaj
populacije određen je uz pomoć GPS uređaja (GPS Garmin eTrex Vista® C). Orografske
karakteristike staništa, pre svega nadmorska visina i ekspozicija su preuzeti iz SRTM (Shuttle
Radar Topography Mission) (Reuter et al., 2007) digitalnog elevacionog modela rezolucije
90 x 90 m (Farr et al., 2007) pomoću softvera ArcGIS 10 (ESRI, 2011) (tabela 3.1).
Herbarski primerak je deponovan u Herbarijumu Departmana za biologiju i ekologiju,
Prirodno-matematičkog fakulteta u Nišu (“Herbarijum Moesiacum Niš” - HMN).
U odabranoj populaciji krivulja izvršeno je sakupljanje četina sa većeg broja odraslih
stabala. U ručnom frižideru materijal je sa mesta sakupljanja prenesen do zamrzivača (-20
°C) na skladištenje do momenta upotrebe.
Tabela 3.1. Geografski položaj i stanišne karakteristike odabrane populacije P. mugo.
Takson P. sylvestris
Lokalitet Šar-planina (Ostrovica)
Geografska širina (N) 42°14'12.80"
Geografska dužina (E) 20°55'13.53"
Nadmorska visina (m a.s.l.) 1734
Ekspozicija jugozapad
Geološka podloga serpentinit
Datum sakupljanja 13.08.2016.
Vaučer broj 12810 HMN
Jelena Stojanović Master rad
11
3.2. Izolacija etarskog ulja (hidro-destilacija)
Iz 335 g svežih i iseckanih četina P. mugo destilovano je etarsko ulje u aparatu tipa
Clavenger u toku 2.5 h. Ulje je ekstrahovano etrom, a etarski ekstrakt sušen anhidrovanim
Mg2SO4 (European Pharmacopoeia, 1983). Posle odvajanja sredstva za sušenje filtracijom,
etar je uklonjen destilacijom na rotacionom-vakuum uparivaču bez zagrevanja, a etarsko ulje
čuvano u zatvorenim hromatografskim vijalama na 4°C do analize. Prinos etarskog ulja je
izražen preko zapreminskih procenata (%) tj. w/w, obračunato u odnosu na 100 g biljnog
materijala. 40 µL svakog ulja razblaženo je etrom do 1mL za dalje hromatografske analize.
3.3. GC-FID i GC-MS analiza etarskog ulja
Hemijski sastav etarskog ulja određen je pomoću GC-FID (gasna hromatografija sa
plameno jonizacionim detektorom) i GC-MS (gasna hromatografija-masena spektrometrija)
tehnika analize. Uzorak etarskog ulja koji je rastvoren u etru sniman je u triplikatu na
7890/7000B gasnom hromatografu (Agilent Technologies, USA) sa Combi PAL auto-
semplerom i HP-5 MS kolonom (5% fenil metil siloksan, 30 m x 0.25 mm i.d. i 0.25 µm
debljina filma) kuplovan sa plamenim jonizacionim detektorom 7890A (FID) i masenim
detektorom 5977A (MS). Temperaturni program: izotermalno prvih 2.25 minuta 50 °C, zatim
linearni porast temperature (gradijent 4 °C/min) od 50 do 290 °C. Temperatura injektora 250
°C, interfejsa 300 °C; protok nosećeg gasa – helijuma 1.0 mL/min. Injektovana zapremina
ulja 1µL, split 40:1. Bekfleš 1.89 min, na 280 °C, sa helijumom pod pritiskom od 50 psi. MS
uslovi (EI): jonizacija -70 eV, opseg masa 35 – 435 amu (3 skena u sekundi), vreme skenova
0.2 sekunde. GC-FID analiza je izvedena pod istim eksperimentalnim uslovima kao što je već
navedeno za GC-MS analizu. Procentni sastav je preračunat na osnovu površine GC-FID
pikova sa hromatograma snimljenih pod istim uslovima kao GC-MS, bez korekcionih
faktora.
Jelena Stojanović Master rad
12
3.4. Identifikacija komponenti
Komponente etarskog ulja identifikovane su pomoću AMDIS softvera (Automated
Mass Spectral Deconvolution and Identification System, Ver. 2.1, DTRA/NIST, 2011) na
osnovu lineranih retencionih indeksa (RI), koji su određeni na osnovu retencionih vremena
standardne serije n-alkana (C8-C40), snimljene na istom aparatu i pod istim uslovima kao i
uzorak ulja. RI su upoređivani sa literaturnim vrednostima (Adams, 2007 i NIST Chemistry
WebBook).
Jelena Stojanović Master rad
13
4. REZULTATI I DISKUSIJA
4.1. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo
4.1.1. Etarsko ulje četina
Biljni materijal P. mugo prikupljen je na Šar-planini (Ostrovica) sredinom avgusta
meseca 2016. godine (tabela 3.1). Iz svežih četina postupkom hidro-destilacije u aparatu po
Clevenger-u izolovano je etarsko ulje svetlo žute boje sa prinosom od 0.30% (w/w).
Kombinacijom GC-FID i GC-MS analize u etarskom ulju krivulja identifikovana je 71
komponenta čije su relativne koncentracije date u tabeli 4.1, a dobijeni hromatogram
prikazan je na slici 4.1. U cilju poređenja dobijenih rezultata sa literaturnim podacima u
tabeli 4.1. je, takođe, dat uporedni pregled pet studija sa sastavom etarskih ulja četina P.
mugo, koja su izolovana postupkom hidro-destilacije kao i u ovom radu (Kubeczka i
Schultze, 1987; Tsitsimpikou et al., 2001; Venditti et al., 2013; Ioannou et al., 2014; Hajdari
et al., 2015).
Etarsko ulje P. mugo, sa područja Šar-planine (ova studija), odlikuje dominacija
monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao glavnim
komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren, terpinolen i
bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i 5.1%, respektivno). Sa
druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%) predstavljaju najznačajnije
metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini 21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina
diterpenska komponenta detektovana u koncentraciji manjoj od 1%. Na ovaj način, prosečan
hemijski profil glavnih terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju P. mugo možemo
predstaviti na sledeći način:
δ-3-karen > α-pinen >> limonen + β-felandren > germakren D = terpinolen = bornil-acetat =
(E)-kariofilen
(>> označava razliku od 5.1-15.0%, > razliku od 1.1-5.0%, = razliku od 0.1-1.0%, prema
Petrakis et al., 2001).
Jelena Stojanović_____________________________________________________________________________________________Master rad
14
(E)-kariofilen limonen β-felandren
3
germakren D
2
α-pinen
Slika 4.1. Hromatogram etarskog ulja četina P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica).
2
1
3 4 7 6 5
δ-3-karen
1
terpinolen bornil-acetat
4 5 6 7
+
Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad
15
Tabela 4.1. Hemijski sastav etarskog ulja četina P. mugo izolovanog hidro-destilacijom.
Takson P. mugo P. mugo subsp.
mugo
P. mugo
subsp. mugo P. mugo
P. mugo var.
rostrata
P. mugo var.
pumilio
P. mugo
subsp.
mugo
P. mugo
P. mugo
subsp.
pumilio
Poreklo biljnog materijala
Kosovo,
Šar-
planina,
Ostrovica
Kosovo, Šar-
planina, različiti
sublokalitetia)
Kosovo,
Prokletije,
različiti
sublokalitetia)
Velika
Britanija,
Botanička
bašta
Univerziteta u
Kembridžu
Velika
Britanija,
Botanička
bašta
Univerziteta
u Kembridžu
Velika
Britanija,
Botanička
bašta
Univerziteta
u Kembridžu
Italija,
Nacionalni
park
Majela
Velika
Britanija,
Kraljevska
Botanička
bašta u
Edinburgu
Komercijalni
uzorak
Referenca ova studija Hajdari et al.
(2015)
Hajdari et al.
(2015)
Ioannou et al.
(2014)
Ioannou et
al. (2014)
Ioannou et
al. (2014)
Venditti et
al. (2013)
Tsitsimpikou
et al. (2001)
Kubeczka i
Schultze
(1987)
R.
br. Komponente Sadržaj (%)
min maks min maks
1. (Z)-2-Penten-1-ol tr - - - - - - - - - -
2. n-Heksanal 0.3 - - - - - - - - - -
3. (E)-2-Heksen-1-al 0.5 - - - - - - - - - -
4. (Z)-3-Heksen-1-ol 0.3 - - - - - - - - - -
5. (Z)-2-Heksen-1-ol tr - - - - - - - - - -
6. n-Heksanol 0.3 - - - - - - - - - -
7. Triciklen 0.8 0.7 0.9 0.9 1.1 0.5 1.6 1.7 - 1.2 0.4
8. α-Tujen 1.5 1.3 2.0 tr 1.0 1.2 - - - - -
9. α-Pinen 18.0 17.0 22.6 19.9 24.5 13.7 12.9 14.1 tr 33.3 13.1
10. α-Fenhen - - - - - - - - - 6.4 -
11. Kamfen 3.0 2.2 3.2 3.2 4.0 2.4 6.5 6.3 - - 1.8
12. Tuja-2,4(10)-dien - tr 0.2 tr 0.3 - - - - - -
13. Sabinen 1.0 0.8 1.0 0.8 1.0 1.1 0.7 4.8 - - 0.6
14. β-Pinen 4.1 1.6 5.5 2.7 3.4 2.1 2.8 0.8 0.1 2.8 7.6
15. β-Mircen 2.2 1.4 2.6 2.4 6.1 6.9 2.6 3.2 0.1 1.2 5.0
16. α-Felandren 0.4 tr 0.5 0.3 1.0 tr 0.6 tr tr - 0.5
17. δ-3-Karen 21.3 16.3 19.8 15.5 27.9 9.9 6.4 12.0 0.8 - 35.2
18. α-Terpinen 0.6 0.3 0.4 0.2 0.3 0.5 0.8 0.3 tr - 0.6
19. p-Cimen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 - - - tr - 0.7
20. Limonen + β-Felandren 7.6 2.0 5.9 2.3 4.8 2.6 2.4 3.0 1.2 0.9 20.6
Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad
16
21. Silvestren - - - - - - 2.3 3.0 - - -
22. (Z)-β-Ocimen tr - - - - tr tr - - - -
23. (E)-β-Ocimen 0.5 tr 1.2 0.7 0.8 0.6 1.1 1.0 0.3 - 0.3
24. γ-Terpinen 0.7 0.5 0.8 0.3 0.4 0.4 0.3 0.3 0.1 - 0.6
25. p-Menta-2,4(8)-dien 0.1 tr tr tr tr - - - - - -
26. Terpinolen 5.5 3.2 4.3 2.2 3.3 3.8 1.5 2.5 0.5 - 3.6
27. Linalool 0.2 tr 0.3 tr tr - - - 0.3 - -
28. α-Pinen-oksid - - - - - - - - - 1.5 -
29. n-Nonanal tr - - - - - - - - - -
30. α-Tujon - - - - - - - - - 1.2 -
31. endo-Fenhol - - - - - - - - 0.1 - -
32. cis-p-Ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.3 - -
33. trans-Pinokarvol - tr 0.2 0.3 0.4 - - - tr - -
34. trans-p-Ment-2-en-1-ol - - - - - - - - 0.5 - -
35. Kamfor tr tr 0.5 0.4 0.5 - - - 0.2 - -
36. Kamfen-hidrat tr - - - - - - - 0.3 - -
37. cis-Hrizantenol - - - - - - - - - 1.0 -
38. Izoborneol - - - - - - - - 0.1 - -
39. trans-Pinokamfon - - - - - - - - tr - -
40. Borneol 0.2 0.5 0.7 0.3 0.5 - 0.2 tr 1.5 - -
41. p-Menta-1,5-dien-8-ol - - - - - - - - 0.5 - -
42. Terpinen-4-ol 0.9 tr tr tr tr 0.2 0.1 tr 3.6 - -
43. m-Cimen-8-ol - tr 0.2 tr tr - - - 0.5 - -
44. Kripton - - - - - - - - 0.4 - -
45. p-Cimen-8-ol tr tr tr tr tr - - - 1.6 - -
46. α-Terpineol 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 - - - 7.3 - -
47. Metil-salicilat - tr tr tr tr - - - - - -
48. cis-Piperitol - - - - - - - - 0.2 - -
49. Mirtenol tr 0.2 0.4 0.2 0.2 - - - 0.2 - -
50. trans-Piperitol - - - - - - - - 0.4 - -
51. trans-Karveol - - - - - - - - 0.2 - -
52. 2-Vinil-3-metil-anizol - - - - - - - - 0.1 - -
53. cis-Karveol - - - - - - - - 0.3 - -
54. Citronelol - - - - - - - - 0.2 - -
55. Timol-metil-etar 0.2 0.3 0.8 tr 0.2 tr tr tr 0.7 - -
56. Karvon - - - - - - - - tr - -
57. 3-Karen-2-on - - - - - - - - 0.1 - -
58. Piperiton - - - - - - - - 1.0 - -
59. Felandral - - - - - - - - 0.2 - -
Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad
17
60. Pregeijeren B - - - - - - - - 0.6 - -
61. Linalil-acetat 0.2 0.2 0.2 0.2 0.3 0.2 0.5 - - - -
62. Bornil-acetat 5.1 2.6 5.2 4.6 8.1 3.8 14.1 7.6 11.5 - 1.3
63. Izobornil-acetat - - - - - - - - - 2.0 -
64. p-Cimen-7-ol - - - - - - - - 0.3 - -
65. 2-Undekanon 0.1 - - - - - - - 0.2 0.8 -
66. Karvakrol - - - - - - - - - 1.6 -
67. izo-Dihidrokarveol-acetat - - - - - - - - 0.1 - -
68. Bicikloelemen - - - - - 0.4 0.6 0.3 - - -
69. δ-Terpinil-acetat - - - - - - - - tr - -
70. α-Kubeben - - - - - tr 0.1 - - - -
71. α-Terpinil-acetat 1.4 - - - - 1.3 1.0 0.7 2.4 3.6 -
72. β-Terpinil acetat - 0.2 0.2 0.2 0.3 - - - - - -
73. Citronelil-acetat - - - - - - - - 0.1 - -
74. α-Longipinen 0.1 - - - - - - - - - -
75. α-Kopaen 0.1 tr 1.5 tr tr 0.2 0.3 0.1 0.1 - tr
76. β-Burbonen 0.1 tr 0.2 tr 0.2 0.2 - 0.1 0.2 - -
77. β-Kubeben - - - - - - tr - - - -
78. β-Elemen 0.6 1.2 2.1 0.7 1.8 2.8 3.7 2.1 0.3 - -
79. Geranil-acetat tr - - - - - - - - - -
80. Longifolen - tr 0.5 tr tr - - - 0.2 - -
81. Junipen tr - - - - - - - - - -
82. (E)-Kariofilen 5.0 5.3 9.0 4.5 5.1 5.3 3.4 6.8 5.9 2.7 3.3
83. β-Kopaen - 0.2 0.3 0.2 0.3 0.2 0.2 0.1 - - -
84. Gvaja-6,9-diene - - - - - - - - 1.4 - -
85. Aromadendren - 0.3 1.5 tr 0.3 tr 0.1 tr 0.1 - -
86. cis-Muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - -
87. trans-Muurola-3,5-dien 0.1 - - - - - - - - - -
88. α-Humulen 0.8 tr 0.6 0.5 0.8 1.1 0.7 1.2 1.2 - 0.5
89. cis-Kadina-1(6),4-dien - - - - - 0.3 0.1 0.1 - - -
90. Seskvisabinen - - - - - - - 0.3 - - -
91. 9-epi-(E)-Kariofilen 0.2 - - - - - - - - - -
92. (E)-β-Farnezen - - - - - - 0.1 0.1 0.1 - -
93. trans-Kadina-1(6),4-dien 0.1 - - - - - - - - - -
94. cis-Muurola-4(14),5-dien 0.2 tr 0.2 tr 0.2 - 0.1 - - - -
95. β-Hamigran - 0.2 0.7 0.2 0.5 - - - - - -
96. γ-Gurjunen - tr tr tr tr - - - - - -
97. γ-Muurolen 0.2 0.4 0.6 0.2 0.3 tr - tr 0.1 3.5 -
98. Germakren D 5.6 5.5 9.9 4.0 8.4 12.1 2.8 8.0 0.6 - 0.5
Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad
18
99. β-Selinen 0.1 0.2 0.5 0.2 0.3 0.2 0.5 0.2 tr 2.1 -
100. trans-Muurola-4(14),5-
dien 0.2 - - - - 0.1 - tr - - -
101. Biciklogermakren 1.7 2.1 3.0 2.2 3.4 4.2 5.7 2.9 0.3 - -
102. γ-Amorfen - 0.2 0.3 tr 0.2 - - - - - -
103. α-Muurolen 0.6 0.6 1.0 0.3 0.4 0.6 1.5 0.3 0.3 2.4 -
104. Germakren A 0.2 - - - - - 0.2 - - - -
105. δ-Amorfen - - - - - tr - - - - -
106. Bornil-izovalerat - - - - - - - - 0.3 - -
107. γ-Kadinen 0.8 0.7 2.2 0.6 0.8 1.3 1.6 0.5 0.3 9.0 -
108. Izobornil-izovalerat - - - - - - - 1.0 0.2 - -
109. Kubebol - - - - - 0.3 - - - 1.8 -
110. δ-Kadinen 2.6 2.1 3.6 2.2 2.3 2.2 - 1.5 1.2 - 0.4
111. Zonaren 0.1 - - - - - - - - - -
112. trans-Kadina-1,4-diene 0.1 tr tr tr 0.3 0.2 - - - - -
113. α-Kadinen 0.2 0.4 0.6 tr 0.2 0.2 - tr 0.1 - -
114. Furopelargon A - - - - - - - - 0.2 - -
115. (E)-Nerolidol - 0.4 0.7 0.6 0.7 - - - 0.1 - -
116. Germakren D-4-ol 0.2 - - - - 6.1 6.0 4.1 - - -
117. Spatulenol 0.1 1.1 1.4 1.2 1.3 1.5 0.6 0.8 0.8 3.5 -
118. Kariofilen-oksid 0.1 1.5 1.9 1.7 1.8 - - 0.2 2.0 6.1 -
119. Humulen-oksid II - - - - - - - - 0.4 - -
120. β-Oplopenon - - - - - - - - - 0.8 -
121. Heksadekan - - - - - - - - tr - -
122. Juneol - tr tr tr tr - - - - - -
123. 1,10-di-epi-Kubenol tr - - - - tr 0.1 tr 0.3 - -
124. 1-epi-Kubenol tr 0.3 0.4 0.2 0.3 0.1 0.2 tr - - -
125. Kariofila-4(12),8(13)-
dien-5-ol - - - - - - - - 0.1 - -
126. epi-α-Kadinol - 0.7 1.6 0.3 0.7 0.6 1.2 0.4 1.3 - tr
127. epi-α-Muurolol 0.7 - - - - 0.9 1.4 0.7 1.3 4.6 tr
128. α-Muurolol 0.1 tr 0.2 tr tr 0.4 0.6 0.2 0.5 0.2 -
129. α-Kadinol 0.9 - - - - 1.9 3.5 1.4 4.1 4.4 tr
130. 14-Hidroksi-9-epi-(E)-
kariofilen - - - - - - - - 0.6 - -
131. Amorfa-4,9-dien-2-ol - tr tr tr tr - - - - - -
132. Heptadekan - - - - - - - - 0.2 - -
133. Oplopanon - - - - - - - - 0.1 - -
134. Benzil-benzoat - - - - - - - - 0.3 1.5 -
Jelena Stojanović______________________________________________ _______________________________________________Master rad
19
135. Oktadekan - - - - - - - - 0.2 - -
136. Izopimara-9(11),15-dien - - - - - - - - 0.1 - -
137. Nonadekan - - - - - - - - 0.1 - -
138. Pimaradien - - - - - - - 0.2 0.1 - -
139. Sandarakopimaradien - - - - - - - - 0.3 - -
140. Manoil-oksid 0.1 tr 0.2 tr 0.2 2.1 tr 0.9 1.0 - -
141. 13-epi-Manoil-oksid - - - - - - - - 2.9 - -
142. Abietatrien - - - - - - - tr 0.7 - -
143. Abietadien - tr tr tr tr - tr 0.8 0.5 - -
144. Abieta-8(14),13(15)-dien - - - - - - tr tr 0.6 - -
145. Abienol - - - - - - - - 1.6 - -
146. 2-Keto-manoil-oksid - - - - - 2.0 - - - - -
147. Sandarakopimarinal - - - - - - - - 0.3 - -
148. Okso-manoil-oksid - - - - - - - - 0.6 - -
149. Abieta-6,8(14)-dien-18-
al - - - - - - - - 8.7 - -
150. Dehidroabietal - - - - - - - - 4.3 - -
151. Abietal - - - - - - - - 0.8 - -
152. 8,13-Abietadien-18-ol - - - - - - - - 0.3 - -
153. Metil-dehidroabietat - - - - - - - - 0.2 - -
154. Dehidroabietol - - - - - - - - 0.4 - -
155. Abieta-8,13(15)-dien-18-
al - - - - - - - - 0.7 - -
Ukupno 99.4 95.8 98.30 97.1 98.6 99.8 93.7 97.5 81.2 100 96.7
Monoterpeni 75.7 55.7 63.60 64.2 68.9 51.2 58.4 61.3 35.8 56.7 90.7
Seskviterpeni 21.9 29.9 34.10 22.9 27.1 43.4 35.3 33.4 24.7 41.1 5.96
Diterpeni 0.1 0.1 0.20 0.1 0.2 4.1 tr 2.8 25.8 - -
Ostalo 1.6 3.6 6.50 5.4 8.2 0.0 0.0 0.0 0.9 2.2 -
tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo minimalne i
maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti
Jelena Stojanović Master rad
20
Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz četina krivulja
ispitivao je veliki broj autora i u većini studija je pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena
kao i u ovom radu (tabela 4.1, slika 4.2). Sa druge strane, poznato je da u etarskom ulju
srodne vrste, P. uncinata, koja pripada P. mugo kompleksu (Hamernik i Musil, 2007)
dominiraju bornil-acetat (30.2%) i α-pinen (12.2%), a u ulju P. uliginosa (bor tresavskih
močvara koji ima veoma kontraverzan taksonomski status) α-pinen (8.1%), bornil-acetat
(7.9%) i δ-3-karen (6.9%) (Bonikowski et al., 2015). Naime, prema mnogim autorima, bor
tresavskih močvara je hibrid između P. mugo i P. uncinata: hibrid na nivou vrste
(Holubičková, 1965) ili podvrste (Christensen, 1987a; 1987b; 1987c); ili hibrid između P.
mugo i P. sylvestris (Staszkiewicz i Tyszkiewicz, 1969). Iako se navedeni taksoni P. mugo
kompleksa razlikuju po svom fenotipu, geografskoj distribuciji i ekologiji (Hamernik i Musil,
2007), prethodna istraživanja na osnovu RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
markera, molekularne citogenetike i protočne citometrije ukazala su na konzervativnu
organizaciju genoma i odsustvo genetičke diferencijacije između njih (Monteleone et al.,
2006; Bogunić et al., 2011). Ipak, poređenjem dominantnih komponenti ulja P. mugo, P.
uncinata i P. uliginosa, možemo zaključiti da se svaki takson odlikuje posebnim hemotipom,
kao i da se terpenski profil P. uliginosa nalazi između P. mugo i P. uncinata, što ide u prilog
hipotezi da je reč o taksonu hibridnog porekla između ove dve bliske Pinus vrste.
Pored sastava etarskih ulja taksona P. mugo kompleksa dobijenih hidro-destilacijim,
Celiński et al. (2015) objavili su sastav terpena u četinama P. mugo, P. unicanata i P.
uliginosa na osnovu izolacije HS-SPME (headspace solid-phase microextraction). Autori su
potvrdili da se isparljive komponente četina mogu koristiti kao pouzdani taksonomski
markeri u identifikaciji ovih srodnih taksona. Utvrđeno je da su α-pinen (20.0%) i δ-3-karen
(18.1%) glavne isparljive komponente u četinama P. mugo, δ-3-karen (21.5%) i α-pinen
(16.1%) u četinama P. uliginosa, a α-pinen (28.4%) i bornil-acetat (10.8%) u četinama P.
uncinata.
Dosadašnja istraživanja sastava etarskog ulja P. sylvestris (vrsta koja se smatra
najbližom P. mugo kompleksu) ukazala su, generalno, na dominaciju α-pinena i mogu se
podeliti u dva hemotipa (grupe): hemotip bez ili sa niskom koncentracijom δ-3-karena i
hemotip sa visokom koncetracijom δ-3-karena (Thoss et al., 2007). Prema tome, drugi
opisani hemotip P. sylvestris odlikuje dominacija istih komponenti kao i P. mugo, što takođe
Jelena Stojanović Master rad
21
može da ukazuje na određeni stepen filogenetske sličnosti između ove dve vrste Dyploxlon
borova.
Iako je u većini dosadašnjih studija pokazana dominacija α-pinena i δ-3-karena u
četinama krivulja (tabela 4.1.), Ioannou et al. (2014) su objavili bornil-acetat i α-pinen kao
glavne komponente ulja P. mugo var. rostrata. Međutim, prema "The Plant List" (2013), P.
mugo var. rostrata je zapravo sinonim vrste P. uncinata, što bi se na osnovu dominantnih
komponenti ulja, takođe, moglo pretpostaviti. Ipak, veoma neobičan terpenski profil
objavljen je za P. mugo subsp. mugo iz Nacionalnog parka Majela u Italiji (Venditti et al.,
2013), u kome su bornil-acetat i terpineol glavne monoterpenske komponente ulja, dok su α-
pinen i δ-3-karen detektovani u koncentraciji manjoj od 1%. Ovo etarsko ulje se, takođe,
odlikuje neuobičajeno visokom količinom diterpena i to abietanskih derivata koji čine čak
25.8% ulja. Ovako visoka koncentracija diterpenskih jedinjenja nije utvrđena u nijednom
dosadašnjem istraživanju P. mugo. Prema Venditti et al. (2013), prisustvo više aldehidnih
diterpena kao što su abieta-6,8(14)-dien-18-al (8.7%), dehidroabietal (4.3%), abietal (0.8%) i
abieta-8,13(15)-dien-18-al (0.7%) u četinama P. mugo ima i taksonomski značaj, s obzirom
da su aldehidni diterpeni detektovani isključivo kod Pinus vrsta (npr. P. contorta, P. elliotti,
P. hunneywelli, P. ponderosa, P. rhaetica), a odsustvuju kod ostalih rodova familije Pinaceae
(Lambert et al., 2007). U svakom slučaju, u potpunosti drugačiji terpenski profil P. mugo
subsp. mugo sa Apeninskog poluostrva u odnosu na balkanski, može se objasniti i veoma
dugom izolacijom populacija krivulja iz ova dva evropska refugijuma.
Jelena Stojanović Master rad
22
Slika 4.2. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju četina P. mugo.
Jelena Stojanović Master rad
23
4.1.2. Etarsko ulje izdanaka
Prema našim istraživanjima u literaturi postoji samo jedan rad u kome je ispitavan
hemijski sastav etarskog ulja izolovanog hidro-destilacijom iz izdanaka P. mugo - populacije
sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). U populacijama sa oba planinska masiva
utvrđena je prosečna dominacija monoterpena (83.4 i 79.6%, resp.) sa δ-3-karenom (31.7 i
34.9%, resp.) i limonenom + β-felandrenom (18.3 i 19.5%, resp.) kao glavnim
komponentama. U okviru monoterpenske frakcije, u populacijama sa Šar-planine, sledeće
najzastupljenije komponente su β-pinen (11.8%) i α-pinen (8.8%), dok je u populacijama sa
Prokletija samo α-pinen utvrđen u umerenoj (6.6%), a β-pinen je detektvan u niskoj
koncentraciji (2.8%). Seskviterpenska frakcija je zastupljena sa svega 13.2 i 15.8%, resp., sa
(E)-kariofilenom kao glavnim metabolitom (6.4 i 7.2%, resp.). Dve diterpenske komponente,
manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid, detektovane su u većini populacija samo u tragovima
(Hajdari et al., 2015).
4.1.3. Etarsko ulje četina i izdanaka
Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz zajedno samlevenih četina i izdanaka P.
mugo ispitivan je manje u odnosu na ulja koja su dobijena isključivo iz četina (tabela 4.2,
slika 4.3). Bojović et al. (2016) su publikovali sastav etarskog ulja dobijenog hidro-
destilacijom iz četina i izdanaka četiri populacije P. mugo sa područja Julijskih Alpa.
Dominantnu grupu jedinjenja predstavljaju monoterpeni (79.7%), a glavne komponente su δ-
3-karen (20.7%), β-felandren (16.4%) i α-pinen (15.0%). Za ovakav rezultat možemo reći da
je u potpunosti i očekivan, ako uzmemo u obzir da su dominantne komponente etarskog ulja
četina α-pinen i δ-3-karen, a ulja izdanaka δ-3-karen i limonen + β-felandren (tabele 4.1 i
4.2). Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, β-mircen i β-pinen, detektovani su u umerenim
koncentracijama (7.8 i 5.8%, resp.). (E)-Kariofilen (5.3%) je najzastupljeniji metabolit u
okviru seskviterpenske frakcije koja čini 19.0% ulja. Manoil-oksid i 3-okso-manoil-oksid su
jedine identifikovane diterpenske komponente prisutne u koncentraciji manjoj od 1%.
Sa druge strane, Stevanovic et al. (2005) su objavili sastav ulja izolovanog
destilacijom vodenom parom iz četina i izdanaka P. mugo sa Šar-planine (Ostrovica).
Utvrđeno je da su δ-3-karen (23.9%), α-pinen (17.9%) i limonen + β-felandren (11.1%)
glavne komponente ulja, a pored njih samo je još β-pinen detektovan u koncentraciji većoj od
Jelena Stojanović Master rad
24
5%. Iako je u pitanju druga tehnika izolacije etarskog ulja (destilacija vodenom parom), kao i
činjenica da je da je u ovom radu analiziran materijal sa područja Balkanskog poluostrva
(Šar-planina), možemo primetiti sličnost u hemijskom sastavu sa uljem koje je izolovano
metodom hidro-destilacije iz četina i izdanaka populacija krivulja sa Julijskih Alpa (Hajdari
et al., 2015; Bojović et al., 2016).
4.1.4. Etarsko ulje šišarki
Hajdari et al. (2015) su, takođe, objavili hemijski sastav etarskog ulja šišarki P. mugo
u populacijama sa Šar-planine i Prokletija (tabela 4.2, slika 4.3). Monoterpeni predstavljaju
glavnu terpensku klasu jedinjenja u populacijama sa oba planinska masiva (prosečni sadržaj
40.3 i 44.8%, resp.), zatim slede seskviterpeni (31.2 i 39.8%, resp.), dok su diterpeni utvrđeni
u niskoj koncentraciji (0.9 i 1.9%, resp.). Dominantne komponente ulja, na oba planinska
masiva, su δ-3-karen (15.8 i 23.4%, resp.) i (E)-kariofilen (16.7 i 21.8%, resp.). Sledeći
najzastupljeniji metaboliti u ulju šišarki populacija sa Šar-planine su β-pinen (6.3%) i α-pinen
(4.2%), a u ulju populacija sa Prokletija α-pinen (5.1%) i germakren D (6.9%).
Primenom hijerarhijske klaster analize - HCA (hierarchical cluster analysis), Hajdari
et al. (2015) ukazuju na jasno izdvajanje tri grupe P. mugo ulja koje odgovaraju sastavu tri
biljna organa iz kojih su ulja izolovana: prva grupa uključila je ulja iz izdanaka, druga grupa
ulja četina i treća ulja šišarki. HCA je, takođe, ukazala na sličniji sastav ulja četina i šišarki u
odnosu na ulja izdanaka. Analiza glavnih komponenti - PCA (principal component analysis)
potvrdila je grupisanje P. mugo ulja u odnosu na biljni organ iz kojeg su izolovana. Na
grupisanje ulja iz četina uticao je veći sadržaj kamfena (3.0%), α-tujena (1.0%),
biciklogermakrena (2.7%), bornil-acetata (5.3%), δ-kadinena (2.5), γ-kadinena (1.0%) i
germakrena D (6.5%) u odnosu na preostale dve grupe. Ulja izdanaka odlikuje veći sadržaj δ-
3-karena (33.3%), sabinena (1.4%), limonena + β-felandrena (18.9%) i β-pinena (7.3%), dok
ulja šišarki imaju veći sadržaj β-kariofilena (18.7%), aromadendrena (1.5%) i linaloola
(1.1%), a manji sadržaj α-pinena (4.6%). Ovako velike razlike u hemijskom sastavu etarskog
ulja iz različitih biljnih organa su i očekivane, s obzirom da se različiti organi odlikuju
potpuno drugačijom ekspresijom gena koja je prilagođena funkciji datog ograna.
Jelena Stojanović Master rad
25
Slika 4.3. Varijabilnost dominantnih terpena (>5%) u etarskom ulju P. mugo poreklom iz različitih delova biljke
(četine i izdanci; izdanci; šišarke).
Jelena Stojanović Master rad
26
Tabela. 4.2. Hemijski sastav etarskog ulja P. mugo poreklom iz različitih delova biljke (četine i izdanci; izdanci; šišarke).
Takson P. mugo P. mugo P. mugo subsp.
mugo
P. mugo subsp.
mugo
P. mugo. subsp.
mugo
P. mugo subsp.
mugo
Poreklo biljnog
materijala Julijski Alpi
Kosovo, Šar-
planina (Ostrovica)
Kosovo, Šar-
planinaa) Kosovo, Prokletijea)
Kosovo, Šar-
planinaa) Kosovo, Prokletijea)
Organ Četine i izdanci Četine i izdanci Izdanci Izdanci Šišarke Šišarke
Način izolacije Hidro-
destilacija
Destilacija
vodenom parom Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija Hidro-destilacija
Referenca Bojović et al.
(2016)
Stevanovic et al.
(2005) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015) Hajdari et al. (2015)
R.br. Komponente Sadržaj (%)
min maks min maks min maks min maks
1. Triciklen 0.5 0.4 tr 0.2 tr 0.2 tr tr tr tr
2. α-Tujen 0.6 0.8 0.2 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr 0.2
3. α-Pinen 15.0 17.9 7.9 9.7 5.6 7.4 3.1 5.4 4.6 5.7
4. Kamfen 1.8 1.7 0.2 0.9 0.5 0.8 0.3 0.7 0.2 0.4
5. Tuja-2,4(10)-dien - - 0.7 1.1 0.3 0.5 0.5 0.7 0.3 2.0
6. Sabinen 1.4 1.3 1.1 2.2 1.0 1.7 0.4 0.5 0.3 0.5
7. β-Pinen 5.9 7.8 5.5 15.4 2.2 3.5 1.6 14.2 1.4 1.6
8. β-Mircen 7.8 2.7 1.6 2.3 2.7 10.3 1.1 1.6 1.1 4.6
9. α-Felandren 0.3 0.2 0.3 0.4 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr
10. δ-3-Karen 20.7 23.9 28.6 34.0 24.0 51.7 10.5 22.1 15.2 31.5
11. α-Terpinen 0.2 - 0.2 0.2 0.2 0.3 tr 0.2 tr tr
12. p-Cimen 0.2 1.1 0.4 0.6 0.3 0.4 0.3 0.4 0.3 0.5
13. Limonen + β-
Felandren 16.4 11.1 12.7 24.3 14.3 23.2 2.0 9.3 4.0 6.3
14. (E)-β-Ocimen tr tr tr tr tr 0.6 tr 0.2 tr 0.2
15. γ-Terpinen 0.4 - 0.4 0.5 0.4 0.6 0.3 0.4 0.2 0.4
16. p-Menta-2,4(8)-dien 0.3 - tr tr tr 0.2 tr tr tr tr
17. Terpinolen 3.2 0.4 2.6 2.7 2.5 4.3 0.9 2.1 1.3 2.3
18. Linalool - 0.3 tr 0.2 tr tr tr 3.6 tr tr
19. cis-p-Ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - -
20. trans-Pinokarveol - - tr 0.2 0.2 0.5 tr 0.3 tr 0.4
21. trans-p-Ment-2-en-1-ol tr - - - - - - - - -
22. Kamfor - - 0.3 0.4 tr tr tr 0.5 tr tr
23. Dekan-2-on 0.1 - - - - - - - - -
Jelena Stojanović Master rad
27
24. Borneol tr - 0.3 1.0 0.5 0.5 0.2 1.0 0.2 0.4
25. Terpinen-4-ol 0.2 1.3 0.2 0.2 0.2 0.3 tr tr tr 0.3
26. m-Cimen-8-ol - - 0.2 0.3 tr 0.3 tr tr tr 0.2
27. Kripton 0.1 1.3 - - - - - - - -
28. p-Cimen-8-ol - 0.9 0.2 0.4 0.2 0.3 tr tr tr 0.4
29. α-Terpineol tr 0.5 0.2 0.3 tr tr tr 0.8 tr tr
30. Metil-salicilat - - tr 0.3 tr 0.2 tr 0.2 tr tr
31. Mirtenol 0.1 - 0.7 1.2 0.6 0.9 tr 0.5 0.2 0.2
32. Timol-metil-etar 0.4 0.2 0.2 0.2 tr 0.2 tr 1.1 tr tr
33. Kumin-aldehid - 0.6 - - - - - - - -
34. Linalil-acetat 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 1.2 tr 0.2
35. (E)-2-Decenal 0.1 - - - - - - - - -
36. Bornil-acetat 2.8 3.2 0.4 2.6 1.8 3.0 0.5 1.5 0.8 1.3
37. 2-Undekanon tr - - - - - - - - -
38. p-Vinilgvajakol 0.4 - - - - - - - - -
39. Piperitenon - 1.2 - - - - - - - -
40. α-Terpinil-acetat 0.9 2.5 - - - - - - - -
41. β-Terpinil-acetat - - tr tr tr tr tr tr tr tr
42. Citronelil-acetat tr - - - - - - - - -
43. α-Kopaen 0.1 - tr 0.4 tr tr tr 0.2 tr tr
44. β-Burbonen - - tr 0.3 0.2 0.3 tr tr tr tr
45. β-Elemen 1.1 - 0.6 1.0 1.0 1.2 0.2 0.6 0.3 0.5
46. Longifolen - - tr 0.4 tr tr tr 2.8 tr tr
47. (E)-Kariofilen 5.3 2.4 5.9 7.3 4.0 10.9 10.4 20.5 16.6 27.0
48. β-Kopaen 0.1 - tr tr tr tr tr 1.1 tr tr
49. Aromadendren - - tr 1.2 tr 0.6 tr 3.3 tr 1.0
50. α-Humulen 0.9 0.4 0.5 1.0 tr 1.8 tr 2.6 1.8 4.5
51. trans-Kadina-1(6),4-
dien 0.2 - - - - - - - - -
52. cis-Muurola-4(14),5-
dien - - tr tr tr tr tr 0.2 tr tr
53. β-Hamigren - - tr 0.3 0.2 0.5 tr 0.5 0.7 1.2
54. γ-Gurjunen - - tr tr tr tr tr tr tr tr
55. γ-Muurolen 0.2 - tr tr tr 0.6 tr 1.1 tr 1.2
56. Germakren D 4.4 0.7 0.4 0.6 tr 6.2 0.2 3.0 1.3 12.5
57. β-Selinen tr - tr 0.2 tr tr tr tr tr tr
58. Biciklogermakren 1.9 - 0.6 0.8 0.5 1.0 tr 0.5 tr 0.4
59. γ-Amorfen - - tr tr tr 0.2 tr 0.4 tr 0.4
60. α-Muurolen 0.1 - tr 0.2 tr tr tr 0.3 tr 0.2
Jelena Stojanović Master rad
28
61. γ-Kadinen 0.5 0.8 0.2 0.2 0.2 0.4 tr 0.6 tr 0.9
62. δ-Kadinen 1.5 1.1 0.5 0.9 0.4 0.9 0.3 1.5 tr 1.8
63. trans-Kadina-1,4-dien - - tr tr tr tr tr 0.5 tr 0.3
64. α-Kadinen tr - tr tr tr tr 0.4 0.8 0.4 1.0
65. (E)-Nerolidol - - tr 0.2 tr 0.2 tr 0.4 tr tr
66. Germakren D-4-ol 1.2 - - - - - - - - -
67. Spatulenol - 1.2 0.2 0.4 tr 0.2 tr 0.3 tr 0.5
68. Kariofilen-oksid 0.2 1.6 0.20 0.60 0.20 0.40 0.02 0.50 0.02 0.70
69. Juneol - - tr tr tr tr 0.5 0.8 0.2 0.2
70. 1-epi-Kubenol - - tr tr tr tr tr tr tr tr
71. epi-α-Kadinol - 0.7 0.2 0.3 tr 0.5 0.3 0.4 0.2 0.6
72. epi-α-Murrolol 0.6 1.1 - - - - - - - -
73. α-Murrolol - - 0.2 0.3 tr 0.5 1.3 2.6 1.3 3.0
74. α-Kadinol 0.7 1.0 - - - - - - - -
75. Amorfa-4,9-dien-2-ol - - tr tr tr tr 0.2 0.5 0.4 0.7
76. Heksadekanal tr - - - - - - - - -
77. Manoil-oksid 0.1 - tr tr tr 0.2 tr 0.7 0.9 1.1
78. 3-Okso-manoil-oksid tr - - - - - - - - -
80. Abietadien - - tr tr tr 0.2 0.2 1.1 0.6 1.1
Ukupno 99.7 93.7 96.8 98.1 95.8 98.6 68.9 81.5 79.1 94.8
Monoterpeni 79.7 82.7 82.8 84.4 69.5 88.7 28.9 59.3 37.7 51.9
Seskviterpeni 19.0 11.0 11.2 14.4 8.3 24.6 19.6 40.8 24.0 55.6
Diterpeni 0.2 - - - - 0.4 0.3 1.8 1.5 2.2
Ostalo 0.8 - 0.8 3.3 2.2 3.3 1.6 3.0 1.1 1.3
tr – detektovano u tragu (<0.1%), - nije detektovano a) Hajdari et al. (2015) su istraživali sastav etarskog ulja P. mugo sa po tri raličita lokaliteta na području Šar-planine i Prokletija; u ovom radu su prikazane samo
minimalne i maksimalne vrednosti sadržaja identifikovanih komponenti
Jelena Stojanović Master rad
29
Sa druge strane, utvrđeno je da razlike između ispitivanih populacija P. mugo (tri
populacije sa Šar-planine i tri populacije sa Prokletija) nisu toliko velike, kao razlike između
organa (Hajdari et al., 2015). S obzirom na izolovanost i udaljenost (oko 100 km) ispitivanih
planina, autori su očekivali postojanje dve distinktne grupe (Šar-planina i Prokletije) na
osnovu sastava etarskih ulja iz četina, izdanaka i/ili šišarki. Multivarijantne statističke analize
nisu podržale ovu hipotezu, s obzirom da su se neki uzorci sa Šar-planine i Prokletija
grupisali zajedno. Odsustvo diferencijacije između ispitivanih populacija P. mugo može se
objasniti činjenicom da je ova vrsta imala znatno širu i kontinuiranu distribuciju na ovim
prostorima u prošlosti. Naime, sadašnji areal P. mugo predstavlja samo ostatak nekadašnjeg
većeg areala koji je značajno redukovan tokom ledenih doba u Pleistocenu. S obzirom da su
populacije sa Šar-planine i Prokletija verovatno ostaci jedne veće, stare populacije do čijeg je
razdvajanja došlo u skorijoj prošlosti, odsustvo njihove trenutne diferencijacije (na osnovu
terpenskih markera) donekle je i očekivano. Pored toga, poznato je da se četinarske vrste,
generalno, odlikuju niskim stepenom genetičke diferencijacije populacija usled efektivnog
protoka gena putem rasejavanja polena i semena (Hamrick et al., 1979).
Jelena Stojanović Master rad
30
4.2. Biološka aktivnost etarskog ulja P. mugo
4.2.1. Antimikrobna aktivnost
U odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje
P. mugo je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. U ovom odeljku
prikazan je uporedni pregled literaturnih podataka o antibakterijskoj i antifungalnoj aktivnosti
etarskog ulja krivulja.
Mnoga etarska ulja su poznata po svojim antifugalnim svojstvima zbog čega imaju
potencijalnu primenu kao antimikotici. Tampieri et al. (2005) su proučavali efikasnost 16
komercijalnih etarskih ulja i 42 čiste komponente (alkohole, aldehide, ketone, fenole i
ugljovodonike) protiv jednog soja Candida albicans korišćenjem SAAS metode (semisolid
agar antifungal susceptibility). Candida albicans je diploidna gljiva (vrsta kvasca) koja se
normalno nalazi u digestivnom sistemu čoveka. Izazivač je gljivičnog oboljenja kože,
sluzokože, noktiju i unutrašnjih organa. Kandidijaza je skoro uvek posledica autoinfekcije, tj.
infekcije gljivicama koje normalno nastanjuju čovekov organizam i koje se najčešće zbog
pada imuniteta intenzivno razmnožavaju. U pomenutom istraživanju je utvrđeno da etarska
ulja Origanum vulgare, Satureja montana, Mentha piperita, Cinnamomum verum,
Cymbopogon flexuosus pokazuju maksimalnu inhibitornu aktivnost (MIC = 500 ppm) nakon
7 dana, dok etarska ulja Santalum album i Pinus mugo ne deluju inhibitorno na rast C.
albicans čak i u najvećim koncentracijama (MIC > 5000 ppm nakon 7 dana). Prema
rezultatima ispitivanja čistih komponenti, β-felandren se pokazao kao najinteresantnija
komponenta među cikličnim monoterpenskim ugljovodonicima, s obzirom da je pokazao
snažnu antifungalnu aktivnost (MIC = 50 ppm). Najaktivniji fenol bio je karvakrol (MIC =
100 ppm), aciklični alkohol 1-dekanol je bio najaktivniji među testiranim alkoholima (MIC =
50 ppm), a među aldehidima kao najaktivniji se pokazao trans-cinamaldehid (MIC = 50
ppm).
Sa druge strane, Karapandzova et al. (2011) su testirali antimikrobni potencijal
etarskog ulja četina P. mugo sa područja Makedonije protiv 13 bakterijskih izolata
(uključujući Gram (+) i Gram (-) bakterije) i jedan soj C. albicans koristeći metodu disk
difuzije. Bujon diluciona metoda je korišćena za testiranje minimalne inhibitorne
koncentracije (MIC) etarskog ulja. Utvrđeno je da etarsko ulje P. mugo poseduje značajnu
antimikrobnu aktivnost, naročito protiv Gram (+) bakterija kao što su Streptococcus
Jelena Stojanović Master rad
31
pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus agalactiae sa minimalnim inhibitornim
koncentracijama od 15.26 µl/ml, 7.5 µl/ml i 31.25 µl/ml, resp. (Karapandzova et al., 2011).
4.2.2. Insekticidna aktivnost
Prema dostupnim literaturnim podacima, isekticidni potencijal etarskog ulja P. mugo
je veoma slabo istraživan. Naime, u recentnoj literaturi postoji samo jedan rad u kome je
testiran larvicidni potencijal 21 etarskog ulja (uključujući i ulje P. mugo) protiv moljca
duvana Spodoptera litura (Isman et al., 2001). Etarska ulja Satureja hortensis, Thymus
serphyllum i Origanum creticum uzrokovala su smrtnost preko 90% larvi u roku od 24h u
dozi od 100 µg po larvi. Toksičnost etarskog ulja Thymus vulgaris (koje nije bilo uključeno u
prvoj skrining fazi) (LD50 = 46.7 µg) uporediva je sa toksičnošću ulja T. serphyllum (LD50 =
50.0 µg) i S. hortensis (LD50 = 48.4 µg), dok je etarsko ulje O. creticum manje toksično za
larve moljca duvana u odnosu na prethodne tri vrste (LD50 = 66.0 µg). Autori smatraju da su
monoterpenski fenoli timol i karvakrol, glavne komponente etarskog ulja Thymus i Satureja
vrsta, odgovorne za utvrđenu larvicidnu aktivnost. Preostalih 18 etarskih ulja, uključujući i
ulje P. mugo, uzrokovalo je stopu smrtnosti manju od 50%.
4.2.3. Antioksidativna aktivnost
Grassmann et al. (2003) su testirali antioksidativni potencijal etarskog ulja P. mugo
pomoću nekoliko biohemijskih test sistema (npr. Fenton sistem, ksantin-oksidaza test, ili
oksidacija lipoproteina male gustine (LDL) indukovana bakrom). Rezultati su pokazali da
postoji umerena ili slaba antioksidativna aktivnost u vodenim sredinama: Fenton sistem,
formiranje superoksid radikala indukovano ksantin oksidazom ili fragmentacija 1-
aminociklopropan-1-karboksilne kiseline (ACC) indukovana hipohlorastom kiselinom
(HOCl). Nasuprot tome, u lipofilnijim sredinama (npr. fragmentacija ACC aktiviranim
neutrofilima u krvi) etarsko ulje P. mugo pokazuje dobru antioksidativnu aktivnost. Etarsko
ulje P. mugo pokazalo je dobru antioksidativnu aktivnost i u drugim lipofilnim test sistemima
npr. kod LDL oksidacije indukovane bakrom. Autori su, takođe, testirali i pojedine čiste
komponentne etarskog ulja krivulja (npr. δ-3-karen, kamfen, α-pinen, (+)-limonen i
terpinolen). Kao i etarsko ulje, one pokazuju slabu ili odsustvo antioksidativne aktivnosti u
vodenim sredinama, ali se ponašaju kao efikasni antioksidansi u odnosu na fragmentaciju
Jelena Stojanović Master rad
32
ACC aktiviranim neutrofilima u krvi ili LDL oksidaciju indukovanu bakrom. Interesantno je
da terpinolen kao komponenta koja je detektovana u niskoj koncentraciji u etarskom ulju P.
mugo značajno sprečava oksidaciju LDL.
Jelena Stojanović Master rad
33
5. ZAKLJUČCI
1. Etarsko ulje P. mugo, sa područja Kosova i Metohije (Šar-planina) odlikuje
dominacija monoterpena (75.7%) sa δ-3-karenom (21.3%) i α-pinenom (18.0%) kao
glavnim komponentama. Sledeći najzastupljeniji monoterpeni, limonen + β-felandren,
terpinolen i bornil-acetat, detektovani su u umerenim koncentracijama (7.6, 5.5 i
5.1%, resp.). Sa druge strane, germakren D (5.6%) i (E)-kariofilen (5.0%)
predstavljaju najznačajnije metabolite u okviru seskviterpenske frakcije koja čini
21.9% ulja. Manoil-oksid je jedina diterpenska komponenta detektovana u
koncentraciji manjoj od 1%. Na ovaj način, prosečan hemijski profil glavnih
terpenskih komponenti (preko 5%) u etarskom ulju četina P. mugo možemo
predstaviti na sledeći način:
δ-3-karen > α-pinen >> limonen + β-felandren > germakren D = terpinolen = bornil-
acetat = (E)-kariofilen
(>> označava razliku od 5.1-15.0%, > razliku od 1.1-5.0%, = razliku od 0.1-1.0%, prema
Petrakis et al., 2001).
2. Na osnovu dosadašnjih istraživanja možemo konstatovati da postoji velika
varijabilnost hemijskog sastava etarskog ulja koje potiče iz različitih organa, ali
istovremeno i iz različitih delova areala krivulja. Međutim, u većini dosadašnjih
istraživanja utvrđeno je da monoterpeni predstavljaju dominantnu grupu jedinjenja u
etarskom ulju P. mugo, bez obzira na tip organa iz kojeg je ulje izolovano (četine,
izdanci ili šišarke) ili poreklo biljnog materijala (populacija iz prirode ili botanička
bašta).
3. Većina dosadašnjih istraživanja ukazala je na dominaciju α-pinena (0.0 - 22.8%) i δ-
3-karena (0.8 – 35.2%) u etarskom ulju četina P. mugo. (E)-Kariofilen (2.7 – 9.0%) i
germakren D (0.0 – 12.1%) predstavljaju glavne metabolite u okviru seskviterpenske
frakcije koja čini od 6.0 – 43.4% ulja četina. Ipak, veoma neobičan terpenski profil
objavljen je za P. mugo subsp. mugo iz Nacionalnog parka Majela u Italiji, u kome su
bornil-acetat i terpineol glavne monoterpenske komponente, dok su α-pinen i δ-3-
karen detektovani u koncentraciji manjoj od 1% (Venditti et al., 2013). Ovo etarsko
ulje se, takođe, odlikuje neuobičajeno visokom količinom diterpena i to abietanskih
Jelena Stojanović Master rad
34
derivata koji čine čak 25.8% ulja. U potpunosti drugačiji terpenski profil P. mugo
subsp. mugo sa Apeninskog poluostrva u odnosu na balkanski, može se objasniti
veoma dugom izolacijom populacija krivulja iz ova dva evropska refugijuma.
4. Prema našim istraživanjima u literaturi postoji samo jedan rad u kome je ispitavan
hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz izdanaka kao i etarskog ulja šišarki P.
mugo u populacijama sa Šar-planine i Prokletija (Hajdari et al., 2015). U etarskom
ulju izdanaka utvrđena je prosečna dominacija δ-3-karena (31.7 i 34.9%, resp.) i
limonena + β-felandrena (18.3 i 19.5%, resp.). Sa druge strane, dominantne
komponente etarskog ulja šišarki, na oba planinska masiva, su δ-3-karen (15.8 i
23.4%, resp.) i (E)-kariofilen (16.7 i 21.8%, resp.).
5. Hemijski sastav etarskog ulja izolovanog iz zajedno samlevenih četina i izdanaka P.
mugo ispitivan je manje u odnosu na ulja koja su dobijena isključivo iz četina.
Dosadašnja istraživanja ukazala na dominaciju δ-3-karena (20.7 – 23.9%), α-pinena
(17.9 – 15.0%) i limonena + β-felandrena (11.1 - 16.4%), što je i očekivan rezultat,
ako uzmemo u obzir da su glavne komponente etarskog ulja četina α-pinen i δ-3-
karen, a ulja izdanaka δ-3-karen i limonen + β-felandren.
6. Takođe, za ovako velike razlike u hemijskom sastavu etarskog ulja P. mugo poreklom
iz različitih delova biljke (četine, izdanci i šišarke) možemo reći da su donekle
očekivane, s obzirom da se različiti biljni organi odlikuju potpuno drugačijom
ekspresijom gena koja je prilagođena funkciji datog ograna.
7. U odnosu na ostale vrste borova, prema dostupnim literaturnim podacima, etarsko ulje
P. mugo je relativno slabo ispitivano sa aspekta bioloških aktivnosti. Do sada je
utvrđeno da poseduje značajan antibakterijski (naročito protiv naročito protiv Gram
(+) bakterija Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes i Streptococcus
agalactiae) i antioksidativni potencijal, dok se sa druge strane odlikuje potpunim
odsustvom larvicidne aktivnosti protiv moljca duvana Spodoptera litura.
Jelena Stojanović Master rad
35
6. LITERATURA
Adams R. P. (2007). Identification of Essential Oil Component by Gas
Chromatography/Quadrupole Mass Spectrometry, Allured Publishing Corporation,
Carol Stream, IL.
Bogunić F., Siljak-Yakovlev S., Muratović E., Ballian D. (2011). Different karyotype
patterns among allopatric Pinus nigra (Pinaceae) populations revealed by molecular
cytogenetics. Plant Biology. 13, 194-200.
Bojović S., Jurc M., Ristić M., Popović Z., Matić R., Vidaković V., Stefanović M., Jurc D.
(2016). Essential oil variability in natural populations of Pinus mugo Turra from the
Julian Alps. Chemistry & Biodiversity, 13, 181-187.
Bonikowski R., Celiński K., Wojnicka-Półtorak A., Maliński T. (2015). Composition of
essential oils isolated from the needles of P. uncinata Ramond ex. Mirb and P.
uliginosa Neumann ex Wimmer grown in Poland. Natural Product Communications
10, 371–373.
Celiński K., Bonikowski R., Wojnicka-Półtorak A., Chudzińska E., Maliński T. (2015).
Volatiles as chemosystematic markers for distinguishing closely related species
within the Pinus mugo complex. Chemistry & Biodiversity 12, 1208–1213.
Christensen K. I. (1987). Taxonomic revision of the Pinus mugo complex and P. × rhaetica
(P. mugo × sylvestris) (Pinaceae). Nordic Journal of Botany, 7(4), 383-408.
European Pharmacopoeia. (1997). Biological tests. 3th ed. Paris: Council of Europe, 123–7.
Farr T. G., Rosen P. A., Caro E., Crippen R., Duren R., Hensley S., Kobrick M., Paller M.,
Rodriguez E., Roth L., Seal D., Shaffer S., Shimada J., Umland J., Werner M., Oskin
M., Burbank D., Alsdorf D. (2007). The shuttle radar topography mission. Reviews of
Geophysics, 45, RG2004.
Gašić M. J. (1985). Etarska ulja. IHTM, Beograd.
Gaussen H., Heywood V. H., Charter A. O. (1993). Pinus L. In: Tutin T. G., Heywood V. H.,
Burges N. A., Valentine D. H., Walters S. M., Webb B. A., editors. Flora Europea.
Vol. 1, 2nd edn. Cambridge University Press, Cambridge, pp. 40-44.
Jelena Stojanović Master rad
36
Grassmann J., Hippeli S., Vollmann R., Elstner E. F. (2003). Antioxidative properties of the
essential oil from Pinus mugo. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, 7576-
7582.
Hajdari A., Mustafa B., Ahmeti G., Pulaj B., Lukas B., Ibraliu A., Stefkov G., Quave C. L.,
Novak J. (2015). Essential oil composition variability among natural populations of
Pinus mugo Turra in Kosovo. SpringerPlus 4, 828.
Hamerník J., Musil I. (2007). The Pinus mugo complex–its structuring and general overview
of the used nomenclature. Journal of Forest Science, 53(6), 253-266.
Hamrick J. L., Mitton J. B., Linhart Y. B. (1979). Levels of genetic variation in trees:
Influence of life history characteristics. Presented at the Symposium on Isozymes of
North American Forest Trees and Forest Insects, Berkeley, Calif.
Holubičková B. (1965). A study of the Pinus mugo complex (variability and diagnostic value
of characters in some Bohemian populations). Preslia, 37, 276-288.
Ioannou E., Koutsaviti A., Tzakou O., Roussis V. (2014). The genus Pinus: a comparative
study on the needle essential oil composition of 46 pine species. Phytochemistry
Reviews, DOI 10.1007/s11101-014-9338-4.
Isman M. B., Wan A. J., Passreiter C. M. (2001). Insecticidal activity of essential oils to the
tobacco cutworm, Spodoptera litura. Fitoterapia, 72, 65-68.
Jalas J., Suominen J. (1973). Atlas Florae Europaeae. 2 Gymnospermae (Pinaceae to
Ephedraceae). Helsinki.
Jovanović B. (1992). Pinus L. In: Sarić M, editor. Flora Srbije 1. Srpska akademija nauka i
umetnosti, Beograd, pp. 194-208.
Karapandzova M., Stefkov G., Trajkovska Dokik E., Kadifkova Panovska T., Kaftandzieva
A., Kulevanova S. (2011). Chemical characterization and antimicrobial activity of the
needle essential oil of Pinus mugo (Pinaceae) from Macedonian flora. Planta Medica
77, PL59.
Kovačević N. (2004). Osnovi farmakognozije. Treće izdanje. Srpska školska knjiga, Beograd.
Kubeczka K.-H., Schultze W. (1987). Biology and chemistry of conifer oils. Flavour and
Fragrance Journal, 2, 137-148.
Jelena Stojanović Master rad
37
Lambert J. B., Kozminski M. A., Fahlstrom C. A., Santiago-Blay J. A. (2007). Proton nuclear
magnetic resonance characterization of resins from the family Pinaceae. Journal of
natural products, 70, 188-195.
Mirov N. T. (1967). The genus Pinus. The Ronald Press, New York.
Monteleone I., Ferrazzini D., Belletti P. (2006). Effectiveness of neutral RAPD markers to
detect genetic divergence between the subspecies uncinata and mugo of Pinus mugo
Turra. Silva Fennica, 40(3), 391–406.
Petrakis P. V., Tsitsimpikou C., Tzakou O., Couladis M., Vagias C., Roussis V. (2001).
Needle volatiles from five Pinus species growing in Greece. Flavour and Fragrance
Journal, 16, 249-252.
Petrović S., Maksimović Z., Kundaković T. (2009). Analiza sastojaka biljnih droga. Priručnik
za teorijsku i praktičnu nastavu iz predmeta Farmakognozija. Farmaceutski fakultet,
Beograd.
Reuter H. I., Nelson A., Jarvis A. (2007). An evaluation of void filling interpolation methods
for SRTM data. International Journal of Geographycal Information Science, 21, 983-
1008.
Staszkiewicz J., Tyszkiewicz M. (1969). Naturalne mieszańce Pinus mugo Turra × Pinus
sylvestris L. w Kotlinie Nowotarskiej. Fragmenta Floristica et Geobotanica, 15(2),
187–212.
Stevanovic T., Garneau F.-X., Jean F.-I., Gagnon H., Vilotic D., Petrovic S., Ruzic N.,
Pichette A. (2005). The essential oil composition of Pinus mugo Turra from Serbia.
Flavour and Fragrance Journal, 20, 96-97.
Tampieri M. P., Galuppi R., Macchioni F., Carelle M. S., Falcioni L., Cioni P. L., Morelli I.
(2003). The inhibition of Candida albicans by selected essential oils and their major
components. Mycopathologia, 159, 339-345.
Thoss V., O’Reilly-Wapstra J., Iason G. R. (2007). Assessment and implication of
intraspecific and phonological variability in monoterpene of Scots pine (Pinus
sylvestris) foliage. Journal of Chemical Ecology, 33, 477-491.
Tsitsimpikou C., Petrakis P. V., Ortiz A., Harvala C., Roussis V. (2001). Volatile needle
terpenoids of six Pinus species. Journal of Essential Oil Research, 13, 174-178.
Jelena Stojanović Master rad
38
Venditti A., Serrilli A. M., Vittori S., Papa F., Maggi F., Di Cecco M., Ciaschetti G., Bruno
M., Rosselli S., Bianco A. (2013). Secondary metabolites from Pinus mugo Turra
subsp. mugo growing in the Majella National Park (Central Apennines, Italy).
Chemistry & Biodiversity, 10, 2091-2100.
Прилог5/1
ПРИРОДНO-MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА
Редни број, РБР:
Идентификациони број, ИБР:
Тип документације, ТД: Монографска
Тип записа, ТЗ: текстуални / графички
Врста рада, ВР: мастер рад
Аутор, АУ: Јелена Стојановић
Ментор, МН: Зорица С. Митић
Наслов рада, НР: Биолошка активност и варијабилност хемијског састава етарског уља
Pinus mugo (Pinaceae)
Језик публикације, ЈП: Српски
Језик извода, ЈИ: Енглески
Земља публиковања, ЗП: Р. Србија
Уже географско подручје, УГП: Р. Србија
Година, ГО: 2017.
Издавач, ИЗ: ауторски репринт
Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.
Физички опис рада, ФО: (поглавља/страна/
цитата/табела/слика/графика/прилога)
38 страна; 5 слика; 3 табеле
Научна област, НО: Биологија
Научна дисциплина, НД: Ботаника
Предметна одредница/Кључне речи,
ПО: Pinus mugo, етарско уље, варијабилност, биолошка активност
УДК 581.5 : 544.02 + 665.52 : 582.475
Чува се, ЧУ: Библиотека Извод, ИЗ: У мастер раду је анализиран хемијски састав етарског уља изолованог
хидро-дестилацијом из четина Pinus mugo са подручја Косова и Метохије (Шар-планина). Резултати су упоређени са литературним подацима о саставу уља кривуља пореклом из различитих органа биљке. Етарско уље четина P. mugo са поментог подручја одликује доминација монотерпена (75.7%) са δ-3-кареном (21.3%) и α-пиненом (18.0%) као главним компонентама. На основу досадашњих истраживања можемо констатовати да постоји велика варијабилност хемијског састава уља које потиче из различитих органа, али истовремено и из различитих делова ареала поменуте врсте. У односу на остале врсте борова, према доступним литературним подацима, етарско уље P. mugo је релативно слабо испитивано са аспекта биолошких активности. До сада је утврђено да поседује значајан антибактеријски (нарочито против Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и Streptococcus agalactiae) и антиоксидативни потенцијал, док се са друге стране одликује потпуним одсуством ларвицидне активности против мољца дувана Spodoptera litura.
Датум прихватања теме, ДП: 17.05.2017.
Датум одбране, ДО:
Чланови комисије, КО: Председник: Др Гордана Стојановић
Члан: Др Петар Марин
Члан,
ментор: Др Зорица Митић
Прилог 5/2
ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ
НИШ
KEY WORDS DOCUMENTATION
Accession number, ANO:
Identification number, INO:
Document type, DT: Monograph
Type of record, TR: textual / graphic
Contents code, CC: master thesis
Author, AU: Jelena Stojanović
Mentor, MN: Zorica S. Mitić
Title, TI: Biological activity and variability of chemical composition of the essential oil of Pinus mugo (Pinaceae)
Language of text, LT: Serbian
Language of abstract, LA: English
Country of publication, CP: Republic of Serbia
Locality of publication, LP: Serbia
Publication year, PY: 2017
Publisher, PB: author’s reprint
Publication place, PP: Niš, Višegradska 33. Physical description, PD: (chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appendixes)
38 p.; 5 pictures; 3 tables
Scientific field, SF: Biology Scientific discipline, SD: Botany
Subject/Key words, S/KW: Pinus mugo, essential oil, variability, biological activity
UC 581.5 : 544.02 + 665.52 : 582.475
Holding data, HD: Library Note, N: Abstract, AB: This master paper includes analysis of chemical composition of essential oils
isolated from needles of Pinus mugo from the territory of Kosovo and Metohija (Šar-planina) by hydrodistillation. The results were compared to literature data on composition of P. mugo essential oils collected from different plant organs. The essential oil of P. mugo needles from the study area was characterized by dominance of monoterpenes (75.7%) with δ-3-carene (21.3%) and α-pinene (18.0%) as the main components. According to the existing studies it may be concluded that there is high variability in chemical composition of oils collected from different organs, but also from different parts of range of P. mugo. In comparison to other pine species, available literature data indicate that essential oil of P. mugo was relatively poorly studied from the aspect of biological activity. So far there is evidence of significant antibacterial (especially against Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes and Streptococcus agalactiae) and antioxidant potential, while on the other hand there was a complete absence of any larvicide activity against tobacco cutworm Spodoptera litura.
Accepted by the Scientific Board on, ASB:
17.05.2017.
Defended on, DE:
Defended Board, DB:
President: Dr. Gordana Stojanović
Member: Dr. Petar Marin
Member, Mentor: Dr. Zorica Mitić