MANUAL DEL LABORATORIO INTEGRAL DE...

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MANUAL DEL LABORATORIO INTEGRAL DE

BIOQUÍMICAS

Javier Barrios González

Francisco José Fernández Perrino

Francisco Fierrro Fierro

Octavio Loera Corral

Armando Mejía Álvarez

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Dr. Enrique Fernández Fassnacht Rector General Mtra. Iris Santacruz Fabila Secretaria General UNIDAD IZTAPALAPA Dr. Javier Velázquez Moctezuma Rector Dr. Óscar Jorge Comas Rodríguez Secretario Dr. Rubén Román Ramos Director de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud Dra. Edith Ponce Alquicira Jefe del Departamento de Biotecnología

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MANUAL DEL LABORATORIO INTEGRAL DE BIOQUÍMICAS

El presente manual responde al proceso de modificación del plan de estudio de cada una de las licenciaturas de la División de Ciencias Biológica y de la Salud. Con la participación de la comisión académica formada por los profesores que son coautores de la obra, se llegó a la integración de esta serie de prácticas, cuya secuencia de ejecución refuerza los principales conceptos teóricos de las UEA de Bioquímica Estructural, Rutas Metabólicas y Biología Molecular, que se imparten en las licenciaturas de Ingeniería de los Alimentos e Ingeniería Bioquímica Industrial. Las sesiones de laboratorio inician con la revisión de los métodos de purificación de una enzima por cromatografía, y su seguimiento a través de la medición enzimática; posterior a esta práctica se revisa el principio de cuantificación de proteínas, para después someter a las muestras seleccionadas a una separación electroforética; después la secuencia de las prácticas revisa conceptos de bioquímica a través del análisis del efecto de la desnaturalización sobre la actividad enzimática. La práctica final está diseñada para que los alumnos entiendan y aprendan los métodos de extracción de ADN, con la cuantificación y análisis de pureza respectiva. Cada práctica incluye un cuestionario de evaluación donde se pide en algunas prácticas la documentación del trabajo mediante fotografías descriptivas del trabajo realizado, información que complementará el proceso de aprendizaje y evaluación que en su momento fije el docente a cargo de dicho laboratorio. Se da también la bibliografía básica y sitios de internet con información relevante para las prácticas. Es notable la sección que cada práctica incluye para el manejo de residuos y las medidas de seguridad, para que esto quede claro desde el inicio de cada sesión en el laboratorio, cuyo objetivo es el manejo responsable y el conocimiento de los primeros auxilios, priorizando la seguridad de los alumnos, profesores y personal del laboratorio.

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INDICE

PRÁCTICA 1

Purificación de una enzima la lisozima de huevo .............................. 1

PRÁCTICA 2

Cuantificación de Proteínas .............................................................. 8

PRÁCTICA 3

Electroforesis: separación de proteínas en geles de poliacrilamida 16

PRÁCTICA 4

Efecto de la temperatura y de la reducción los puentes disulfuro

sobre la actividad enzimática ....................................................... 22

PRÁCTICA 5

Purificación y Cuantificación de ADN .............................................. 26

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PRÁCTICA 1

PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO

OBJETIVO: Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía de intercambio catiónico utilizando carboximetilcelulosa. Determinar la actividad de la lizosima en las diferentes fracciones de purificación. INTRODUCCIÓN

El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadena polipeptídica (129 aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de 14 a 30 KDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos X) y la primera para la que se propuso un mecanismo de acción detallado.

El enlace que se hidroliza por la lisozima se puede consultar en el sitio: http://es.wikipedia.org/wiki/Peptidoglicano

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de las proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una resina con carga negativa (Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con carga positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Una vez unida la proteína a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas: 1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI

2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+

en el

caso de intercambio catiónico o Cl-

para el intercambio aniónico)

2

Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las proteínas de la clara del

huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prácticamente la única proteína con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes. La CM-celulosa es, debido a la presencia de restos carboxilo ionizados a pH neutro y básico, una resina intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prácticamente la única proteína que puede unirse a la CM-celulosa. Posteriormente, puede disociarse de la resina mediante lavados con un tampón de alta fuerza iónica. MATERIALES Y METODOS

• Huevos de gallina para la obtención de la enzima. • Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10 • Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl • Carboximetil-Celulosa (CMC)

Activación de la CMC: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5 M (5 minutos), 2

veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y finalmente dos veces con H

2O (hasta pH

neutro). Por último se hace una suspension 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10 • Tampón fosfato sódico 100 mM, pH 6,2 • Suspensión de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del

tampón fosfato anterior A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA

1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A. Tomar 10 ml de la muestra anterior en un tubo cónico con tapón de 15 ml.

2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml para medir la actividad de la enzima en la fracción de partida.

3. A los 9 ml restantes (Fracción O, Fo), añadir 4 ml de CMC previamente activada y agitar suavemente durante

15 min, para que la lisozima se adsorba a la resina. 4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el sobrenadante (Fracción

1, F1 ).

5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de tampón A. Agitar suavemente y centrifugar de nuevo. Recoger el sobrenadante (Fracción 2, F

2 ).

6. Repetir el lavado anterior y desechar el sobrenadante. 7. Elución. Resuspender la CMC con 3 ml de tampón B e incubar, agitando suavemente, durante 10 minutos.

Centrifugar y recoger el eluido (Fracción 3, F3, lisozima purificada).

Almacenar de forma segura esta Fracción 3 ó F

3, se usará como material de análisis en las prácticas

posteriores.

Medir, exactamente, en tubo cónico graduado el volumen total de cada fracción.

B. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La medida de la actividad lisozima se realiza utilizando una suspensión de agregados de pared celular del

microorganismo Bacillus subtilis en concentración suficientemente elevada para atenuar, por dispersión, la

transmisión de luz monocromática a través de la cubeta de un espectrofotómetro. Al incubar esta suspensión con

lisozima, los fragmentos de pared celular se hidrolizan, originando otros más pequeños, lo que reduce la dispersión de la

luz, que se manifiesta en una reducción en la absorbancia a una longitud de onda fija de 450 nm. La actividad enzimática

es proporcional a la disminución de la absorbancia a 450 nm. Por definición, en condiciones estándar (25ºC, pH 6,2 y

0,1 M fosfato), se considera que 1 unidad de actividad enzimática de lisozima (U) produce una disminución en la

absorbancia de 0,001 en 1 minuto.

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METODO DE MEDIDA:

1. En una cubeta de espectrofotómetro, añadir 3 ml de suspensión de pared bacteriana. Meterla en el

espectrofotómetro y anotar la densidad óptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y hay que hacerlo para

cada medida.

2. Añadir 25 μl de la fracción correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e introducir la cubeta

en el espectrofotómetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al segundo minuto. Calcular la variación de

absorbancia al primer minuto (ΔA1/min) y al segundo (ΔA

2/min). Hacer la media de las dos medidas.

Anotar los resultados en la tabla siguiente:

Volúmenes

(ml)

Absorbancia

a tº 0´

Absorbancia

a tº 1´

Absorbancia

a tº 2´

ΔA1/min ΔA

2/min ΔA/min Actividad

(U)

Fo

F 1

F 2

F 3

CALCULOS:

1. Actividad de cada fracción

2. % Retención de la resina:

(Actividad F0 – Actividad F

1 x 100) / Actividad F

0 = % Retención

3. % de Recuperación:

(Actividad F3 x 100) / Actividad Fo = % Recuperación

GUARDAR TODAS LAS FRACCIONES

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Diagrama: Manejo de Residuos

D1- Recuperar para desechos a incinerar D2- Recuperar por profesor para uso posterior D3- Residuos a neutralizar y desechar en tarja

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Medidas de Seguridad

SUSTANCIA

EFECTOS NOCIVOS

PRIMEROS AUXILIOS

MEDIDAS DE PREVENCIÓN

DERRAME

DESECHO Y TRATAMIENTO Indicaciones

Generales Inhalación Contacto con

la piel Contacto con

los ojos Ingestión

HCl Se generan vapores tóxicos e irritantes de HCl cuando se calienta. Riesgos a la salud: El ácido clorhídrico y concentraciones altas de gas, son altamente corrosivos a la piel y membranas mucosas

En todos los casos de exposición, el paciente debe ser transportado al hospital tan pronto como sea posible. Ver medidas de prevención.

Mover al afectado al aire fresco. Si está consciente, suministrar oxígeno, si es posible, y mantenerlo sentado, pues puede presentarse dificultad para respirar. Si no respira, dar respiración artificial y mantenerlo caliente y en reposo, no dar a ingerir nada.

Lavar abundantemente con agua. Quitarse la bata o ropa contaminada .

Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir inmediatamente atención médica.

No provocar vómito. Si está consciente dar a beber un poco de agua continuamente, por ejemplo una cucharada cada 10 minutos. En caso de que la víctima esté inconsciente, dar respiración artificial y mantenerla en reposo y caliente.

Para su manejo es necesario utilizar lentes de seguridad y, si es necesario, guantes de neopreno, viton o hule butílico, nunca de PVA o polietileno en lugares bien ventilados. No deben usarse lentes de contacto cuando se utilice este producto. Al trasvasar pequeñas cantidades con pipeta, siempre utilizar propipetas, NUNCA ASPIRAR CON LA BOCA

Avisar al profesor del laboratorio.

Ventilar el área. Neutralizar con bicarbonato de sodio o mezcla 50:50 de hidróxido de calcio y cal. Barrer y asegurarse que los residuos se han neutralizado antes de desechar al drenaje.

Diluir con agua cuidadosamente, neutralizar con carbonato de calcio o cal. La disolución resultante puede verterse al drenaje.

NAOH

El hidróxido de sodio es irritante y corrosivo de los tejidos. Los casos más comunes de accidente son por contacto con la piel y ojos, así como inhalación de neblinas o polvo.

Ver medidas de prevención.

Retirar del área de exposición hacia una bien ventilada. Si el accidentado está inconsciente, no dar a beber nada, dar respiración artificial y rehabilitación cardiopulmonar. Si se encuentra consciente, levantarlo o sentarlo lentamente, suministrar oxígeno, si es necesario.

Lavar con abundante agua corriente, asegurándose de levantar los párpados, hasta eliminación total del producto. .

Quitar la ropa contaminada inmediatamente. Lavar el área afectada con abundante agua corriente.

No provocar vómito. Si el accidentado se encuentra inconsciente, tratar como en el caso de inhalación. Si está consciente, dar a beber una cucharada de agua inmediatamente y después, cada 10 minutos. En todos los casos de exposicion, el paciente debe ser

Para el manejo del NaOH es necesario el uso de lentes de seguridad, bata y guantes de neopreno, nitrilo o vinilo. Siempre debe manejarse en una campana y no deben utilizarse lentes de contacto al trabajar con este compuesto.

En el caso de trasvasar pequeñas

En caso de derrame, avisar al profesor del laboratorio. Ventilar el área Mezclar el sólido derramado con arena seca, neutralizar con HCl diluido, diluir con agua, decantar y tirar al drenaje. La arena puede

Para pequeñas cantidades, agregar lentamente y con agitación, agua y hielo. Ajustar el pH a neutro con HCl diluido. La disolución acuosa resultante, puede tirarse al drenaje diluyéndola con agua. Durante la neutralización se desprende

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transportado al hospital tan pronto como sea posible.

cantidades de disoluciones de sosa con pipeta, utilizar una propipeta, NUNCA ASPIRAR CON LA BOCA.

desecharse como basura doméstica.

Si el derrame es de una disolución, hacer un dique y neutralizar con HCl diluido, agregar gran cantidad de agua y tirar al drenaje.

calor y vapores, por lo que debe hacerse lentamente y en un lugar ventilado adecuadamente.

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Cuestionario Práctica 1:

1) ¿Qué reacción cataliza la lisozima? Haga un esquema del tipo de enlace que hidroliza

2) ¿Qué carga superficial tiene la CMC activada?

3) ¿Qué carga eléctrica tiene la lisozima al pH del Tampón A, ie mayor a su pI?

4) Explica qué característica de la lisozima es la base para esta purificación, es decir para

separarla de otras proteínas en la mezcla.

5) ¿Por qué se eluye la lisozima con el Tampón B? ¿Cuál es el ion clave?

6) ¿Para qué sirven los 2 lavados con Tampón A?

Para las respuestas incluya la lista de referencias consultadas.

Bibliografía

Strang R.H.C. 1984. Purification of egg-white lisozyme by ion-exchange chromatography.

Biochemical Education 12 (2): 57-59.

Young, E G (1963) Comparative Biochemistry (edited by Florkin H and Stotze H) Elsevier, New

York, 7, 25.

Warner, R C (1954) in The Proteins (edited by Neurath, - H and Bailey, K. Academic Press, New

York, p 449.

Rhodes, M B, Azari, P R and Feeney, R E (1958) J Biol Chem 230, 399.

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PRÁCTICA 2

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

OBJETIVO: Calcular la concentración total de proteínas contenida en una disolución. Con este fin, utilizaremos las muestras obtenidas en la práctica de Purificación de la Lisozima y seguiremos el método de Lowry.

FUNDAMENTO

El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas basado en la asociación de dos reacciones complementarias:

1- Reacción de Biuret. Característica de grupos aminopeptídicos. El Cu2+

, en medio alcalino y presencia de tartrato, forma complejos de coordinación de color violeta con los átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos de las proteínas. Además, estos complejos Cu-proteína provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reacción.

2- Reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato). Este reactivo es reducido, también en medio básico, por los grupos fenólicos de los residuos de tirosina presentes en las proteínas, actuando el cobre como catalizador. La reacción hace virar el reactivo a color azul oscuro, con un máximo de absorbancia en 560 y 680 nm, siendo la misma proporcional a la concentración de proteínas.

La intensidad del color dependerá por tanto de la cantidad presente en las proteínas de

grupos fenólicos (tirosina) y en menor medida grupos imidazol (histidina) e indol (triptófano), los cuales también pueden reducir al reactivo de Folin-Ciocalteu. Por lo tanto concentraciones idénticas de proteínas con diferentes contenidos en estos aminoácidos pueden dar resultados diferentes con el método de Lowry. Sin embargo, en muestras con mezclas complejas de proteínas la estimación no debe verse muy alterada.

La concentración de una solución problema puede calcularse interpolando el valor obtenido de absorbancia en una recta de calibrado, obtenida a partir de valores conocidos de concentración de una proteína y sus respectivas absorbancias.

Entre las ventajas del método de Lowry para valorar concentraciones de proteína destaca su alta sensibilidad (aunque inferior a la del método de Bradford) y su relativa sencillez. Las desventajas de este método se encuentran principalmente en que los resultados de concentración varían entre proteínas diferentes, debido a la abundancia relativa de los aminoácidos tirosina, triptófano e histidina, y además hay compuestos que pueden reaccionar con el reactivo si están presentes en la muestra, como sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos, hexoaminas, azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con sulfidrilo.

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MATERIAL

Tubos de plástico o vidrio de 10 ml

Tubos de 50 ml

Micropipetas P200 y P1000

Puntas para micropipetas

Espectrofotómetro

Celdas de 1 ml para espectrofotómetro

Papel milimetrado

REACTIVOS

• Lowry A: Na2CO

3 al 2,0% en NaOH 0,1N

• Lowry B: CuSO4 ∙ 5H2O al 1%

• Lowry C: Tartrato sódico-potásico al 2% • Reactivo de Folin-Ciocalteu: tungstato sódico y molibdato sódico en H

3PO

4 y HCl

• Albúmina: 500 μg/ml • H2O destilada

PROTOCOLO

Etapa 1. Preparar diluciones de la solución de Albúmina para hacer la recta de calibración.

A partir de la solución original (500 μg/ml) realizar diluciones con H2O destilada para obtener las siguientes concentraciones: 250, 125, 75, 25 μg/ml, para un volumen final de 400 µl. Disponer estas soluciones en 6 tubos, marcados del 1 al 6, el tubo 1 será el blanco (H2O destilada), y del 2 al 6 poner cantidades crecientes de Albúmina, desde 25 hasta 500 μg/ml. El volumen final en todos los tubos será de 400 µl.

Etapa 2. Dilución de las muestras de Lisozima cuya concentración se va a determinar

F0 y F1, como tendrán una mayor concentración de proteínas, se diluyen 100 veces (dilución

1/100) (0.1 ml fracción + 9.9 ml H2O)

F2, fracción que procede del lavado de la columna de CM y que tendrá una menor cantidad de

proteínas, se diluye 10 veces (dilución 1/10) (0.1 ml fracción + 0.9 ml H2O)

F3, fracción de lisozima pura, se diluye 50 veces (dilución 1/50) (0.1 ml fracción + 4.9 ml H2O)

Disponer estas soluciones en tubos marcados del 7 al 10, 400 µl de volumen por tubo

Etapa 3. Preparar la solución D

Solución D: 30 ml Lowry A

0.3 ml Lowry B

0.3 ml Lowry C

Etapa 4. Reacción del Cu2+

con los grupos aminopeptídicos de proteínas (Reacción de

Biuret)

Añadir a todos los tubos 2 ml de la solución D. Mezclar y mantener 15 min a temperatura ambiente

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Etapa 5. Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteu

- Añadir a todos los tubos 200 μl de reactivo de Folin-Ciocalteu diluido en agua destilada 1/1 (vol/vol) Mezclar y mantener 30 min a temperatura ambiente

Etapa 6. Medida de la densidad óptica

- Medir la densidad óptica a 640 nm de todos los tubos, ajustando el aparato a cero con el blanco (tubo 1)

Tabla 1. Esquema de diluciones y mezclas de reacción

Tubo Muestra H2O

Albúmina

500 μg/ml

Muestras

Lisozima

diluidas

Solución D

Folin-

Ciocalteu:H2O

(1:1)

1 Blanco 400 μl - - 2 ml 200 μl

2 Alb. 25 μg/ml 380 μl 20 μl - 2 ml 200 μl




6 Alb. 500 μg/ml - 400 μl - 2 ml 200 μl

7 F0 (1/100) - - 400 μl 2 ml 200 μl

8 F1 (1/100) - - 400 μl 2 ml 200 μl

9 F2 (1/10) - - 400 μl 2 ml 200 μl

10 F3 (1/50) - - 400 μl 2 ml 200 μl

CÁLCULOS

Obtener la recta de calibración, marcando los valores de absorbancia a 640 nm obtenidos frente a las concentraciones de albúmina, en papel milimetrado. Extrapolar los valores correspondientes a las distintas fracciones de la purificación para el cálculo de la concentración de proteínas, teniendo en cuenta el factor de dilución empleado.

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Relacionar los valores de Actividad de la lisozima de la Práctica 1 con los valores de concentración de la lisozima de esta práctica en las distintas fracciones. Obtener la Actividad específica.

Actividad específica: AE = U/mg de proteína

Tabla 2. Valores de absorbancia obtenidos

Nº Tubo Muestra Absorbancia a 640 nm

1 0 μg/ml

2 25 μg/ml

3 75 μg/ml

4 125 μg/ml

5 250 μg/ml

6 500 μg/ml

7 F0 (1/100)

8 F1 (1/100)

9 F2 (1/10)

10 F3 (1/50)

Tabla 3. Resultados finales

Fracciones

Volúmenes de las

fracciones de la

Práctica 1 (ml)

Concentración de

Proteína

(mg/ml)

Cantidad de

Proteína

Total (mg)

Actividad

Específica

(U/mg)

F0

F1

F2

F3

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DIAGRAMA MANEJO DE RESIDUOS


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Sustancia Efectos nocivos Primeros Auxilios

Medidas de prevención

Derrame Deshecho y Tratamiento General Inhalación

Contacto con la piel

Contacto con ojos Ingestión

Albúmina

Levemente peligroso en caso de contacto con los ojos (irritante) o inhalación

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. La bata o ropa contaminada se debe lavar antes de reusarse

Moverse a un lugar con aire fresco. Si no hay respiración practicar respiración artificial. Si la respiración es dificultosa suministrar oxígeno. Buscar atención médica si persiste el malestar.

Lavar la piel con agua. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.

Quitar lentillas de contacto. Lavar los ojos con agua durante 15 min. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.

No inducir el vómito salvo con supervisión médica. Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Si se ingirió una gran cantidad buscar un médico inmediatamente.

Usar bata y guantes. No respirar el polvo, si se genera polvo, ventilar el lugar.

Si es polvo, limpiar con papel húmedo y arrojar al contenedor de deshechos. Si es en solución, limpiar con papel y arrojar al contenedor de deshechos.

En solución puede eliminarse por el drenaje del agua corriente. Si es papel con residuos de un derrame se arroja al contenedor de deshechos.

Lisozima

Puede ocasionar reacciones alérgicas. Puede causar irritación en los ojos, la piel y el tracto respiratorio



Lavar la piel con agua. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.


No inducir el vómito salvo con supervisión médica. Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente, darle de beber 2-4 vasos de agua o leche. Si se ingirió una gran cantidad buscar un médico inmediatamente.


Si es polvo, usar un aspirador o limpiar con papel húmedo y arrojar al contenedor de deshechos. Si es en solución, limpiar con papel y arrojar al contenedor de deshechos.

En solución puede eliminarse por el drenaje del agua corriente. Si es papel con residuos de un derrame se arroja al contenedor de deshechos

Na2CO

3

Irritante en contacto con la piel, ojos, y en caso de ingestión o inhalación. Soluciones concentradas pueden causar daño permanente en la córnea, si es ingerido síntomas de vómito y diarrea, daño cardiovascular. Si es inhalado puede provocar disnea y edema pulmonar.



Lavar la piel con agua, cubrir la piel irritada con un emoliente. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.




Usar el material adecuado para eliminar el vertido sólido al contenedor de residuos tóxicos. Si es una gran cantidad neutralizar con una solución diluída de ácido acético. Finalizar la limpieza lavando con agua la superficie contaminada.

Si proviene de la limpia de un derrame se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje.

NaOH

Muy peligroso en contacto con la piel y los ojos (corrosivo, irritante), y en caso de ingestión o inhalación. En contacto con los ojos puede causar daño en la córnea o

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. La bata o ropa contaminada se

Moverse a un lugar con aire fresco. Si no hay respiración practicar respiración artificial. Si la respiración es dificultosa suministrar oxígeno. Buscar atención

Lavar la piel afectada con abundante agua, cubrir la piel irritada con un emoliente. Quitar la ropa contaminada y lavarla antes de

Quitar lentillas de contacto. Lavar los ojos con agua abundante durante al menos 15 min. Buscar ayuda médica inmediatamente.

No inducir el vómito salvo con supervisión médica. Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Si se ingirió una gran

Usar bata y guantes. Cuando se maneja en estado sólido usar mascarilla y gafas protectoras o manipular en el

Usar el material adecuado para eliminar el vertido sólido al contenedor de residuos tóxicos. Si es necesario neutralizar con

Si proviene de la limpia de un derrame se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin

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ceguera. En la piel puede producir inflamación y quemaduras. Por ingestión puede producir irritación y daños en la mucosa gastro-intestinal. Por inhalación del polvo puede producir irritación en el tracto respiratorio, con ardor, estornudos y tos; la sobreexposición puede producir daño pulmonar, ahogamiento, inconsciencia o muerte.

debe lavar antes de reusarse

médica inmediatamente.

volverse a usar. Buscar ayuda médica inmediatamente.

cantidad buscar un médico inmediatamente

interior de una campana extractora

una solución diluida de ácido acético. Usar un espray de agua para reducir vapores. Evitar que se vierta en el drenaje de agua corriente.

que se vierta en el drenaje. No eliminar por el drenaje.

CuSO4 ∙ 5H2O

Irritante en caso de contacto con los ojos o la piel, por inhalación o por ingestión. Posibilidad de causar daño en hígado y riñones.



Lavar la piel con agua, cubrir la piel irritada con un emoliente. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.




Usar el material adecuado para eliminar el vertido sólido al contenedor de residuos tóxicos. Finalizar la limpieza lavando con agua la superficie contaminada

Los residuos sólidos se almacenan en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje. Soluciones de cobre pueden concentrarse y recuperarse para su reciclaje, o bien precipitarse para desecharse como residuos químicos.

Tartrato sódico

potásico

Peligroso en caso de inhalación. Tóxico para las membranas mucosas. Levemente peligroso en caso de contacto con piel y ojos (irritante) y de ingestión


Moverse a un lugar con aire fresco. Si no hay respiración practicar respiración artificial. Si la respiración es dificultosa suministrar oxígeno. Buscar atención médica.

Lavar la piel con jabón y agua, cubrir la piel irritada con un emoliente. Buscar ayuda médica si persiste la irritación.


No inducir el vómito salvo con supervisión médica. Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Si se ingirió una gran cantidad buscar un médico inmediatamente


Usar el material adecuado para eliminar el vertido sólido al contenedor de residuos tóxicos. Finalizar la limpieza lavando con agua la superficie contaminada

Los residuos sólidos se almacenan en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje.

Reactivo de Folin-

Ciocalteu

Muy irritante en contacto con los ojos, puede causar daños en los ojos. Irritante en contacto con la piel. Contiene componentes que pueden causar daño en órganos por inhalación o por ingestión.


Moverse a un lugar con aire fresco. Si no hay respiración practicar respiración artificial. Si la respiración es dificultosa suministrar oxígeno. Buscar atención médica.

Lavar la piel con agua abundante durante al menos 10 min. Buscar ayuda médica.

Quitar lentillas de contacto. Lavar los ojos con agua abundante durante al menos 15 min. Buscar ayuda médica inmediatamente

No inducir el vómito salvo con supervisión médica. Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente, beber algo de agua. Buscar atención médica

Usar bata y guantes.

Diluir con agua y usar papel o un paño absorbente para limpiar la superficie, eliminar el papel o paño en el contenedor de residuos.

No eliminar por el drenaje. Si proviene de la limpia de un derrame se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común.

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1) ¿Qué diferencia existe entre Transmitancia y Absorbancia? ¿Cuál es la expresión

matemática que relaciona estos dos conceptos?

2) La relación entre absorbancias y concentración de proteínas ¿se mantiene lineal aunque

se incremente mucho la concentración? Haga un comentario al respecto

3) ¿Qué podemos deducir al comparar las actividades de la lisozima de la Práctica 1 con las

actividades específicas que acabamos de obtener?

4) Si utilizáramos fracciones de otra proteína diferente a la lisozima que tuvieran una

concentración inicial idéntica a las fracciones de lisozima ¿obtendríamos un resultado

idéntico al aplicarles el método de Lowry? ¿por qué? ¿de qué dependerían los resultados?

5) ¿Conoces otros métodos de medición de la concentración de proteínas?

Para las respuestas incluya la lista de referencias consultadas

BIBLIOGRAFÍA

Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. 1951. Protein Measurement with the

Folin Phenol Reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Folin, O., and Ciocalteu, V. 1927. On Tyrosine and Tryptophane Determinations in Proteins. J. Biol.

Chem. 73: 627-650

Kresge, N., Simoni, R.D. and Hill, R.L. 2005. The Most Highly Cited Paper in Publishing History:

Protein Determination by Oliver H. Lowry. J. Biol. Chem. 280: e25

16

PRÁCTICA 3

ELECTROFORESIS: SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS EN GELES DE POLIACRILAMIDA

OBJETIVO: utilizar la técnica de la electroforesis en gel para analizar la purificación de la enzima lisozima. Se analizará la composición proteica de las distintas fracciones y se constatará el grado de pureza de la lisozima. FUNDAMENTO

La electroforesis es la migración de iones en un campo eléctrico. Es una de las técnicas analíticas más importantes dentro de la Bioquímica. Las moléculas biológicas (ADN, proteínas, vitaminas, etc.) poseen cargas eléctricas, y por tanto poseen esta propiedad de movilidad en un campo eléctrico. La movilidad dependerá de la carga que presentan al pH que trabajemos. La electroforesis en gel es el método más conveniente para realizar separaciones de macromoléculas (ADN y Proteínas). El soporte de la electroforesis (el gel) es un entramado tridimensional que impide o reduce la difusión. Este gel ha de ser compatible con los tampones usados y debe permitir la entrada del líquido en los poros (reticulados hidratables).

Los soportes pueden ser más o menos restrictivos según que el tamaño de poros limite o impida el paso de las moléculas. Los más restrictivos, como los geles de acrilamida-bisacrilamida, oponen impedimento al paso de las moléculas, participando así en el proceso de separación. Entre los menos restrictivos está la agarosa. El tamaño de poro que da unas dimensiones moleculares de criba de los geles puede ser establecido previamente. El gel en la electroforesis retarda, en mayor o menor medida, a las moléculas mayores respecto a las de menor tamaño. Las separaciones moleculares están pues basadas en el tamizado molecular junto a la movilidad electroforética de las moléculas que van a ser separadas.

Para llevar a cabo la electroforesis se necesita: A) una fuente de Tensión que proporciona

el campo eléctrico, mediante dos electrodos, positivo (ánodo) y negativo (cátodo), entre los que se establece la diferencia de potencial. B) una cubeta o recipiente, en cuyos extremos se sitúan los electrodos. C) un soporte electroforético. D) el tampón de electroforesis: durante la electroforesis se produce electrolisis del agua, generándose protones en la proximidad del ánodo e iones hidroxilos en la proximidad del cátodo; el tampón evitará que el entorno anódico se acidifique y el catódico se haga más básico a lo largo de la electroforesis.

El polímero utilizado para la formación del gel es la acrilamida y la bis-acrilamida, los cuales se polimerizan mediante la adición de catalizadores (persulfato amónico, TEMED). En nuestro caso, la separación de las proteínas se verá condicionada sólo por su tamaño y no por su carga ya que previamente las proteínas serán desnaturalizadas utilizando un detergente (SDS), el cual despliega a las proteínas y se queda pegado a su superficie confiriéndole una gran carga negativa. Esa gran carga negativa enmascara la carga intrínseca de la proteína, y las proteínas una vez tratadas con SDS presentan todas la misma carga, y la separación será debida solamente a la masa molecular de la proteína. PROTOCOLO

La separación electroforética se lleva a cabo según el método descrito por Laemmli (1970) en geles de poliacrilamida Gel de separación: poliacrilamida 16%

- Acrilamida (30%) 5.33 ml - Bis-acrilamida (1%) 1.32 ml - Tampón de separación 4X 2.54 ml - H

20 0.81 ml

- TEMED 20 μl - Persulfato amónico 50% 20 μl

Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales.

17

Cubrir, cuidadosamente con agua (utilizar una pipeta Pasteur) para delimitar el frente. Esperar a que el gel polimerice.

Gel concentrador: poliacrilamida 3%

- Acrilamida (30%) 1 ml - Bis-acrilamida (1%) 1 ml - Tampón de empaque 2X 5 ml - H

20 3 ml

- TEMED 10 μl - Persulfato amónico 50% 20 μl Retirar el agua. Verter, cuidadosamente, la acrilamida entre los cristales. Colocar los peines y esperar a que polimerice. Retirar los peines.

El volumen final de los geles es aproximadamente 10 ml, para la preparación de 2

cristales. El tampón de separación se prepara 4X porque se diluye 4 veces en el volumen final de 10 ml. El tampón de empaque está preparado 2X, se diluye dos veces en el volumen final.

PROTOCOLO

A 20 μl de la Fracción 3 (Práctica 1) se le añaden, en un tubo Eppendorf, 20 μl de tampón de carga (MIXER): (Tris-HCI 0,125 M, pH 6,8; SDS 4%; glicerol 20%; 2-mercaptoetanol 10%; Azul de bromofenol 0,008%).

Calentar las muestras a 95°C durante 3 min. Calentar también el estándar de proteínas que puede incluir las siguientes proteínas: Albúmina sérica bovina (66kD), Ovoalbúmina (40kD) y Lisozima (16 kD). Estos estándares de tamaño de peso molecular varían de acuerdo a la marca comercial, pero son necesarios para asignar el peso molecular a las muestras analizadas (ver ilustración más abajo).

Cargar en pocillos independientes 20 μl de F3 y 10 μl del estándar de proteínas

Correr la electroforesis en tampón Tris-HCl 0,025 M, pH 8,8, glicina 0,192 M y SDS 0,1%, a una intensidad de corriente constante de 30 mA hasta que el azul de bromofenol esté aproximadamente, a 5 mm del extremo inferior del gel.

Desmontar el gel y teñirlo con metanol/acético/H20 (5/1/5) con azul de Coomassie (1

g/l). Desteñir el gel en metanol/acético/H

20 (10/10/80).

Para consultar cómo se ensambla un gel y la cámara de electroforesis se recomienda consultar el siguiente sitio antes de la práctica: http:// www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20-%20Cap13%20PAGE.pdf

Para estimar el peso molecular de una proteína, o el rango en el que se encuentra, se hace referencia a la movilidad relativa (abreviada como Mr o Rf) de un grupo de proteínas conocidas en el mismo gel (estándares de peso molecular en Kilodaltons o KDa). En la siguiente liga se muestra un ejemplo de marcadores de peso molecular (proteínas conocidas) usados como estándares de tamaños de proteínas: http://www.upch.edu.pe/facien/fc/.

http://www.upch.edu.pe/facien/fc/

18



19


SUSTANCIA

EFECTOS NOCIVOS

PRIMEROS AUXILIOS


DERRAME


Generales Inhalación Contacto

con la piel Contacto con

los ojos Ingestión

ACRILAMIDA

Es un potente neurotóxico, absorbido totalmente por la piel y sus efectos son acumulativos. La poliacrilamida una vez formada se considera no tóxica

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito.

Trasladar a la persona al aire libre. En caso de asfixia proceder a la respiración artificial. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.

Lavar abundantemente con agua. Quitarse la bata o ropa contaminada


Beber agua abundante. Provocar el vómito. Pedir inmediatamente atención médica.

Se debe usar bata, guantes, tapabocas, máscara durante su manejo. Una vez polimeriza, se considera no tóxica

Avisar al profesor del laboratorio. Limpie con un cepillo o escoba sin levantar polvo, vertiéndolo en una bolsa de plástico. Ventile y limpie con agua el sitio del derrame

Si es polvo que proviene de la limpia de un derrame se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje. Los geles (polimerizados) que lo contienen se desechan en bolsas de plástico

BIS-ACRILAMIDA

También es un potente neurotóxico, absorbido totalmente por la piel y sus efectos son acumulativos. La poliacrilamida una vez formada se considera no tóxica



Lavar abundantemente con agua y jabón.

Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir inmediatamente atención médica

Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Pedir inmediata atención médica.

Se debe usar bata, guantes, tapabocas, máscara durante su manejo. Una vez polimeriza, se considera no tóxica

Avisar al profesor del laboratorio. Limpie con un cepillo o escoba sin levantar polvo, vertiéndolo en una bolsa de plástico. Ventile y limpie con agua el sitio del derrame


SDS (dodecil-sulfato de sodio)

Detergente que es irritante para la piel, vías respiratorias y piel.

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. La bata o ropa contaminada se debe lavar antes de reusarse:


Lavar abundantemente con agua y jabón.

Lavar con agua abundante (mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos

Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Pedir inmediata atención médica.

Se debe usar bata, guantes, tapabocas, máscara durante su manejo en su forma de polvo.

Avisar al profesor del laboratorio. Limpie con un cepillo o escoba sin levantar polvo, vertiéndolo en una bolsa de plástico. Limpie con agua el sitio del derrame


PERSULFATO AMÓNICO

Oxidante e Irritante a los

En caso de pérdida del

Trasladar a la persona al aire

Lavar con agua

Lavar con agua abundante

Enjuagar la boca con

Mantener lejos de otros

Avisar al profesor del

Si se proviene de la limpia de un derrame

20

ojos, vías respiratorias y piel

conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. La bata o ropa contaminada se debe lavar antes de reusarse.

libre. En caso de asfixia proceder a la respiración artificial. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.

abundante y jabón.

(mínimo durante 15 minutos), manteniendo los párpados abiertos. Pedir inmediatamente atención médica.

abundante agua si la persona está consciente. Pedir inmediata atención médica.

reactivos flamables. Usar bata y guantes. Evitar el contacto con la piel

laboratorio. Limpie con un cepillo o escoba sin levantar polvo, vertiéndolo en una bolsa de plástico. Limpie con agua el sitio del derrame.

se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje. Los geles que lo contienen se desechan en bolsas de plástico.

TEMED

Irritante a los ojos, vías respiratorias y piel, causa quemaduras. Es flamable.

En caso de pérdida del conocimiento nunca dar a beber ni provocar el vómito. . La bata o ropa contaminada se debe lavar antes de reusarse


Lavar con abundante agua y jabón.


Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Pedir inmediata atención médica..

Mantener lejos de otros reactivos flamables. Usar bata y guantes. Evitar el contacto con la piel

Avisar al profesor del laboratorio. Cubra el área del derrame con cal, arena o sosa. Estos productos deben estar secos. Recoja todo este material y póngalo en un contenedor cerrado (bote de basura con una bolsa) fuera del laboratorio y donde no haya posibilidad de chispas que provoquen la ignición del TEMED. Ventile y limpie el área cuando ya no haya restos del TEMED.

Si se proviene de la limpia de un derrame se almacena en frascos como residuos tóxicos, evitando la mezcla con basura común, sin que se vierta en el drenaje. Los geles que lo contienen se desechan en bolsas de plástico

β-MERCAPTO-ETANOL

Irritante de vías respiratorias y piel, especialmente para los ojos,


. Trasladar a la persona al aire libre. En caso de asfixia proceder a la respiración artificial. En caso de que persista el malestar, pedir atención médica.

Lavar con abundante agua y jabón


NO induzca el vómito, Enjuagar la boca con abundante agua si la persona está consciente. Pedir inmediata atención médica.

Se debe usar bata, guantes, tapabocas, máscara durante su manejo. Evite aspirar los vapores y trabaje en zonas bien ventiladas.

Avisar al profesor del laboratorio. Absorba con ayuda de papel o servilletas, póngalo en un recipiente cerrado de residuos peligrosos.

Si se proviene de la limpia de un derrame, el papel absorbente se almacena en recipientes cerrados como residuos tóxicos para su posterior incineración, evitando la mezcla con basura común. Los geles que lo contienen se desechan en bolsas de plástico.

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1) Haga un esquema de cómo se ven las bandas de una muestra de un estándar de tamaño

molecular, es decir, cómo es el patrón electroforético de estas muestras, por ejemplo del

marcador de peso moleculares que se usó en esta práctica (mencione la marca comercial).

2) Incorpore una fotografía descriptiva del gel obtenido en esta práctica.

3) ¿Qué grupos químico en la estructura del SDS le confiere la carga negativa?

4) ¿En qué productos domésticos se encuentra el SDS?

5) ¿Qué función tiene el β-mercaptoetanol durante la preparación de la muestra antes de la

electroforesis?

6) ¿A qué equivale un Dalton en el peso molecular de una proteína?

7) ¿Por qué el colorante Azul de Coomassie se adhiere a las proteínas pero no al gel de

poliacrilamida?

8) ¿Por qué dos proteínas con el mismo número de aminoácidos pueden tener tamaño

distinto?


Bibliografía:

Laemmli U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacteriophage T4. Nature 227(5259): 680-685, doi: 10.1038/227680a0

Bradford, M.M. (1976), Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248–254, doi:10.1016/0003-

2697(76)90527-3

Noble, J.E.; Bailey, M.J.A. (2009). Quantitation of Protein, Methods Enzymol. 463: 73–95,

doi:10.1016/S0076-6879(09)63008-1

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http://dx.doi.org/10.1016%2FS0076-6879%2809%2963008-1

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PRÁCTICA 4

EFECTO DE LA TEMPERATURA Y DE LA REDUCCIÓN DE LOS PUENTES DISULFURO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

OBJETIVO: estudiar la contribución de los enlaces disulfuro y puentes de hidrógeno a la conformación del centro activo de la lisozima y su efecto sobre la actividad de la enzima. La lisozima es una proteína globular constituida por una sola cadena polipeptídica, su estructura presenta 4 hélices α y 1 hoja extendida β. Esta proteína presenta cuatro puentes disulfuro cruzados que contribuyen a su elevada estabilidad.

El DTT (ditiotreitrol) es un reductor de puente disulfuro. Por tanto, su adición en concentración suficiente, reducirá los -S-S- de la lisozima y producirá cambios en la estructura terciaria de la proteína. Estos cambios pueden afectar a la actividad enzimática de la lisozima.

Por otra parte, los puentes de hidrógeno también están implicados en el mantenimiento de la estructura de las proteínas. Estos puentes de hidrógenos se pueden romper fácilmente por tratamiento con calor. Del mismo modo al caso anterior, la modificación de la estructura de la proteína por rotura de los puentes de hidrógeno puede modificar la actividad del enzima.

PROTOCOLO El estudio se lleva a cabo en la fracción F

3 purificada en la práctica 1.

1. Preparar 4 tubos Eppendorf numerados del 1 al 4 y pipetear las cantidades adecuadas según se indica en la tabla siguiente:

Tubo Fracción F3 DTT (0.5 M)* 50°C/30min

1 200μl - -

2 200μl 20μl -

3 200μl - +

4 200μl 20μl +

* La concentración de DTT de 0.5M es concentración inicial (75 mg/1000 ml) Los tubos 1 y 2 se mantienen a temperatura ambiente Los tubos 3 y 4 se calientan a 50ºC durante 30 min. 2. Medir la actividad. 1. En una cubeta de espectrofotómetro, añadir 3 ml de suspensión de pared bacteriana (Bacillus subtilis). Leer en el espectrofotómetro a 450 nm y anotar la densidad óptica (D.O.). Esta medida constituye el tiempo cero y hay que hacerlo para cada medida. 2. Añadir 25 μl de la fracción correspondiente a ensayar, tomar el tiempo por el reloj, agitar e introducir la cubeta en el espectrofotómetro y anotar la absorbancia observada al primer minuto y al segundo minuto. Calcular la variación de absorbancia al primer minuto (ΔA

1/min) y al segundo

(ΔA2/min). Hacer la media de las dos mediciones.

Anotar los resultados en la tabla siguiente: Tubo Absorbancia a

tº 0´ Absorbancia a

tº 1´ Absorbancia a

tº 2´ ΔA

1/min ΔA

2/min _

ΔA/min Actividad

(U)/200 ml

1

2

3

4

23


D1- Recuperar para desechos a esterilizar D2- Recuperar por profesor para uso posterior D3- Residuos a neutralizar y desechar

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SUSTANCIA

EFECTOS NOCIVOS

PRIMEROS AUXILIOS


DERRAME


Generales Inhalación Contacto con


los ojos Ingestión

DTT (ditiotreitrol) Corrosión / irritación cutáneas

Lesiones oculares graves / irritación ocular

Tratar sintomática-mente.

Salir al aire libre Si la respiración es difícil, darle oxígeno Consultar inmediatamente un médico si los síntomas aparecen.

Lavar inmediatamente con mucha agua por lo menos durante 15 minutos Consultar inmediatamente un médico si los síntomas aparecen

Enjuagar inmediatamente con abundancia de agua, también debajo de los párpados, por lo menos durante 15 minutos Consulte al médico

NO provocar vómitos Consulte al médico

Utilizar gafas, guantes y ropas de protección adecuados para evitar la exposición de los ojos y la piel.

Avisar al profesor del laboratorio. Empapar con material absorbente inerte Guardar en contenedores apropiados y cerrados para su eliminación

Eliminar, observando las normas locales en vigor. Eliminar los recipientes vacíos para la reutilización local, la recuperación o para la eliminación de los residuos.

Bacillus subtilis

Microorganis-mo no patógeno

Llevar a cabo prácticas estándar de seguridad microbiológica

Acudir al servicio médico

En contacto con la piel, lavar con alcohol al 70% y luego con agua y jabón. Cuando se producen heridas por cortes o pinchazos con agujas o cristales rotos, se deberá lavar rápidamente el área afectada con jabón desinfectante y agua durante 15 minutos.

Lavar con agua y acudir al servicio médico

Acudir al servicio médico

No comer, beber ni fumar en las áreas de trabajo.

El laboratorio debe mantenerse limpio y ordenado. La suciedad, el polvo, y el desorden ocasionan riesgos para la seguridad

Estricta-mente prohibido pipetear con la boca.

Absorba o cubra el material derramado con toallas desechables. Limpie el área utilizando toallas empapadas en desinfectante (por ejemplo, alcohol al 70%).

Ponga todos los materiales utilizados como placas, tubos, muestras y otros tanto en el trabajo como en un posible derrame y descontami-nación en un recipiente para esterilizar en autoclave

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1) ¿Qué aminoácidos forman puentes disulfuro en la estructura de una proteína?

2) ¿Qué otros enlaces débiles estabilizan la estructura terciaria de una proteína, además de

los mencionados puentes de hidrógeno?

3) Entre mayor es el número de puentes disulfuro que presenta una proteína, mayor será su

… (Complete)

4) ¿Qué resultados esperaría si no hubiera reducido los puentes disulfuro?

5) Defina brevemente la energía de activación de una enzima.

6) Es posible calcular la energía de activación de una enzima mediante la ecuación de

Arrhenius. Explique.


Bibliografía:

Morris J Gareth (1993). Fisicoquimica para Biologos, Editorial Reverté. ISBN 968670809X

Donald Voet and Judith G. Voet (2005) Biochemistry, 3rd Edition. Swarthmore College. ISBN 978-0-471-19350-0 R Wetzel, L J Perry, W A Baase, and W J Becktel (1988) Disulfide bonds and thermal stability in T4 lysozyme. PNAS vol. 85 no. 2 401-405.

http://www.pnas.org/search?author1=R+Wetzel&sortspec=date&submit=Submit

http://www.pnas.org/search?author1=L+J+Perry&sortspec=date&submit=Submit

http://www.pnas.org/search?author1=W+A+Baase&sortspec=date&submit=Submit

http://www.pnas.org/search?author1=W+J+Becktel&sortspec=date&submit=Submit

26

PRÁCTICA 5

PURIFICACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN OBJETIVO: Extraer ADN a partir de Bacillus subtilis y cuantificarlo por un método espectrofotométrico. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar las bandas de ADN. Etapa 1. AISLAMIENTO DE ÁDN INTRODUCCION Los ácidos nucléicos son macromoléculas que se encuentran tanto en el núcleo como en el citoplasma celular. Por ello, para su aislamiento es necesario digerir previamente las membranas citoplasmáticas y nuclear con un detergente adecuado. Este detergente a su vez desnaturaliza las proteínas asociadas a los ácidos nucléicos. Una vez que ha actuado el detergente, se trata la solución con disolventes orgánicos (fenol, cloroformo, alcohol isoamílico, etc.). Tras una centrifugación, en el precipitado (fase orgánica más densa) quedan los lípidos de membrana, en la interfase quedan las proteínas desnaturalizadas y en el sobrenadante (fase acuosa menos densa) quedan disueltos los ácidos nucléicos. Se separa el sobrenadante y se añade alcohol absoluto, el cual insolubiliza el ADN, que va quedando en forma de fibras. MATERIALES Y REACTIVOS

• Cultivo de Bacillus subtilis • DNAzol® Reagent (reactivo preparado para aislar el ADN en un solo paso. Contiene

un detergente, derivado de la guanidina, que hidroliza al ARN y es selectivo para la obtención de ADN a partir de lisados celulares. Los disolventes orgánicos de este reactivo son no fenólicos, obviando la toxicidad del mismo)

• Etanol 100% • Etanol 95% • NaOH 8 mM • HEPES 1 M

PROTOCOLO

Utilice guantes en todo momento 1. Se añade 1 ml de DNAzol® Reagent a 1-3 × 10

7 células en suspensión (volumen

menor a 0.1 ml). 2. Las células se lisan por pipeteo suave. 3. Se centrifuga 10 minutos a 5000 rpm. 4. Se quita todo el sobrenadante con cuidado de no llevarnos el precipitado y se pasa a un

tubo Eppendorf limpio. 5. Se precipita el ADN con 500 μl de etanol al 100 % (se mezcla por inversión). 6. Se deja a temperatura ambiente 1-3 minutos. 7. Se toma, con la punta de una pipeta, la madeja de ADN que se forma, y se pasa a un

nuevo tubo Eppendorf dejándolo en la pared del tubo para que escurra bien. 8. Se deja 1 minuto escurriendo y a continuación se recoge con una pipeta el líquido que

excedente, desechándose. 9. Se lava la madeja de ADN 2 veces con 800 μl de etanol al 95 %, invirtiendo los tubos

de 3-6 veces. Se dejan 1 minuto en reposo y se quita el etanol con la pipeta, desechándolo.

10. Se dejan los tubos abiertos 10 minutos, para que se evapore el resto del etanol. 11. Se disuelve el ADN con 500 μl de NaOH 8 mM (con la pipeta, muy despacito,

aspirando y soltando). 12. Finalmente, se ajusta el pH con 15 μl de HEPES 1 M.

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13. Se separan 15 μl para la etapa 3 de la práctica y con los 500 μl restantes se continúa con la etapa 2.

Etapa 2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE ADN POR ESPECTROFOTOMETRÍA

INTRODUCCION Para cuantificar el ADN obtenido, se debe analizar en un espectrofotómetro su absorbencia a longitudes de onda de 260 y 280 nm. La lectura a 260 nm permitirá calcular la concentración de ácidos nucléicos, mientras que la lectura a 280 nm es significativa de la presencia de proteínas en la solución. Como referencia, se toma una OD260.corresponde aproximadamente a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, 40 μg/ml de ARN o de ADN de cadena sencilla y 20 μg/ml de un oligonucleótido. La proporción de la lectura entre 260 y 280 (OD260/OD280) proporciona una estimación de la pureza del acido nucléico. Una preparación pura de ADN tendría una OD260/OD280 de 1.8. Si se tratara de ARN el valor OD260/OD280 sería superior, próximo a 2.0. Si hay contaminación con proteínas, fenol o cualquier otra solución empleada durante la extracción del ADN, el valor de la relación OD260/OD280 sería menor a 1.8 y la cuantificación del ADN no sería precisa. En esos casos podría procederse a un paso extra de purificación o bien utilizarse un método alternativo de cuantificación MATERIALES

•ADN obtenido previamente Agua destilada.

PROTOCOLO

1.- Se toman 2 ul de la muestra de ácidos nucléicos y se agregan 98 ul de agua desionizada. 2.- Se mezcla y se transfiere a una cubeta.de cuarzo. 3.- Se mide la absorbencia a 260 nm en el espectrofotómetro. Si el valor es superior a 0.4 deben hacerse diluciones de la solución inicial. 4.- Para analizar la pureza de la muestra, se toma una segunda lectura de la muestra, pero esta vez a 280 nm.

CALCULOS

Determinar la concentración del ADN en la solución y la relación OD260/OD280 de la misma.

Etapa 3. SEPARACIÓN Y VISUALIZACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS POR ELECTROFORESIS

EN GELES DE AGAROSA. INTRODUCCION Se pueden detectar fácilmente pequeñas diferencias entre moléculas similares de ADN y ARN separándolas mediante electroforesis en gel. En muchos tipos de geles, la movilidad electroforética de un fragmento de ADN es inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases, dentro de un cierto límite. Se utilizan geles de poliacrilamida para separar fragmentos de hasta unos mil pares de bases, y geles más porosos, de agarosa, para resolver mezclas de fragmentos mayores. La agarosa es un polímero lineal, procedente de las algas rojas, en el que se alternan D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa. Una característica importante de estos geles es su alto poder de resolución. Además es posible visualizar los ácidos nucléicos separados en el gel si a éste se le añade bromuro de etidio durante su preparación. El bromuro de etidio es un compuesto fluorescente con capacidad de intercalarse entre los pares de bases de los ácidos nucléicos, haciendo posible su visualización cuando el gel es iluminado con luz ultravioleta.

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Como del bromuro de etidio es un compuesto altamente cancerígeno, en esta práctica se utilizará

un reactivo alternativo denominado SYBR SafeTM

, con el que se visualizarán las bandas de ADN.

MATERIALES Y REACTIVOS

• Agarosa

• SYBR Safe TM

• Tampón de electroforesis 10×TAE:

- 0.4 M Tris-acetato - 0.02 M EDTA

• Tampón de carga: - 25% Ficoll - 25 mM EDTA - 0.25% Xileno cianol - 0.25% Azul de bromofenol

PROTOCOLO Preparación del gel. Se utilizará un gel de agarosa al 1.5 %. Para prepararlo:

1., Se añaden 2.25 g de agarosa a 150 ml de tampón de electroforesis TAE, se mezcla bien y se calienta en una parrilla hasta que la agarosa se disuelva sin que llegue a hervir. 2. Cuando no esté tan caliente se añaden 7.5 μl de SYBR Safe y se remueve para que se mezcle. 3. Mientras tanto se prepara la placa donde se va a polimerizar el gel, sellando sus extremos con cinta adhesiva e introduciendo el peine para formar los pocillos. 4. Una vez que la agarosa no esté tan caliente se vierte sobre la placa y se deja polimerizar. 5. A continuación se saca el peine con cuidado y se retira la cinta adhesiva.

Electroforesis. 1. Se añaden 5 μl de tampón de carga a 5 μl de ADN aislado previamente. 2. Se introduce la muestra en el pocillo con ayuda de una punta y una micropipeta. 3. Se separan las muestras en tampón 1× TAE a 90 voltios durante 45-60 min. 4. Una vez terminada la electroforesis, el gel se visualiza en un transiluminador con luz

ultravioleta. Las bandas de ADN se verán de color verde.

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DIAGRAMA MANEJO DE RESIDUOS

D1- Recuperar para desecho por compañía de manejo de sustancias peligrosas D2- Recuperar por profesor para uso posterior D3- Residuos a neutralizar y/o desechar en tarja o basura normal

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Medidas de seguridad

SUSTANCIA

EFECTOS NOCIVOS

PRIMEROS AUXILIOS


DERRAME


generales Inhalación Contacto con


los ojos Ingestión

ÁCIDO ETILEN DIAMINO

TETRAACÉTICO (EDTA)

Peligroso en caso de inhalación (irritante pulmonar). Ligeramente peligroso en caso de contacto cutáneo (irritante), de contacto con los ojos (irritante) o de ingestión.

Nunca haga que una persona inconsciente vomite o beba líquidos.

En caso de inhalación, trasladar al aire libre a la persona afectada. Si no está respirando, administre respiración artificial. Si la respiración es dificultosa, dar oxígeno. Solicite atención médica de inmediato.

Lavar con agua fría y jabón. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Busque atención médica si se desarrolla irritación.

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante agua fría durante al menos 15 minutos. Solicite atención médica de inmediato si se desarrolla irritación.

NO provocar el vómito a menos que lo indique expresamente el personal médico. Si se ingieren grandes cantidades de este material, llamar inmediatamente al médico. Aflojar las ropas apretadas, tales como collares, corbatas o cinturones. Busque atención médica si aparece algún síntoma.

Use gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y ropa y guantes apropiados, resistente a productos químicos. Debe existir la posibilidad de proporcionar un lavado de emergencia de los ojos: es necesario disponer de una fuente y una regadera de presión en el área de trabajo.

Avisar al profesor del laboratorio. Diluir con agua y limpiar, o absorber con un material inerte seco y colocar en un contenedor de residuos adecuado. Si es necesario, neutralizar el residuo con una solución diluida de carbonato de sodio. Terminar la limpieza vertiendo agua en la superficie contaminada.

Elimine de acuerdo con las regulaciones aplicables.

AGAROSA Peligroso en caso de ingestión. Ligeramente peligroso en caso de contacto cutáneo (irritante), con los ojos (irritante), o por inhalación.



Lavar con agua y jabón. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Busque atención médica si aparece irritación.

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante agua durante al menos 15 minutos. Busque atención médica si se produce irritación.

NO provocar el vómito a menos que lo indique expresamente el personal médico. Si se ingieren grandes cantidades de este material, llamar inmediatamente al médico. Aflojar las ropas apretadas, tales como collares, corbatas o cinturones.


Avisar al profesor del laboratorio. Utilice las herramientas adecuadas para poner el sólido derramado en un recipiente de recuperación apropiado. Terminar la limpieza vertiendo agua en la superficie contaminada.


AZUL DE BROMOFENOL

Ligeramente peligroso en caso de contacto cutáneo (irritante), con los ojos (irritante) o por ingestión o inhalación.


En caso de inhalación, trasladar al aire libre a la persona afectada. Si no está respirando,

Lavar con agua y jabón. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Busque atención médica si

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante

NO provocar el vómito a menos que lo indique expresamente el personal médico.

Use gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y ropa y guantes

Avisar al profesor del laboratorio. Utilice las herramientas adecuadas para


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administre respiración artificial. Si la respiración es dificultosa, dar oxígeno. Solicite atención médica de inmediato.

aparece irritación. agua durante al menos 15 minutos. Busque atención médica si se produce irritación.

Si se ingieren grandes cantidades de este material, llamar inmediatamente al médico. Aflojar las ropas apretadas, tales como collares, corbatas o cinturones.

apropiados, resistente a productos químicos. Debe existir la posibilidad de proporcionar un lavado de emergencia de los ojos: es necesario disponer de una fuente y una regadera de presión en el área de trabajo.

poner el sólido derramado en un recipiente de recuperación apropiado. Terminar la limpieza vertiendo agua en la superficie contaminada.

DNAZOL® REAGENT

Peligroso en contacto con la piel y los ojos y, probablemente, con un efecto tóxico moderado por ingestión o inhalación. En contacto con ácidos se liberan gases muy tóxicos. Puede producir gases peligrosos, como óxido nitroso y cianuro, por calentamiento. Evítese el contacto con la piel y los ojos


En caso de inhalación, trasladar al aire libre a la persona afectada. Vigilar la aparición de dificultades respiratorias y, si es necesario, iniciar la respiración artificial. Solicite atención médica si los síntomas o molestias persisten.

Retire la ropa contaminada y limpie el exceso de solución de la piel. Lave el área con agua durante 10-15 minutos. Use la ducha de seguridad para descontaminar grandes áreas de superficie corporal, con agua corriente y jabón no abrasivo. Obtener atención médica si el malestar o los síntomas persisten.

Verificar y retirar lentes de contacto. Enjuague con agua en un lavaojos durante al menos 15 minutos, manteniendo los párpados abiertos. No utilice ungüento para los ojos. Obtener atención médica si los síntomas o el malestar persisten.

Retirar las prótesis dentales, si las hubiera. Haga que la persona (sólo si está consciente) beba 2-4 vasos de leche o agua o leche. Provoque el vómito metiendo el dedo en la garganta, y cuando se produzcan vómitos, mantenga la cabeza más baja que las caderas, para evitar aspiración. Si la persona está inconsciente, gire la cabeza hacia un lado. Busque atención médica de inmediato.


Avisar al profesor del laboratorio. Diluir con agua y limpiar, o absorber con un material inerte seco y colocar en un contenedor de residuos adecuado.

Mantenga en contenedores sellados entre el uso y su disposición final. Puede ser incinerado en un incinerador de residuos peligrosos equipado con controles apropiados para los óxidos de azufre y nitrógeno. En bajas concentraciones, se esperaría que se degrade en las instalaciones de tratamiento biológico de aguas residuales

ETANOL Provoca irritación severa en los ojos. Puede causar sensibilización dolorosa a la luz, conjuntivitis química y daños en la córnea. Causa irritación moderada de la pie y cianosis de las extremidades. Por ingestión, puede causar irritación


Retirar de la exposición y trasladar al aire libre a la persona afectada. Si no está respirando, administre respiración artificial. Si la respiración es dificultosa, dar oxígeno. Solicite atención médica.

Retire la ropa contaminada y limpie el exceso de solución de la piel. Lave el área con agua durante 10-15 minutos. Use la ducha de seguridad para descontaminar grandes áreas de superficie corporal, con agua corriente y

Lave inmediatamente los ojos con abundante agua durante al menos 15 minutos. Levante suavemente los párpados y lávelos continuamente con agua. Busque atención médica.

NO induzca el vómito. Haga que la persona (sólo si está consciente) beba varios vasos de agua o leche. Busque atención médica.

Use gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y ropa y guantes apropiados, resistente a productos químicos. Debe existir la posibilidad de proporcionar un lavado de

Avisar al profesor del laboratorio. Absorber el derrame con material inerte (ej. vermiculita, arena o tierra), luego colóquelo en un recipiente adecuado. Retire todas las fuentes de ignición del


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gastrointestinal, con náuseas, vómitos y diarrea y toxicidad sistémica con acidosis. Puede causar depresión del sistema nervioso central, caracterizada por la excitación, seguida de dolor de cabeza, mareos, somnolencia y náuseas. En etapas avanzadas puede provocar un colapso, inconsciencia, coma y posible muerte, debido a insuficiencia respiratoria. La inhalación de altas concentraciones puede causar efectos en el sistema nervioso, caracterizados por náuseas, dolor de cabeza, mareos, pérdida del conocimiento y coma. Causa irritación del tracto respiratorio. Puede causar efectos narcóticos en alta concentración. Los vapores pueden causar mareos o sofocación. Líquido inflamable.

NO use la respiración boca a boca.

jabón no abrasivo. Obtener atención médica si el malestar o los síntomas persisten.

emergencia de los ojos: es necesario disponer de una fuente y una regadera de presión en el área de trabajo.

alcance y no utilice herramientas que generen chispas. Ventile el área. Puede utilizarse una espuma supresora de vapor para reducir los vapores.

FICOLL Puede causar irritación en los ojos, la piel y el tracto digestivo. Las propiedades toxicológicas de esta sustancia no han sido plenamente investigadas. Por inhalación, puede causar reacción alérgica respiratoria e irritación del tracto respiratorio.


Retirar de la exposición y trasladar al aire libre a la persona afectada. Si no está respirando, administre respiración artificial. Si la respiración es dificultosa, dar oxígeno. Solicite atención médica.

Lavara inmediatamente la piel con abundante agua durante al menos 15 minutos, mientras se quita la ropa contaminada y los zapatos. Lávese la ropa y limpie a fondo los zapatos antes de usarlos nuevamente. Si la irritación persiste, solicite atención médica.

Lave inmediatamente los ojos con abundante agua durante al menos 15 minutos. Levante suavemente los párpados y lávelos continuamente con agua. Busque atención médica.

NO induzca el vómito. Haga que la persona (sólo si está consciente y alerta) beba 2-4 vasos de leche o agua. Busque atención médica.

Use gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y ropa y guantes apropiados, resistente a productos químicos. Debe existir la posibilidad de proporcionar un lavado de emergencia de los ojos: es necesario disponer de una fuente y una regadera de presión en el área de

Avisar al profesor del laboratorio. Aspire o barra el material y colóquelo en un contenedor apropiado para su eliminación. Limpie los derrames inmediatamente, observando las precauciones indicadas en la columna de protección. Evite que se den condiciones de mucho polvo,


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trabajo. aunque debe proporcionarse ventilación en el área afectada.

HEPES Peligroso en caso de ingestión. Ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), los ojos (irritante) o por inhalación.


Permita a la víctima descansar en un área bien ventilada. Busque atención médica inmediata

En caso de contacto con la piel, lavar inmediatamente con abundante agua fría y jabón no abrasivo. Tenga especial cuidado de limpiar los pliegues, grietas, pliegues y la ingle. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Si la irritación persiste, busque atención médica. Lave la ropa contaminada antes de su reutilización.

Lave inmediatamente los ojos con agua corriente fría, durante al menos 15 minutos, manteniendo los párpados abiertos.

NO provocar el vómito. Aflojar las ropas apretadas, tales como collares, corbatas o cinturones. Si la víctima no está respirando, lleve a cabo la respiración boca a boca Solicite atención médica de inmediato.




HIDRÓXIDO DE SODIO (NaOH)

Muy peligroso en caso de contacto con la piel (corrosivo, irritante y permeabilizador), ojos (irritante, corrosivo) y en caso de ingestión. Ligeramente peligroso en caso de inhalación (sensibilizador del pulmón). En líquido o como espray puede causar daño a los tejidos, sobre todo en las mucosas: membranas de los ojos, la boca y el tracto respiratorio. En contacto con la piel puede producir quemaduras. La inhalación de gotas del líquido puede producir irritación severa del tracto respiratorio, caracterizada por tos, asfixia, o falta de aliento. Una severa sobreexposición puede causar la muerte. La inflamación de los ojos se caracteriza por



Lave inmediatamente la piel con abundante agua durante al menos 15 minutos, mientras se quita la ropa contaminada y los zapatos. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Lávese la ropa y limpie a fondo los zapatos antes de usarlos nuevamente. Solicite atención médica de inmediato.

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante agua fría durante al menos 15 minutos, manteniendo los párpados abiertos. Para terminar, enjuague bien con agua corriente para evitar una posible infección.. Solicite atención médica de inmediato.

NO provocar el vómito a menos que lo indique expresamente el personal médico. Si se ingieren grandes cantidades de este material, llamar inmediatamente al médico. Aflojar las ropas apretadas, tales como collares, corbatas o cinturones. Solicite atención médica de inmediato.


Avisar al profesor del laboratorio. Diluir con agua y limpiar, o absorber con un material inerte seco y colocar en un contenedor de residuos adecuado. En caso necesario, neutralizar el residuo con una solución diluida de ácido acético.


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enrojecimiento, lagrimeo y picor. La inflamación de la piel se caracteriza por picazón, descamación, enrojecimiento o aparición ocasional de ampollas.

SYBR SAFE De acuerdo a las especificaciones del fabricante, no es un producto tóxico.


En caso de inhalación, trasladar al aire libre a la persona afectada.

Lave inmediatamente la piel con abundante agua durante al menos 15 minutos.

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante agua fría durante al menos 15 minutos, manteniendo los párpados abiertos.



Avisar al profesor del laboratorio. Diluir con agua y limpiar, o absorber con un material inerte seco y colocar en un contenedor de residuos adecuado.


TRIS Ligeramente peligroso en caso de contacto con la piel (irritante), ojos (irritante), o por ingestión o inhalación.



Lavar con agua fría y jabón. Cubrir la piel irritada con un emoliente. Busque atención médica si aparece irritación

Verificar y retirar los lentes de contacto. Lave inmediatamente los ojos con abundante agua durante al menos 15 minutos. Busque atención médica si se produce irritación.





XILENO CIANOL Muy peligroso en caso de contacto con la piel (irritante, corrosivo y permeabilizador) y ojos (irritante). Peligroso también en caso de de ingestión, de inhalación. En líquido o

Nunca haga que una persona inconsciente vomite o beba líquidos..

Permita a la víctima descansar en un área bien ventilada. Busque atención médica inmediata

Si el compuesto químico se encuentra en la parte del cuerpo con ropa, quitar la ropa contaminada lo antes posible, protegiendo sus

Verificar y retirar lentes de contacto. Enjuague con agua en un lavaojos durante al menos 15 minutos, manteniendo los párpados abiertos.

NO provocar el vómito. Examine los labios y la boca de la víctima, para comprobar si los tejidos están dañados (un

Use gafas de seguridad resistentes a salpicaduras y ropa y guantes apropiados, resistente a productos químicos.

Avisar al profesor del laboratorio. Diluir con agua y limpiar, o absorber con un material inerte seco y colocar en un contenedor de


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en espray puede causar daño a los tejidos, particularmente en las mucosas de ojos, boca y tracto respiratorio. En contacto con la piel puede producir quemaduras. La inhalación de gotas del líquido puede producir una severa irritación de las vías respiratorias, caracterizada por tos, asfixia o falta de aliento. Una severa sobreexposición puede causar la muerte. La inflamación de los ojos se caracteriza por enrojecimiento, lagrimeo y picor. La inflamación de la piel se caracteriza por comezón, escamadura, enrojecimiento o aparición ocasional de ampollas. Material inflamable.

propias manos y el cuerpo. Coloque a la víctima bajo la ducha. Si el químico se encuentra sobre la piel expuesta de la víctima (por ejemplo, en las manos): lavar suavemente la piel contaminada con agua corriente fría y jabón no abrasivo. Tenga especial cuidado en limpiar los pliegues, grietas y la ingle. Si la irritación persiste, busque atención médica. La ropa contaminada debe lavarse antes de ser reutilizada.

No utilice ungüento para los ojos. Solicite inmediatamente atención médica.

posible indicio de que el material tóxico fue ingerido). La ausencia de estos signos, sin embargo, no es concluyente. Afloje la ropa, como collares, corbatas o cinturones. Si la víctima no respira, realizar la respiración boca a boca. Busque atención médica inmediata.

Debe existir la posibilidad de proporcionar un lavado de emergencia de los ojos: es necesario disponer de una fuente y una regadera de presión en el área de trabajo.

residuos adecuado. Si es necesario, neutralizar el residuo con una solución diluida de carbonato de sodio.

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1) ¿Cuál es el propósito de tratar las células con un detergente?

2) ¿Qué características tiene la guanidina y cómo funciona?

3) ¿Por qué precipita el ADN en presencia de etanol?

4) Describe métodos alternativos de purificación del ADN.

5) Describe algún método alternativo de cuantificación del ADN.

6) ¿Cuáles son los objetivos de la electroforesis?

7) Haga un esquema del enlace entre dos monómeros de la agarosa e incorpore una

fotografía descriptiva de la cámara de electroforesis usada en esta práctica.

8) ¿Cómo se favorecería la migración de un fragmento grande de ADN en un gel de agarosa?

¿Y de uno pequeño?.

9) ¿Hay alguna otra técnica de biología molecular en que se usen colorantes para cuantificar

el ADN?

Para las respuestas incluya la lista de referencias consultadas

Bibliografía Textos Lewin B. 2001. Genes, VII. Oxford University Press Lodish H, Darnell J., Berk A. Zipursky L., Matsudaira P. y Baltimore D. 2002. Biología celular y molecular, 4ª ed. Médica Panamericana. México Nelson DL y Cox MM. 2000. Lehninger Principios de Bioquímica, 3ª ed. Ed. Omega. Primrose SB, Twyman RM y Old RW. 2001. Principles of Gene Manipulation, 6ª ed. Blackwell Science. Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. 2001. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

MANUAL DEL LABORATORIO INTEGRAL DE...

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