Manual de Practicas Instrument Ales y as

8/8/2019 Manual de Practicas Instrument Ales y as

1/132

Manual de prcticasde qumica analtica II

Jos Ramn Verde Calvo Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes Frida Malpica Snc h ez

Casa abierta al t iempo

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPA

OS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia [email protected]


2/132

Ramn Verde Calvo es egresadode la Facultad de Qumica de laUNAM, en donde obtuvo su ttulode qumico farmacutico bilogo,

tecnlogo en alimentos. Poste-riormente realiz sus estudios demaestra en la Facultad de Cienciasde la UNAM. Actualmente trabaja

en la UAM-Iztapalapa en el grupo de Enologa y Ali-mentos Fermentados, en donde lleva a cabo investiga-ciones sobre el cambio en el color del vino tinto du-rante el aejamiento.

Mara de Lourdes Escamilla Hur-tado realiz sus estudios de licen-ciatura en la Facultad de Qumicade la UNAM, obteniendo el ttulode qumica farmacutica biloga,orientacin en Tecnologa de Ali-mentos. Posteriormente obtuvo sugrado de maestra en la Universi-

dad de Hiroshima, Japn, en el rea de Tecnologa deFermentaciones. Posteriormente se ha desarrolladoprofesionalmente como profesora-investigadora en laUniversidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapa-lapa, desde 1982, dirigiendo proyectos sobre fermen-taciones lcticas en alimentos indgenas tradicionales,produccin de aromas por fermentacin y enologa, delos cuales surgieron diversas publicaciones nacionalese internacionales. Tambin ha ejercido la docencia, tantoen la UAM-Iztapalapa como en la Facultad de Qumicade la UNAM, formando recursos humanos en los cam-pos de microbiologa y biotecnologa alimentaria.



3/132OS RESERVADOS 2004, Universidad Autnoma Metropolitana (Mxico). Prohibida la reproduccin de esta obra as como la distribucin y venta fuera del mbito de la UAM. E-libro Bibliomedia [email protected]


5/132

Manual de prcticas dequmica analtica II



6/132

UNIVERSIDAD AUTN OM A METROPOLITANA

Dr. Jos Luis Gzquez MateosRector General

Lic. Edmundo Jacobo MolinaSecretario General

UNIDAD IZTAPALAPADr. Luis Mier y Tern CasanuevaRector

Dr. Eduardo Carrillo HoyoSecretario

Dr. Jos Luis Arredondo FigueroaDirector de la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud

Dr. Gerardo SaucedoJefe del Departamento de Biotecnologa

Ma. del Rosario Hoyos AleaJefa de la Seccin de Produccin Editorial

Casa abierta al tiempo



7/132

Manual de prcticas dequmica analtica II

Jos Ramn Verde Calvo

Ma. de Lourdes Escamilla Hurtado

Alberto Reyes Dorantes

Frida Malpica Snchez

guc i



8/132

Cuidado de la edicin y correccin de estilo:Ma. Guadalupe Olvera Arellano

Primera impresin: 1999

UNIVERSIDAD AUTNOMA METROPOLITANAUNIDAD IZTAPALAPAAv. Michoacn y La PursimaIztapalapa, 09340, Mxico, D.F.

ISBN: 970-654-363-5Impreso y hecho en Mxico /Printed in Mxico



9/132

ndice

Presentacin 9

Captulo 1.CROMATOGRAFA DE GASES 11

Prctica 1. Anlisis cualitativo de cromatografa

de gases (dos columnas) 33

Prctica 2. Factor de respuesta en cromatografa de gases 37

Bibliografa 40

Captulo 2.CROMATOGRAFA LQUIDA DEALTA RESOLUCIN 43Prctica 3. Cuantificacin de una muestra problema de anisaldehdo(mtodo del patrn interno) 63

Prctica 4. Separacin y cuantificacin de una muestra de antocianinas(mtodo del patrn externo) 69

Bibliografa 74

Captulo 3.ESPECTROFOTOMETR A 75

I. VISIBLE ULTRAVIOLETA 77

Prctica 5. Desarrollo de un mtodo espectrofotomtrico 85Prctica 6. Determinacin por espectrofotometra de laconcentracin de cobalto y nquel en una mezcla 91



10/132

II . TURBIDIMETRA 95

Prctica 7. Cuantificacinturbidimtrica de sulfates 97

Bibliografa 101

Captulo 4-MTODOS ELECTROQUMICOS 103

Prctica 8. Determinacin potenciomtnca de constantes

de ionizacin 113

Prctica 9, Titulacin potenciomtnca del ferrocianuro con ceno 117

Bibliografa 125



11/132

Presentacin

El presente manual tiene como meta apoyar de la manera ms amplia el cuterico-prctico de Qumica Analtica II, materia que se imparte en el setrimestre de las carreras de ingeniera en alimentos e ingeniera bioqumicadustrial. El material est elaborado pensando en el sistema trimestral deUniversidad Autnoma Metropolitana, hecho que no restringe que cuquier curso de qumica analtica impartido en otra escuela pueda utilizar ematerial.

En el manual se abordan temas como: cromatografa de gases y de lquide alta resolucin, espectrofotometra y potenciometra. Cada captulo eestructurado con una introduccin (los fundamentos tericos necesarios pcomprender los temas incluidos en la parte prctica), y presenta la descripde los aparatos a utilizar, as como la forma correcta de operarlos.

El texto se compone de nueve prcticas, estructuradas con objetivos, intduccin, material y reactivos, normas y reglas de seguridad, tcnicas, tratamide datos experimentales, cuestionario y bibliografa. Esta ltima se presenfinal de cada captulo e incluye textos de autores reconocidos, as como revcon artculos actualizados de apoyo a los experimentos.

Para la obtencin de mejores resultados, se recomienda relacionar apliamente los conceptos tericos con las actividades experimentales.

Los autores



12/132


13/132

Captulo1

CROMATOGRAFADEGASES



15/132

Introduccin

Este captulo tiene como objetivo mostrar al alumno los fundamentos prcticde la cromatografa de gases: cmo funciona un cromatgrafo con detectorconductividad trmica y cmo se obtiene e interpreta el cromatograma, icluyendo una explicacin sobre los clculos para cuantificar muestras a parde compuestos puros.

La cromatografa de gases es la tcnica ms utilizada entre los mtodoinstrumentales de separacin, ya que identifica de manera sencilla y rpida

nmero de componentes de una mezcla. El nico requisito para su implmentacin es que las sustancias a separar sean estables a la temperatura ncesaria para mantenerlas en estado gaseoso (Ewing, 1979).

Clasificacin de la cromatografa

Por sus caractersticas analticas la cromatografa puede ser:

a) Crom atografa cualitativa, que consiste solamente en la separacinde los componentes de una mezcla.b) Cromatografa cuantitativa o analtica, que permite identificar ycuantificar cada uno de los componentes de la mezcla.

De acuerdo con la naturaleza de la fase estacionaria, la cromatografa dgases se divide en dos:

a) Cromatografa gas slido (CGS), tambin conocida comocroma-tografa de adsorcin, en donde la fase estacionaria cuenta con unmaterial slido como el slice granular, la almina o el carbn. El soluse adsorbe en la superficie de las partculas slidas. Las separaciones llevan a cabo sobre adsorbentes, debido a que se crea un equilibrioentre el adsorbente y las molculas de la fase mvil. Si las molculas dun componente estn estrechamente ligadas al adsorbente, la sustanc



16/132

Manual de prcticas de qumica analtica II

no correr por la columna ya que es retenida fuertemente por sta. Simolculas tienen una baja atraccin por el adsorbente, tendern a movecon rapidez junto con la fase mvil (figura 1.1).

Soluto absorbido en lasuperficie de la faseestacionaria

Figura 1.1Cromatografa de adsorcin.

La tabla siguiente muestra algunos ejemplos de columnas capilares comciales, utilizadas en cromatografa gas slido, mencionando su aplicacy la temperatura m xima de trabajo.

Tabla 1.1Columnas capilares comerciales.

Columna

H P S o M

Poraplot Q

Poraplot U

TemperaturaMxima

200 C

250 C

190C

Aplicacin

Hidrocarburos, gas natural

Alcoholes voltiles enagua,gases

Compuestos vo ltiles polares,aldehidos

HP Hewlett PackardColumnas capilares, soporte; A12O3

14



17/132

Cromatografa de gases

b) Cromatografa gas lquido (CGL) o cromatografa de reparto, endonde la fase estacionaria es una capa delgada de un lquido no volticolocada sobre un soporte slido (figura 1.2).

La fase estacionaria forma una pelcula delgada en la superficie de usoporte slido. El soluto se equilibra entre este lquido estacionario una fase mvil gaseosa. La cromatografa de reparto o de particinpresenta grandes ventajas, comparada con la cromatografa de adsorcies mucho ms reproducible y, gracias a que el coeficiente de particise hace constante en un margen ms amplio de concentraciones, permique las bandas sean ms definidas y mucho ms simtricas.

Soluto disuelto en la faselquida que recubre lasuperficie del soporteslido

Figura 1.2Cromatografa de reparto.

El soporte slido ideal no debe tener efecto en el procesocromatogrfico, slo debe servir como matriz mecnica para la faslquida. El soporte ms comn es la tierra de diatomeas, tambin conoccomo kieselguhr, material muy poroso que contiene muchos grupooxidrilo libres en su superficie.

15



18/132


Componentes importantes de un cromatgrafo de gases

Uno de los puntos ms importantes a considerar en la cromatografa dees el grado de separacin que puede lograrse entre diferentes componenuna columna dada. Son varios los factores que pueden influir en la sepadeseada: dimensiones de la columna, temperatura, velocidad de flujo dacarreador, volumen de la muestra y cada de presin en la columna.

Existen dosdiferentes tipos de columnas: las empacadas y las capilares.En las primeras el soporte se encuentra empacado en tubos de acero inoxo vidrio, que comnmente tienen un dimetro de 3 a 6 mm y de uno a

metros de longitud. Las columnas con mayor dimetro son utilizadas en tde preparacin para obtener una mayor cantidad de compuestos separEn las columnas capilares la longitud es mucho mayor, pudiendo llega100 metros con un dimetro de 0.1 a 0.3 mm. Estas ltimas se caracteriztener un mayor nmero de platos tericos, lo que implica mejor resolmenor tiempo de anlisis y una mayor sensibilidad, aunque la cantidmuestra por correr debe ser menor (Harris, 1992).

Se pueden emplear muy diversos soportes slidos y fases lquidascionarias. La eleccin depende bsicamente de la naturaleza de los compque se desean separar (tabla 1.2). La literatura informa acerca de gran cade soportes slidos que han resultado satisfactorios, y de un nmero aunde lquidos para la fase estacionaria. El lquido estacionario debe produreparto diferencial de los diversos componentes de la mezcla de ensposeer suficiente poder de disolucin sobre los componentes en estadoPor supuesto, el lquido estacionario no ha de ser voltil a las temperatutrabajo, pues de otra manera se evaporara abandonando la columnatiene inters por profundizar en este tema, se pueden consultar los trabBens (1961), donde describe algunas propiedades y caractersticas dsoportes ordinarios. Rohrschneider (1971) report una clasificacin de lalquidas en funcin de su polaridad, y propuso una escala de 0 a 100 enel escualeno es tomado como cero y el oxidipropionitrilo como cien.

La temperatura necesaria para efectuar la separacin de una mezcldeterminada por dos factores: el grado de separacin que se considere suy el tiempo razonable para el anlisis. En general, cuanto ms baja es peratura mayor es la separacin de los componentes, y mayor tambin el

16



19/132


de retencin de estos ltimos en la columna. Rowan (1961), al igual que Des(1965) y muchos otros autores (Meloan, 1973), analizan el efecto de ltemperatura en la cromatografa de gases.

La velocidad de flujo del gas portador vara con cada anlisis y puede cambpara diferentes tipos de compuestos por analizar. Tal velocidad influye en cuantificacin de la altura equivalente de un plato terico (AEPT). Para lcolumnas empacadas de 0.63 cm de dimetro, se recomiendan flujos de 40100 ml/min, que debern regularse con una precisin mayor de 1 ml/min.

Losgases portadores que se utilizan con ms frecuencia son: nitrgeno,helio, argn y dixido de carbono. Su eleccin se basa, al menos en parte, el factor econmico, pero un criterio ms importante es el tipo de detecto

empleado. Para un detector de conductividad trmica, los gases adecuadson: nitrgeno, hidrgeno, argn y helio. El hidrgeno presenta altos valoresconductividad trmica, factor muy importante en la deteccin de compuestpero debido a su explosividad no es recomendable para la docencia. El hetambin tiene un alto valor de conductividad trmica, pero es un recurso nrenovable y de costo elevado. En cambio, el nitrgeno se utiliza ampliamenpor ser barato e inocuo, a pesar de no tener un valor alto de conductividatrmica.

17



20/132


Tabla 1.2Fases e stacionarias lquidas de uso comn encroma tografa de gases.

NombreComercial

Escualeno

Apienzon L

SE-30

OV-1

UCW-982

DC-200

OV-101

SP-2100

SE-52 0 SE-54

Dexsii 300

OV-17

OV-25

OV-210

Carbowax20M

Carbowax20MTPA

Carbowax1500

SilariOC

Descripcin

Escualeno

Apienzon L

100%goma de silicona

100% goma de silicona

goma del 99% m etil, 1 % vinil

100%de metil silicona lquida



fenilo al 5%

Metil carbonato de silicona

Metil fenil silicona al 50%

Metil fenil silicona al 75%

3,3,3-trifluoropropilo al 50%

polietilen glicol

polietilen glicol modificadocon cido tereftlico

polietilen glicol

Cianopropil silicona al 100%

Polaridad*

I

I

I

I

II

II

II

II

II

II

II

III

III

IV

IV

IV

IV

TemperaturaIquido/C

20/100

50/300

50/300

50/300

0/300

0/250

0/350

0/350

50/300

50/450

0/375

0/350

0/275

60/225

60/250

40/200

0/250

* I a IV de menor a mayor polaridad.

18



21/132


La muestra lquida se introduce en el cromatgrafo inyectndola con ujeringa a travs de un septo de goma, la temperatura vaporiza la muestra ygas acarreador lo lleva a lo largo de la columna. Las columnas analticas requide 0.1 a 10 jal de muestra lquida, mientras que las columnas para trabapreparativo llegan a utilizar de 20 a 1000 jil. Las muestras gaseosas requiede jeringas con cierre hermtico o vlvulas de muestreo de gases. Para el traanaltico se utilizan volmenes de 0.5 a 10 mi de gas, y para el anlisis preparalos volmenes pueden aumentar hasta un litro (Harris, 1992).

Detector de conductividad trmica. La capacidad de enfriamiento de ungas est basada en la facilidad que tiene para transferir el calor que absorcualidad representada por su valor de conductividad trmica. Entre ms grasea el valor, la capacidad para transmitir el calor ser mejor. Por lo tanto, ssuministra una cantidad constante de energa elctrica al filam ento del detecsu temperatura estar en funcin de la conductividad trmica del gas acarreaCon un gas puro, la temperatura del filamento es constante, pero al presentcambios en la composicin del gas, la temperatura vara y se modificaresistencia elctrica. Por lo tanto, los filamentos deben ser resistentes a cambios de temperatura y a la corrosin qumica. Para su fabricacin se emgeneralmente platino, tungsteno y nquel.

Los factores que afectan la sensibilidad de los filamentos son: su geomet

la corriente que pasa a travs de los mismos, su resistencia y el valor de la cductividad trmica del gas. La tabla 1.3 muestra la conductividad trmicalos gases y de algunos compuestos utilizados en cromatografa.

19



22/132


Tabla 1.3Condu ctividad trmica.

sustancia

Nitrgeno

Helio

Argn

co2Hidrgeno

Oxgeno

CO

Metano

Propano

n-Butano

tanol

Acetona

Cloroformo

ct*

5.81

34.80

3.98

13.52

41.60

5.89

5.63

7.21

3.58

3.22

3.50

2.37

1.58

* unidades de la conductividad trmica cal cnrr2 seg 2/C crrr1

Clculos en cromatografa

Con los datos de un cromatograma es posible realizar una serie de clsencillos para conocer parmetros como la eficiencia de la columna, adsi aplicamos tcnicas de estndares se puede conocer tambin la concent

de muestras problema. A continuacin se desarrollan los clculos ms coy tiles en cromatografa.

20



23/132


Nmero de platos tericos en una columna(n)

Un plato terico es el lugar donde se lleva a cabo el equilibrio de distribucde la muestra entre la fase mvil y la fase estacionaria. A mayor nmeroplatos tericos, la separacin en la columna es mejor.

w= 16

n - nmero de platos tericost^ = tiempo que transcurre desde la inyeccin hasta el centro del pico delcomponenteAw =ancho del pico del componentetj y Aw se expresan en las mismas unidades (tiempo, volumen, distancia, e

Altura equivalente de un plato terico (AEPT)

Un plato terico puede considerarse la longitud de columna necesaria pestablecer un equilibrio de distribucin entre la fase estacionaria del solutofase mvil.

AEPT = ^

AEPT = altura equivalente de un plato tericoL = longitud de la columnan = nmero de platos tericos

21



24/132


Clculo del rea de un pico con forma de tringulo

Las curvas o picos en un cromatograma generalmente presentan una fgaussiana. Un mtodo sencillo para calcular el rea bajo la curva es transfoen un tringulo, extrapolando la tangente en los puntos de inflexin halnea de referencia, como lo indica la figura 1.3.

Respuestadel.detector

t = 0inyeccin

tr o vr

Punto de inflexin(parte ms jinclinada de la /curva) /

tiempo o volumen

Figura 1.3Cromatograma ideal

Frmula para calcular el rea de un tringulo:

A b*hA

A = reah = alturab = longitud de la base

22



25/132


Clculo de la resolucin

Mide la separacin entre componentes. La figura 1.4 indica la manera de m edlos parmetros:

ECUACIN DE RESOLUCIN

Figura 1.4Resolucin e ntre dos picos croma togrficos.

V -VV 2 V \

R 1/2 (Wx + W2)

Vx = distancia desde la aplicacin hasta el centro del pico 1V2 = distancia desde la aplicacin hasta el centro del pico 2FPj y fP2 = ancho de los picos 1 y 2

23



26/132


Anlisis cuantitativoExisten diversos mtodos para el clculo de concentraciones en un sistcromatogrfico. Los hay sencillos, pero poco confiables, pues no utilizan ninsustancia de referencia, y los hay ms elaborados con un mayor gradoconfiabilidad. Estos mtodos son:

1. Normalizacin2. Calibracin absoluta3. Estndar interno

4. Estndar externo

Normalizacin o porcentaje por reas

Con base en el cromatograma de una mezcla separada, es posible determla concentracin de cada uno de sus componentes por el rea bajo la cuPrimero hay que medir las reas individuales de cada pico , sumarlas y,base en el total, sacar el porcentaje de cada componente. Este porcentajproporcional a la concentracin del componente en la mezcla, siempre y cula conductividad trmica de los componentes sea la misma, o muy parecique la respuesta del detector de conductividad trmica tambin sea igualtodos los componentes. Como esto no es posible en la mayora de los case requiere utilizar otros mtodos ms exactos.

Calibracin absoluta

Consiste en inyectar en la columna una cantidad conocida de sustancia para medir el rea del pico resultante. Enseguida, bajo las mismas condicde corrimiento cromatogrfico, se mide el rea del pico que resulte de la susen la mezcla desconocida.

Finalmente, estableciendo una proporcin, se puede encontrar la ccentracin de la sustancia desconocida.

24



27/132


Estndar internoEste mtodo se puede utilizar de dos formas, para calcular un factor de respueo elaborando una curva estndar para encontrar la concentracin de una mueproblema. El estndar o patrn interno es aquella sustancia que se inyecjunto con la o las muestras problema en un cromatgrafo. Las condiciones qesta sustancia debe cumplir son (Len, 1982):

No debe formar parte de la muestra que se desea analizar. Tener similitud con los componentes del problema. Proporcionar por s solay junto con la muestra problema, picos bien resueltos

y de buena forma. Eluir en un tiempo cercano al de los componentes del problema. No debe reaccionar con los componentes de la muestra.

a) Factor de respuesta El mtodo se basa en calcular el factor de respuestapara cada sustancia analizada, ya que los detectores no responden de misma manera a todos los solutos. La tcnica no es muy complicadaconsiste en medir el rea bajo los picos de cada compuesto, en relacicon el rea de los picos de un patrn interno. El factor de respuesta esdefinido por la relacin:

[P] \Ap

[S] = concentracin del soluto (cualquier unidad de masa/volumen)[P] = concentracin del patrn (cualquier unidad de masa/volumen)As = rea del solutoAp = rea del patrn

Este factor de respuesta se puede utilizar tanto con el mtodo denormalizacin como con el del patrn interno.

b) Estndar interno con elaboracin de curva estndar. En este casotambin se requiere de la adicin de un compuesto de concentraciconocida. Se utilizan mezclas conocidas del patrn (P) y del solutoanalito (S) para construir una curva patrn, como en la figura 1.5. Si u

25



28/132


cantidad conocida de patrnseagregaauna muestra problema,lacurvade calibracin puede utilizarse para hallarlaconcentracindelsoluto.Cuandose use unestndar internoesrecomendablequ e lacurvadecalibracinseelabore cuando menos con tres puntos. Las unidadesdeconcentracin pueden ser moles/litro, g/1, mg/1, porcentuales, etc.

hs

~hp

[S ] = concentracin del soluto hs = altura del soluto[P] = concentracin del patrn hp = altura del patrn

Figura 1.5Curva para estndares internos.

Estndar externo

Esta tcnica es menos complicada que el estndar interno, pero requimayor cuidado durante las separaciones cromatogrficas. Las curv

calibracin con patrones puros son elaboradas con base en varias cotraciones. Es importante cuidar que los volmenes de inyeccin sean los mque para los compuestos de inters. Se construye una grfica de rea oen funcin de la concentracin, la cual puede estar en cualquier unidmasa/volumen, ya sea molaridad, % p/v, o tambin puede utilizarse el La concentracin del compuesto desconocido se interpola en el grficbase en el dato de rea o altura del pico correspondiente (figura 1.6).

reaoaltura

Concentracin

Figura 1.6Curva para estndares externos.

26



29/132


Operacin del cromatgrafoGow-Mac modelo 69-350

Descripcin

Todos los controlesde operacin del modelo69-350 estn localizados en laparte frontaldel aparato (figura 1.7).

11

Figura 1.7 Cromatgrafo de gases G ow-Mac.

27



30/132


1. Puerto de inyeccin para la columna "A "2. Control de ajuste del flujo de la columna "A "3. Control de temperatura del puerto de inyeccin4. Control de temperatura del detector5. Control de temperatura de la columna6. Sistema analgico de medicin7. Selector de medicin8. Control de encendido del cromatgrafo9. Control de cambio de polaridad10. Control de encendido del detector11. Control de ajuste del cero12. Control de atenuacin13. Control de la corriente del detector14. Control de ajuste de flujo de la columna "B "15. Puerto de inyeccin para la columna "B "16. Tapa del horno del cromatgrafo

Uso del cromatgrafo

1. Verifique que todos los controles estn apagados y siga las instrucciones,

en funcin de los parmetros a utilizar en cada una de las prcticas decromatografa de gases.2. Abra la llave del tanque que contiene el gas acarreador y verifique que la

presin se encuentre entre 500 y 2 300 lb/in2, en caso de ser menor a500 lb/in2, reprtelo al profesor.

3. La presin de entrada del gas al cromatgrafo debe ser de 30 lb/in2.Mida la velocidad del flujo de salida de las columnas utilizando unflujmetro de burbuja que tenga una disolucin de jabn al 3 %.

28



31/132


Flujo del gas delcromatgrafo

u

Marcas decalibracin

_ Disolucinjabonosa

P E R A

Burbuja

Figura 1.8 Med idor de flujo.

La metodologa es la siguiente: conecte la manguera del flujm etro a lasalida de la columna donde se quiere ajustar el flujo. Presione ligeramenteel bulbo lleno de disolucinjabonosa,para formar las burbujas que sernarrastradas por el gas. Mida el tiempo en segundos, desde la m arcacero hasta la diez del aparato y calcule el flujo utilizando la siguienteecuacin:

Flujo =600tseg

Con base en el resultado y utilizando el control correspondiente (columna"A " o "B") ajuste el flujo requerido.

4. Ajuste los controles de temperatura y de inyeccin (tanto de la columnacomo del detector). Fije la corriente de este ltimo.

5. Verifique que el registrador tenga papel y tinta para un buen funciona-miento, encindalo y seleccione la velocidad de corrimiento.

Para su buen funcionamiento el cromatgrafo requiere aproximada-mente de 2 horas para que se estabilice la lnea base. Durante este tiempose puede preparar la muestra, limpiar la jeringa y ajustar el cero.

6. Ajuste del cero: el atenuador del cromatgrafo debe marcar infinito(nmero 12 de la figura 1.7). Con el control de cero del graficador,coloque la plumilla donde desee la lnea base. Ponga el control de la

29



32/132


atenuacin del cromatgrafo en la posicin 1. Coloque el atenuador enla posicin 256 y el cero con el control del cromatgrafo.

7. Inyeccin de la muestra. Se debe tener cuidado al introducir la j eringa,si sta es de una capacidad de 5 o 10 |il, tanto el mbolo como la agujason muy delgadas y se doblan fcilmente. Debe colocarse la jeringa enposicin perpendicular con respecto al cromatgrafo e introducirla en elpuerto de inyeccin de la columna. Efectuar la inyeccin con fuerza,para asegurar que la muestra entre en la columna.

Con el fin de evitar contaminaciones, se debe enjuagar la jeringacuando menos cinco veces con el disolvente adecuado. Debe limpiarseinmediatamente despus de usarla, para prevenir que la muestra se sequey queden residuos en la jeringa o el mbolo.

8. Si los picos de la muestra se salen de escala, incremente la atenuacin ycorra nuevamente su sistema.

9. Una vez terminado el trabajo cromatografa) disminuyalas temperaturasde la columna, inyector y detector, y apague la corriente de este ltimo.Cuide que el flujo del gas contine hasta que la temperatura de la columnadescienda hasta 50 C o menos. Cierre l paso del gas acarreador ylimpie lajeringa.

Precauciones en el manejo del detector de conductividad trmica

a) Para evitar que se queme el filam ento del detector, verifique que el gasacarreador fluya a travs del cromatgrafo,antes de encender eldetector.

b) Apagar la corriente del filam ento, antes de abrir el sistema, para evitarque ste se oxide.

c) La velocidad de flujo del gas portador debe permanecer constante.

30



33/132


Metodologa para las prcticas de qumica analtica II

1. Los alumnos deben cubrir totalmente las nueve prcticas de este manual.2. Cada alumno debe elaborar una bitcora, en la cual, adems de anotar

todas las observaciones de la prctica en cuestin, realizar las siguientesactividades: Dibuj ar un diagrama de bloques de la prctica que se va a realizar. Anotar las propiedades fsicas, qumicas y txicas de cada uno de los

reactivos mencionados en el protocolo de la prctica (investigadospreviamente en la biblioteca).

Realizar los clculos necesarios para la preparacin de las disolucionesmencionadas en la prctica, tomando como base 100 mi de disolucin.

Prevencin de accidentes en el trabajocon sustancias qumicas*

1. Al manipular sustancias corrosivas ser obligatorio el uso de equipopersonal de proteccin.

2. La transferencia de lquidos, especialmente los corrosivos o txicos,debe hacerse con ayuda de pipeta y propipeta. Queda estrictamente

prohibido usar las pipetas succionando con la boca.3. Al poner en contacto sustancias que reaccionan violentam ente o al

calentar lquidos en tubos de ensayo o frascos, la cara deber apartarsepara que no sea alcanzada por posibles proyecciones. Se deben usaranteojos protectores o careta de plstico.

4. Nunca vierta agua sobre cido sulfrico concentrado.5. Todas las operaciones con sustancias voltiles debern hacerse en la

campana de extraccin.6. Queda estrictamente prohibido probar cualquier sustancia qumica.7. Las sustancias susceptibles de generar perxidos (THF, ter, etc.) debern

ser verificadas peridicamente.

* Las normas de seguridad indicadas en esta parte fueron extradas delInstructivo sobreel uncionamiento interno y operativo para regular el uso de los servicios e instalacionesde los laboratorios de docencia de la UAM ,aprobado por el Consejo Acadmico en susesin 133.

31



35/132

Prctica 1

Anlisis cualitativo de cromatografa de gases(dos columnas)

Introduccin

Objetivo

Conocer y utilizar la cromatografa de gases es hoy en da un aspecto primor-dial, tanto en la industria como en el campo cientfico. La elaboracin deproductos alimenticios o farmacuticos necesita de un buen control de calidad,y muchas de las tcnicas utilizadas para esto requieren de la precisin del anlisiscromatogrfico.

Uno de los primeros problemas en cromatografa es la seleccin de la faseestacionaria o tipo de columna a utilizar. Existe una gran variedad de faseslquidas disponibles para la cromatografa de reparto gas-lquido. Para resolvereste problema es necesario considerar queun soporte polar retendr msfuertemente un soluto polar y que, por lo tanto, las sustancias menos polaressaldrn con mayor rapidez de la columna, presentando tiempos de retencinms cortos.

En esta prctica se corrobora tal criterio, ya que son separados compuestosde diferente polaridad corrindolos en una columna polar como la Carbowax20 M . Posteriormente se efecta la misma separacin, pero utilizando la columnaDC-200 no polar.

El alumno aprender a utilizar el cromatgrafo de gases Gow-M ac, modelo69-350, para el anlisis cualitativo de mezclas y observar la diferencia deseparar una misma muestra en dos columnas de diferente polaridad.

33



36/132

Manual de prcticas de qumica analtica I

Materiales y reactivos Cromatgrafo de gases Medidor de fluj o de burbuj a Cronmetro Jeringa para cromatografa de gases de 50 mi 5 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapn de baquelita 5 vasos de precipitados de 50 mi

5 pipetas volumtricas de 1 miPropipeta

n-pentano

Tetrahidrofurano 2-butanona n-propanol

En la parte terica de este captulo se encuentran las instrucciones de ope-racin del cromatgrafo Gow-Mac, modelo 69-350 (p. 27).

Normas de seguridad

Maneje los disolventes con cuidado en un lugar ventilado, utilicepropipetas para hacer la mezcla. Asegrese de que no haya mecherosprendidos y coloque letreros para indicar que est trabajando condisolventes.Cuando trabaje con el cromatgrafo, asegrese de que se encuentrepresente el profesor del laboratorio, quien le ayudar y brindar asesorasobre el buen manejo del equipo.

Procedimiento

1. Mezcle un mililitro de cada uno de los siguientes disolventes: n-heptano,tetrahidrofurano, 2-butanona y n-propanol. Guarde la mezcla en un re-cipiente cerrado.

34



37/132

Anlisis cualitativo de cromatografa de gases

2. Las condiciones del cromatgrafo deben ser las siguientes:

Temperatura de la columna

Flujo del gas

Corriente del detector

130C

80 ml/min.

200 mA (si el gas es helio)100 mA (si el gas es nitrgeno)

3. Tome en cuenta que el equipo requiere al menos de tres horas de ca-lentamiento previo, con el fin de estabilizar la temperatura de la columna,el flujo del gas acarreador y la corriente del detector, y para que todoesto se refleje en una lnea base estable.

4. Verifique el flujo del gas en las dos columnas, utilice un medidor deburbuja como se indica en la figura 1.8.

5. Trabaje primero con la columna de Carbowax. Fije el atenuador en 4 yponga a funcionar el graficador a una velocidad de 2.5 cm/min.

6. Con una jeringa de 50 fil, mida 3\ de n-heptano y adicione otros 10 |Lilde aire. Inyctelos en la columna y enjuague la jeringa.

7. Marque el punto de inyeccin en la carta, as como la informacinrelacionada con la m uestra inyectada.

8. El primer pico que debe eluir es el pico de aire, seguido por el pico deln-heptano.

9. Repita los pasos 5 y 6 con los otros tres componentes y, por ltimo,inyecte la mezcla de los disolventes.

10. Baj o las m ismas condiciones de trabajo, repita todo el proceso utilizandola columna DC-200. Cam bie la polaridad del sistema para que los picossalgan en el mismo sentido que con la columna polar.

Tratamiento de datos experimentales

Mida y tabule todos los tiempos y volmenes de retencin de todas las

corridas. Con la ayuda de los tiempos de retencin de las sustancias puras,identifique los componentes de la mezcla en los cromatogramas de lasdos columnas.

35



38/132


Cuestionario

i.

2.

3.

Calcule el nmero de platos tericos "n" y AEPT para cada columna,utilizando los datos del n-heptano.Calcule el porcentaje de cada componente de las mezclas, utilizando elmtodo de normalizacin (por reas).

En qu se basa la cromatografa de gases?

Cmo puede medirse la eficiencia de una columna?

Qu se entiende por cromatografa lquido-lquido y cromatografa gas-lquido?

Qu ventajas tiene la programacin de temperatura en la cromatografade gases? Se puede hacer esta programacin en un cromatgrafo degases con detector de conductividad trmica? Justifique su respuesta.

Explique cules son las ventajas y desventajas de las columnas capilaresy las columnas empacadas.

Con base en los siguientes datos, obtenidos con el empleo de una columnade ftalato de dodecilo, realice los ejercicios que se piden.

CompuestoAcetonaButanona3-pentanonaAcetilcetona

Vr(ml)21.558.0

145.0400.0

a) Calcular el nmero de platos tericos "n" y AEPT para cada compuesto.b) Calcular el porcentaje de cada compo nente, utilizando el mtodo de

normalizacin.

36



39/132

Prctica 2

Factor de respuesta en cromatografa de gases

Introduccin

El uso de estndares internos es necesario en el anlisis cuantitativo. Lasensibilidad de los detectores de conductividad trmica difiere de un compuestoa otro, ya que depende de la conductividad trmica del analito. A menorconductividad trmica, mayor es la respuesta para una cantidad dada decompuesto. Por lo tanto, debe medirseun actor de respuesta emprico paracada sustancia que se somete a un anlisis cuantitativo. El factor de respuestaF est definido por la relacin:

[P] \ApJ

Objetivo

El alumno efectuar el anlisis de cromatografa de gases para conocer elfactor de respuesta con el n-heptano, empleando como estndar interno aln-pentano.

Materiales y reactivos

Cromatgrafo de gases Medidor de fluj o de burbuj a

37



40/132


CronmetroJeringa para cromatografa de gases de 50 mi2 tubos de ensayo de 10 x 150 mm con tapn de baquelita2 vasos de precipitados de 50 mi2 pipetas volumtricas de 1 miPropipetan-pentanon-butano

Normas de seguridad

Procedimiento

Los com puestos a trabajar son muy voltiles y flamables, trabaje en unrea ventilada y lejos de fuentes de calor. Tome en cuenta las reglas deseguridad de la prctica 1.

1. Prepare en tubo de ensayo una disolucin estndar, mezclando un mililitrode n-heptano con otro de n-pentano.

2. Ajuste las condiciones del cromatgrafo con base en los siguientes datos:

Columna

Gas acarreador

Flujo del gasTemperatura

Atenuacin

Corriente del detector

Velocidad de la carta

DC-200

Helio

60 ml/min.

90 C

4

200 mA

2.5 cm/min.

3. Verifique que la lnea base se encuentre estable.4. Inyecte 3 (il de la disolucin estndar, repita por triplicado.5. Solicite al profesor la muestra problema e inyecte 3\9 repita por

triplicado.

38



41/132

Factor de respuesta en cromatografa de gases


Cuestionario

Mida y tabule todos los tiempos y volmenes de retencin de todas lascorridas.Con base en las reas y concentraciones de la disolucin patrn, calcularel factor de respuesta para el n-heptano, utilizando el n-pentano comoestndar interno.Calcular la concentracin del n-heptano en la muestra problema, utilizandoel factor de respuesta y las reas del segundo grupo de cromatogramas.

1. Explicar qu se entiende por factor de respuesta.

2. Esta tcnica para el clculo del factor se puede utilizar con otrosdetectores como el de ionizacin de flama o el de captura de electrones?

3. Cmo se seleccionan las temperaturas para el inyector, la columna y eldetector?

4. Problema: Para la cuantificacin de una muestra comercial delantimicrobiano metil parabeno, se utiliz la tcnica del factor de respuestausando el propil parabeno como estndar interno. Se corrieron las mues-tras en un cromatgrafo con detector de ionizacin de flama, columnacapilar BP5 con pelcula de 0.5 |Lim, temperatura inicial de 160 C y ungradiente de 15 C/min. La temperatura final fue de 280 C. Para elclculo del factor se utilizaron 0.98 mmol de metil parabeno y 0.75 mmolde propil parabeno. Se obtuvieron las siguientes alturas respectivas: 180y 165 mm.

Una segunda corrida cromatogrfica es utilizada para cuantificar la

muestra com ercial. Se mezcla el problema con 1.2 m mol de propilparabeno. Las alturas resultantes fueron 150 mm para el metil y 160 mmpara el propil parabeno. Calcular la concentracin del metil parabenoen la muestra comercial.

39



42/132


Bibliografa

Baugh, P. J. (editor). 1993.Gas Chromatography A P raetical Approach.IRL Press, Gran B retaa.

Bens, E. 1961. "Adsorption Characteristics of Some Gas-Liquid C hromato-graphic Supports."Anal Chem.,33:178, California.

Brewer, S. 1987.Solucin de problemas de qumica analtica.Ed. Limusa,Mxico.

Ewing, G. W. 1979.Mtodos instrumentales de anlisis qumicos.Ed. MeGraw Hill, Mxico.

Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 1965.Advances in Chromatography.Vol. 1:199, USA.

Giddins, J. C. y R. A. Keller (eds.). 197 1.Advances in Chromatography.Vol. 4:33 3, USA.

Harris, D. C. 1992. Anlisis qumico cuantitativo. Grupo Editorial

Iberoamrica, Mxico.

Me loan, C. F. y R. M. Kiser. 1973.Problemas y experimentos en anlisisinstrumental. Ed. Reverte, Mxico.

Miller, J. M. y R. L. Harmon. 1978.Elementary Theory ofGas Croma-tography. Gow-Mac Instrument C o., USA.

Operator }s Manual Gas Chromatograph, Model 69-350.1989. Gow MacInstrument Co., USA.

Pecsok, R. L. 1981.Mtodos modernos de anlisis qumico.Ed. Limusa,Mxico.

40



43/132

Bibliografa

Rowan, R. Jr. 1961. "Prediction of Retention Temperatures in ProgrammedTemperature Gas Chromatography. A Descriptive Equation and Com-putacional Method."Anal. Chem.,33:510-515, Nueva Jersey.

Storch de Garca y Asensio, J. M. 1975.Fundamentos de la cromatografade gases. Alhambra, Espaa.

41



45/132

Captulo 2

CROMATOGRAFA LQUIDADE ALTA RESOLUCIN



47/132

Introduccin

La cromatografa de lquidos de alta resolucin en los pasados diez aos incrementado su importancia en muchas de las reas del anlisis, tanto a niinvestigacin como a nivel industrial. Muchas de las tcnicas de control delidad de frmacos, alimentos, aditivos y contaminantes ya se estn efectuanconHPLC.

Hace ms de 80 aos que se conoce la cromatografa de lquidos, pero s

a partir de 1967 los avances tecnolgicos permitieron desarrollar un procecromatogrfico para trabajar con altas presiones. Este proceso de ningumanera sustituye a la cromatografa de gases, slo es un complemento paranlisis de componentes que no toleran una fase mvil gaseosa o temperatumuy elevadas. De hecho, presenta las siguientes ventajas frente a la cromatogde gases:

Tiene una difusin mnima en la fase mvil, debido a la rapidez del anli No tiene efectos negativos por calor, ya que generalmente se realiza

temperatura ambiente o ayudado por un calentador de columnas temperaturas menores de 100 C.

La muestra no se destruye, por lo que se puede recuperar para un uposterior.

La cromatografa de lquidos es una tcnica de separacin que utiliza ufase mvil lquida, es ideal para la separacin de macromolculas de intebiolgico y de compuestos inicos, ya que no depende de la volatilidad otabilidad trmica de los componentes. Se puede utilizar para separar proteaminocidos, lpidos, cidos nucleicos. Otras aplicaciones industriales soanlisis de pesticidas, aceites, polmeros, antioxidantes, anlisis de agucontaminantes, sabores, colorantes, etc. La cromatografa de lquidos se ben la solubilidad de los compuestos: hay que escoger el disolvente o la mede disolventes apropiados para llevar a la muestra a travs del sistema, tambhay que tomar en cuenta que los compuestos se adsorben en menor o ma



48/132


medida en la fase estacionaria y que gracias a las altas presiones con las qmueve la fase mvil, se puede obtener una rpida separacin de los compode una mezcla.

La cromatografa de lquidos se puede clasificar en cuatro tipos, dependde su uso:

Cromatografa de lquido-slido

En este caso, la separacin depende de la afinidad de la muestra hacia lslida o lquida. Si la muestra es muy afn a la fase estacionaria (compuespartculas slidas pequeas) el tiempo de retencin ser mayor. El solvutilizado se conoce comoeluyente y tambin influye de manera importante enla separacin: si la muestra es ms afn a la fase lquida, los tiempos de retsern ms cortos. La tabla 2.1 muestra una lista de disolventes segcapacidad para eluir solutos.

La seleccin de la fase mvil influye directamente en la separacin dmuestras. Los solventes pueden ser de naturaleza orgnica o acuosa. Exmuchas caractersticas que debe tener una buena fase mvil, entre lasimportantes se encuentran: no alterar la columna ni su naturaleza, disolmuestra, ser de baja viscosidad y, una vez terminada la separacin, debe pela recuperacin del soluto de manera simple (Watty, 1989).

En la cromatografa lquido-slido existen dos subdivisiones que est

funcin de su conformacin: la fase normal y la fase inversa.Paral^fase normalse requiere de una fase estacionaria polar, por lo tantola fase mvil debe ser no polar. Los empaques que se pueden utilizar ennormal son diol, slica y amino, entre otros.

En \difase inversa se necesita un empaque no polar y una fase mvil polar. Los empaques ms comunes para la fase reversa son: ODS (C18), octyl,dimetil, etc.

Otra variacin de este tipo de cromatografa se conocecomo fase ligada(bondedphase),que consiste en enlazar con el soporte de slica compuestque aumenten su carcter no polar (C2, C6, C8, Clg). En funcin del tamao dela cadena de hidrocarburos que se haya unido, los tiempos de retencin

solutos que eluyan en estas columnas, tendern a aumentar, pues se retems fuertemente.

46



49/132

Cromatografa lquida de alta resolucin

Tabla 2.1Lista de disolventes.

Disolvente

cido acticoAcetonaAcetonitriloBencenoN-butanol

Tetracloruro de carbonoCloroformoCiclohexano1,2-dicloroetano

Cloruro de metilenoDimetil sulfxidoDioxanoAcetato de etiloEtanolDietilterHeptanoHexanoMetanolPentanoN-propanol

Iso-propanolTetrahidrofuranoToluenoTricloroetilenoAguaXileno

ndice depolaridad

0.625.105.802.703.90

1.604.100.203.503.107.204.804.406.202.800.000.005.100.004.003.904.002.401.009.002.50

Longitud deonda de corte nm

230330190280215

263245200225235268215260210220200200205200210210215285273200290

Solubilidad enagua % p/p

100100100

0.187.81

0.080.8150.010.811.6

100100

8.7100

6.890.0003

0.001100

0.004

100100100

0.0510.11

1000.018

47



50/132


Cromatografa de intercambio inicoConsiste en cambiar iones de la fase estacionaria por iones que se encutran disueltos en la fase mvil. Aniones como el sulfito -SO3~ o cationes[N-(CH3*)3+] se unen covalentemente con la fase estacionaria: los iones dsoluto, de carga opuesta a los de la fase estacionaria, son atrados por fuelectrostticas (la fase mvil es un lquido, figura 2.1). Se puede efeccromatografa de intercambio inico no solamente en HPLC, sino tambicapa fina, en columna y en papel impregnado de resina. En este mtodo paracin depende de las variables: fuerza inica, capacidad de carga dcolumna y del pH durante el proceso de separacin. El procedimiento d

de la cromatografa de lquido-slido, y se utiliza en la separacin de amindos,en anlisis de trazas, en la separacin de metales por formacin complejos, etc.

Las resinas utilizadas en las columnas pueden estar o no polimerizadas. mercado existen resinas intercambiadoras catinicas, tipo cido fuerte o e intercambiadores amnicos tipo base fuerte o dbil. Tambin hay gelintercambio inico, que se utilizan para separar molculas pequeas con moleculares menores a 500. La tabla 2.2 muestra ejemplos de columnaintercambio inico comerciales, mencionando el tipo de iones que puede reel pH de trabajo y la presin mxima a la que pueden ser utilizadas.

Aniones mvi les

mantenidos cerca de

los cationes unidos

covalentemente a la

fase es tac ionar ia

Figura 2.1Cromatografa de intercambio inico (resina de intercambioaninico, slo los aniones pueden ser atrados hacia ella).

48



51/132


Tabla 2.2Columnas para HPLC de intercambio inico.

Columna

Syn Chropac SAXFuertemente aninica

Syn Chropac WAXDbilmente aninica

Syn Chropac SCXFuertemente catinica

TSKcatinica

Soporte

Slica

Slica

Slica

Resina

pH

2 a 8

2 a 8

2 a 8

2 a 1 2

Presin mx.

5 000 psi

5 000 psi

5 000 psi

200 psi

Cromatografa de exclusin molecular

Con este mtodo las molculas se separan por su tamao y conformacin: peso molecular les permite adentrarse en la red del gel y/o si la molculaglobular, la retencin ser mayor, comparada con una molcula de peso surior al de la capacidad del gel o con una molcula de conformacin irregu

(figura 2.2). Las aplicaciones de esta tcnica son amplias, ya que permite sepmuestras con pesos moleculares entre 700 y ms de 150 millones, particumente aquellas de inters bioqumico. Tambin es muy utilizada para separacin de polmeros (tabla 2.3). Los soportes utilizados pueden ser dede slice unido a compuestos que aumentan su carcter hidroflico, comocolumnas Biosep-SEC-S; o pueden ser polmeros como los de la serie PolyGFC-P (poliestireno, polihidroximetacrilato, estireno-divinilbenceno, etc.)el mercado de la cromatografa de exclusin molecular existe un gran nmde columnas que permiten seleccionar el intervalo de fraccionamiento qurequiera (Phenomenex, 1994).

49



52/132

Manual de prcticas de qumica analtica

Molculas grandesson excluidas

Molculaspequeaspenetran el gel

Figura 2.2Cromatografa de exclusin molecular.

Tabla 2.3Columnas comerciales para la exclusin molecular.

ColumnaStyagel HR 0.5

Styagel HT 4Styagel HMW7

Rango PM0 a 1 000

5 000 a 600 000500 000 a 1 x1 08

AplicacionesAditivos, fenoles, epxidos, urea

PM intermedioPM alto

Cromatografa de afinidad

Se basa en la interaccin especfica que existe entre un soluto de una meun sitio activo presente en el gel de la fase estacionaria de la columnainteracciones estn relacionadas ms con las caractersticas estructuralcon la carga, tamao, solubilidad u otras propiedades que se aprovech

otros tipos de cromatografa. Ejemplos de aplicaciones son la relacin suenzima y la relacin antgeno anticuerpo (Day y Underwood, 1989).Una mayor fuente de informacin sobre los mtodos cromatogrfic

puede encontrar en los excelentes libros: Harris, 1992; Pecsok, 1981.

50



53/132


Operacin del cromatgrafo dealta resolucin (HPLC)

El HPLC consta de cuatro partes: el sistema de bombas encargado de manteconstante el flujo de la fase mvil; el sistema de inyeccin que permite introdla muestra a trabajar; la columna que tiene la funcin de separar los componentesde la muestra y el sistema de deteccin de los solutos eluidos, el cual manuna seal al sistema de registro.

Sistema de bombas

Este sistema es un componente importante del cromatgrafo de lquidoscual requiere de una bomba de alta presin, comnmente de un mximo6 000 psi. La presin es necesaria para mover las partculas del soluto entrfase estacionaria de la columna. Una bomba para cromatografa de lquidebe tener un flujo continuo y libre de pulsaciones.

Existen dos tipos de sistemas de elucin: uno donde el disolvente no camde composicin durante el proceso de aislamiento, conocido como elucsocrtica, y otro que requiere de un gradiente para mejorar la separacin dlos componentes en una mezcla (elucin porgradiente).

Las bombas con pistones sincronizados son las ms empleadas en los sistede HPLC. Un pistn siempre bombea disolvente, mientras el otro se llena.te arreglo proporciona un flujo relativamente libre de pulsos o pulsaciones

Pueden evitarse muchos problemas con las bombas si se cuidan los solveutilizados: no deben tener un pH muy bajo ni formar precipitados con facili

En columnas convencionales de 5 mm de dimetro interno y con flujos e1 y 2 ml/min, pueden resultar presiones de 400 bar, dependiendo de la longde la columna, el tamao de partcula y el disolvente.

El sistema de bombas debe de mantenerse en ptimas condiciones siquiere tener reproducibilidad en las corridas cromatogrficas.

51



54/132

Manual de prcticas de qum ica analtica II

Figura 2.3Control del sistema de bombas del HPLC

Figura 2.4Sistema de bombas del HPL C

52



55/132


Operacin del sistema de bombas (figuras 2.3 y 2.4):Se enciende el aparato con el botn rojo de la parte inferior derecha (nm8 de la figura 2.4). La parte frontal consta de (figura 2.3):

1. Pantalla digital para conocer la presin del sistema, la cual est dadalibras por pulgada cuadrada (psi). El nmero que aparece en la pantadebe multiplicarse por 10, a fin de obtener la presin verdadera.

2. Botones que fij an la presin mnima y mxima de trabaj o durante proceso de separacin. Se recomienda establecer la presin baja ecero psi y la mxima en 3 500 psi. El valor mximo depende del tipo

columna a utilizar y de la viscosidad del disolvente o mezcla de ellos.durante el proceso de separacin la presin del sistema rebasa estovalores, el sistema de bombas se apaga automticamente.

3. Standby. Permite que el motor se apague y el sistema elctrico sigafuncionando.

4. Reset.Botn que reenciende las bombas y restablece el fluj o y la presindel sistema.

5. Led. Foco rojo que indica el apagado de las bombas y que el flujo desistema tiende a cero.

6. Control de fluj o. Consta de tres diales rotatorios individuales y permpreseleccionar el flujo del sistema en ml/min. El flujo debe incrementa

poco a poco (de dcima de mi en dcima de mi). Una lectura de 0indica un flujo de 0.70 ml/min.7. Vlvula de purga. Permite la purga hidrulica del sistema.8. Botn de encendido o apagado.

Sistema de deteccin de solutos eluidos

Existen diferentes tipos de detectores utilizados en la cromatografa de lqulos hay defluorescencia, ndice de refraccin, conductividad elctrica, de UVvisible, arreglo de diodos, etc.El tipo UV-visible es el ms ampliamente distribuido como detector HPLC, la mayora de los compuestos tienen cuando menos alguna absorbaen las regiones del UV o el visible. El fundamento cuantitativo de es

53



56/132


Figura 2.5Control del sistema de deteccin d e solutos eluidos.

6

7

Figura 2.6Detector UV-visible.

54



57/132


determinaciones se encuentra en la ley de Lamber y Beer, la cual relacionabsorbancia del soluto con su concentracin (c, en moles/1) y la longitudpaso del haz de luz(b): A = 8be.

Los detectores de los equipos actuales tienen una mayor flexibilidad que losespectros comunes, ya que pueden reportar valores menores de 0.001 unidade absorbancia.

Opera cin del sistema de deteccin

Se enciende el aparato con el botn rojo de la parte inferior derecha. La pfrontal (figuras 2.5 y 2.6) consta de:

1. Pantalla. Permite leer hasta diezmilsimas de unidades de absorban2. Botn de polaridad. Sirve para cambiar la seal de salida del sistema

registro.3. Botn de corte(short switch). Conecta o desconecta las terminales

positiva y negativa nulificando la seal del integrador o registrador. Eefecto es lo mismo que si se mandara una seal de cero volts al registrapermitiendo ajustar el cero independientemente del ajuste hecho enregistrador o integrador.

4. Mark. Este botn permite producir una marca en la carta y se utilizgeneralmente para indicar el momento de la inyeccin de la muestra

5. Auto cero. Este botn permite definir la lnea base y tiene un intervalo 0.7 UA (unidades de absorbancia). Cuando la lmpara parpadea indque la seal de salida de la lnea base excede el intervalo de trabajo auto cero.

6. Pantalla indicadora de la longitud de onda seleccionada.7. Control de seleccin de longitud de onda. Ajusta la longitud de onda

trabajo entre 190 y 700 nm con incrementos de 0.2 nm.8. Intervalo de unidades de absorbancia (AUFS, Absorbance Units F

Scale). Cuenta con doce posiciones diferentes que seleccionan

sensibilidad de las unidades de absorbancia.9. Botn de control. Consta de seis posiciones que se pueden seleccioy observar en la pantalla:

55



58/132


SE{Sample Energy).La pantalla reporta la energa UV de la celdade la muestra problema.RE (Reference Energy).Reporta la energa UV de la celda dereferencia.AU(Absorban ce Units).Se observan la unidades de absorbanciapresentes en la muestra problema.Zero, cantidad en unidades de absorbancia que el aparato tomacomo cero.

DLV(Deuterium LampVoltage). Reporta el voltaje de la lmparade deuterio.DLC {Deuterium LampCurrent). Reporta la corriente del filamentode la lmpara en miliamperios, una lectura de 300 es ideal y de 2a 315 es aceptable.

10. Tiempo de respuesta. Son cinco posiciones que seleccionan los diferetiempos de respuesta:

0.05 sea, respuesta rpida que provoca picos angostos y mucruido en la lnea base.

0.10 sea, respuesta rpida con ruido ligeramente menor queanterior.

0.50 sea, ms rpida que la respuesta normal y con ruido ligerammayor de lo normal.

1.00 sea , respuesta normal con picos angostos y una cantidpequea de ruido.

5.00 sea , respuesta lenta para una supresin mxima del ruido

Operacin del integrador SP4400

Es un equipo que permite interpretar la seal mostrando no slo el cro

tograma, sino tambin un reporte completo con los tiempos de retencireas y sus porcentajes. Si se requiere, tambin proporciona informacin las condiciones bajo las cuales se corri el sistema y cuenta con prograpara hacer clculos con patrones externos e internos (figura 2.7).

56



59/132


Figura 2.7Integrador

Figura 2.8Vista parcial del teclado del integrador.

57



60/132


Dentro de las ventajas que tiene utilizar un integrador, se encuentranmtodos numricos que permiten realizar diferentes tipos de clculos, clos siguientes:

a) Mtodo numrico cero: MN = 0. Es un mtodo de porciento de reausado cuando los resultados de concentracin no son necesarios. Emtodo no utiliza factores de respuesta del detector y de esta manerrequiere de calibracin. Una vez que el dilogo de rutina terminaselecciona el mtodo en el reporte, el cual incluye todos los picoscromatograma identificados por orden de elucin. Los nombres decomponentes no son generalmente utilizados.

b) Mtodo numrico uno: MN = 1.Es el ms utilizado en cromatografade gases, en particular cuando todos los componentes de la muestraconocidos. Es muy similar al mtodo cero, con excepcin de quereas (o altura) de los picos son corregidos por factores de respuecalculados previamente en una corrida con sustancias patrn de ccentracin conocida.

c) Mtodo num rico dos: MN= 2. Requiere la utilizacin de estndaresinternos para cuantificar de manera exacta los componentes de una mEs de uso comn en anlisis de compuestos farmacuticos, aditivomentarios, etc. La concentracin del estndar interno debe ser ligerammayor, pero no pasar de un factor de 10, con respecto a los compone

de inters en una mezcla.

Descripcin del teclado (figura 2.8)

Backspace: borra datos previos moviendo el cursor hacia atrs.LCD status:Presenta un cuadro en pantalla donde indica el canal (C/archivo(FI\ nmero de inyecciones en ese archivo(Biri), la velocidadde la carta(Cs), atenuacin(Atteri), tiempo de corrimiento(Runtime),nivel(Level)y capacidad de memoria.Inj/endA: Tecla que se debe oprimir en el momento de efectuar inyeccin en la columna "A".Shift inj/endA:Detiene el desarrollo del cromatograma sin dar el repordel mismo.

58



61/132


62/132


rebasan la escala del integrador, se puede aumentar la atenuacinvalor prximo, de manera que los picos reduzcan a la mitad su tam(siempre y cuando se utilicen las mismas condiciones de separacin

7. Verifique el valor del PTevaluation: debe ser como mximo de 250.8. Inyecte la muestra con una jeringa de 50jal conaguja sin punta, mida

la cantidad establecida en el manual de prcticas de la muestra a coe introduzca la jeringa en la vlvula de inyeccin. El mecanismoinyeccin de la muestra (figura 2.9) es de dos posiciones: cargadescarga. Presione el mbolo para que la muestra pase a la tuberaacceso(loop).Mueva la palanca a la posicin de descarga para que lamuestra sea llevada a la columna, el lquido contenido en elloop serdesplazado hacia la columna. El movimiento debe ser rpido para evuna cada brusca de presin que desconecte el sistema de bombPosteriormente oprima la teclainj/endAdel integrador.

Terminado el tiempo de corrimiento vuelva a presionar la teclainj/endA, el integrador le dar un reporte completo de su sistema separado

60



63/132


Hacia lacolumna

Flujo

Alojamiento demuestras

FlujoJeringuilla I

Excesode inyeccin

CARGAR

Unin

INYECTAR

Figura 2.9 Vlvula de inyeccin para cromatgrafo de lquidos de altaresolucin.

61



65/132

Prctica 3

Cuantificacin de una muestra problema deanisaldehdo (mtodo del patrn interno)

Introduccin

El funcionamiento de un comatgrafo de alta resolucin empieza con el sisde bombas de alta presin, el cual impulsa el disolvente a travs de todsistema. La muestra es inyectada por medio de una microj eringa, el volumde unos cuantos microlitros para que la resolucin de los picos sea buenaseparacin sea ms rpida. Una vez en la columna, se realiza la interaccsoporte-soluto-disolvente, lo cual permite la separacin de los componen

de la muestra. El detector est compuesto por una microcelda en forma"Z",a travs de la cual fluye la disolucin; es excelente para que los compueno se mezclen y el flujo sea rpido. Por ltimo, en el integrador, la absorbcia es convertida en seal elctrica y as es reproducida como cromatogra

En la cromatografa de lquidos de particin existen dos grupos de trabel ms frecuente se conoce comocromatografa de fase inversa, en ella lafase estacionaria tiene un carcter no polar y se eluye con un disolvente pEl segundo grupo es lacromatografa de fase normal que utiliza un soportepolar y un disolvente no polar. El sistema de elucin puede ser isocrtico ogradiente y el detector ms comn es el uv-visible, aunque tambin es utiliel de ndice de refraccin.

La cuantificacin de una muestra problema por medio de un estndar intse puede efectuar con la elaboracin de una curva estndar, la cual debehecha mnimo con tres puntos. En el laboratorio se debe tener especial cui

63



66/132


sobre las condiciones de separacin, en cuanto a volumen inyectado, fcomposicin de la fase mvil. La curva se desarrollar en funcin de la rede alturas o reas de los picos del compuesto entre las del estndar (ver c1: Clculos en cromatografa). En las abscisas se coloca la relacin concentracin del soluto entre la concentracin de la sustancia patrconcentracin de la muestra problema se interpola de la curva patrn.

Objetivo

El alumno aprender a utilizar el cromatgrafo de lquidos de alta resopara cuantificar una muestra problema de anisaldehdo, utilizando el mdel patrn interno.


Cromatgrafo de lquidos de alta resolucinColumna Spherisorb ODS C]810 mmFiltros de tefln de 0.4 mmJeringa de 50 mi, con aguja para HPLC5 frascos viales de 5 mi con tapa2 pipetas volumtricas de 1 miAnisaldehdoAcetonitriloToluenoMuestra problema con anisaldehdo

Normas de seguridad

Al preparar la mezcla acetonitrilo agua y acetonitrilo tolueno debe h

en la campana de extraccin.Revise su bitcora para recordar que el acetonitrilo es venenoso mable, que debe evitar respirar sus vapores y que puede causar irrien la piel.

64



67/132

Cuantificacin de una muestra problema de anisaldehdo

Procedimiento1. Las condiciones de funcionamiento del cromatgrafo deben ser las s

guientes:

2.3.

4.

5.

6.

Columna Spherisorb

Dimensiones

Presin mxima

Fase mvil

Flujo

1 0 O D S 1 0 j i m

250 x 4.6 mm

3 500 psi

acetonitrilo/agua (50:50)

0.8 ml/min

Prenda y acondicione el cromatgrafo dejando que el sistema se estabiliPrepare las siguientes mezclas de anisaldehdo y tolueno:

Compuesto

Anisaldehdo

Tolueno

Corrida 1

0.07 M

0.05 M

Corrida 2

0.05 M

0.05 M

Corrida 3

0.03 M

0.05 M

Filtre por membranas de 0.4 jom: a) La mezcla de acetonitrilo agua, cada una de las mezclas patrn y c) la muestra problema.Solicite al profesor la muestra problema que contiene 0.05 M de toluencomo estndar interno, mida 2 |il e inyctelos.Repita por triplicado la determinacin.


Con las concentraciones y las alturas de los picos del patrn externelabore una curva patrn como la que se muestra en la figura 2.10.

65



68/132


ALTURA SALTURA P

[SOLUTO S][SOLUTO P]

Figura 2.10Curva patrn.La concentracin de la muestra problema se calcula a partir de sustiel valor de la altura del anisaldehdo (altura S) en la mezcla problemla relacin:

ALTURASALTURA P

La altura "P " es la altura del tolueno, el valor de esta relacin se interen la curva patrn y el valor de la grfica es sustituido en la siguie

relacin, para obtener la concentracin del soluto de la muestra probleSOLUTO SSOLUTO P

Cuestionario

1. Mencione tres diferencias, en cuanto a su aplicacin, entre la cromatogdegasesye lHPLC.

2. Describa los cuidados expe rimen tales que se deben tener para: a)disolventes a utilizar como fase mvil, b) la muestra problema a sepo cuantificar.

66



69/132

Cuantifcacin de una muestra problema de anisaldehdo

Indique usted qu fase estacionaria, qu fase mvil y qu detector serlos indicados para efectuar una buena separacin de las siguientes mezcla) de carbohidratos, b) de aminocidos y c) de protenas.

Para conocer el contenido de anfetamina en un preparado farmacuticcomercial, se utiliza como estndar interno la metanfetamina y se efecttres corridas cromato grficas. Con base en estos datos construya uncurva patrn y calcule la concentracin de una muestra problema danfetamina que dio una altura de 123 mm.

Corrida

Frmaco

Anfetamina

Metanfetamina

1

Conc.

0.6

0.6

Altura

30

38

2

Conc.

1.2

0.6

Altura

60

38

3

Conc.

1.8

0.6

Altura

98

38

Conc.= concentracin en mM .

67



71/132

Prctica 4

Separacin y cuantificacin de una muestra deantocianinas (mtodo del patrn externo)

Introduccin

La cromatografa de lquidos de alta resolucin ha tenido un gran auge enltimos 20 aos, se ha utilizado como tcnica para separar, identificar y presustancias en m uchas reas. Actualmente estos equipos se combinan cobanco de memoria de una computadora, lo que ofrece una mayor facilidala identificacin de compuestos.

Una aplicacin actualizada es la separacin e identificacin de antocianitanto en uvas como en vinos tintos. A pesar de tener el vino tantos aohistoria, an no se conoce qu ocurre con sus compuestos durante aejamiento. El color es uno de los atributos ms importantes del vino determinante en la evaluacin sensorial. En las uvas tintas est dado pocontenido de antocianinas y en las uvas blancas por los flavonoles. Exien las uvas tintas 14 antocianinas, de las cuales cinco se encuentran en yor proporcin: malvidina, petunidina, cianidina, peonidinay delfidina (Retal., 1992).

Las antocianinas son pigmentos de color rojo, azul y violeta. En condiciacidas, el color rojo predomina; en presencia del ion bisulfito (HSO3 )reaccionan y se decoloran, esta reaccin es reversible. El color de los vtintos se debe principalmente a las antocianinas libres (estos compuestos tiea polimerizarse casi de manera inmediata desde que son estrujadas), pigmentos polmeros formados durante el tiempo de afiejamiento del vinocondensacin de antocianinas con otros compuestos flavonoides y pro

69



72/132


blemente aldehidos. El color de los vinos tintos depende del pH, el contde SO2?de los pigmentos polimricos y los taninos.

El uso de equipos como el HPLC permite la separacin de las antociaen vinos tintos y stas aparecen como picos discretos.

Objetivo

El alumno utilizar el cromatgrafo de lquidos de alta resolucin para sy cuantificar una muestra de antocianinas, utilizando el mtodo del patrn e


Cromatgrafo de lquidos de alta resolucinColumna Spherisorb ODS Clg 10 mmFiltros de tefln de 0.4 mmPapel filtro WhatmanNo. 1Jeringa de 50 mi, con aguja para HPLC4 tubos de ensayo con tapa de roscaMortero con pistiloPipeta graduada de 10 miClorhidrato de malvidinamonoglucsidocido frmicoAcetonitriloMetanolHC1 (concentrado)

Normas de seguridad

Cuide que al preparar las mezclas acetonitrilo agua y acetonitrilo tose haga en la campana de extraccin.

70



73/132

Separacin y cuantifcacin de una muestra de antocianinas

Procedimiento

Recuerde que el acetonitrilo es venenoso, flamable y que causa irritacinen la piel. Se debe evitar respirar sus vapores.Maneje con cuidado el cido frmico y evite el contacto con la piel,que es corrosivo.

1. Extracto a partir del hollejo de la uva: lavar y quitar el hollej o a 10 utintas, colocando ste en un mortero limpio. Adicionar 10 mi de meta

y presionar suavemente con el pistilo contra el hollejo para obtener udisolucin muy colorida. El extracto es prefiltrado con papel WhatmNo.1, antes de filtrar con membranas Millipore de 0.45 |Ltm. El extracse guarda en un tubo de ensayo limpio y con tapn de rosca. Se protede la luz y debe utilizarse a la brevedad.

2. Las condiciones de funcionamiento del cromatgrafo deben ser:

Columna Spherisorb 10 ODS 10 |jmDimensiones 250 x 4.6 mmPresin mxima 3 500 psiFase mvil. Se utiliza un gradiente de elucin con dos disolventes:

Disolvente A, cido frmico al 40%Disolvente B, acetonitriloGradiente inicial: 25 % solvente A6 minutos despus incremente el disolvente B a 23 %.8 minutos despus incremente el disolvente B a 50 %.5 minutos despus incremente el disolvente B a 95 %.Flujo 0.7 ml/min

NOTA: verifique que tanto las muestras como los disolventes de la fmvil se filtren en membranas Millipore de 0.45 |jm.

3. Prenda y acondicione el cromatgrafo, permitiendo que se estabilicflujo y la columna.4. Se inyectan 2 (il del extracto colorido. Reptalo por triplicado.

71



74/132


5. Para elaborar la curva patrn con el clorhidrato de malvidin 3monoglucsido, se preparan cuatro diferentes concentraciones 25 ,100 y 150 mg/1 en metanol con1 ml/1 deHC1 concentrado. Se inyectanen la columna por separado, los volmenes de inyeccin deben ser214,1.Ajuste la atenuacin para que los picos no rebasen la escala dintegra

Manual de Practicas Instrument Ales y as

Documents

Transcript of Manual de Practicas Instrument Ales y as