1976, 126(1):338.J. Bacteriol.F P Guengerich and H P Broquistrelated fungi.Rhizoctonia leguminicola and Lysine catabolism inhttp://jb.asm.org/content/126/1/338found at: Updated information and services can beThese include:CONTENT ALERTSmorealerts (when new articles cite this article), Receive: RSS Feeds, eTOCs, free emailhttp://journals.asm.org/site/misc/reprints.xhtml Information about commercial reprint orders: http://journals.asm.org/site/subscriptions/ To subscribe to to another ASM Journal go to: on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , A p r . 1 9 7 6 , p . 3 3 8 - 3 4 7C o p y r i g h t 1 9 7 6 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 1 2 6 , N o . 1P r i n t e d i n U . S A .L y s i n e C a t a b o l i s m i n R h i z o c t o n i a l e g u m i r n i c o l aa n d R e l a t e d Fu n g iF. P E T E R G U E N G E R I C HA N D HA R R Y P . B R O QU I S T *De p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y , V a n d e r b i l t U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n e , N a s h v i l l e , T e n n e s s e e 3 7 2 3 2R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 3 De c e m b e r 1 9 7 5T h e c a t a b o l i s m o f l y s i n e w a s s t u d i e d i n s e v e r a l y e a s t s a n d f u n g i . R e s u l t s w i t hc e l l - f r e e e x t r a c t s o f R h i z o c t o n i a l e g u m i n i c o l a s u p p o r t a p r o p o s e d p a t h w a y i n -v o l v i n g ( D- a n d L - ) e - N - a c e t y l l y s i n e , a - k e t o - E - a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d , 8 - a c e t a m -i d o v a l e r i c a c i d , a n d 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d i n t h e c o n v e r s i o n o f L - l y s i n e t o s h o r t -c h a i n o r g a n i c a c i d s . L a b e l f r o m r a d i o a c t i v e L - l y s i n e w a s f o u n d t o a c c u m u l a t e i nD- a n d L - E - N - a c e t y l l y s i n e , 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d , 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d , a n dg l u t a r i c a c i d i n c u l t u r e s o fR . l e g u m i n i c o l a , N e u r o s p o r a c r a s s a , S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e , a n d Ha n s e n u l a s a t u r n u s , s u g g e s t i n g t h a t t h e p r o p o s e d w - a c e t y lp a t h w a y o f l y s i n e c a t a b o l i s m i s g e n e r a l i z e d a m o n g y e a s t s a n d f u n g i . I n N .c r a s s a , a s i s t h e c a s e i nR . l e g u m i n i c o l a , t h e m a j o r p r e c u r s o r o f L - p i p e c o l i c a c i dw a s t h e L - i s o m e r o f l y s i n e ; ' " N e x p e r i m e n t s w e r e c o n s i s t e n t w i t h A l ' - p i p e r i d e i n e -2 - c a r b o x y l i c a c i d a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e t r a n s f o r m a t i o n .T h e v a r i o u s r o u t e s f o r t h e c a t a b o l i s m o f l y -s i n e h a v e b e e n r e v i e w e d b y R o d w e l l ( 2 7 ) . A l -t h o u g h t h e c a t a b o l i c p a t h w a y s h a v e b e e n w e l ld e l i n e a t e d f o r s e v e r a l g r o u p s o f b a c t e r i a , t h ec a t a b o l i s m o f l y s i n e i n y e a s t s a n d f u n g i h a s n o tb e e n s u b j e c t e d t o a g r e a t d e a l o f s t u d y . T h ei d e n t i f i c a t i o n o f E - N - a c e t y l l y s i n e , 8 - a c e t a m i -d o v a l e r i c a c i d , a - h y d r o x y - e - a c e t a m i d o h e x a n o i ca c i d , a n d g l u t a r i c a c i d a s m e t a b o l i t e s o f L - l y -s i n e i n t h e y e a s tHa n s e n u l a s a t u r n u s l e d R o t h -s t e i n t o p o s t u l a t e a d e g r a d a t i v e p a t h w a y i n -v o l v i n g t h e s e i n t e r m e d i a t e s i n y e a s t s ( 2 8 , 3 1 ) .T h e y e a s t T o r u l a u t i l i s a c c u m u l a t e s 8 - a m i n o -v a l e r i c a c i d a n d a - h y d r o x y - e - a m i n o h e x a n o i ca c i d f r o m a - a m o n o a d i p i c a c i d , p r e s u m a b l y v i al y s i n e ( 3 2 ) , w h e r e a s M a t t o o n a n d Ha i g h t ( 1 5 )d e s c r i b e d a l y s i n e - r e q u i r i n g m u t a n t o f S a c c h a -r o m y c e s c e r e v i s i a e t h a t a c c u m u l a t e s g l u t a r i ca c i d . S c h w e e t e t a l . ( 3 4 ) s h o w e d t h a t i nN e u r o -s p o r a c r a s s a L - l y s i n e i s c o n v e r t e d t o L - p i p e c o l i ca c i d a n d a n N - a c y l d e r i v a t i v e o f a - h y d r o x y - e -a m i n o h e x a n o i c a c i d . M e i s t e r e t a l . ( 1 8 ) l a t e rd e s c r i b e d a p y r i d i n e n u c l e o t i d e - d e p e n d e n t r e -d u c t a s e t h a t r e d u c e s A ' - p i p e r i d e i n e - 2 - c a r b o x -y l i c a c i d s t e r e o s p e c i f i c a l l y t o L - p i p e c o l i c a c i d i nt h e s a m e o r g a n i s m .P r e v i o u s w o r k f r o m o u r l a b o r a t o r y w i t h t h ef u n g u s R h i z o c t o n i a l e g u m i n i c o l a h a s s h o w nt h a t - E - N - a c e t y l l y s i n e a n d L - p i p e c o l i c a c i d a c -c u m u l a t e f r o m e i t h e r D- o r L - l y s i n e ; a l y s i n er a c e m a s e w a s d e m o n s t r a t e d ( 8 ) . M o r e o v e r , D-l y s i n e w a s m e t a b o l i z e d t o D- e - N - a c e t y l l y s i n e ,w h e r e a s L - l y s i n e g a v e r i s e t o L - p i p e c o l i c a c i dv i a A ' - p i p e r i d e i n e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d i n v i v o ( 8 ) .T h e p o s s i b i l i t y w a s c o n s i d e r e d t h a t c a t a b o l i s mv i a w - a c e t y l a t e d d e r i v a t i v e s m a y c o n s t i t u t e ag e n e r a l i z e d d e g r a d a t i v e p a t h w a y o f l y s i n e m e -t a b o l i s m i n t h o s e f u n g i s y n t h e s i z i n g l y s i n e v i at h e h o m o c i t r i c - a m i n o a d i p i c a c i d p a t h w a y ( 3 ) .T h i s p a p e r r e p o r t s a s e r i e s o f s t u d i e s , b o t h i nv i v o a n d i n v i t r o , o f t h e l y s i n e c a t a b o l i s m o fd i v e r s e f u n g i t h a t l e n d s u p p o r t t o t h i s v i e w .Fi g u r e 1 p r e s e n t s t h e r e l e v a n t p a t h w a y s c o n -s i d e r e d . A b r i e f a c c o u n t o f t h i s w o r k h a s a p -p e a r e d ( F. P . G u e n g e r i c h a n d H. P . B r o q u i s t ,Fe d . P r o c . 3 2 : 5 9 3 , 1 9 7 3 ) .M A T E R I A L S A N D M E T HO DSC u l t u r e s . R . l e g u m i n i c o l a w a s g r o w n i n s t a t i o n -a r y c u l t u r e ( R o u x b o t t l e s ) o n 2 5 0 m l o f r e d c l o v e r h a ye x t r a c t m e d i u m a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 , 1 0 ) . A l lo t h e r o r g a n i s m s w e r e g r o w n w i t h r o t a r y s h a k i n g a t3 2 C ( 2 0 m l o f m e d i u m / s h a k e f l a s k ) . N . c r a s s a l y s i n ea u x o t r o p h s 1 5 0 6 9 a n d 3 3 9 3 3 w e r e g r o w n o n t h e m e -d i u m o f Ho r o w i t z a n d B e a d l e ( 1 1 ) c o n t a i n i n g 2 . 0 m ML - l y s i n e . ( M u t a n t 1 5 0 6 9 l a c k s s a c c h a r o p i n e d e h y d r o -g e n a s e [3 3 ]; 3 3 9 3 3 l a c k s c i s - h o m o a c o n i t a s e [1 ]. ) T h ey e a s t s S . c e r e v i s i a e S - 2 2 8 C ( f r o m F. Wo m a c k , V a n -d e r b i l t U n i v e r s i t y ) a n d H. s a t u r n u s ( A T C C 2 5 7 9 )w e r e g r o w n e i t h e r o n 1 . 4 % Di f c o n i t r o g e n b a s e - 1 %d e x t r o s e m e d i u m o r a s d e s c r i b e d b y R o t h s t e i n ( 2 9 ) ,r e s p e c t i v e l y .Wh o l e c e l l i n c u b a t i o n s . Wh o l e c e l l l y s i n e i n c u b a -t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h N . c r a s s a a n d t h e y e a s t sb y a d d i n g t h e a p p r o p r i a t e l y l a b e l e d l y s i n e ( 1 t o 1 0, u m o l ) t o t h e m e d i a ( 2 0 m l ) o f m a t u r e ( 5 d a y ) c u l -t u r e s ; i n c u b a t i o n p r o c e e d e d a t 3 2 C ( w i t h s h a k i n g )f o r 1 2 t o 4 8 h . N . c r a s s a m y c e l i a w e r e d r a i n e d ,r i n s e d , b l e n d e d w i t h 9 5 % e t h a n o l , a n d e x t r a c t e d i n aS o x h l e t a p p a r a t u s o v e r n i g h t w i t h t h e e t h a n o l i c f i l -3 3 8 on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from L Y S I N E C A T A B O L I S M I N FU N G I 3 3 9S A C C HA R O P I N EL - L Y S I N E -- KE T O - E - N H2, ,A HE XA N O A T ED- E - N - A c L Y S I N E *; o : - L - C - N - A c L Y S I N E a-2 - Cc ( - KE T O - E - N - A c HE XA N O A T E _ >- O H- e - N - A cHE XA N O A T EI -c o 2i - N - A c - V AL E R A TEP I P E R I DE I N E -' A R B O XY L A TEL - P I P E C OL A T Eo c - O H- E - N H2H E XA N O A T E\ 1 -S - N H2 - V A L E R A T E - - G L U T A R I C - G L U T A R A T E - - - A C E T A T ES E M I A L DE HY DEFI G . 1 . P o s t u l a t e d p a t h w a y s o f l y s i n e c a t a b o l i s m i n y e a s t s a n d f u n g i .t r a t e ; t h e e t h a n o l i c e x t r a c t s w e r e c o n c e n t r a t e d i nv a c u o . Wh o l e y e a s t c u l t u r e s w e r e h a r v e s t e d b y t h es a m e p r o c e d u r e .I n s o m e c a s e s ( s e e T a b l e 2 ) r a d i o t r a c e r s w e r ei n j e c t e d u n d e r t h e m y c e l i u m o f m a t u r e ( 1 2 d a y ) R .l e g u m i n i c o l a c u l t u r e s i n t o t h e m e d i u m ( 2 5 0 m l ) . I nm o s t c a s e s , t h e m e d i u m w a s d r a i n e d o f f a n d t h em y c e l i u m w a s s u s p e n d e d i n 5 0 m l o f s t e r i l e w a t e rc o n t a i n i n g t h e c o m p o u n d ( s ) o f i n t e r e s t ( u n l e s s o t h -e r w i s e n o t e d , t h e l e v e l o f a d d i t i o n o f l a b e l e d l y s i n ew a s 1 t o 1 0 j m m o l / 5 0 m l ) . I n c u b a t i o n p r o c e e d e d a tr o o m t e m p e r a t u r e ( s t a t i o n a r y c u l t u r e ) f o r 1 2 t o 2 4 h .T h e m y c e l i a w e r e h a r v e s t e d a n d w o r k e d u p a s i n t h ec a s e o f N . c r a s s a d e s c r i b e d a b o v e .C e l l - f r e e e x t r a c t s a n d i n c u b a t i o n s . C e l l - f r e e e x -t r a c t s o f R . l e g u m i n i c o l a ( 1 0 t o 1 2 d a y s o f a g e ) w e r ep r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) a n d a d d e d t ot e s t i n c u b a t i o n s y s t e m s o n t h e b a s i s o f p r o t e i n c o n -t e n t ( 1 4 ) ; w h e n n o t e d , " d e s a l t i n g " o f e n z y m e f r a c -t i o n s w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g a c o l u m n ( 2 . 5 b y 5 0c m ) o f S e p h a d e x G - 2 5 ( a t 4 C ) . A f t e r i n c u b a t i o n ,r e a c t i o n s w e r e u s u a l l y s t o p p e d b y b o i l i n g ( 5 m i n ) o rt r e a t m e n t w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d o r HC l 0 4 a n dc e n t r i f u g e d . P r o d u c t s a n d r e a c t a n t s w e r e s e p a r a t e db y a p p r o p r i a t e c h r o m a t o g r a p h i c p r o c e d u r e s t o p e r -m i t q u a n t i t a t i o n o f r e s u l t s a f t e r m e a s u r e m e n t o fr a d i o a c t i v i t y .C h r o m a t o g r a p h y . T h e i o n - e x c h a n g e s y s t e m d e -s c r i b e d b y P i e z e t a l . ( 2 5 ) w a s u s e d t o s e p a r a t e t h ea m i n o a c i d s o f c o n c e r n , w i t h t h e c o l u m n m o d i f i c a -t i o n s a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) ; t h e f l o w r a t e w a s5 0 m l / h , a n d 5 - m l f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d . A c i d i cc o m p o u n d s ( v o i d v o l u m e ) , 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d , E - N -a c e t y l l y s i n e , a n d p i p e c o l i c a c i d ( o r d e r o f e l u t i o n )w e r e r e a d i l y s e p a r a t e d u s i n g t h i s s y s t e m ( 8 ) . T h ei d e n t i t i e s o f a l l r a d i o a c t i v e p e a k s f r o m t h e c o l u m n sw e r e c o n f i r m e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y . De s a l t -i n g o f a m i n o a c i d s w a s a c h i e v e d b y a p p l y i n g s a m -p l e s t o a c o l u m n ( 1 . 2 b y 2 5 c m ) o f Do w e x 5 0 X8 ( H+f o r m , 2 0 0 t o 4 0 0 m e s h ) , e l u t i n g t h e c i t r a t e w i t h 2 0 0m l o f d i s t i l l e d w a t e r , a n d e l u t i n g t h e a m i n o a c i d sw i t h 2 N N H4 0 H, f o l l o w e d b y i n v a c u o r e m o v a l o ft h e a m m o n i a .A c i d i c m e t a b o l i t e s w e r e u s u a l l y s e p a r a t e d b yc h r o m a t o g r a p h y o n Do w e x 1 X8 ( 2 8 ) ; t h e c o l u m ns i z e w a g 0 . 9 b y 4 5 c m ( 2 0 0 t o 4 0 0 m e s h ) , a n d s a m p l e so f 1 t o 2 m l i n v o l u m e w e r e a p p l i e d a t p H8 t o 9 . T h ei d e n t i t i e s o f p e a k s o f c o n c e r n w e r e c o n f i r m e d i n a l lc a s e s b y p a p e r a n d / o r t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y( T L C ) .A l t e r n a t i v e l y , i n s e v e r a l i n s t a n c e s s i l i c i c a c i dc h r o m a t o g r a p h y w a s u s e d t o s e p a r a t e a c i d i c m e t a b -o l i t e s ( s e e Fi g . 2 a n d 3 ) . E t h a n o l i c c e l l e x t r a c t s w e r ec o n c e n t r a t e d i n v a c u o t o a s m a l l v o l u m e a n d a p p l i e dt o a Do w e x 5 0 X8 c o l u m n ( 1 . 2 b y 2 5 c m , 2 0 0 t o 4 0 0m e s h , H+ f o r m ) . T h e a c i d i c c o m p o u n d s w e r e e l u t e dw i t h 2 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n d c o n c e n t r a t e d i nv a c u o a t 4 0 C t o a b o u t a 1 - m l v o l u m e . T h e s a m p l e sw e r e a c i d i f i e d , t r i t u r a t e d w i t h s i l i c i c a c i d , a n d c h r o -m a t o g r a p h e d b y t h e p r o c e d u r e o f R a m s e y ( 2 6 ) .P a p e r c h r o m a t o g r a p h y s y s t e m s e m p l o y e d Wh a t -m a n n o . 1 p a p e r i n a d e s c e n d i n g a p p a r a t u s . T h es o l v e n t s y s t e m s e m p l o y e d w e r e : B A W ( n - b u t a n o l -a c e t i c a c i d - w a t e r , 4 : 1 : 1 ) ; P A W ( p y r i d i n e - a c e t i c a c i d -w a t e r , 1 0 : 7 : 3 ) ; B P W ( n - b u t a n o l - p y r i d i n e - w a t e r ,1 : 1 : 1 ) . T L C s y s t e m s u t i l i z e d 0 . 1 - , 0 . 2 5 - , o r 0 . 5 - m ml a y e r s o f s i l i c a g e l G ; t h e s o l v e n t s y s t e m s u s e d w e r e :B M A ( b e n z e n e - m e t h a n o l - a c e t i c a c i d , 8 : 1 : 1 ) ; E A( e t h a n o l - 1 4 % a q u e o u s N H4 0 H, 3 : 1 ) ; C M A ( c h l o r o -f o r m - m e t h a n o l - 1 4 % a q u e o u s N H4 0 H, 2 : 2 : 1 ) ; C M( c h l o r o f o r m - m e t h a n o l , 1 : 1 ) .A s s a y o f i s o t o p e s . R a d i o a c t i v e c o u n t i n g w a s a sp r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 , 1 0 ) ; f o r d o u b l e - l a b e l c o u n t -i n g , t h e P a c k a r d 3 3 2 0 s p e c t r o m e t e r w a s s e t u p s u c ht h a t t h e 3 He f f i c i e n c y w a s 1 7 % i n t h e l o w e r c h a n n e la n d 0 . 1 % i n t h e u p p e r c h a n n e l . T h e ' 4 C e f f i l c i e n c yD- L Y S I N E'V O L . 1 2 6 , 1 9 7 6 on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from 3 4 0 G U E N G E R I C H A N D B R O QU I S Tw a s 5 0 % i n t h e u p p e r c h a n n e l a n d l e s s t h a n 1 0 % i nt h e l o w e r c h a n n e l ( c o r r e c t i o n s w e r e m a d e u s i n gb o t h [3 H]- a n d [1 4 C ]t o l u e n e i n t e r n a l s t a n d a r d s ) .I n c o r p o r a t i o n o f ' 5 N i n t o p i p e c o l i c a c i d w a s a s -s a y e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) .M a t e r i a l s . D- , L - , a n d DL - e - N - a c e t y l l y s i n e s w e r ep u r c h a s e d f r o m C y c l o C h e m i c a l C o r p . ; 8 - a m i n o v a l -e r i c a c i d w a s f r o m C a l b i o c h e m . R a d i o a c t i v e l y s i n e sw e r e p u r c h a s e d f r o m N e w E n g l a n d N u c l e a r C o r p .[1 , 5 - ' 4 C ]g l u t a r i c a c i d w a s f r o m I n t e r n a t i o n a l C h e m -i c a l a n d N u c l e a r C o r p .]3 _[1 - ' 4 C ]l y s i n e w a s p r e p a r e d a sp r e v i o u s l y d e -s c r i b e d ( 8 ) ; t h e o p t i c a l p u r i t y w a s d e t e r m i n e d t o b e9 9 . 0 % . DL - [a - ' 3 N ]l y s i n e a n d DL - [E - 'N ]l y s i n e w e r es y n t h e s i z e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 8 ) .A c e t y l c o e n z y m e A w a s s y n t h e s i z e d a c c o r d i n g t oO c h o a ( 2 3 ) . 8 - A m i n o v a l e r i c a c i d w a s a c e t y l a t e d w i t hp y r i d i n e - a c e t i c a n h y d r i d e t o f o r m 8 - a c e t a m i d o v a l -e r i c a c i d a c c o r d i n g t o Fi e s e r ( 5 ) , u s i n g t h e p r o c e d u r ed e s c r i b e d f o r t h e a c e t y l a t i o n o f a l a n i n e .DL - E - N - b e n z o y l l y s i n e ( C y c l o C h e m i c a l C o r p . ) w a su s e d t o p r e p a r e DL - a - b r o m o - E - b e n z a m i d o h e x a n o i ca c i d ( 9 ) , w h i c h w a s u s e d t o s y n t h e s i z e DL - a - h y d r o x y -e - a m i n o h e x a n o i c a c i d a c c o r d i n g t o Fi s c h e r a n dZ e m p l e n ( 6 ) ( m e l t i n g p o i n t , 1 9 9 t o 2 0 4 C ; c a l c u l a t e df o r C 6 i H, , N O : C , 4 8 . 9 4 ; H, 8 . 9 1 ; N , 9 . 5 2 ; f o u n d : C ,4 8 . 8 5 ; H, 8 . 7 8 ; N , 9 . 4 6 [G a l b r a i t h L a b o r a t o r i e s ,Kn o x v i l l e , T e n n . ]; s i n g l e n i n h y d r i n - p o s i t i v e s p o t o np a p e r c h r o m a t o g r a p h y [B A W]) . A c e t y l a t i o n w i t hp y r i d i n e - a c e t i c a n h y d r i d e ( 5 ) f o l l o w e d b y m i l d b a s i ch y d r o l y s i s p r o d u c e d DL - a - h y d r o x y - E - a c e t a m i d o h e x -a n o i c a c i d .L a b e l e d E - N - a c e t y l l y s i n e s w e r e s y n t h e s i z e d f r o mt h e a p p r o p r i a t e l y l a b e l e d l y s i n e s a s p r e v i o u s l y d e -s c r i b e d ( 2 1 ) . T h e p r o d u c t s w e r e p u r i f i e d b y i o n - e x -c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( 2 5 ) a n d d e s a l t e d p r i o r t ou s e . a - Ke t o - E - a c e t a m i d o - l G - 3 H]h e x a n o i c a c i d w a sp r e p a r e d b y t r e a t m e n t o f L - E - N - a c e t y l - [G - 3 H]l y s i n ew i t h C r o t a l u s a d a m a n t e u s v e n o m ( R o s s A l l e n R e p -t i l e I n s t i t u t e , S i l v e r S p r i n g s , Fl a . ) a c c o r d i n g t oM e i s t e r ( 1 6 ) . T h e p r o d u c t w a s p u r i f i e d b y c h r o m a -t o g r a p h y o n Do w e x 1 X8 ( e l u t i o n w i t h d i s t i l l e dw a t e r , 1 N HO A c , a n d 2 N HO A c i n s u c c e s s i v eo r d e r ) f o l l o w e d b y s u b s e q u e n t p u r i f i c a t i o n b y p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ( B A W) .8 - A c e t a m i d o - [5 - ' 4 C ]v a l e r i c a c i d w a s p r e p a r e d a sf o l l o w s . E t h y l 8 - a c e t a m i d o - [5 - ' 4 C ]v a l e r a t e w a s s y n -t h e s i z e d a c c o r d i n g t o R o t h s t e i n ( 2 9 ) , s t a r t i n g w i t h9 . 8 0 g ( 2 5 0 , C i ) o f K' 4 C N ( N e w E n g l a n d N u c l e a rC o r p . ) a n d 2 . 5 g o f e t h y l 4 - b r o m o b u t y r a t e ( J . T .B a k e r C o . ) . T h e e s t e r w a s h e a t e d f o r 1 0 m i n i n 2 0 m lo f 2 N N a O Ha t 1 0 0 C . A f t e r c o o l i n g , t h e s o l u t i o nw a s l o w e r e d t o p H2 w i t h 6 NHC I a n d e x t r a c t e d f i v et i m e s w i t h e t h y l a c e t a t e . T h e c o m b i n e d o r g a n i c l a y -e r s w e r e d r i e d w i t h a n h y d r o u s s o d i u m s u l f a t e a n dr e d u c e d i n v a c u o . T h e r e s i d u e w a s t a k e n u p i n w a -t e r , a d j u s t e d t o p H8 . 2 , a n d a p p l i e d t o a c o l u m n ( 4 5b y 1 . 2 c m ) o f Do w e x 1 X8 ( a c e t a t e f o r m , 2 0 0 t o 4 0 0m e s h ) . T h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h 1 0 0 m l o f d i s -t i l l e d w a t e r ; 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d w a s e l u t e dw i t h 0 . 5 N a c e t i c a c i d . T h e p e a k f r a c t i o n s w e r ec o m b i n e d a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o ; t h e p r o d u c tm i g r a t e d a s a s i n g l e p e a k o n T L C ( C M A , v i s u a l i z a -t i o n w i t h 1 2 v a p o r a n d w i t h b r o m c r e s o l g r e e n ; a l lr a d i o a c t i v i t y c h r o m a t o g r a p h e d w i t h t h e p r o d u c t ) .J . B A C T E R I O L .R E S U L T SC o n v e r s i o n o f l y s i n e t o p i p e c o l i c a c i d . E v i -d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d t h a t i n R . l e g u m i n i -c o l a t h e n i t r o g e n a t o m o f L - p i p e c o l i c a c i d i sd e r i v e d f r o m t h e e - a m i n o g r o u p o f t h e L - i s o m e ro f l y s i n e , s u g g e s t i n g t h a t A ' - p i p e r i d e i n e - 2 - c a r -b o x y l i c a c i d i s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e t r a n s f o r -m a t i o n ( 9 ) . B e c a u s e t h e l a t t e r c o m p o u n d h a sb e e n s u g g e s t e d a s a n i n t e r m e d i a t e i n t h e f o r -m a t i o n o f p i p e c o l i c a c i d i n N . c r a s s a ( 1 8 , 3 4 ) ,t h e w o r k w i t h R . l e g u m i n i c o l a w a s r e p e a t e dw i t h a l y s i n e - r e q u i r i n g a u x o t r o p h o fN . c r a s s a .N . c r a s s a 1 5 0 6 9 w a s g r o w n f o r 5 d a y s o ne i t h e r 0 . 2 m M DL - E - ' >N I l y s i n e ( 4 4 . 8 % e x c e s s' " N ) o r 0 . 4 m M DL - [a - ' ; N ]l y s i n e ( 4 5 . 6 % e x c e s s' - N ) . G a s - l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y - m a s s s p e c -t r o m e t r y ( 9 ) o f t h e e t h y l e s t e r s o f t h e i s o l a t e dp i p e c o l i c a c i d f r a c t i o n s s h o w e d t h a t t h e p i p e -c o l i c a c i d o f N . c r a s s a 1 5 0 6 9 g r o w n o n t e -I ' N i l y s i n e c o n t a i n e d 3 5 . 0 % e x c e s s ' - N , w h e r e a st h a t f r o m t h e s a m e a u x o t r o p h g r o w n o n [a -' 5 N ]l y s i n e c o n t a i n e d o n l y 1 . 2 % e x c e s s ' - N .S i n c e t h e p e r c e n t a g e o f i n c o r p o r a t i o n o f l y -s i n e l a b e l i n t o p i p e c o l i c a c i d w a s f o u n d t o b es o m e w h a t v a r i a b l e i n N . c r a s s a , t h e d o u b l e -l a b e l t e c h n i q u e o f L e i s t n e r e t a l . ( 1 4 ) w a s u s e dt o e x a m i n e t h e s t e r e o s p e c i f i c i t y o f t h e t r a n s f o r -m a t i o n . T h e r o l e o f a l y s i n e r a c e m a s e i n v i v oh a d b e e n s u g g e s t e d b y t h e e x p e r i m e n t s o fS c h w e e t e t a l . ( 3 4 ) , a s l y s i n e - r e q u i r i n g N .c r a s s a a u x o t r o p h s w e r e f o u n d t o g r o w o n h i g hl e v e l s o f D- l y s i n e . S i n c e t h e l y s i n e r a c e m a s e s o fR . l e g u m i n i c o l a a n d P s e u d o m o n a s p u t i d a a r es t r o n g l y i n h i b i t e d b o t h i n v i t r o a n d i n v i v o b yN H2 O H ( 1 , 1 9 ) , t h i s a n t i m e t a b o l i t e w a s a d d e di n t h e N . c r a s s a e x p e r i m e n t s . T a b l e 1 s h o w st h a t i n t h e c o n t r o l e x p e r i m e n t ( C o l u m n 1 ) t h ee x p e c t e d r a t i o o f u n i t y ( p i p e c o l i c a c i d r a t i o /l y s i n e r a t i o ) w a s o b t a i n e d w i t h i n e x p e r i m e n t a le r r o r . E x p e r i m e n t s w i t h _[1 _- ' 4 C ]- a n d i L U -' 4 C i l y s i n e s ( T a b l e 1 ) i n d i c a t e d t h a t a b o u t 7 0 %o f t h e p i p e c o l i c a c i d i s d e r i v e d f r o m t h e L -i s o m e r o f l y s i n e . T h e r e m a i n i n g 3 0 % c a n b ee x p l a i n e d b y e i t h e r ( i ) d i r e c t c o n v e r s i o n o f n -l y s i n e t o p i p e c o l i c a c i d , o r ( i i ) i n c o m p l e t e i n h i -b i t i o n o f a l y s i n e r a c e m a s e b yN H, O Hi n t h e s ee x p e r i m e n t s .L y s i n e : e - N - a c e t y l l y s i n e i n t e r c o n v e r s i o n .T h e f o r m a t i o n o f E - N - a c e t y l l y s i n e f r o m v a r -i o u s l y l a b e l e d l y s i n e s a f t e r i n c u b a t i o n o f w h o l ec u l t u r e s o f R . l e g u m i n i c o l a h a s b e e np r e v i o u s l yd e m o n s t r a t e d ( 8 ) . U s i n g t h e s e s a m e t e c h -n i q u e s , e - N - a c e t y l l y s i n e h a s b e e n s h o w n t o a c -c u m u l a t e f r o m l y s i n e i n N e u r o s p o r a a n d y e a s tc u l t u r e s , c o n s i s t e n t w i t h o b s e r v a t i o n s o f e a r l i e ri n v e s t i g a t o r s o n t h e o c c u r r e n c e o f e - a c e t y l l y -s i n e d e r i v a t i v e s i n t h e s e o r g a n i s m s ( 2 8 , 3 4 ) .T a b l e 2 p r e s e n t s a s e r i e s o f s u c h e x p e r i m e n t s i n on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from L Y S I N E C A T A B O L I S M I N FU N G I 3 4 1T A B L E 1 . S t e r e o c h e m i s t r y o f t h e l y s i n e ( L y s ) t o p i p e c o l i c a c i d ( P i p ) c o n v e r s i o n i n N . c r a s s a aL y s P i p%P i p d e r i v e dL a b e l e d L y s b P i p r a t i o / L y s f r o m : L a b e l e dL y 4 C r a t i o3 H 1 4 C3 H/ ' 4 C3 H( g C i )' 4 C( I M C i )3 H/ 1 ' 4 C D- L y e ' L - L y e d( p L c i ) ( A C i )DL - [4 , 5 - 3 H]/ DL - [2 - ' 4 C ] 7 . 6 9 1 . 8 9 4 . 0 9 0 . 2 8 0 0 . 0 6 4 4 . 3 9 1 . 0 7( 3 . 6 4 ) e ( 3 . 3 9 )DL - [4 , 5 - 3 H/ D[1 -1 4 C ] 1 8 . 7 5 2 . 9 9 6 . 2 8 0 . 4 6 3 0 . 0 5 2 8 . 8 9 1 . 4 2 3 5 6 5( 2 . 4 7 ) ( 1 . 7 4 )DL - [4 , 5 - 3 H]/ L - [U - 1 4 C ] 2 0 . 5 0 2 . 7 1 7 . 5 8 0 . 4 5 8 0 . 0 8 6 5 . 3 4 0 . 7 0 2 9 7 1( 2 . 2 3 ) ( 3 . 1 7 )aN . c r a s s a 1 5 0 6 9 w a s g r o w n a t 3 2 C i n t h r e e s h a k e c u l t u r e s o n t h e b a s a l m e d i a ( 2 5 m l / f l a s k ) o f Ho r o w i t za n d B e a d l e ( 1 1 ) c o n t a i n i n g 1 . 0j i go f b i o t i n p e r m l a n d 1 . 0 m M L - l y s i n e . A f t e r 5 d a y s t h e l a b e l e d l y s i n em i x t u r e s ( 5 0 M u M t o t a l l y s i n e ) w e r e a d d e d a l o n g w i t h 0 . 4m M c a r r i e r DL - l y s i n e a n d 1 . 5 m M N H2 O H. A f t e r 1 2h a t 3 2 C , p i p e c o l i c a c i d w a s i s o l a t e d f r o m t h e m y c e l i a l e x t r a c t s u s i n g t h e d e s c r i b e d i o n - e x c h a n g e s y s t e mo f P i e z e t a l . ( 2 5 ) , d e s a l t e d , a n d c o u n t e d a s d e s c r i b e d .b P r e p a r e d b y m i x i n g DL - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e ( 2 5 0 u C i / u m o l ) , DL - [2 - ' 4 C ]l y s i n e ( 3 . 9 u C i / u m o l ) , D- [1 - ' 4 C ]l y s i n e( 1 . 9 6 M C i / , u m o l ) , a n d L - [U - ' 4 C ]l y s i n e ( 3 8 . 5 M C i / , u m o l ) t o a c h i e v e t h e s t a t e d r a t i o s o f 3 H/ ' 4 C .' T h e p e r c e n t a g e ( y ) o f t h e p r o d u c t ( p i p e c o l i c a c i d ) d e r i v e d f r o m D- l y s i n e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h ee x p r e s s i o ny = 5 0 n / x , w h e r e n=3 H/ ' 4 C r a t i o o f t h e s u b s t r a t e ( DL - 4 4 , 5 - 3 H]l y s i n e / D- [1 - ' 4 C ]l y s i n e ) a n d x = 3 H/1 4 C r a t i o o f t h e p r o d u c t ( p i p e c o l i c a c i d ) ( 1 3 ) .d T h e p e r c e n t a g e o f p i p e c o l i c a c i d a r i s i n g f r o m L - l y s i n e w a s c a l c u l a t e d b y d i f f e r e n c e .eV a l u e s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e p e r c e n t a g e i n c o r p o r a t e d .T A B L E 2 . C o n f i g u r a t i o n o f & N - a c e t y l l y s i n e ( e N - A c L y s ) i n s e v e r a l y e a s t s a n d f u n g i ae - N - A c L y s L a b e l a c c u m u -O r g a n i s m A d d e d s u b s t r a t e l a t e d a s e - N -D ( % ) L ( % ) A c L y s ( % )R . l e g u m i n i c o l a L - [U - ' 4 C ]L y s ( 0 . 4 M u M ) 9 4 6 0 . 4 5N . c r a s s a 3 3 9 3 3 L - [4 , 5 - 3 HI L y s ( 1 0 M A M ) 4 0 6 0 0 . 1 5S . c e r e v i s i a e L - [4 , 5 - 3 H]L y s ( 1 0 M u M ) 1 9 8 1 0 . 0 5H. s a t u r n u s L - [4 , 5 - 3 H]L y s ( 1 0 M A M ) 2 1 7 9 0 . 0 4aM a t u r e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r 4 8 h w i t h e i t h e r L - [U - ' 4 C ]l y s i n e ( 3 1 2 M C i / M u m o l ) o r L - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e( 2 5 0 M A C i / M u m o l ) . E t h a n o l i c c e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d a n d a p p l i e d t o a Do w e x 5 0 c o l u m n [P i e ze t a l . ( 2 5 ) ] f r o m w h i c h E - N - a c e t y l l y s i n e w a s i s o l a t e d ; i t s i s o m e r i c n a t u r ew a s d e t e r m i n e d b y t h e D- a m i n o a c i do x i d a s e a s s a y ( 8 , 3 5 ) .w h i c h t h e c o n f i g u r a t i o n o f t h e f o r m e d E - N - a c e -t y l l y s i n e w a s d e t e r m i n e d a f t e r i n c u b a t i o n o ft h e f u n g i a n d y e a s t s w i t h l a b e l e d L - l y s i n e s .S i g n i f i c a n t 1 - i s o m e r w a s p r e s e n t i n a l l i n -s t a n c e s ; t h e - i s o m e r p r e d o m i n a t e d i n R . l e g -u m i n i c o l a , w h e r e a s t h e L - f o r m w a s p r o m i n e n ti n t h e o t h e r o r g a n i s m s .E x t r a c t s o f R . l e g u m i n i c o l a f o r m e - N - a c e t y l -l y s i n e f r o m b o t hn -a n d L - l y s i n e ( T a b l e 3 ) . E - N -a c e t y l l y s i n e f o r m a t i o n r e q u i r e d a c e t y l c o e n -z y m e A , b u t a c e t y l p h o s p h a t e w a s n o t u t i l i z e d .( Hy d r o x y l a m i n e w a s i n c l u d e d i n t h e i n c u b a -t i o n m i x t u r e t o m i n i m i z e l y s i n e r a c e m a s e a c t i v -i t y [8 ]. ) I n o t h e r e x p e r i m e n t s ( n o t s h o w n ) , e n -z y m i c h y d r o l y s i s o f e - N - a c e t y l l y s i n e t o l y s i n ep r o c e e d e d s i g n i f i c a n t l y f a s t e r ( a b o u t 2 0 - f o l d )w i t h t h e L - t h a n t h e n - i s o m e r . T h e e n z y m i cr a c e m i z a t i o n o f L - e - N - a c e t y l l y s i n e t o t h e n - i s o -m e r w a s a l s o d e m o n s t r a t e d i n R . l e g u m i n i c o l ae x t r a c t s ( u s i n g t h e n - a m i n o a c i d o x i d a s e a s s a y[3 5 ] i n t h ep r e s e n c eo f a d d e dp y r i d o x a l p h o s - .p h a t e ) . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e f i n d i n g s i nr e l a t i o n t o t h e s t e r e o s p e c i f i c r e q u i r e m e n t s f o rl y s i n e c a t a b o l i s m i n R . l e g u m i n i c o l a i s c o n s i d -e r e d m o r e f u l l y b e l o w .C o n v e r s i o n o f E - N - a c e t y l l y s i n e t o 8 - a c e t a m -i d o v a l e r i c a c i d v i a a - k e t o - e - a c e t a m i d o - h e x a n -o i c a c i d i n R . l e g u m i n i c o l a . A n e x t r a c t p r e -p a r e d f r o m a n R . l e g u m i n i c o l a c u l t u r e i n c u -b a t e d w i t h DL - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e w a s c h r o m a t o -g r a p h e d o n a s i l i c i c a c i d c o l u m n u n d e r c o n d i -t i o n s a p p r o p r i a t e f o r s e p a r a t i o n o f c a r b o x y l i ca c i d s ( 2 6 ) ( Fi g . 2 ) . T h e m a j o r p e a k w a s i d e n t i -f i e d a s 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d b y T L C ( B M A ,E A ) a n d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ( B A W) . T h ep e r c e n t a g e o f t h e l y s i n e l a b e l a c c u m u l a t e d i nt h e 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d f r a c t i o n w a s 0 . 9 % .T h er e m a i n d e r o f t h e r a d i o a c t i v e e l u a t e s w e r e as e r i e s o f c a r b o x y l i c a c i d s , w h i c h w e r e n o t c h a r -a c t e r i z e d . A f t e r a c i d h y d r o l y s i s ( 6 N HC l ,1 1 0 C , 1 2 h ) , t h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e p r e s u m e d8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d c h r o m a t o g r a p h e d w i t hV O L . 1 2 6 , 1 9 7 6 on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from 3 4 2 G U E N G E R I C H A N D B R O QU I S Ta u t h e n t i c 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d ( T L C , C M A ; p a -p e r c h r o m a t o g r a p h y , B A W) . L a b e l e d 8 - a c e t -a m i d o v a l e r i c a c i d w a s a l s o i d e n t i f i e d b y i o n -e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o n Do w e x 2 X8 ( 2 8 )i n a n e t h a n o l i c e x t r a c t o f a R . l e g u m i n i c o l ac u l t u r e i n c u b a t e d w i t h DL - [2 - 1 4 C ]l y s i n e .S i n c e i t s e e m e d r e a s o n a b l e t h a t 8 - a c e t a m i -d o v a l e r i c a c i d w a s a r i s i n g f r o m E - N - a c e t y l l y -s i n e v i a d e c a r b o x y l a t i o n o f t h e a - k e t o a c i d o ft h e l a t t e r , d e s a l t e d e x t r a c t s o f R . l e g u m i n i c o l aw e r e i n c u b a t e d w i t h D- e - N - a c e t y l - [4 , 5 -T A B L E 3 . L y s i n e a c e t y l a t i o n i n R . l e g u m i n i c o l ae x t r a c t sE - N - A c L y g cS y s t e m a S u b s t r a t e b f o r m e d( , u m o l )C o m p l e t e i - L y s i n e 0 . 5 2C o m p l e t e L - L y s i n e 0 . 3 0C o m p l e t e , c e l l e x t r a c t DL - L y s i n e 0b o i l e dL e s s a c e t y l C o A DL - L y s i n e 0 . 0 5L e s s a c e t y l C o A p l u s 5 DL - L y s i n e 0 . 0 1, u m o l o f a c e t y l p h o s -p h a t eaI n a d d i t i o n t o t h e s u b s t r a t e n o t e d , t h e c o m p l e t ei n c u b a t i o n s y s t e m c o n t a i n e d : c r u d e c e l l e x t r a c t ( 5m g ) , a c e t y l c o e n z y m eA ( C o A ) ( 5 , u m o l ) , N H2 O H( 7 . 2A m o l ) ,a n d p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 2 0 0 j u m o l , p H7 . 5 )i n 3 . 5 m l t o t a l v o l u m e .bI n e a c h c a s e , 5 , u m o l o f e i t h e r D- [1 - ' 4 C ]l y s i n e( 0 . 4 0 , C i / u m o l ) , L - [U ' 4 C I l y s i n e ( 0 . 4 8 , u C i / , u m o l ) , o rDL - [1 - _4 C ]l y s i n e ( 0 . 4 0 , u C i / , u m o l ) w a s a d d e d .' A f t e r i n c u b a t i o n f o r 2 h a t 2 5 C , a l l r e a c t i o n sw e r e s t o p p e d b y b o i l i n g f o r 5 m i n a n d c e n t r i f u g e d ; e -N - a c e t y l l y s i n e ( E - N - A c L y s ) f o r m a t i o n w a s m e a s u r e db y c o u n t i n g r a d i o a c t i v i t y a f t e r s e p a r a t i o n b y p a p e rc h r o m a t o g r a p h y ( B A W) .1 0 0 0 -- Ji 5 0 0 - l0 .0 0 X0 .J . B A C T E R I O L .3 H]l y s i n e , a - k e t o g l u t a r a t e , a n d p y r i d o x a l p h o s -p h a t e f o r 2 h a t r o o m t e m p e r a t u r e ( c o n d i t i o n sa s i n T a b l e 4 ) . C h r o m a t o g r a p h y o f a n a c i d i ce t h y l a c e t a t e e x t r a c t s h o w e d e s s e n t i a l l y o n er a d i o a c t i v e p e a k ( p a p e r [B A W], R f = 0 . 9 8 ; T L C[B M A I , R f = 0 . 7 9 ) . M a t e r i a l i n t h e e t h y l a c e -t a t e e x t r a c t f o r m e d a 2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a -z o n e ( p a p e r [B A W], R f = 0 . 9 1 ; T L C [B M A ], R f= 0 . 6 2 ) . R e d u c t i o n o f t h e l a t t e r w i t hh y d r o g e no v e r P t O 2 ( 1 7 ) y i e l d e d e x c l u s i v e l y e - N - a c e t y l l y -s i n e a s d e m o n s t r a t e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y( B A W, R f = 0 . 3 8 ) a n d T L C ( B M A , R f = 0 . 0 3 ) ,t h u s e s t a b l i s h i n g t h a t t h e p r o d u c t o f t h e e n -z y m e r e a c t i o n m u s t b e a - k e t o - E - a c e t a m i d o h e x -a n o i c a c i d ( a l l c h r o m a t o g r a p h y w a s d o n e s i m u l -T A B L E 4 . T r a n s a m i n a t i o n o f e - N - a c e t y l l y s i n e i n R .l e g u m i n i c o l a e x t r a c t sa - Ke t o - e - a c e t a m i -S y s t e m a d o h e x a n o i c a c i d( , m o l )C o m p l e t e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 5 7L e s s a - KG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 1 8L e s s p y r u v a t e . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 6 2L e s s P L P . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 . 5 0L e s s a - KG , p y r u v a t e , P L P 0 . 0 0 1C o m p l e t e ; e n z y m e e x t r a c t b o i l e d . 0 . 0 0 2aC o m p l e t e s y s t e m : d e s a l t e d R . l e g u m i n i c o l a e n -z y m e e x t r a c t ( 2 . 5 m g ) , DL - e - N - a c e t y l - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e( 8 . 4 , u m o l ; 0 . 3 2 u C i / V u m o l ) , a - k e t o g l u t a r a t e ( a - KG )( 1 5 , m o l ) , p y r u v a t e ( 1 5 , m m o l ) , p y r i d o x a l p h o s p h a t e( P L P ) ( 0 . 4 , u m o l ) , a n d p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 1 6 5, L m o l , p H7 . 4 ) i n 3 . 3 m l t o t a l v o l u m e . A f t e r i n c u b a -t i o n f o r 2 h a t 2 5 C , r e a c t i o n s w e r e s t o p p e d w i t h 0 . 2m l o f 5 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d a n d c e n t r i f u g e d ; a -k e t o - e - a c e t a m i d o - h e x a n o i c a c i d w a s d e t e r m i n e d i nt h e s u p e r n a t a n t s a s d e s c r i b e d .M L >FI G . 2 . S i l i c i c a c i d c h r o m a t o g r a p h y o f l y s i n e c a t a b o l i t e s o f R . l e g u m i n i c o l a . A m a t u r e R .l e g u m i n i c o l ac u l t u r e w a s d r a i n e d , s u s p e n d e d i n 5 0 m l o f2 0 u M DL - t 4 , 5 - 3 H]l y s i n e ( 2 0 0 p a C i I p . m o l ) , a n d i n c u b a t e d a t r o o mt e m p e r a t u r e f o r 2 4 h . T h e e t h a n o l i c m y c e l i a l e x t r a c t w a s t r e a t e d a s d e s c r i b e d a n d c h r o m a t o g r a p h e d o n as i l i c i c a c i d c o l u m n a c c o r d i n g t o R a m s e y ( 2 6 ) . S - N - A c - V a l , & - A c e t a m i d o v a l e r i c a c i d . on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from L Y S I N E C A T A B O L I S M I N FU N G I 3 4 3t a n e o u s l y ) . S u c h t r a n s a m i n a s e a c t i v i t y w a ss t u d i e d i n m o r e d e t a i l , a s o u t l i n e d i n T a b l e 4 .a - Ke t o g l u t a r a t e w a s p r e f e r r e d o v e r p y r u v a t ea s t h e k e t o - a c i d ; o n l y s l i g h t i f a n y d e p e n d e n c eo n a d d e d p y r i d o x a l p h o s p h a t e w a s s h o w n w i t ht h e d e s a l t e d R . l e g u m i n i c o l a e x t r a c t .I n a n o t h e r e x p e r i m e n t t h e t r a n s a m i n a s e s y s -t e m ( a s d e s c r i b e d i n T a b l e 4 ) w a s r e p e a t e d , b u ta f t e r 2 h t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e ( 4 . 3 u m o l )a n d o x i d i z e d n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e( 1 3 . 8 u m o l ) w e r e a d d e d , a n d i n c u b a t i o n w a sc o n t i n u e d f o r 2 h m o r e . Wh e nt h e e t h y l a c e t a t ee x t r a c t w a s c h r o m a t o g r a p h e d , v i r t u a l l y a l l o ft h e r a d i o a c t i v i t y w a s c o i n c i d e n t w i t h 8 - a c e t a m -i d o v a l e r i c a c i d ( p a p e r [B A W], R f= 0 . 8 1 ; T L C[B M A ], R f=0 . 5 0 ) a n d d i s t i n c t f r o m a - k e t o - e -a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d . T h e 1 ) - i s o m e r o f E - N -a c e t y l l y s i n e w a s f o u n d t o b e m e t a b o l i z e d m u c hm o r e r a p i d l y t o 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d t h a nw a s t h e L - i s o m e r i n a R . l e g u m i n i c o l a c e l l - f r e es y s t e m ( T a b l e 5 ) . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s er e s u l t s r e l a t i v e t o t h e s t e r e o s p e c i f i c r e q u i r e -m e n t s f o r l y s i n e c a t a b o l i s m i nR . l e g u m i n i c o l ai s c o m p l i c a t e d , h o w e v e r , b y t h e p r e s e n c e o f ad e a c y l a s e a n d r a c e m a s e f o r e - N - a c e t y l l y s i n ea n d i s c o n s i d e r e d b e l o w . I n a s i m i l a r s y s t e m , i tw a s f o u n d ( d a t a n o t s h o w n ) t h a t n - e - N - a c e t y l -[1 - ' 4 C ]l y s i n el o s e s i t sc a r b o x y l g r o u p a s 1 4 C O 2i na n e n z y m i c r e a c t i o n t h a t i s p a r t i a l l y d e p e n d e n tu p o n t h e p r e s e n c e o f a d d e d t h i a m i n e p y r o p h o s -p h a t e a n d p y r i d o x a l p h o s p h a t e . a - Ke t o - E - a c e -t a m i d o - [G - 3 H]h e x a n o i c a c i d w a s c o n v e r t e d t o 8 -a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d ( 2 8 ) i n t h e p r e s e n c e o fR .T A B L E 5 . E v i d e n c ef o r c o n v e r s i o n o f e N - a c e t y l l y s i n et o 6 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d i n R . l e g u m i n i c o l ae x t r a c t s8 - A c e t a m i d o v a l e r i cS u b s t r a t e a c d ( . o la c i d( j A m o l )D- e - N - a c e t y l - [2 - ' 4 C ]l y s i n e 1 4 6( 0 . 1 0 l C i / , u m o l ; 2 9 u m o l ) aL - e - N - a c e t y l - [G - 3 H]l y s i n e 1 3( 0 . 1 3 , u C i / j , m o l ; 4 9 j , m o l ) PaT h e c o m p l e t e i n c u b a t i o n s y s t e m c o n t a i n e d R .l e g u m i n i c o l a c r u d e h o m o g e n a t e ( 1 0 . 0 m g ) , a - k e t o -g l u t a r a t e ( 1 1 0 , u m o l ) , t h i a m i n e p y r o p h o s p h a t e ( 2 . 8, u m o l ) , p y r i d o x a l p h o s p h a t e ( 0 . 6 4 , u m o l ) , ( 3 - m e r c a p -t o e t h a n o l ( 1 . 5 , u m o l ) , a n d p o t a s s i u m p h o s p h a t e ( 3 0 0, u m o l , p H7 . 5 ) i n 6 . 0 m l t o t a l v o l u m e . A f t e r i n c u b a -t i o n f o r 5 h a t 2 5 C , t h e i n c u b a t i o n w a s s t o p p e d w i t h0 . 2 m l o f 5 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d a n d c e n t r i f u g e d .T h e s u p e r n a t a n t w a s a d j u s t e d t o p H9 a n d c h r o m a t -o g r a p h e d o n a Do w e x 1 X8 c o l u m n a s d e s c r i b e d b yR o t h s t e i n ( 2 8 ) ; t h e 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d p e a k w a sc o u n t e d .b T h e i n c u b a t i o n w a s e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d i nf o o t n o t e a , e x c e p t t h a t 6 . 4 m g o f c r u d e h o m o g e n a t ew a s u s e d .l e g u m i n i c o l a e x t r a c t a n d t h i a m i n e p y r o p h o s -p h a t e .8 - A c e t a m i d o v a l e r i c a c i d c a t a b o l i s m i n R .l e g u m i n i c o l a . M a t u r e R . l e g u m i n i c o l a c u l -t u r e s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 4 h w i t h v a r i o u s l yl a b e l e d l y s i n e s ; s a m p l e s o f t h e e t h a n o l i c e x -t r a c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d a s b e f o r e ( 8 , 2 5 ) .T h e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e p e a k b e -t w e e n t h e 6 0 - a n d 1 0 0 - m l e l u t i o n v o l u m e s w e r ed e s a l t e d ; t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h i s p e a k w a ss h o w n t o m i g r a t e w i t h a u t h e n t i c 8 - a m i n o v a l -e r i c a c i d u p o n s u b s e q u e n t T L C ( C M A ) a n d p a -p e r c h r o m a t o g r a p h y ( B A W) . ( U n d e r t h e c o n d i -t i o n s , u s e d , a n a r t i f a c t w a s r o u t i n e l y o b t a i n e da f t e r i n v a c u o c o n c e n t r a t i o n [4 0 C ] o f t h e d e -s a l t e d f r a c t i o n t h a t c o u l d b e e x t r a c t e d i n t o c h l o -r o f o r m a t n e u t r a l p Ha n d w a s i d e n t i f i e d [T L C ,C M A ] a s t h e l a c t a m o f 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d , 2 -p i p e r i d o n e . ) I nR . l e g u m i n i c o l a c u l t u r e s , i t w a sf o u n d t h a t t h e a d d i t i o n o f 1 . 2 m M N H2 O Hd u r -i n g i n c u b a t i o n w i t h l y s i n e r e s u l t e d i n a n e n -h a n c e d a c c u m u l a t i o n o f 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d , t ot h e e x t e n t o f a b o u t 1 % o f t h e l y s i n e l a b e l , a so p p o s e d t o 0 . 1 t o 0 . 2 % i n t h e a b s e n c e o fN H2 O H( p r e s u m a b l y p y r i d o x a l - d e p e n d e n t t r a n s a m i n a -t i o n o f 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d i s i n h i b i t e d ) . A sw i t h 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d , l a b e l d i d n o t a c -c u m u l a t e i n 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d f o r-o r DL - [1 -' 4 C l l y s i n e ; a l l o t h e r l y s i n e l a b e l s u s e d ( [2 - ' 4 C ],[6 - ' 4 C ], [4 , 5 - 3 H])w e r ei n c o r p o r a t e dt oa p p r o x i -m a t e l y t h e s a m e e x t e n t .T h e d e a c e t y l a t i o n o f 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i dt o f o r m 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d w a s d e m o n s t r a t e dt o o c c u r i nR . l e g u m i n i c o l a e x t r a c t s . 8 - A c e t a m -i d o - [5 - ' 4 C ]v a l e r i c a c i d ( 6 0 . 7 u m o l , 2 0 . 2 u C i /m m o l ) w a s i n c u b a t e d w i t h d e s a l t e d R . l e g u m i n -i c o l a e n z y m e e x t r a c t ( 5 . 0 m g ) f o r 9 h a t 2 5 C ( 3 0m M p o t a s s i u m p h o s p h a t e , p H 7 . 5 ; t o t a l v o l -u m e , 6 . 2 m l ) . A f t e r b o i l i n g a n d c e n t r i f u g a t i o n ,8 - a m i n o v a l e r i c a c i d ( 1 . 3 1 , u m o l ) w a s i d e n t i f i e di n t h e s u p e r n a t a n t a f t e r i o n - e x c h a n g e c h r o m a -t o g r a p h y ( 2 5 ) . Wh e n t h e e x p e r i m e n t w a s p e r -f o r m e d w i t h b o i l e d e n z y m e e x t r a c t , o n l y n e g l i -g i b l e 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d ( 0 t o 0 . 1 , u m o l ) w a sf o r m e d . T h u s , a l l o f t h e p o s t u l a t e d e n z y m i ct r a n s f o r m a t i o n s b e t w e e n i l y s i n e a n d 8 - a m i -n o v a l e r i c a c i d ( Fi g . 1 ) h a v e b e e n d e m o n s t r a t e dt o o c c u r i n c e l l - f r e e e x t r a c t s o f R . l e g u m i n i c o l a .A m a t u r e R . l e g u m i n i c o l a c u l t u r e w a sd r a i n e d , s u s p e n d e d o n 8 - a c e t a m i d o - [5 -' 4 C ]v a l e r i c a c i d , a n d i n c u b a t e d f o r 2 4 h ; s i l i c i ca c i d c h r o m a t o g r a p h y o f t h e a c i d i c a n d n e u t r a lf r a c t i o n ( n o t b o u n d t o Do w e x 5 0 ) r e v e a l e d t h ep r e s e n c e o f e s s e n t i a l l y t w o r a d i o a c t i v e p e a k s( Fi g . 3 ) . T h e s e c o n d w a s i d e n t i f i e d a s r e s i d u a l8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d ( T L C , E A , B M A ; p a p e rc h r o m a t o g r a p h y , B A W) . T h e f i r s t p e a k e l u t e da t t h e e x p e c t e d p o s i t i o n f o r g l u t a r i c a c i d ; t h eV O L . 1 2 6 , 1 9 7 6 on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from 3 4 4 G U E N G E R I C HA N D B R O QU I S T1 0 0 0 -0 5 0 0 -a .00 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0M L- *FI G . 3 . S i l i c i c a c i d c h r o m a t o g r a p h y o f b - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d c a t a b o l i t e s o f R . l e g u m i n i c o l a . A m a t u r eR .l e g u m i n i c o l a c u l t u r e w a s i n c u b a t e d w i t h 3 0 m M b - a c e t a m i d o - [5 - ' 4 C ]v a l e r i c a c i d ( 2 0 2 Xi l m m o l ) f o r 2 4 h a tr o o m t e m p e r a t u r e . T h e e t h a n o l i c e x t r a c t w a s t r e a t e d a s d e s c r i b e d a n d c h r o m a t o g r a p h e d o n a s i l i c i c a c i dc o l u m n ( 2 6 ) . G L U T , G l u t a r i c a c i d ; S - N - A c V A L , S - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d .i d e n t i t y w a s c o n f i r m e d b y T L C o f t h e f r e e a c i d( B M A ) a n d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y ( 3 % O V - 1 7 ,1 3 0 C ) o f t h e d i m e t h y l e s t e r ( p r e p a r e d b y r e f l u xi n m e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f d r y HC l ) .I n c u b a t i o n o f a m a t u r e R . l e g u m i n i c o l a c u l -t u r e w i t h [1 , 5 - ' 4 C ]g l u t a r i c a c i d a n d s u b s e q u e n ts i l i c i c a c i d c h r o m a t o g r a p h y s h o w e d t h e c o n v e r -s i o n t o a c o m p l e x m i x t u r e o f t r i c a r b o x y l i c a c i dc y c l e a n d o t h e r c a r b o x y l i c a c i d s .I n v i v o c a t a b o l i s m o f l y s i n e v i aw - a c e t y l a t e dd e r i v a t i v e s i n N . c r a s s a a n d S . c e r e v i s i a e .E v i d e n c e f o r t h e a c c u m u l a t i o n o f E - N - a c e t y l l y -s i n e f r o m i - l y s i n e h a s b e e n p r e s e n t e d i n T a b l e2 . I n a s i m i l a r s e r i e s o f w h o l e c e l l i n c u b a t i o n sw i t h m a t u r e N . c r a s s a 3 3 9 3 3 a n d S . c e r e v i s i a ec u l t u r e s , t h e s e o r g a n i s m s w e r e a l s o f o u n d t oa c c u m u l a t e r a d i o a c t i v e 8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i da f t e r i n c u b a t i o n f o r 2 4 h w i t h DL - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e( i n c u b a t i o n d e t a i l s a s i n T a b l e 2 ; s e p a r a t i o n o f8 - a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d b y i o n - e x c h a n g e c h r o -m a t o g r a p h y o n Do w e x 1 X8 [2 8 ]; i d e n t i f i c a t i o nb y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y [B A W]) . A s i n t h ec a s e o f R . l e g u m i n i c o l a , t h e l e v e l o f i n c o r p o r a -t i o n w a s a b o u t 1 % f r o m l y s i n e ; m o r e o v e r , i nb o t h c a s e s , l a b e l f r o m e i t h e r D- o r DL - L 1 -1 4 C ]l y s i n e w a s n o t a c c u m u l a t e d i n 8 - a c e t a m i -d o v a l e r i c a c i d .M a t u r e c u l t u r e s o fN . c r a s s a 3 3 9 3 3 a n d 1 5 0 6 9a n d S . c e r e v i s i a e a l s o a c c u m u l a t e d l a b e l a f t e r2 4 h f r o m DL - 1 2 - ' 4 C ]- , DL - [6 - ' 4 C ]- , a n d DL - [4 , 5 -3 H]l y s i n e ( b u t n o t DL - [1 - _4 C ]- o r ]- [1 _- 4 C ]l y s i n e )i n 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d ( i n c u b a t i o n d e t a i l s s i m -i l a r t o t h o s e i n T a b l e 2 ; s e p a r a t i o n a s d e s c r i b e di n t h e c a s e o fR . l e g u m i n i c o l a ; i d e n t i f i c a t i o n i na l l c a s e s b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y [B A W,B P W] a n d T L C [C M A ]) . T h e l e v e l o f a c c u m u l a -t i o n o f l a b e l i n 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d w a s q u i t ev a r i a b l e i n t h e s e e x p e r i m e n t s , r a n g i n g f r o m 1t o 5 % o f t h e p r o f f e r e d l y s i n e l a b e l .R a d i o a c t i v i t y f r o m i 4 G - 3 H]l y s i n e w a s f o u n dt o a c c u m u l a t e i n a c o m p o u n d i d e n t i f i e d a s a -h y d r o x y - E - a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d ( s e p a r a t i o no n Do w e x 1 X8 [2 8 ]) i n m a t u r eN . c r a s s a 3 3 9 3 3a n d S . c e r e v i s i a e c u l t u r e s ( 2 4 - h i n c u b a t i o n s ; d e -t a i l s s i m i l a r t o t h o s e o f o t h e r l y s i n e i n c u b a -t i o n s ; t h e e x t e n t o f i n c o r p o r a t i o n i n b o t h c a s e sw a s a b o u t 1 % ) . T h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e f r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h e d w i t h a u t h e n t i c a - h y d r o x y - e -a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d o n T L C ( E A , B M A )a n d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ( B A W, B P W) ; a f t e ra c i d h y d r o l y s i s ( 6 N HC l , 1 1 0 C , 1 2 h ) t h e r a d i o -a c t i v i t y w a s c o i n c i d e n t w i t h a u t h e n t i c a - h y -d r o x y - e - a m i n o h e x a n o i c a c i d a s j u d g e d b y T L C( C M A ) a n d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ( B A W,B P W) .DI S C U S S I O NT h e ' - N e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e t h a t i nN .c r a s s a 3 3 9 3 3 , a s i s t h e c a s e i nR . l e g u m i n i c o l a ,t h e n i t r o g e n a t o m o f p i p e c o l i c a c i d i s d e r i v e df r o m t h e E - n i t r o g e n o f l y s i n e , c o n s i s t e n t w i t ht h e r o l e o f A l - p i p e r i d e i n e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d ( b u tn o t A 1 - p i p e r i d e i n e - 6 - c a r b o x y l i c a c i d ) a s a n i n -t e r m e d i a t e i n t h e c o n v e r s i o n o f l y s i n e t o p i p e -c o l i c a c i d i n v i v o .T h e r e s u l t s s h o w n i n T a b l e 1 a l s o a r g u e t h a ti n N . c r a s s a 3 3 9 3 3 , a s i n R . l e g u m i n i c o l a ( 8 ) ,p i p e c o l i c a c i d i s p r e f e r e n t i a l l y d e r i v e d f r o m t h eL - i s o m e r o f l y s i n e . T h e s e f i n d i n g s w i t h f u n g ic o n t r a s t w i t h t h e w o r k w i t h b a c t e r i a ( 1 9 ) , a n i -J . B A c TE R I O L . on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from L Y S I N E C A T A B O L I S M I N FU N G I 3 4 5m a l s ( 7 ) , a n d h i g h e r p l a n t s ( 1 3 ) , i n w h i c h p i p e -c o l i c a c i d d e r i v e s f r o m D- l y s i n e ; t h e p o s s i b i l i t yt h a t p i p e c o l i c a c i d i s d e r i v e d m a i n l y f r o m ' -l y s i n e a l s o i nN . c r a s s a h a s b e e n p r o p o s e d ( 2 0 ) .T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r u t i -l i z e d ( i ) a l y s i n e a u x o t r o p h t o b l o c k s y n t h e s i s o fe n d o g e n o u s l y s i n e , ( i i ) a r a c e m a s e i n h i b i t o r ,a n d ( i i i ) a d o u b l e - l a b e l t e c h n i q u e t o m i n i m i z ei n t e r e x p e r i m e n t a l v a r i a t i o n s ; a l t h o u g h t h es y n t h e s i s o f a s m u c h a s 3 0 % o f t h e p i p e c o l i c a c i df r o m Dl y s i n e c a n n o t b e r u l e d o u t , t h e d a t aa r g u e s t r o n g l y t h a t m o s t o f t h e p i p e c o l i c a c i da r i s e s f r o m L - l y s i n e i n N . c r a s s a .L a b e l f r o m DL - [R - 3 H]p i p e c o l i c a c i d ( 1 0 ) w a sn o t i n c o r p o r a t e d i n t o l y s i n e i n e i t h e r R . l e g u m -i n i c o l a o r N . c r a s s a 3 3 9 3 3 ; m o r e o v e r , i n R . l e g -u m i n i c o l a , N . c r a s s a 3 3 9 3 3 , a n d S . c e r e v i s i a el a b e l f r o m p i p e c o l i c a c i d w a s n o t i n c o r p o r a t e di n t o t h e u s u a l l y s i n e c a t a b o l i t e s d e r i v i n g f r o mw - a c e t y l a t i o n ( v i d e s u p r a ) , a - a m i n o a d i p i c a c i d( a p i p e c o l i c a c i d m e t a b o l i t e i n a n i m a l s [7 , 3 0 1a n d P . p u t i d a [4 , 2 7 ]) , o r a n y s i g n i f i c a n t l e v e l so f a c i d i c c o m p o u n d s . O f t h e s e o r g a n i s m s , o n l yR . l e g u m i n i c o l a m e t a b o l i z e s p i p e c o l i c a c i d t oa n y s i g n i f i c a n t e x t e n t ; t h e n o v e l a l k a l o i d s s l a f -r a m i n e ( 1 0 ) a n d 3 , 4 , 5 - t r i h y d r o x y o c t a h y d r o - 1 -p y r i n d i n e ( 9 ) a r e d e r i v e d f r o m p i p e c o l i c a c i d .( T h e y e a s t s S . c e r e v i s i a e a n d H. s a t u r n u s d i dn o t a c c u m u l a t e p i p e c o l i c a c i d u n d e r t h e c o n d i -t i o n s u s e d , i n s u p p o r t o f R o t h s t e i n ' s f i n d i n g s[2 8 ]w i t h H.s a t u r n u s . )a - Hy d r o x y - E - a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d w a ss h o w n t o a c c u m u l a t e f r o m l y s i n e i n N . c r a s s a3 3 9 3 3 a n d S . c e r e v i s i a e . R o t h s t e i n ( 2 8 ) h a s p r e -v i o u s l y d e m o n s t r a t e d s u c h a n a c c u m u l a t i o n i nH. s a t u r n u s ; S c h w e t t e t a l . ( 3 4 ) i d e n t i f i e d a nN -a c y l d e r i v a t i v e o f a - h y d r o x y - E - a m i n o h e x a n o i ca c i d i n N . c r a s s a ( t h e a c y l m o i e t y w a s n o ti d e n t i f i e d ) . I n o u r w o r k , f r e e a - h y d r o x y - E - a m i -n o h e x a n o i c a c i d w a s a l s o f o u n d t o a c c u m u l a t ef r o m DL - [4 , 5 - 3 H]l y s i n e i nH. s a t u r n u s , a s p r e v i -o u s l y d e m o n s t r a t e d b y R o t h s t e i n ( 2 8 ) . N e i t h e rc o m p o u n d w a s f o u n d t o a c c u m u l a t e f r o m l y s i n ei nR . l e g u m i n i c o l a i n v i v o ; m o r e o v e r , a t t e m p t st o c o n v e r t a - k e t o - E - a c e t a m i d o h e x a n o i c a c i d t ot h e a - h y d r o x y c o m p o u n d i n t h e p r e s e n c e o f R .l e g u m i n i c o l a e x t r a c t s a n d r e d u c e d n i c o t i n a -m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e a n d / o r r e d u c e d n i c -t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e p h o s p h a t e w e r eu n s u c c e s s f u l .A r a d i o a c t i v e p e a k a r i s i n g f r o m DL - [4 , 5 -3 H]l y s i n e e l u t e d f r o m t h e Do w e x 5 0 X8 c o l u m n( 8 , 2 5 ) a f t e r 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d a n d b e f o r e E - N -a c e t y l l y s i n e i n t h e c a s e o f N . c r a s s a 3 3 9 3 3 b u tw i t h n o n e o f t h e o t h e r o r g a n i s m s . T h i s c o m -p o u n d w a s i d e n t i f i e d a s s a c c h a r o p i n e ( p a p e rc h r o m a t o g r a p h y : B A W, B P W, w a t e r - s a t u r a t e dp h e n o l ) , t h e i m m e d i a t e b i o s y n t h e t i c p r e c u r s o ro f l y s i n e i n y e a s t s a n d f u n g i ( 1 2 , 3 3 ) . P r e s u m -a b l y , t h i s c o m p o u n d a c c u m u l a t e d b y r e v e r s a l o ft h e a c t i o n o f s a c c h a r o p i n e d e h y d r o g e n a s e , s i n c eN . c r a s s a 1 5 0 6 9 ( w h i c h l a c k s t h i s e n z y m e ) d i dn o t a c c u m u l a t e s a c c h a r o p i n e .I n c o n t r a s t t o o t h e r o r g a n i s m s ( b a c t e r i a a n da n i m a l s ) , n o e v i d e n c e f o r a c c u m u l a t i o n w a s o b -s e r v e d f o r a - a m i n o a d i p i c a c i d ( 4 , 7 , 3 0 ) , g l u -t a m i c a c i d ( 2 4 ) , g l u t a m i n e , p i p e r i d o n e - 2 - c a r -b o x y l i c a c i d ( l a c t a m o f a - a m i n o a d i p i c a c i d ) , o r8 - a m i n o v a l e r a m i d e ( 2 7 , 3 6 ) f r o m l y s i n e i n t h ey e a s t s a n d f u n g i s t u d i e d h e r e . T h e i n v i v o w o r kw i t h t h e v a r i o u s y e a s t s a n d f u n g i s u p p o r t s t h eb a s i c s c h e m e o f l y s i n e c a t a b o l i s m p r o p o s e d f o rH. s a t u r n u s ( 2 8 ) . O n t h e b a s i s o f o u r w o r k a n dt h a t o f R o t h s t e i n ( 2 8 ) a n d S c h w e e t e t a l . ( 3 4 ) ,w e p r o p o s e t h a t t h e s c h e m e o f l y s i n e c a t a b o l i s mp r e s e n t e d i n Fi g . 1 i s p e c u l i a r t o a n d g e n e r a l -i z e d a m o n g y e a s t s a n d f u n g i , w i t h c e r t a i n l i m i -t a t i o n s ( y e a s t s d o n o t a p p e a r t o f o r m p i p e c o l i ca c i d ; t h e a - h y d r o x y c o m p o u n d s d o n o t a p p e a r t ob e i m p o r t a n t i n R . l e g u m i n i c o l a ; t h e a r r o w sl e a d i n g f r o m a - h y d r o x y - E - a m i n o h e x a n o i c a c i dt o g l u t a r a t e a r e b a s e d o n t h e f i n d i n g s o f R o t h -s t e i n [2 8 ] i n H. s a t u r n u s ) . A l l o f t h e p r o p o s e ds t e p s b e t w e e n L - l y s i n e a n d 8 - a m i n o v a l e r i c a c i dh a v e n o w b e e n d e m o n s t r a t e d t o o c c u r i n c e l l -f r e e e x t r a c t s o f R . l e g u m i n i c o l a .I t c a n b e f o r c i b l y a r g u e d t h a t D- l y s i n e f i g u r e sp r o m i n e n t l y i n l y s i n e c a t a b o l i s m v i a - E - N - a c e -t y l l y s i n e i nR . l e g u m i n i c o l a ( Fi g . 1 ) . T h u s ( i ) DE - N - a c e t y l l y s i n e a c c u m u l a t e s p r e f e r e n t i a l l y i nR . k e g u m i n i c o l a ( T a b l e 2 ) , ( i i ) t h e l y s i n e r a c e -m a s e a p p e a r s t o f a v o r f o r m a t i o n o f D- l y s i n ef r o m t h e L - i s o m e r ( 8 ) , ( i i i ) D- l y s i n e a p p e a r s t ob e f a v o r e d o v e r L - l y s i n e f o r f o r m a t i o n o f E - N -a c e t y l l y s i n e ( T a b l e 3 ) , a n d ( i v ) D- E - N - a c e t y l l y -s i n e i s p r e f e r e n t i a l l y c a t a b o l i z e d o v e r t h e L -i s o m e r i n R . l e g u m i n i c o l a e x t r a c t s ( T a b l e 5 ) .B u t t h e i n f e r e n c e t h a t l y s i n e c a t a b o l i s m i n R .l e g u m i n i c o l a m a y p r o c e e d e x c l u s i v e l y v i a D- E -N - a c e t y l l y s i n e i s h a z a r d o u s a t t h i s t i m e i n v i e wo f t h e a c t i v i t y o f a n L - E - N - a c e t y l l y s i n e d e a c y l -a s e a n d a n E - N - a c e t y l l y s i n e r a c e m a s e i n t h e s ec r u d e e x t r a c t s . P u r i f i c a t i o n o f E - N - a c e t y l l y -s i n e - a - k e t o g l u t a r a t e t r a n s a m i n a s e a n d d e m -o n s t r a t i o n o f i t s s t e r e o s p e c i f i c i t y w o u l d s h e di m p o r t a n t l i g h t o n t h i s i n t e r e s t i n g p r o b l e m . I tw o u l d b e a t t r a c t i v e , a l t h o u g h p e r h a p s t o o s i m -p l i s t i c , t o c o n c l u d e t h a t i n t h e l y s i n e m e t a b o -l i s m o f R . l e g u m i n i c o l a , t h e L - i s o m e r i s c o n -c e r n e d w i t h a n a b o l i c r e a c t i o n s a n d t h a t a r a c e -m a s e f u n c t i o n s t o c o n v e r t t h e L - f o r m t o - l y s i n ew h e n m e t a b o l i c e v e n t s i n t h e c e l l d i c t a t e c a t a b -o l i s m .I t i s o f i n t e r e s t t h a t 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d i sa l s o a k e y i n t e r m e d i a t e i n l y s i n e c a t a b o l i s m i nP s e u d o m o n a s ( 1 9 , 2 7 ) ; h o w e v e r , o u r w o r kV O L . 1 2 6 , 1 9 7 6 on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from 3 4 6 G U E N G E R I C HA N D B R O QU I S Ts t r o n g l y s u g g e s t s t h a t e - N - a c e t y l l y s i n e a n d 8 -a c e t a m i d o v a l e r i c a c i d ( a s o p p o s e d t o & - a m i n o -v a l e r a m i d e 1 2 7 , 3 6 1 ) a r e i n t e r m e d i a t e s i n t h ec o n v e r s i o n o f l y s i n e t o 8 - a m i n o v a l e r i c a c i d . P r e -s u m a b l y , t h e d e g r a d a t i o n o f 8 - a m i n o v a l e r i ca c i d v i a g l u t a r a t e f o l l o w s s t e p s r e s e m b l i n gt h o s e d e l i n e a t e d i n P s e u d o m o n a s b y N u m a e ta l . ( 2 2 ) .T h e e v i d e n c e p r e s e n t e d f o r a g e n e r a l i z e dp a t h w a y o f l y s i n e c a t a b o l i s m s p e c i f i c f o r y e a s t sa n d f u n g i i s o f e v o l u t i o n a r y s i g n i f i c a n c e , a st h e s e o r g a n i s m s ( a n d o n l y t h e s e o r g a n i s m s )s y n t h e s i z e l y s i n e v i a t h e p r e v i o u s l y d e s c r i b e dh o m o c i t r i c - a m i n o a d i p i c a c i d p a t h w a y ( 3 ) .T h u s , t h e s e l o w e r p l a n t s m a y b e e v o l u t i o n a r i l yr e l a t e d n o t p n l y w i t h r e s p e c t t o t h e i r b i o s y n -t h e t i c e n z y m e s o f l y s i n e m e t a b o l i s m b u t w i t hr e s p e c t t o t h e i r m a j o r c a t a b o l i c e n z y m e s a sw e l l .A C KN O WL E DG M E N T ST h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y P u b l i c He a l t h S e r v i c e g r a n tA M - 1 4 3 3 8 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f A r t h r i t i s , M e t a b o -l i s m a n d Di g e s t i v e Di s e a s e s . F. P . G . w a s t h e r e c i p i e n t o fP u b l i c He a l t h S e r v i c e P r e d o c t o r a l Fe l l o w s h i p G M - 4 7 4 8 0f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f G e n e r a l M e d i c a l S c i e n c e s .L I T E R A T U R E C I T E D1 . B r o q u i s t , H. P . 1 9 7 1 . c i s - Ho m o a c o n i t a s e , p . 1 1 4 - 1 1 8 . I nD. M c C o r m i c k a n d L . Wr i g h t ( e d . ) , M e t h o d s i n e n z y -m o l o g y , v o l . 1 7 , p a r t B . A c a d e m i c P r e s s I n c . , N e wY o r k .2 . B r o q u i s t , H. P . , a n d J . J . S n y d e r . 1 9 7 1 . R h i z o c t o n i at o x i n , p . 3 1 9 - 3 3 3 . I n S . J . A j l , S . Ka d i s , a n d T . C .M o n t i e ( e d . ) , M i c r o b i a l t o x i n s , v o l . 7 . A c a d e m i c P r e s sI n c . , N e w Y o r k .3 . B r o q u i s t , H. P . , a n d J . S . T r u p i n . 1 9 6 6 . A m i n o a c i dm e t a b o l i s m . A n n u . R e v . B i o c h e m . 3 5 : 2 3 1 - 2 7 4 .4 . C a l v e r t , A . F. , a n d V . W. R o d w e l l . 1 9 6 6 . M e t a b o l i s m o fp i p e c o l i c a c i d i n a P s e u d o m o n a s s p e c i e s . I I I . L - a -A m i n o a d i p a t e 6 - s e m i a l d e h y d e : n i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d e o x i d o r e d u c t a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 1 : 4 0 9 -4 1 4 .5 . Fi e s e r , L . F. 1 9 6 4 . E x p e r i m e n t s i n o r g a n i c c h e m i s t r y ,p . 1 3 8 . He a t h , B o s t o n , M a s s .6 . Fi s c h e r , E . , a n d G . Z e m p l e n . 1 9 0 9 . N e u e S y n t h e s e v o nA m i n o - o x y s a u r e n u n d v o n P i p e r i d o n - De r i v a t e nC h e m . B e r . 4 2 : 4 8 7 8 - 4 8 9 2 .7 . G r o v e , J . A . , T . J . G i l b e r t s o n , R . H. Ha m m e r s t e d t , a n dL . M . He n d e r s o n . 1 9 6 9 . T h e m e t a b o l i s m o f D- a n d L -l y s i n e s p e c i f i c a l l y l a b e l e d w i t h ' 5 N . B i o c h i m . B i o -p h y s . A c t a 1 8 4 : 3 2 9 - 3 3 7 .8 . G u e n g e r i c h , F. P . , a n d H. P . B r o q u i s t . 1 9 7 3 . B i o s y n -t h e s i s o f s l a f r a m i n e , ( 1 S , 6 S , 8 a S ) - 1 - a c e t o x y - 6 - a m i -n o o c t a h y d r o i n d o l i z i n e , a p a r a s y m p a t h o m i m e t i c a l k a -l o i d o f f u n g a l o r i g i n . I I . T h e o r i g i n o f p i p e c o l i c a c i d .B i o c h e m i s t r y 1 2 : 4 2 7 0 - 4 2 7 4 .9 . G u e n g e r i c h , F. P . , S . J . Di M a r i , a n d H. P . B r o q u i s t .1 9 7 3 . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a I - p y r i n d i n ef u n g a l a l k a l o i d . J . A m . C h e m . S o c . 9 5 : 2 0 5 5 - 2 0 5 6 .1 0 . G u e n g e r i c h , F. P . , J . J . S n y d e r , a n d H. P . B r o q u i s t .1 9 7 3 . B i o s y n t h e s i s o f s l a f r a m i n e , ( 1 S , 6 S , 8 a S ) - 1 - a c e -t o x y - 6 - a m i n o o c t a h y d r o i n d o l i z i n e , a p a r a s y m p a t h o -m i m e t i c a l k a l o i d o f f u n g a l o r i g i n . I . P i p e c o l i c a c i da n d s l a f r a m i n e b i o g e n e s i s . B i o c h e m i s t r y 1 2 : 4 2 6 4 -4 2 6 9 .1 1 . Ho r o w i t z , N . H. , a n d G . W. B e a d l e . 1 9 4 3 . A m i c r o b i o -J . B A C T E R I O L .l o g i c a l m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f c h o l i n e b y u s eo f a m u t a n t o f N e u r o s p o r a . J . B i o l . C h e m . 1 5 0 : 3 2 5 -3 3 3 .1 2 . Ku o , M . H. , P . P . S a u n d e r s , a n d H. P . B r o q u i s t . 1 9 6 4 .L y s i n e b i o s y n t h e s i s i n y e a s t : a n e w m e t a b o l i t e o f a -a m i n o a d i p i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 3 9 : 5 0 8 - 5 1 5 .1 3 . L e i s t n e r , E . , R . N . G u p t a , a n d I . D. S p e n s e r . 1 9 7 3 . Ag e n e r a l m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r e c u r s o rc o n f i g u r a t i o n i n b i o s y n t h e t i c p r e c u r s o r - p r o d u c t r e l a -t i o n s h i p s . De r i v a t i o n o f p i p e c o l i c a c i d f r o m D- l y s i n e ,a n d o f p i p e r i d i n e a l k a l o i d s f r o m L - l y s i n e . J . A m .C h e m . S o c . 9 5 : 4 0 4 0 - 4 0 4 7 .1 4 . L o w r y , 0 . H. , N . J . R o s e b r o u g h , A . L . Fa r r , a n d R . J .R a n d a l l . 1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e Fo l i np h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .1 5 . M a t t o o n , J . R . , a n d R . D. Ha i g h t . 1 9 6 2 . G l u t a r i c a c i da c c u m u l a t i o n b y a l y s i n e - r e q u i r i n g y e a s t m u t a n t . J .B i o l . C h e m . 2 3 7 : 3 4 8 6 - 3 4 9 0 .1 6 . M e i s t e r , A . 1 9 5 4 . T h e a - k e t o a n a l o g u e s o f a r g i n i n e ,o r n i t h i n e , a n d l y s i n e . J . B i o l . C h e m . 2 0 6 : 5 7 7 - 5 8 5 .1 7 . M e i s t e r , A . , a n d P . A . A b e n d s c h i e n . 1 9 5 6 . C h r o m a t o g -r a p h y o f a - k e t o a c i d 2 , 4 - d i n i t r o p h e n y l h y d r a z o n e s a n dt h e i r h y d r o g e n a t i o n p r o d u c t s . A n a l . C h e m . 2 8 : 1 7 1 -1 7 3 .1 8 . M e i s t e r , A . , A . N . R a d h a k r i s h n a n , a n d S . D. B u c k l e y .1 9 5 7 . E n z y m a t i c s y n t h e s i s o f L - p i p e c o l i c a c i d a n d L -p r o l i n e . J . B i o l . C h e m . 2 2 9 : 7 8 9 - 8 0 0 .1 9 . M i l l e r , D. L . , a n d V . W. R o d w e l l . 1 9 7 1 . M e t a b o l i s m o fb a s i c a m i n o a c i d s i n P s e u d o m o n a s p u t i d a . C a t a b o -l i s m o f l y s i n e b y c y c l i c a n d a c y c l i c i n t e r m e d i a t e s . J .B i o l . C h e m . 2 4 6 : 2 7 5 8 - 2 7 6 4 .2 0 . M u l l e r , W. - U . , a n d E . L e i s t n e r . 1 9 7 5 . C o n v e r s i o n o f D-l y s i n e t o L - l y s i n e v i a L - p i p e c o l i c a c i d i n N e u r o s p o r ac r a s s a . Z . N a t u r f o r s c h . T e i l C 3 0 : 2 5 3 - 2 6 2 .2 1 . N e u b e r g e r , A . , a n d F. S a n g e r . 1 9 4 3 . T h e a v a i l a b i l i t y o ft h e a c e t y l d e r i v a t i v e s o f l y s i n e f o r g r o w t h . B i o c h e m .J . 3 7 : 5 1 5 - 5 1 8 .2 2 . N u m a , S . , Y . I s h i m u r a , T . N a k a z a w a , R . O k a z a k i , a n d0 . Ha y a i s h i . 1 9 6 4 . E n z y m a t i c s t u d i e s o n t h e m e t a b o -l i s m o f g l u t a r a t e i n P s e u d o m o n a s . J . B i o l . C h e m .2 3 9 : 3 9 1 5 - 3 9 2 6 .2 3 . O c h o a , S . 1 9 5 5 . C r y s t a l l i n e c o n d e n s i n g e n z y m e f r o mp i g h e a r t , p . 6 8 5 - 6 9 4 . I n S . P . C o l o w i c k a n d N . 0 .Ka p l a n ( e d . ) , M e t h o d s i n e n z y m o l o g y , v o l . 1 . A c a -d e m i c P r e s s I n c . , N e w Y o r k .2 4 . P e r f e t t i , R . , R . J . C a m p b e l l , J . T i t u s , a n d R . A . Ha r t .l i n e . 1 9 7 2 . C a t a b o l i s m o f p i p e c o l a t e t o g l u t a m a t e i nP s e u d o m o n a s p u t i d a . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 4 0 8 9 - 4 0 9 5 .2 5 . P i e z , K. A . , F. I r r e v e r r e , a n d H. L . Wo l f f . 1 9 5 6 . T h es e p a r a t i o n a n d d e t e r m i n a t i o n o f c y c l i c a m i n o a c i d s .J . B i o l . C h e m . 2 2 3 : 6 8 7 - 6 9 7 .2 6 . R a m s e y , H. A . 1 9 6 3 . S e p a r a t i o n o f o r g a n i c a c i d s i nb l o o d b y p a r t i t i o n c h r o m a t o g r a p h y . J . Da i r y S c i .4 6 : 4 8 0 - 4 8 3 .2 7 . R o d w e l l , V . W. 1 9 6 9 . C a r b o n c a t a b o l i s m o f a m i n o a c i d s ,p . 2 1 7 - 2 3 5 . I n D. M . G r e e n b e r g ( e d . ) , M e t a b o l i c p a t h -w a y s , v o l . 3 . A c a d e m i c P r e s s I n c . , N e w Y o r k .2 8 . R o t h s t e i n , M . 1 9 6 5 . I n t e r m e d i a t e s o f l y s i n e d i s s i m i l a -t i o n i n t h e y e a s t , Ha n s e n u l a s a t u r n u s . A r c h . B i o -c h e m . B i o p h y s . 1 1 1 : 4 6 7 - 4 7 6 .2 9 . R o t h s t e i n , M . 1 9 5 4 . T h e s y n t h e s i s o f 8 - a m i n o v a l e r i ca c i d - 8 - C 4 . J . A m . C h e m . S o c . 7 6 : 3 0 3 8 - 3 0 3 9 .3 0 . R o t h s t e i n , M . , K. E . C o o k s e y , a n d D. M . G r e e n b e r g .1 9 6 2 . M e t a b o l i c c o n v e r s i o n o f p i p e c o l i c a c i d t o a - a m i -n o a d i p i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 3 7 : 2 8 2 8 - 2 8 3 0 .3 1 . R o t h s t e i n , M . , a n d J . L . Ha r t . 1 9 6 4 . P r o d u c t s o f l y s i n em e t a b o l i s m i n y e a s t . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 3 : 4 3 9 -4 4 1 .3 2 . S a g i s a k a , S . , a n d K. S h i m u r a . 1 9 6 1 . S t u d i e s i n l y s i n eb i o s y n t h e s i s . I I . M e t a b o l i c f a t e o f DL - a - a m i n o a d i p i ua c i d - 6 - C ' 4 i n T . u t i l i s . J . B i o c h e m . ( T o k y o ) 4 9 : 3 9 2 -3 9 6 .3 3 . S a u n d e r s , P . P . , a n d H. P . B r o q u i s t . 1 9 6 6 . S a c c h a r o . on February 22, 2014 by guesthttp://jb.asm.org/Downloaded from V O L . 1 2 6 , 1 9 7 6p i n e , a n i n t e r m e d i a t e o f t h e a m i n o a d i p i c a c i d p a t h -w a y o f l y s i n e b i o s y n t h e s i s . I V . S a c c h a r o p i n e d e h y -d r o g e n a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 1 : 3 4 3 5 - 3 4 4 0 .3 4 . S c h w e e t , R . S . , J . T . Ho l d e n , a n d P . H. L o w y . 1 9 5 4 .T h e m e t a b o l i s m o f l y s i n e i n N e u r o s p o r a . J . B i o l .C h e m . 2 1 1 : 5 1 7 - 5 2 9 .L Y S I N E C A T A B O L I S M I N FU N G I 3 4 73 5 . S o d a , K. , a n d T . O s u m i . 1 9 7 1 . A m i n o a c i d r a c e m a s e( P s e u d o m o n a s s t r i a t a ) , p . 6 2 9 - 6 3 6 . I n D. 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