ESTIMATION OF PROTEIN CONCENTRATION IN EGG ALBUMIN BY LOWRY METHOD 

  

INTRODUCTION  

The  “Lowry Assay: Protein by  Folin Reaction”  (Lowry et al., 1951) has been  the most widely used method to estimate the amount of protein (already  in solution or easily‐soluble  in dilute alkali) in biological samples. First the proteins are pretreated with copper ion in alkali solution, and  then  the  aromatic  amino  acids  in  the  treated  sample  reduce  the phosphomolybdatephosphotungstic acid present  in the Folin Reagent. The end product of this reaction has a blue color. The amount of protein in the sample can be estimated via reading the absorbance  (at 750 nm) of the end product of the folin reaction against a standard curve of a selected protein solution ( in our case; Bovine Serum Albumin(BSA) solution).  The Lowry method relies on two different reactions.  

1. The first reaction  is the formation of a copper  ion complex with amide bonds, forming reduced  copper  in  alkaline  solutions.  This  is  called  a  Biuret  chromophore  and  is commonly stabilized by the addition of tartrate (Gornall et al., 1949).  

2. The second reaction is reduction of the Folin‐Ciocalteu reagent (phosphomolybdate and phosphotungstate), primarily by the reduced copper‐amide bond complex as well as by tyrosine and tryptophan residues. 

 The  Biuret  reaction  itself  is  not  very  sensitive.  Using  the  Folin‐Ciocalteu  reagent  to  detect reduced  copper  makes  the  Lowry  assay  nearly  100  times  more  sensitive  than  the  Biuret reaction alone. Several useful modifications of the original Lowry assay have been developed to increase the dynamic range of the assay over a wider protein concentration (Hartree, 1972), to make  the assay  less sensitive  to  interference by detergents  (Dulley and Grieve, 1975), and  to first precipitate  the proteins  to  remove  interfering  contaminants  (Bensadoun and Weinstein, 1976).  The  Lowry  assay  is  relatively  sensitive,  but  requires  more  time  than  other  assays  and  is susceptible to many interfering compounds. The following substances are known  to  interfere with  the  Lowry  assay: detergents,  carbohydrates,  glycerol,  Tricine,  EDTA, Tris,  potassium  compounds,  sulfhydryl  compounds,  disulfide  compounds, most  phenols,  uric acid,  guanine,  xanthine,magnesium,  and  calcium. Many  of  these  interfering  substances  are commonly used  in buffers  for preparing proteins or  in  cell extracts. This  is one of  the major limitations of the assay. The Lowry assay is also sensitive to variations in the content of tyrosine and tryptophan residues, a trait shared with the ultraviolet assay at 280 nm). The assay is linear over the range of 1 to 100 μg protein. The absorbance can be read in the region of 500 to 750 nm, with 660 nm being  the most commonly employed. Other wavelengths can also be used, however,  and may  reduce  the  effects  of  contamination  (e.g.,  chlorophyll  in  plant  samples 

2  

interferes at 660 nm, but not at 750 nm). Also,  if  the A660 values are  low, sensitivity can be increased by rereading the samples at 750 nm.  

MATERIALS  &  CHEMICALS  1. Clean Glasswares 2. Centrifuge Tubes(10 ml) 3. semi‐micro cuvettes 4. Spectrophotometer (750 nm) 5. Bovine Serum Albumin (BSA) 6. Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent (2N) 7. Sodium tartrant : Na2Tartrant.2(H2O) 8. Copper sulphate : CuSO4.5(H2O) 9. Other chemicals : NaOH, Na2CO3 

 

PREPARING  THE  SOLUTION  • The Lowry Solution  is a mixture of the above chemicals, except the Folin Reagent. The 

Lowry  solution  should  be  prepared  fresh,  at  the  day  of  measurement.  Though  the individual solutions for the Lowry solution can be prepared  in advance and then mixed at the day of measurement. 

• Solution A is a dilute alkali solution. 2N Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent contain HCl and H2PO4. 

 Solution A: (alkaline Solution) (for 100 ml) 

0.572gm NaOH 2.862gm Na2CO3 

 Solution B: (for 20 ml) 

0.285gm CuSO4.5(H2O)  Solution C: (for 20 ml) 

0.571gm Na2Tartrant.2(H2O)  Lowry Solution: (freshly prepared, 0.7/ml sample) 

Sol. A + Sol. B +Sol. C with a ratio (vol:vol) of 100:1:1  Folin Reagent (instant fresh, 0.1 ml/sample) 

5ml of 2N Folin and Ciocalteu’s Phenol Reagent + 6ml of double distilled water ‐ this solution is light sensitive. So it should be prepared at least 5min of the first 

sample incubation and kept in an amber container.  

3  

BSA Standard Protein Solution (fresh) Although  BSA  is  a water  soluble  protein,  it  takes  time  to  dissolve  it  completely.  So, prepare  this  stock  solution  and  keep  it  mixed  i.e.,  for  1  hour  before  starting  the experiment. 

‐ weigh 0.05 gm of BSA and add to a 500 ml volumetric flask containing ddl water. ‐ Stir  well  to  dissolve  and  adjust  the  volume  to  500 ml  with  ddl  water.  Final 

concentration of the stock solution is 100 mg BSA/L. ‐ Prepare the dilution in 15 ml tubes, following the recipe given below 

 Vol.  ddl water  Vol. of stock BSA solution  Final Concentration  Diluted Sample no. 

10 ml  0 ml  0 mg/ml  dil. Std 1 

8 ml  2 ml  20 mg/ml  dil. Std 2 

6 ml  4 ml  40 mg/ml  dil. Std 3 

4 ml  6 ml  60 mg/ml  dil. Std 4 

2 ml  8 ml  80 mg/ml  dil. Std 5 

0 ml  10 ml  100 mg/ml  dil. Std 6 

  

PROTOCOL  1. The stock BSA solution was prepared and diluted for the standard curve. 2. The Lowry Solution was prepared by mixing Sol. A + Sol. B +Sol. C with a ratio (vol:vol) of 

100:1:1 3. the samples were vortexed and diluted with ddl water 4. 0.5 ml of the diluted sample (or standard) was transferred to 10 ml centrifuge tube  5. 0.7 ml of Lowry Solution was added to the same centrifuge tube 6. The centrifuge tubes were capped and vortexed well to mix 7. The tubes were incubated for 20 min at room temp. in dark. 8. At the last 5 min of the incubation, Folin Reagent was prepared 9. After  the 20 min  incubation,  the  samples were  taken out  and 0.1 ml of diluted  Folin 

Reagent was added to each tube 10. The tubes were capped and vortexed immediately 11. The tubes were incubated for 30 min at room temp. in dark 12. While waiting, the UV‐VIS spectrophotometer was warmed up and stabilized 13. After the 30 min incubation, the tubes were vortexed briefly 14. Then the  1.3 ml of samples  were transferred to semi‐micro disposable cuvettes 15. Absorbance reading were taken at 750 nm 16. The calibration curve form the absorbance readings of the standards were prepared and 

the protein concentration in the samples in mg BSA/lit was calculated form the curve.  

4  

PROTOCOL  SUMMARY  For Standard BSA solution: 

Std. Sample no. Vol. of std 

transferred to tubes 

Vol. of Lowry 

Solution added 

Vol. of FC reagent 

added To cuvettes 

dil. Std 1  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. Std 2  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. Std 3  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. Std 4  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. Std 5  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. Std 6  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

 

For Egg albumin (Unknown) solution: Dilution of Egg albumin is done similar to the dilution of BSA  

Unknown 

 Sample no. 

Vol. of std 

transferred to tubes 

Vol. of Lowry 

Solution added 

Vol. of FC reagent 

added To cuvettes 

dil. sample 1  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. sample 2  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. sample 3  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. sample 4  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. sample 5  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

dil. sample 6  0.5 ml  0.7 ml 0.1 ml 1.3 ml + distill. water

 REFERENCE  Protein (Lowry) Protocol, Protein Protocol, Ebru Dulekgurgen UIUC’04, (Author Unknown)