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LE VIRUS D’EGTVED. I. - STABILITÉ,DÉVELOPPEMENT ET STRUCTURE DU VIRUS DE

I,A SOUCHE DANOISE F1P. de Kinkelin, R. Scherrer, Evelyne Bic, J. Cohen

To cite this version:P. de Kinkelin, R. Scherrer, Evelyne Bic, J. Cohen. LE VIRUS D’EGTVED. I. - STABILITÉ,DÉVELOPPEMENT ET STRUCTURE DU VIRUS DE I,A SOUCHE DANOISE F1. Annales deRecherches Vétérinaires, INRA Editions, 1970, 1 (1), pp.17-30. �hal-00900652�

LE VIRUS D’EGTVED

1. - STABILITÉ, DÉVELOPPEMENT ET STRUCTURE DU VIRUSDE I,A SOUCHE DANOISE Fi

P. de KINKELIN R. SCHERRER

d’Evelyne BIC J. COHEN

Station de Vivologie et d’Immunologie, 78 - Thivernal- GrignonInstitut national de la Recherche agronomique

RÉSUMÉ

Cet article définit les propriétés in vitro de stabilité et de croissance d’une souche de virusd’Egtved (souche danoise F,), agent de la Septicémie Hémorragique Virale de la truite Arc-en-ciel.Parallèlement une étude en microscopie électronique, effectuée au cours de certains cycles dudéveloppement viral, apporte des données complémentaires sur la structure du virus et une con-tribution à sa classification. Le but ultérieur de ces recherches est de relier le pouvoir pathogènedu virus d’Egtved à des propriétés in vitvo, l’expérience ayant démontré que la souche employéeici avait perdu son pouvoir pathogène.

INTRODUCTION

Le virus d’Egtved, agent de la Septicémie Hémorragique Virale (S. H. V.) de latruite Arc-en-Ciel, a été isolé pour la première fois en culture cellulaire par JErrsExau Danemark (JENSEN, Ig63). Quand sa morphologie fut établie (ZWIUENBERGet al., 1965), il apparut que ce virus avait une étroite ressemblance avec ceux de laRage (MATSUMOTO, Ig62), de la Stomatite Vésiculeuse (HownTSOrr et WHrT!oR!,ig62), avec le virus Sigma de la Drosophile (B>;xKnr,o>!>! et al,, 1965) et celui d’unenécrose de la laitue (HARRISSON, 1965) et plus récemment avec le virus de P-Tarburg(KISSLING et al., I968). _

Devant l’importance économique croissante de la Septicémie Hémorragiqueen salmoniculture, les recherches effectuées ont été surtout orientées vers le dia-

gnostic de la maladie et les méthodes à appliquer pour limiter son extension. Aussiexiste-t-il une abondante bibliographie sur ce sujet (GHITTINO, Ig68), mais on netrouve que très peu de travaux sur le virus lui-même.

K. Worr>! (1966) avait publié un début d’étude de la croissance et de la stabilitédu virus et P. E. VESTERGARD-JORGE:’<SEN (r96g) avait commencé son étude sérolo-gique dans le but de le différencier du virus de la Nécrose Pancréatique, autre virosedes salmonidés. Plus récemment, la nature de l’acide nucléique du virus (A. R. N.)a été démontrée par CAMPBELI, et BVOI,F (Ig(¡g).

Il nous est donc apparu nécessaire de définir certains caractères io2 vitro d’une

souche de virus d’Egtved dans le but ultérieur de comprendre la pathogénie de lamaladie et de préciser les rôles respectifs de l’hôte et de son virus dans l’apparitionde la Septicémie Hémorragique.

Or, pour qu’un virus provoque une maladie, il faut qu’il se multiplie chez sonhôte et qu’il résiste ensuite aux facteurs d’inactivation du milieu intérieur de l’hôteet du milieu extérieur pour assurer la transmission. C’est donc vers la stabilité et la

croissance du virus à différentes températures que nous avons orienté nos recherchesen nous souvenant que l’apparition de la Septicémie Hémorragique est étroitementliée à la température.

Parallèlement nous avons associé à certaines de nos expériences sur la croissancevirale une étude en microscopie électronique en vue d’étendre nos connaissances surla morphogenèse et la structure des particules.

MATERIEL ET TECHNIQUES

I. Cellules

Deux lignées cellulaires de poisson ont été employées : -la lignée l2airzbow Trout Gorzadou R. T. G. 2 (Won.-, Iq62) et la Fat Head JB1innow oU F. H. M. (GR:&dquo;iELL et 31,XLSBERGER, 1965)La R. T. G. 2 provient du Ilicrobiological Associates et la F. H. Vl. nous a été donnée parIï. WoLF dc l’liastcrll FisTa Diseascs labovatovy.

Les deux lignées sont produites dans du milieu de l:agle, tamponné Tris à un pH de 7,4 etcontenant par millilitre : 100 unités de pénicilline, ioo microgrammcs de streptomycine, So mi-crogrammcs de kanamycine et So unités de m5!costatine. Du sérum de veau (10 p. 100) a été pro-gressivement substitué à la même proportion de sérum f&oelig;tal en diminuant ainsi de façon appré-ciable le prix de revient du milicu.

Les cellules sont cultivées en bouteilles de Houx d’un litre placées à l4oC pour les R. ’J’. G. 2

et à 290C pour les F. H. :B1. Ces deux lignées se congèlent facilement et se conservent en ampoulesdans l’azote liquide.

2. Virus _

La souche danoise F, (Jr.!sr.v, Iq<,_1) , à son T_5.. passage en culture cellulaire 12. T. G. 2, nousa été fournie par P. 7!:. B,Esll,-IZ(iAAI!r)7jOlZ(-!UNSII-N. Nous avons utilisé ce virus pour nos expériencesaprès ig passages supplémentaires sur cellules K. !1’. (!. 2 et 1’’. H. AI.

Les stocks de virus ont été produits sur ces cultures confluentes, âgées de 2 à 5 jours, incu-bées à 14° dans des bouteilles de Roux contenant 40 millilitres de milieu de hagle tamponnéTris à, pH 6,!, additionné de 2 p. ioo de sérum de veau. Du milieu de Earle à o,5 p. ioo d’hydrolysatde lactalbumine et tamponné dans les mcmes conditions a également servi à titre de comparaison.

Le virus est récolté par deux opérations successives de congélation (&mdash; 35«C) et de décongé-lation à la température ordinaire, trois jours après l’inoculation des cellules qui présentent uneffet cytopathogène intense. La suspension est alors centrifugée pendant 10 minutes à 4 ooo/t mn,à -)- 4°C, dans une centrifugeuse AI. S. J.1. (H. S. W ).

-

Le virus contenu dans le surnageant peut ensuite être concentré par une centrifugation dedeux heures à i8 00o t/mn (40 00o g) à .1- 4!’C dans la même centrifugeuse, en reprenant les culotsdans du milieu de I!a;!le 2 p. 100 représentant z/ro ou moins du volume initial.

3. Titrage du virus (fig. i)

Le virus est titré par la méthode des plages selon une technique décrite par (’AMi’BELL et WOLF(io0c» mais. que nous avons légèrement modifiée. Des boîtes de Pétri Falcon de 35 X 10 milli-mètres (surface 8 cmz), contenant une culture conflucnte de cellules F. H. 3i. de 24 heures, soit3 millions de cellules dans T ,5 ml de milieu, sont infectées avec o,2 ml d’une dilution de virus àraison de quatre ou cinq boîtes par dilution.

Après une heure d’adsorption à une température de il à 2o(,(’,, pendant laquelle les boîtessont agitées cinq ou six fois, du milieu de Eag)e à 2 p. 100 de sérum et 0,5 p. Too d’agarose, tam-ponné Tris à un pH de !,6 est coulé sur les cellules à une température de 300C à raison de 1, milli-litre par Voîte. Au bout de deux jours et demi à trois jours, i millilitre de rouge neutre à o,05 p. 100en solution de Garle, a o,s p. 100 d’agarose, est coulé sur lit première couche de milieu 4 heuresavant la lecture. Le troisième jour le diamètre des plages est de l’ordre d’un millimètre.

Cycle de dévc!oppemcnt dit virils

Des boîtes Falcon de go ml contenant, les unes 1,3 . 10&dquo; cellules R. T. G. 2, les autres !,9 10.cellules F. H. -NI., sont respectivement infectées avec 6 et 2 unités formant des places (I’. F. P.)de virus 1! par cellule. Après une heure d’adsorption et un triple lavage avec du milieu de Kaglecontenant 2 p. oo de sérum de veau, les ’boites sont incubées à 14&dquo;(’ en présence de mi de milieu.

Des flacons sont prélevés à différents moments aprèsl’infection et titrés après avoir été congeléset décongelés deux fois.

’

En outre, des expériences de croissance virale en cycle unique ont été faites à différentestempératures allant de + 6<’ à ; 24°C en modifiant la multiplicité d’infection ainsi que le nombrede cellules.

5. XI icroscoPic élatroniquf

Des cultures de cellules K. T, (G. 2, infectées en cycle unique, sont fixées avec la glutaraldé-hy<le à 1,6 p. roo dans du tampon de S’01’enscn à p1I 7,2, pendant 3o minutes à -1- 4!C..!prèsune post-fixation au tétroxyde d’osmium à 2 p. 100 pendant une heure, les cellules sont déshy-dratées à l’alcool et incluses dans l’Épon. Des coupes ultrafines sont effectuées à l’aide d’un ul-trotomc L. K. 13. Il colorées avec l’acétate d’uranyl et le citrate de plomb, puis examinées dansun microscope électronique l’hilips E. !1. 300 à 80 liv et 60 Lc.

RÉSULTATS

I. Stabilité du virus

LI. Congélation-Décongélation.Une suspension virale en milieu de I;agle contenant 2 p. roo de sérum et exempte

de débris cellulaires est répartie en quatre tubes qui subissent respectivement deune à quatre opérations de congélation-décongélation en 24 heures. Les titragesindiquent que le virus supporte ce traitement sans diminution significative de sonpouvoir infectieux, comme le montre le tableau ci-dessous :

1.2. Lyophilisation.La suspension virale est lyophilisée, à raison de 30 ml contenant 20 p. IOO de

sérum de veau, dans des ballons de 250 ml. Des essais d’infection, effectués aprèsune semaine, provoquent un effet cytopathogène accentué au bout de trois jourspour un inoculum de io ml par bouteille de Roux.

1.3. Thermosevcsibilité.

Des dilutions de virus produisant roo à r5o plages par 0,2 ml à 140C sont placéespendant 15 minutes dans des bains-marie à 140C, 24°C, 27°C, 3o°C, 33°C et 34°C.Les tubes servant à la dilution finale (0,2 - Io-4) ont été préablablement portésaux températures voulues avant l’introduction du virus. Un fin d’expérience, lestubes sont placés dans la glace fondante et l’on procède au titrage du virus.

On constate (fig. 2) qu’après 15 minutes à 30°, 50 p. ioo de l’infectiosité ont

disparu.

1.4. Inactivation par L’eau de pisciculture.Une suspension virale titrant environ 10’ U. F. P. par 0,2 ml est préalablement

diluée à IO-1 dans de l’eau de pisciculture centrifugée, filtrée sur membrane Milli-

pore G. S. (0,22 microns) et V. M. (o,o5 microns) et maintenue à 14°C. Des prélè-vements effectués aux temps o, 4 h 30, q heures et 24 heures sont titrés.

On voit alors que le virus perd dans ces conditions go p. IOO de son titre initialen 24 heures.

i.5. Stabilité ae! PH.La souche F a été diluée à 0,2.10&dquo;! dans des solutions tamponnées à des pH allant

de 2,2 à I o,4 puis titrée après 5 minutes d’expérience. On constate que l’infectiositédiminue de plus de 99,5 p. ioo entre les pH 3 et 4 et qu’au delà elle demeure assezstable, la zone de pH la plus favorable étant voisine de 7,5.

i.0. Effet du glycérolLe virus F et deux virus isolés sur des truites malades sont mélangés à parties

égales avec du glycérol, placés à 14«C et des prélèvements sont effectués à des inter-valles de trois jours pour vérifier le niveau de l’infectiosité.

Il apparaît une rapide décroissance du pouvoir infectieux du virus F alors queles virus sauvages sont inactivés beaucoup plus lentement. Avec le virus S. H. V. 8,à son 3e passage en culture, des effets cytopathogènes ont été obtenus après 15 joursde contact avec le glycérol à i4!C.

2. Courbes de croissance du virus

2.i. L’infection en cycle unique à 14°C des cellules F. H. M. montre que la productionvirale débute vers la 7e heure et parvient à un plateau vers la 3oe. On assiste ensuiteà une légère baisse du titre infectieux.

Dans les cellules R. T. G. 2, la production virale s’amorce avec q heures de retardenviron par rapport à ce que l’on observe en cellules F. H. M. Cependant le titre

final obtenu (3-10’) U. F. P. /ml est sensiblement le même quelle que soit la cellulehôte.

2.2. Les cycles de développement du virus à ciuq températures (fig. 7) démontrent quela multiplication virale est possible dans un large intervalle thermique et que pourles températures supra-optimales le plateau est atteint dès la 3oe heure tandis qu’auxtempératures inférieures à r4!C, la production virale continue de croître jusqu’à la72e heure.

2.3. Dans la zone des températures supra- optimales, la température de 2W provoqueune diminution de go p. ioo du rendement infectieux maximal et constitue doncle « yt » (I,wo!!, ig6i) de cette souche (fig. 8).

3. ,Ilicroscopie électronique

L’augmentation du titre infectieux qui survient vers la il heure du cycle(cellules R. T. G. 2) coïncide avec la première observation de virions néoformés,dans les coupes ultrafines de cellules infectées examinées au microscope électronique.

A la 3oe heure du cycle, on note une extraordinaire prolifération de particulesvirales, correspondant par ailleurs à un titre infectieux maximal. Ainsi que ledémontre la figure 9, la plupart des virions sont trouvés à l’état libre dans les espacesinter-cellulaires, mais on en observe également qui sont attachés sur les cellules ouen voie de formation. Ces particules effectuent leur maturation par bourgeonnementà la surface cellulaire (fig. I et il). Au cours de ce processus la nucléocapside viraleacquiert une enveloppe qui dérive directement de la membrane cellulaire.

Les particules virales libres ont une morphologie caractéristique (fig. io).De forme cylindrique, elles mesurent en moyenne 240 fLm en longueur et 75 pni enlargeur. L’un des pôles de la particule est arrondi, l’autre au contraire, qui a servi depoint d’attache sur la cellule, est le plus souvent plat ou légèrement incurvé versl’intérieur du virion ; en outre on y observe systématiquement une queue de 80 à

90 fLm de longueur qui semble être un prolongement d’une portion latérale de l’en-veloppe. L’intérieur de la particule présente une striation transversale particulière-

ment frappante dans les sections longitudinales, (fig. il). Une telle image reflètesans aucun doute la configuration hélicoïdale de la nucléocapside. On remarque dansles coupes transversales que cette nucléocapside ménage un axe de 20 >m en largeur,de très faible densité électronique et qui occupe le centre de la particule (fig. r2).

Les coupes transversales autorisent par ailleurs une très bonne observation de

l’enveloppe. Celle-ci se présente comme une membrane à trois feuillets ; le feuilletinterne, très opaque aux électrons, étant intimement accolé à la nucléocapside (fig. r3).

D’autres micrographies (fig. r4) semblent indiquer également l’existence, surcette membrane, d’un matériel superficiel diffus et dont l’organisation n’apparaîtpas très clairement dans les coupes. On y décèle néanmoins une certaine périodicité.

Pendant toute la phase de croissance exponentielle du virus les cellules, dans leurensemble, conservent une apparence très saine. On note cependant une tendance àla vacuolisation progressive du cytoplasme.

Ce qui est plus frappant durant toute cette période, c’est l’apparition dans lecytoplasme des cellules infectées de larges zones assez faiblement contrastées (fig. z5),où sont observées, à l’exclusion de toute autre structure, de longues fibres enrouléesen hélice de 25 à 30 >m de large (fig. r6). Les fibres elles-mêmes ont une épaisseur de85 A environ.

Ces plages représentent probablement des sites d’édification ou d’accumulationde nucléoprotéines virales. Il est pour le moins tentant d’établir un rapport entreces fibres enroulées en hélice et la nucléocapside du virion.

DISCUSSION

Le choix des cellules F. H. M. pour la plus grande partie de ce travail tient comptedu fait que ces cellules se multiplient rapidement, ont une très bonne aptitude àformer des plages et que par comparaison aux R. T. G. 2, elles produisent, à surfacede culture égale et pour une multiplicité d’infection au moins égale à 5 U. F. P. parcellule, environ deux fois plus de virus. Ce fait s’explique simplement : sur une mêmesurface les F. H. M. sont quatre à cinq fois plus nombreuses que les R. T. G. 2.

Les cellules R. T. G. 2 sont produites à r4 °C, cette température étant commodepour leur conservation (elles peuvent y demeurer au moins six semaines) sans renou-vellement de milieu après une subculture, ce qui n’est pas le cas des F. H. M. qui,dès leur confluence, commencent à donner de nombreuses cellules mortes.

La souche de virus danoise Fi a été choisie car c’est elle qui avait été employéedans les travaux de JENSEN, ZwWt,Frrs!RG, WOLF et V!sT!RGnnxv-JoxG!NS!N, ce

qui permet de comparer certains résultats.Pour titrer le virus nous avons préféré la méthode des plages car nous la trouvons

plus pratique et plus concrète que celle des dilutions limites. D’autre part l’écartthermique 14°C à 20°C que nous donnons pour l’adsorption a été déterminé expéri-mentalement et le nombre des plages pour une dilution donnée n’y présentait aucunedifférence significative.

Les essais de décongélations successives ont montré que le virus était stable dansle milieu Tris contenant 2 p. IOO de sérum et que ce mode de traitement permettaitdonc la conservation de solutions virales de titre connu pour l’étude expérimentale

du virus ou son stockage comme antigène d’une réaction sérologique. Par ailleurs, onsavait déjà que l’infectiosité pouvait subsister au moins deux ans à-2o°Cet qu’ellepersistait plus de six mois dans les poissons congelés (WOLF, JORGENSEN, 1966 et1968), mais des tests en rapport avec la manipulation du virus n’avaient pas étépubliés.

La lyophilisation apparaît également comme un moyen possible de conserver levirus d’Egtved mais nous n’avons effectué jusqu’à présent que des essais qualitatifs.Des expériences quantitatives seront menées dans les deux années à venir.

Le pouvoir infectieux du virus d’Egtved est en revanche très sensible à un séjourà la température de -! 3ooC. Il est indispensable de connaître cette propriété avantd’entreprendre tout travail sur ce virus et les résultats que nous avons obtenus sonten accord avec ceux de VESTERGAARD-JORGENSEN (ig6g) qui trouve encore de l’infec-tiosité après IO minutes à 30°C, mais plus après 3 heures. A -f- 44°C, nous n’avonsplus retrouvé de plages après r5 minutes ce qui corrobore également les résultats denotre collègue Danois.

L’inactivation du virus dans l’eau était déjà pressentie par JENSEN et montre

l’intérêt de reconnaître les porteurs de virus puisque ce dernier est rapidementinactivé à l’état libre. VESTERGAARD-JORGE)¡’SEN (ig6g) en recherchant le virus à lasurface d’oeufs de truites provenant d’une pisciculture infectée et aussi d’oeufs infec-tés expérimentalement, constate une disparition du pouvoir infectieux entre 3 h 30 et

48 heures.L’inactivation du virus F dans le glycérol est conforme à ce qui en était connu

(Woi,F, 1966) ; en revanche, le comportement des virus « sauvages » est inattendu.Le pouvoir infectieux du virus S. H. V. I. (rer passage) décroît moins vite que celui duS. H. V. 8 (4e passage en culture cellulaire). Par ailleurs il ne s’agit pas d’une conta-mination par le virus de la Nécrose Pancréatique Infectieuse car aucune séroneutra-lisation ne se produit avec le sérum polyvalent anti I. P. N. de l’Eastern Fish DiseaseLaboratoyy. De plus la microscopie électronique a montré de nombreux virionsd’Egtved dans des cellules présentant un effet cytopathogène après infection par levirus sauvage ayant passé deux semaines dans le glycérol à 50 p. ioo. La sensibilitédu pouvoir infectieux dans le glycérol ne semble donc valable que pour le virus aprèsplusieurs passages en culture cellulaire.

Le comportement du virus F, en fonction du pH montre qu’il est relativementstable dans les zones que l’on peut retrouver chez la truite mais que c’est vers 7,5qu’il faut se placer pour avoir la meilleure protection du virus et à cet effet l’emploidu tampon Tris et l’addition de sérum (2. p. ioo) ont une influence très favorabledans les manipulations du virus.

La croissance virale obtenue dans les cellules R. T. G. 2 est sensiblement iden-

tique à celle que trouve WOLF (ig66) et qui aboutit à un titre maximal à la 3oe heure

après une phase de latence de ro h 30 et une phase exponentielle de 12 heures. En

revanche, cette multiplication en R. T. G. 2 est légèrement en retard par rapport àcelle en F. H. M. qui a une phase de latence plus courte (7 heures) et parvient plusvite au titre maximal (vers la 28e heure). Il faut cependant noter que malgré ladifférence des optimums thermiques de croissance cellulaire (24°C pour les R. T. G. 2et 34°C pour les F. H. M.), la température permettant le meilleur rendement viralreste identique (12° - 14°C) et que son action s’exerce donc, indépendamment descellules, sur la multiplication du virus.

La similitude des titres infectieux dans les cycles à 14°C avec les deux typescellulaires (fig. 6) n’est qu’un fait relatif à cette expérience dans laquelle les multi-plicités d’infection étaient respectivement de 2 U. F. P. par cellule, pour les F. H. M.et de 5 pour les R. T. G. 2. Dans d’autres expériences à cette température, mais avecdes multiplicités toujours supérieures à 5 U. F. P. par cellule, pour chacune des

lignées, et un rapport du nombre des R. T. G. 2 à celui des F. H.M. de i à 4 ou 5,

pour une surface de culture égale, les titres obtenus en F. H. M. excédaient au moinsdu double ceux des R. T. G. 2.

Aux températures inférieures à la zone + r4°C - -!- r2°C, la production viraleest plus lente mais aboutit aux mêmes titres que dans cette zone. Ceci est en accordavec les résultats de Wo!,! qui, à !- 4°C, avec la lignée R. T. G. 2, obtient un titremaximum le 5e jour. Ayant nous-mêmes employé les F. M. H., nous n’avons pasopéré à -+- q°C mais à -!- 6°C en arrêtant les expériences au 3e jour. On voit doncqu’en dessous de !-- iq°C (zone thermique à laquelle on observe la maladie in vivo),la température semble n’agir, in vitvo, que sur la vitesse de la multiplication viraleet non sur le titre final.

Aux températures supra-optimales de -! 18° et -!- 22°C, le rendement le plusélevé est obtenu vers la 30e heure, ce qui nous a permis d’établir le temps d’expériencenécessaire à la détermination du rt de la souche Fi. C’est autour de -!-- 210C que lerendement infectieux est diminué de go p. ioo, alors que dans les piscicultures lamaladie disparaît quand la température atteint -!- 140C.

Ayant procédé à des contrôles de pouvoir pathogène en inoculant la souche Fipar voie péritonéale, à raison de 5moe U. F. P. par animal, à des truitelles de 80 g,

placées à + 6°C, + Io°C, -! 14°C et -f- 18°C (25 truitelles par lot) au laboratoired’Hydrobiologie de l’Électricité de France à Montereau, nous n’avons pas reproduitla maladie. De même V!sT!xGnnxD-JoRG!NS!! (ig6g) a inoculé 12 fois en un an des

truites Arc-en-Ciel avec la souche F passée en culture, sans reproduire la maladiemais en obtenant finalement un léger pouvoir neutralisant dans le sérum des ani-maux.

En étudiant la souche Fi, nous avons donc établi des propriétés in vityo corres-pondant à un virus ayant perdu son pouvoir pathogène. Nous disposons donc main-tenant d’une méthodologie qui nous permet d’aborder l’étude de virus sauvagesisolés sur poissons malades afin de voir si l’on peut relier le pouvoir pathogène duvirus à des propriétés in vitro.

L’ensemble des observations effectuées au microscope électronique confirme,comme l’avait déjà énoncé Zwm!,!VS!xG et al. (1965), que le virus d’Egtved présentede nombreux traits communs avec celui de la Stomatite Vésiculeuse (= VSV) (Ho-WATSON et WHITMORE, 1962 ; NAKAI et HOWATSON, 1968) qui est considéré actuelle-ment comme le chef de file d’un groupe de virus désignés sous le nom de Stomatovividae (Pyovisionat Committee for Nomenclature of Viruses, 1965).

Si, en cette matière, nos conclusions rejoignent celles de Zwm!,!rrs!RG et al., il

n’en est pas toujours ainsi en ce qui concerne l’interprétation des images observéesdans les coupes ultrafines. Nous notons également des différences quant à la dimen-sion des particules. Les valeurs que nous indiquons pour le diamètre et la longueurdes virions sont sensiblement plus élevées que celles mentionnées par ces auteurs.A ce propos, il convient de signaler que nous n’avons pas utilisé la même technique defixation et d’inclusion, ce qui peut expliquer certaines différences.

Cependant, un autre point nous semble présenter un intérêt plus fondamental.Contrairement à ZWILLENBERG et al., nous pensons que la striation transversale desparticules est effectivement l’image de la nucléocapside virale, enroulée en hélice.Le plus faible diamètre de cette nucléocapside serait au moins égal à l’épaisseur desstries opaques aux électrons, soit environ 60 A. La nucléocapside serait enrouléeselon une hélice dont le plus grand diamètre avoisinerait la largeur du virion soit55 à 60 !.m, le pas de l’enroulement étant de i3o ! environ.

Cette hypothèse est appuyée par le fait que l’axe des particules nous apparaîtavec une densité électronique trop faible pour justifier l’existence d’une nucléocapsidecentrale de 20 !,m de diamètre, identique aux hélices cytoplasmiques. Ces dernières,en section transversale, ont un contraste très prononcé, et que l’on s’attend à trouverconnaissant l’affinité des sels d’uranyl et de plomb pour les nucléoprotéines. Si cesfibres cytoplasmiques représentent bien la nucléoprotéine virale il faut, dans notrehypothèse, imaginer que leur enroulement est modifié au moment où s’effectuela maturation du virion. Les récents travaux de NaKez et HowATSON (1968) nevont pas à l’encontre d’une telle présomption. Ces auteurs ont démontré, en effet,que la nucléocapside du VSV peut revêtir au moins trois conformations différentes.

La plus stable sans doute est trouvée dans le virion intact. La nucléocapside seprésente alors comme une hélice de grand diamètre et dont les sous-unités seraientorientées perpendiculairement par rapport à l’axe. Dans les particules en voie de dégra-dation, les auteurs constatent que la nucléocapside se déroule pour former une fibrelâchement ondulée qui, à son tour, peut s’enrouler à nouveau pour former une hélicede faible diamètre, les sous-unités étant alors orientées parallèlement à l’axe.

Si l’existence d’un phénomène inverse est concevable nous ne saurions affirmerà l’heure actuelle qu’il existe réellement dans le cas de notre modèle car les étapestransitoires de la morphogénèse du virion n’ont pas pu être observées avec suffi-samment de netteté jusqu’à présent.

Par ailleurs, il ne fait pas de doute que les particules bourgeonnent à la surfacecellulaire et que l’enveloppe du virion est une membrane de type « unitaire » à troisfeuillets, recouverte par- un-matériel diffus dont la nature reste encore à déterminer.Jusqu’à présent l’existence d’un composant superficiel dans le virus d’I;gtved n’avaitpu être établie avec certitude. Signalons également que la membrane des cellulesR. T. G. 2 et F. H. M. ne se présente pas avec autant de netteté que dans les cellulesde vertébrés. Pour cette raison la continuité entre la membrane cellulaire et l’enve-

loppe virale, au moment de la maturation, s’observe plus difficilement que dans lecas du VSV ou des virus leucémogènes (BERNHARD, Ig60) .

Les aspects nouveaux qui peuvent être dégagés de notre analyse sur la structuredu virus d’Egtved en coupes minces concernent la localisation et la conformationde la nucléocapside dans le virion, mais également les caractéristiques de l’enveloppe.Dans l’état actuel de nos recherches, il serait trop tôt pour vouloir donner une conclu-sion définitive ; cependant, sur la base d’une comparaison que nous pouvons établiravec le virus de la Stomatite Vésiculeuse dont les caractéristiques morphologiquessont très bien connues, il nous paraît raisonnable d’admettre que ces deux virus doi-vent posséder une architecture semblable.

Reçu pour publication en février 1970.

SUMMARY

EGTVED VIRUS.

1. - STABII,ITY, GROWTH, AND STRUCTURE

OF THE DANISH STRAIN F’1

The stability and growth of Egtved Virus (Danish strain Fl), the causative agent of ViralHaemorrhagic Setpicemia of rainbow trout, were studied in vitro using two cell lines : RTG-2(rainbow trout gonads) and FHM (fat head minnow). The titrations were carried out using aplaque technic in 0,5 per 100 agarose. Viral growth was studied under single cycle replicationconditions.

In some of the experiments, electron microscopic examinations of infected cells were carriedout to provide information on viral morphogenesis and structure.

It appears that the virus remains stable during successive freezing-thawing cycles, can beconserved by lyophilization, and loses 50 per ioo of its infectivity after heating for 15 minutes at

30°C. (fig. 2). Twenty-four hours after dilution in trout farm water at r4°C., only io per ioo ofinfectivity remains (fig. 3). In addition, the Fi virus is quite stable between a pH of 5 and io. 4(fig. q). The virus is rapidly inactivated in 50 per ioo glycerol, in contrast to the behaviour ofwild type strains recently isolated from diseased fish (fig. 5).

The optimum growth temperature of strain 1’1 is 12 to 140C., with superior growth beingobserved in FHM cells as compared with the RTG-2 cells. The ri of this virus strain is 2rOC.

In the RTG-2 cells the viral particles mature near outpocketings of the cell surface. Duringthis process the particles acquire an envelope which is derived in part from the cellular membrane,but which has, in addition, unidentified, diffuse material on its surface. Ultrafine sections showedthat the internal structure of this virus bears a close resemblance to that of Vesicular Stomatitisvirus.

A hypothesis is proposed and discussed to account for modifications in certain helical, cyto-plasmic fibers (which probably represent viral nucleoproteins) that occur during viral morpho-genesis.

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