L’UNIVERSITE BORDEAUX 1ori-oai.u-bordeaux1.fr/pdf/2009/ESTEVE_KARINE_2009.pdfCHAPITRE I : SYNTHESE...

N° d’ordre : 3550

THESE

Présentée à

L’UNIVERSITE BORDEAUX 1 ECOLE DOCTORALE SCIENCE DE LA VIE

Par Karine ESTEVE

POUR OBTENIR LE GRADE DE

DOCTEUR

SPECIALITE : Biogéochimie de l’environnement

Procédé de traitement biologique aérobie d’effluents

phytosanitaires en viticulture

Date de soutenance : 14 décembre 2007

Après avis de :

Mme B. PICOT , Professeur, Université Montpellier Rapporteur

Mme H.CARRERE , Chargé de recherche - INRA Narbonne Rapporteur

Devant la commission d’examen formée de :

M. B. DONECHE, Professeur - Université Bordeaux II Président

M. M. COUDERCHET , Professeur - Université de Reims Examinateur

M. V. MILISIC , Professeur - Université Bordeaux I Directeur de thèse

Mme M. MIETTON-PEUCHOT , Professeur - Université Bordeaux II Directeur de thèse

-2007-

A l’attention de mon ami,

de mes parents,

et de toute ma famille.

Remerciements

Remerciements

Avant tout propos, je tiens à remercier Madame Martine MIETTON-PEUCHOT, Responsable de l’équipe

Génie des procédés et environnement de l’UMR INRA-Œnologie (1219), de m’avoir reçue et hébergée

au sein de son laboratoire. Je lui exprime tout spécialement ma gratitude pour avoir bien voulu

accepter d’être ma Directrice de thèse et qui m’a toujours efficacement soutenue et conseillée lorsque

je l’ai sollicitée.

Je remercie tout particulièrement et très chaleureusement Monsieur Vladan MILISIC pour l’accueil qu’il

m’a réservé, pour son encadrement, ses encouragements, sa confiance et l’aide qu’il a su m’apporter

tout au long de ce travail.

Je remercie Madame Bernadette PICOT, Professeur à la Faculté de Pharmacie de Montpellier, Madame

Hélène CARRERE, Chargé de recherche à l’INRA de Narbonne, Monsieur Michel COUDERCHET,

Professeur à l’Université de Reims, ainsi que Monsieur le Doyen de la Faculté d’oenologie de Bordeaux

II, Bernard DONECHE, qui me font l’honneur d’accepter de juger cette thèse.

Merci aussi au C.I.V.B. et en particulier à Mme Muriel BARTHE pour leur soutien financier qui m’a

permis de mener à bien mes travaux de recherche.

Un grand merci aussi à l’ensemble des personnes de l’équipe de Génie des Procédés : Audrey

DEVATINE, Michel SERRANO, Christian POUPOT, pour leurs précieux conseils.

Je tiens à remercier aussi Madame Laurence GENY, Monsieur Cédric SAUCIER et Monsieur Philippe

MICHONNEAU pour leur encadrement lors de mes stages précédents.

J’exprime ma gratitude à Monsieur et Madame Guy SOULAS pour leur gentillesse et leur amabilité. Je

n’oublie pas l’équipe du CNRS Transport de photoassimilats de Poitiers et particulièrement Madame

Pierrette FLEURAT-LEUSSARD pour son encouragement à continuer mes études.

Je remercie Monsieur Atif KABLI du LEGTA de Melle pour l’aide qu’il m’a apportée durant toutes ces

années d’études. Je tiens également à remercier le LPA de Jonzac qui m’a permis de mener de concert

ma recherche et l’enseignement.

Une grand merci à mes collègues de bureau : Caroline, Joana, Fabrice, Igor et Arnaud. Nos discussions

amicales n’ont peut-être pas toujours fait avancer la science, mais ont largement contribué à

entretenir notre enthousiasme et notre détermination. Merci aussi à tous les stagiaires avec lesquels le

travail et l’encadrement ont été très enrichissants.

Je remercie spécialement Mathieu, ainsi que notre « tribu », qui a consacré beaucoup de temps et de

patience lors de la rédaction de ce manuscrit. Je remercie mes parents et ma famille pour m’avoir

soutenue et aidée dans les moments difficiles.

TABLE DES MATIERES

Table des matières

i

Table des Matières

Table des illustrations vii

Nomenclature x

INTRODUCTION GENERALE 1

CHAPITRE I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 1 : Les produits phytosanitaires et leurs

impacts environnementaux 6

I.1.1. Les produits phytosanitaires : Caractéristiques générales 7

I.1.1.1. Définition 7

I.1.1.2. Caractéristiques chimiques 9

I.1.1.3. Utilisation et mode d’action 10

I.1.1.4. Origine et prévention de la pollution des eaux

par les produits phytosanitaires 12

I.1.2. La dégradation des produits phytosanitaires 14

I.1.2.1. Généralités 14

I.1.2.2. Photodégradation 15

I.1.2.3. Dégradation chimique 16

I.1.2.4. Dégradation biologique 17

Table des matières

ii

I.1.3. La stratégie française en matière de réduction de la pollution par

les produits phytosanitaires 20

I.1.3.1. La réglementation 20

I.1.3.2. Réduction et récupération des volumes d’effluent 22

I.1.3.3. Le traitement des effluents phytosanitaires 22

I.1.3.4. Le contrôle de l’épuration 26

I.1.4. Conclusion 28

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 2 : Traitement biologique par boues activées 29

I.2.1. Généralités 29

I.2.1.1. Description du procédé par boues activées 29

I.2.1.2. Les différentes natures de pollution et norme de rejet 29

I.2.1.3. Paramètres spécifiques du procédé par boues activées 31

I.2.2. Caractérisation et composition du floc biologique de boues

activées : comportement face à un toxique 32

I.2.2.1. Caractéristiques de la population microbienne 32

I.2.2.2. Caractéristiques d’un floc 36

I.2.2.2.1. Structure et nature d’un floc 36

I.2.2.2.2. Rôle des composés exocellulaires dans la formation

d’un floc 38

I.2.2.3. Incidence des pesticides sur l’épuration biologique 40

I.2.3. Mécanismes de transfert et de réaction d’une culture

microbienne 41

I.2.3.1. Transfert du substrat à travers un floc 41

I.2.3.2. Transfert et métabolisation du substrat dans un organisme 41

I.2.4. Modélisation des cinétiques de réaction 44

I.2.4.1. Rappel du modèle de MONOD 44

I.2.4.2. Spécificité des autres modèles 45

I.2.4.3. Utilisation actuelle du modèle de Monod pour

la dégradation des toxiques 47

I.2.5. Conclusion 47

Table des matières

iii

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES

II.1. Description des pilotes

II.1.1. Le bioréacteur 48

II.1.2. Jar-test aéré 49

II.2. Molécules phytosanitaires 49

II.2.1. Concentrations des pesticides 49

II.2.2. Les matières actives phytosanitaires 50

II.3. Méthodes d’analyses 52

II.3.1. Analyses de l’effluent initial et traité 52

II.3.2. Analyses des boues 58

CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION

PARTIE RESULTATS ET DISCUSSION 1: Dégradation biologique

des matières actives phytosanitaires 60

III.1.1. Dégradation biologique des effluents vinicoles 60

III.1.1.1. Mode opératoire 60

III.1.1.1.2. Caractéristiques physico-chimiques et biologiques

des boues activées initiales 60

III.1.1.1.3. Protocole d’essai 62

III.1.1.2. Etude de la dégradation des effuents vinicoles 63

III.1.1.2.1. Evolution de la DCO 63

III.1.1.2.2. Comportement des boues 64

III.1.1.3. Comparaison des deux modalités 68

III.1.2. La dégradation des produits phytosanitaires par boues activées 69

III.1.2.1. Les molécules phytosanitaires 69

III.1.2.2. Protocole d’essai 70

III.1.2.3. Etude de la Biodégradation 71

III.1.2.3.1. Evolution de la DCO 71

III.1.2.3.2. Evolution du phosphore total et du phosphate 73

III.1.2.3.3. Evolution de la concentration en pesticides

dans l’effluent 75

Table des matières

iv

III.1.2.3.4. Evolution de la concentration en pesticides

dans les boues 75

III.1.2.4. Comportement des boues 77

III.1.2.4.1. Le volume de boues 77

III.1.2.4.2. Les matières en suspension 78

III.1.2.4.3. Les matières sèches 79

III.1.2.4.4. Evolution des micro-organismes 80

III.1.2.4.6. Evolution des polysaccharides 83

III.1.2.5. Toxicité des effluents 84

III.1.3. Discussion 86

III.1.4. Conclusion 88

PARTIE RESULTATS ET DISCUSSION 2: Dégradation biologique

d’un effluent phytosanitaire 90

III.2.1. L’effluent et la biomasse initiale 90

III.2.2. Etude de l’épuration des effuents viti-vinicoles 93

III.2.2.1. Evolution de la DCO 93

III.2.2.2. Comportement des boues activées 94

III.2.2.2.1. Evolution des Matières sèches (MS),

des matières Volatiles (MVS) 94

III.2.2.2.2. Evolution des matières en suspension (MES)

et de la turbidité 95

III.2.2.2.3. Evolution du volume de boues 96

III.2.2.2.4. Evolution de l’ATP 97

III.2.2.3. Discussion 99

III.2.3. Influence de la concentration en produits phytosanitaires 100

III.2.3.1. Evolution de la DCO 100

III.2.3.2. Etude des liqueurs mixtes 102

III.2.3.2.1. Evolution des MES et de la turbidité 102

III.2.3.2.2. Les Matières Volatiles (MVS) 104

III.2.3.3. Comparaison des paramètres après 24 h 104

III.2.3.4. Comparaison des paramètres cinétiques 105



Table des matières

v

PARTIE RESULTATS ET DISCUSSION 3: Saccharomyces cerevisiae

bio-marqueur de la pollution phytosanitaire 110

III.3.1. Rappel bibliographique 110

III.3.2. Protocole Opératoire 111

III.3.2.1. La souche de levure 111

III.3.2.2. Les conditions de culture 111

III.3.2.3. Le protocole d’essai 112

III.3.2.4. Dénombrement des levures 113

III.3.2.5. Test de viabilité 113

III.3.2.6. Dosage de l’ATP 113

III.3.3. Incidence des pesticides sur la levure Saccharomyces cerevisiae 116

III.3.3.1. Molécules phytosanitaires 116

III.3.3.2. Evolution des teneurs en ATP au cours du temps 117

III.3.3.3. Effet des pesticides sur la viabilité de la levure et la

production de biomasse 118


III.3.4. Validation du test d’écotoxicité aiguë (ATPyeast test) 119


III.3.4.2. Réponse dose-effet des pesticides sur la synthèse

d’ATP de Saccharomyces cerevisiae 120

III.3.4.3. Détermination de l’EC50 121

III.3.4.4. Validation du biotest 123



PARTIE RESULTATS ET DISCUSSION 4: Etude du procédé de bio-élimination

des effluents viti-vinicoles 127

III.4.1. Mode opératoire 128


III.4.1.2. Caractéristiques physico-chimiques et biologiques

des boues activées 128

III.4.1.3. Protocole d’essai 130

Table des matières

vi

III.4.2. La dégradation des effuents viti-vinicoles 131

III.4.2.1. Evolution de la DCO et du COT 131

III.4.2.2. Evolution des teneurs en pesticides 132

III.4.3. Comportement des boues activées face aux produits phytosanitaires 134

III.4.3.1. Evolution des Matières Sèches (MS), des Matières Volatiles

(MVS) et du taux de boues 135

III.4.3.2. Evolution des MES et de la turbidité 136

III.4.3.3. Evolution des micro-organismes 137

III.4.3.4. Evolution des subtsances secrétées par les micro-organismes 138

III.4.4. Mesure de la toxicité 140

III.4.4.1. Toxicité de l’effluent d’entrée 140

III.4.4.2. Toxicité de l'effluent de sortie 144

III.4.4.3. Évolution de la toxicité au cours de la dégradation 145


CONCLUSION GENERALE 148

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 151

ANNEXES 160

TABLE DES ILLUSTRATIONS

Table des illustrations

vii

FIGURES

Figure I.1. Tonnage des substances actives vendues en France entre 1999 et 2006 d’après UIPP. 6

Figure I.2. Répartion mondiale des produits phytosanitaires par catégorie en 2005. 8

Figure I.3. Classification des pesticides selon leur nature physico-chimique. 10

Figure I.4. Principales causes de pollutions ponctuelles. 13

Figure I.5. Courbe dose-réponse d’un polluant des tests écotoxicologiques. 27

Figure I.6. Principe du procédé d’épuration par boues activées. 29

Figure I.7. Principales relations au sein de l’édifice biologique boues activées. 33

Figure I.8. Evolution des populations des boues activées. 35

Figure I.9. Représentation schématique du floc bactérien. 36

Figure I.10. Photographie au microscope optique (X100) de flocs de boues activées. 38

Figure I.11. Schéma d’un floc bactérien. 42

Figure I.12. Shématisation du floc selon différents modèles. 42

Figure I.13. Mécanismes de transfert et de réaction dans une culture bactérienne. 43

Figure II.1. Schéma du bioréacteur pilote de 30 L. 48

Figure II.2. Schéma du jar-test aéré. 49

Figure II.3. Protocole expérimental du test écotoxicologique. 57

Figure II.4. Méthode d’extraction des matières actives phytosanitaires dans les boues. 59

Figure III.1. Récapitulatif des expérimentations. 63

Figure III.2. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) en traitement biologique. 64

Figure III.3. Evolution du volume de boues (Vb) et du pH au cours du traitement biologique. 64

Figure III.4. Evolution des teneurs en Matières Sèches (MS) et en turbidité au cours du

traitement biologique. 66

Figure III.5. Descriptif du procédé expérimental. 70

Figure III.6. Evolution de la microfaune dans la liqueur mixte issue du traitement

des effluents de soutirage. 80

Figure III.7. Evolution de la microfaune dans la liqueur mixte issue du traitement

des effluents de filtration. 81

Figure III.8. Exemple de structure du floc bacterien dans la liqueur mixte

de soutirage après traitement biologique des pesticides. 82

Figure III.9. Exemple de structure du floc bactérien dans la liqueur mixte de filtration

après traitement biologique des pesticides. 82

Figure III.10. Descriptif du disposif expérimental utilisé. 92

Figure III.11. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) au cours du traitement biologique. 93

Figure III.12. Evolution en matières sèches (MS) au cours du traitement biologique. 94

Figure III.13. Evolution des matières volatiles (MVS) au cours du traitement biologique. 94

Figure III.14. Evolution du rapport MVS/MS au cours du traitement biologique. 95

Figure III.15. Evolution des matières en suspension (MES) au cours du traitement biologique. 96

Figure III.16. Evolution des turbidités au cours du traitement biologique. 96

Figure III.17. Evolution du volume de boues (Vb) au cours du traitement biologique. 97

Figure III.18. Evolution des teneurs en ATP au cours du traitement biologique. 98

Figure III.19. Evolution de la DCO et du rapport ATP/MVS au cours du traitement biologique. 98

Figure III.20. Evolution de la DCO dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte. 101

Figure III.21. Evolution des Matières en Suspension dans les essais en jar-test utilisant

une liqueur mixte. 102


viii

Figure III.22. Evolution des turbidités dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte. 103

Figure III.23. Evolution des Matières Volatiles dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte. 104

Figure III.24. Evolution du taux de croissance (µ) en fonction de la concentration S0 en substrat. 107

Figure III.25. Photo de levures au microscope optique Grossissement X400. 112

Figure III.26. Protocole expérimental du test ATPyeast. 112

Figure III.27. Protocole experimental de détermination de la viabilité des levures. 114

Figure III.28. Représentation simplifiée du métabolisme cellulaire. 114

Figure III.29. Evolution des teneurs en ATP (URL) de la levure : Témoin (�), Mélange phytosanitaire (�). 117

Figure III.30. Viabilité des levures : photo a (Témoin) et photo b (Mélange phytosanitaire). 118

Figure III.31. Structure des matières actives phytosanitaires sélectionnées. 120

Figure III.32. Effet de l’Azoxystrobine, du Cymoxanil et du Diuron sur la synthèse d’ATP de S.C. 121

Figure III.33. Graphique PROBIT pour déterminer les valeurs d’EC50 de Azoxystrobine, du Cymoxanil

et du Diuron. 123

Figure III.34. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO)(�) et du Carbone Organique

Total (COT)(□) au cours du traitement biologique. 131

Figure III.35. Evolution des Matières Sèches (MS) (�) et Matières Volatiles

(MVS) (�) au cours du traitement biologique. 135

Figure III.36. Evolution du volume de boues (Vb) au cours du traitement biologique. 136

Figure III.37. Evolution des matières en suspension (MES) (□) et de la turbidité (●) au cours du

traitement biologique. 136

Figure III.38. Evolution des teneurs en exopolymères (EPS) (protéines (◊),

substances humiques (�), polysaccharides (●), EPS totaux (▲)). 138

Figure III.39. Evolution des teneurs en EPS (◊) et en DCO (�). 139

Figure III.40. Evolution de l’adénosine 5-triphosphate (ATP) au cours du traitement biologique. 139

Figure III.41. Influence de la concentration en pesticides sur la synthèse d'ATP

de Saccharomyces cereviseae. 143

Figure III.42. détermination de l’EC50 de l’effluent d’entrée. 144

Figure III.43. Détermination de l’EC50 de l’effluent de sortie. 144

Figure III.44. Toxicité de l’effluent de sortie au cours du traitement biologique. 145

TABLEAUX

Tableau I.1. Propriétés chimiques, physiques et structurelles influençant la dégradation d’un pesticide. 15

Tableau I.2. Liste des procédés de traitement des effluents phytosanitaires reconnus

comme efficaces par le MEDD. 23

Tableau I.3. Charge massique et volumique 32

Tableau I.4. Classification de la faune des boues activées en fonction de la charge massique. 35

Tableau I.5 : Modèles applicables à la cinétique des boues activées. 46

Tableau I.6. Paramètres cinétiques quantifiés par différents modèles. 46

Tableau II.1. Matières actives phytosanitaires pures. 50

Tableau II.2. Matières commerciales phytosanitaires. 51

Tableau II.3. Propriétés des molécules actives phytosanitaires. 52

Tableau II.4 : Protocole de dosage des protéines et substances humiques. 54

Tableau II.5. Protocole de dosage des polysaccharides. 55

Tableau II.6. Phase mobile utilisée en HPLC. 56

Tableau III.1. Paramètres initiaux des liqueurs mixtes issues du traitement biologique de Latresne. 61

Tableau III.2. Observation des micro-organismes des boues activées de Latresne. 61


ix

Tableau III.3. Observation des micro-organismes des boues activées de l’expérimentation 1. 67

Tableau III.4. Observation des micro-organismes des boues activées de l’expérimentation 2. 68

Tableau III.5. Récapitulatif des molécules actives phytosanitaires testées. 70

Tableau III.6. DCO (mg O2.L-1) avant et après traitement biologique des pesticides, DCO résiduelle

et le pourcentage d’efficacité. 72

Tableau III.7. Evolution du phosphore total (mg.L-1) avant et après traitement biologique

de chaque pesticide et son pourcentage d’augmentation. 74

Tableau III.8. Evolution de la teneur en pesticides (mg.L-1) avant et après traitement biologique

de chaque pesticide et pourcentage d’élimination. 75

Tableau III.9. Evolution de la teneur en pesticides dans les boues (µg.g-1 de MS) avant et après traitement

biologique de chaque pesticide 76

Tableau III.10. Bilan global de l’épuration avant et après traitement biologique de chaque pesticide. 76

Tableau III.11. Evolution du volume de boue (mL.L-1 de liqueur mixte) après traitement biologique. 77

Tableau III.12. Evolution des matières en suspension (g.L-1) avant et après traitement

biologique de chaque pesticide. 78

Tableau III.13. Evolution des matières sèches (g.L-1) avant et après traitement biologique des pesticides 79

Tableau III.14. Evolution des polysaccharides après traitement biologique de chaque pesticide. 83

Tableau III.15. Toxicité de l’effluent après traitement biologique de chaque pesticide. 85

Tableau III.16. Paramètres initiaux des liqueurs mixtes issues du traitement biologique de Latresne. 91

Tableau III.17. Produits phytosanitaires composant l’alimentation des boues activées. 91

Tableau III.18. Concentrations initiales de l’effluent vinicole et viticole. 100

Tableau III. 19. Paramètres à 24 h du traitement biologique. 105

Tableau III.20. Détermination des taux de croissance µ (h-1) des 2 expérimentations. 107

Tableau III.21. Les produits phytosanitaires sélectionnés. 116

Tableau III.22. Comparaison des valeurs de toxicité aiguë de l’Azoxystrobine, du Cymoxanil

et du Diuron avec les différents biotests (ATPyeast-test, test Vibrio fisheri et test Daphnia magna). 123

Tableau III.23. Produits phytosanitaires composant l’alimentation des boues activées. 128

Tableau III.24. Caractérisation initiale de la liqueur mixte issue de l’unité d’épuration

(vignobles MABILLE). 129

Tableau III.25. Observation des micro-organismes des boues activées des vignobles MABILLE. 130

Tableau III.26. Concentrations résiduelles en sulfates, cuivre et soufre total après traitement. 132

Tableau III.27. Concentrations résiduelles en pesticides organiques après traitement. 133

Tableau III.28. Évolution des micro-organismes présents dans la liqueur mixte avant,

pendant et après traitement. 137

Tableau III.29. Pourcentage d'inhibition de l'ATP de Saccharomyces cervisieae en contact

avec différentes molécules phytosanitaires contenues dans le mélange phytosanitaire

formant l'effluent d'entrée. 141

Tableau III.30. Valeurs de toxicité aiguë de l’effluent avant et après traitement par différents biotests. 145

NOMENCLATURES

Nomenclatures

x

ABREVIATIONS

Abs Absorbance -

ADN Acide Désoxyribonucléique -

ATP Adénosine triphosphate -

EPS Substances Polymériques Extracellulaires -

LM Liqueur mixte -

HPLC Chromatographie liquide haute performance -

SC Saccharomyces cerevisiae -

LETTRES LATINES

Cm Charge massique T-1

Cv Charge volumique M.L-3.T-1

COT Concentration en carbone organique total M.L-3

DBO Demande biologique en oxygène M.L-3

DCO Demande chimique en oxygène M.L-3

ECx concentration en toxique qui provoque une inhibition M.L-3

Ki Constante d’inhibition dans le modèle de Haldane M.L-3

Koc coefficient de partage carbone organique/eau -

KS Constante de demi saturation M.L-3

L constante de diffusion dans le modèle de Powell -

Log P coefficient de partage eau/octanol -

NOEC concentration de toxique maximale qui ne cause pas d’effet M.L-3

NT Concentration en azote total M.L-3

NTK Concentration en azote Kjeldhal M.L-3

M maintenance -

MES Concentration des matières en suspension M.L-3

MS Concentration en matières sèches M.L-3

MVS Concentration en matières volatiles M.L-3

PT Concentration en phosphore total M.L-3

QEB Débit effluent d’entrée L3.T-1

Qp débit d’extraction ou de purge L3.T-1

rpm Rotation par minute L2.T-1

Rx vitesse de formation de biomasse M.L-3.T-1

Rs vitesse de consommation du substrat M.L-3.T-1

St concentration en substrat à l'instant t M.L-3

S Concentration en substrat M.L-3

S0 Concentration initiale en substrat M.L-3

Tb Taux de boues -

T constante de saturation dans le modèle de Teissier -

TR Temps de rétention T

Nomenclatures

xi

TRH Temps de rétention hydraulique T

V volume de liqueur mixte L-3

Vb volume de boues L-3

Vs Vitesse d’épuisement du substrat M.L-3.T-1

Vx vitesse de croissance des micro-organismes M.L-3.T-1

X constante déterminée expérimentalement dans le modèle de Moser -

X Concentration en biomasse M.L-3

Xp Concentration de purge M.L-3

Xt concentration en biomasse à l’instant t M.L-3

X0 Concentration initiale en biomasse M.L-3

Y Taux de conversion du substrat en biomasse -

LETTRES GRECQUES

λ Longueur d’onde L

θ Age de boues T

µ* Taux de croissance avec inhibition T-1

µ Taux de croissance T-1

µmax Taux de croissance maximal T-1

INTRODUCTION GENERALE

Introduction Générale

1

INTRODUCTION GENERALE

L’intensification de l’agriculture a engendré une utilisation croissante des fertilisants

et des produits phytosanitaires due au progrès dans le domaine de la chimie

organique de synthèse. Les produits phytosanitaires, de synthèse ou naturels, sont

destinés à limiter la prolifération des parasites (mauvaises herbes, insectes,

champignons, rongeurs, acariens) dans le but d’améliorer les rendements.

Aujourd'hui, La Direction Générale de la Santé a estimé à environ 100 000 tonnes la

quantité totale de matières actives utilisées en France pour une surface développée

(surface traitée / nombre d’applications) de 129 millions d’hectares. Les fongicides

et les herbicides représentent à eux seuls 89 % de ce tonnage et la viticulture est

de loin la plus grosse consommatrice de ces produits. L’utilisation des produits

phytosanitaires se caractérise en France par une très grande diversité des

substances actives (environ 400) et de spécialités commerciales (environ 6000).

Malgré leurs atouts non négligeables, ces composés ne sont pas anodins : fortement

actifs biologiquement, ils sont toxiques et ils représentent un risque potentiel pour

la santé humaine, la faune et l’environnement (Gavrilescu, 2005 ; Kordel et al.,

1997). Ce risque est maintenu à un niveau acceptable grâce à l’ensemble des

études menées dans le cadre de l’homologation des produits qui préconise

l’utilisation et en limite leur usage. Cependant, malgré les réglementations, ces

composés restent encore trop souvent mal ou trop abondamment utilisés et se

retrouvent dans le milieu écologique. Pour exemple, des insecticides organochlorés

qui ont des propriétés physico-chimiques hydrophobes, continuent à être détectés

dans les eaux 20 ans après leur utilisation (Kleka et al., 2001 ; Tanabe et al.,

1994).

Une mauvaise gestion de l’application des produits phytosanitaires se traduit par la

contamination des eaux de surface et des eaux souterraines. Cette dégradation de

la qualité de la ressource en eau provient des pollutions d’origine diffuse ou

ponctuelle. Les premières sont difficiles à maîtriser car elles sont dépendantes des

facteurs anthropiques (traitements, pratiques agricoles, type de culture) et des

paramètres liés au milieu naturel tels que le climat, le sol, la topographie. Par

contre, les pollutions ponctuelles peuvent être maitrîsées par des moyens

techniques adaptés car leurs causes sont identifiées : pour exemple, on peut citer

un manque d’information des utilisateurs, un mauvais entretien du matériel de


2

pulvérisation, la vidange des fonds de cuve et des eaux de lavage/rinçage des

instruments de traitement ou encore l’élimination des fonds de produits de

traitement.

A ce jour, il est indispensable de mettre en place toutes les mesures nécessaires

permettant de réduire les transferts de pesticides dans l’environnement en limitant la

concentration et la nature des intrants, en mettant en œuvre les bonnes pratiques

agricoles et en développant des dispositifs de traitement adaptés pour éliminer les

résidus phytosanitaires dans des conditions contrôlées. Ainsi, dans le cadre de la

protection intégrée des cultures, la viticulture s’oriente vers un mode de production qui

associe à la fois des traitements ciblés et basés sur une observation de la parcelle. En

parallèle, la pratique du rinçage à la parcelle se développe et est soutenue par les

structures institutionnelles (Rochard et al., 2001).

L’arrêté du 12 septembre 2006 relatif à la mise sur le marché et à l’utilisation des

produits visés à l’article L.253-1 du code rural, fixe une réglementation sur l’utilisation et

le rejet des pesticides (Annexe 1). Cela concerne des dispositions relatives à l’utilisation

des produits, à la limitation des pollutions ponctuelles, aux zones non traitées au

voisinage des points d’eau et aux conditions à respecter pour l’épandage, la vidange et le

rinçage du matériel de pulvérisation. La dernière partie décrit les dispositions relatives

aux procédés de traitement des effluents phytosanitaires et en particulier les modalités

pour qu’un procédé puisse être inscrit dans la liste des systèmes autorisés (B.O du

Ministère de l’écologie et du développement durable).

Le développement des systèmes de traitement de déchets phytosanitaires présente dans

ce contexte un intérêt croissant. Actuellement, plusieurs solutions d’épuration sont

proposées aux viticulteurs. Différents procédés physico-chimiques peuvent éliminer les

pesticides : la coagulation–floculation, utilisée en prétraitement pour limiter les

concentrations du traitement ultérieur ; l’osmose inverse, pour la concentration des

résidus ; la photocatalyse, pour la dégradation des matières actives organiques (Mietton-

Peuchot, 2003).

Parmi les technologies validées pour le traitement des produits phytosanitaires, certaines

impliquent de recourir à un prestataire de service, ce qui accroît leurs coûts ; d’autres

révèlent un fonctionnement difficile à contrôler dans le cadre ordinaire d’une exploitation.

Une des alternatives à ces procédés est l’utilisation de systèmes biologiques (Biobac,

boues activées,…). Les procédés biologiques sont conçus pour dégrader des contaminants

organiques dans les eaux souillées en utilisant des micro-organismes. Les micro-


3

organismes se développent et se reproduisent en utilisant les polluants comme substrat.

L’utilisation de tels procédés provient d’une constatation : les pesticides actuellement

homologués sont biodégradables. Kipopoulou et al. (2004) ont étudié la dégradation des

pesticides par différents micro-organismes. Des travaux montrent que la biodégradation

d'un pesticide est un processus complexe. Le résultat, qui dépend de plusieurs facteurs

(oxygène, pH, température ou alimentation), est fonction de la structure chimique et de

la concentration des composés, de leurs interactions et des conditions

environnementales.

En collaboration avec le Conseil Interprofessionnel des Vins de Bordeaux (CIVB),

l’équipe Génie des procédés et Environnement de la Faculté d’œnologie de

Bordeaux, développe des recherches dans l’objectif de réduire la pollution des

ressources en eaux générée par les activités viti-vinicoles. Les travaux, menés par

l’équipe, pour répondre aux différentes réglementations, ont permis de mettre en

place des solutions technologiques adaptées aux effluents vinicoles (issues de la

vinification). Il existe un ensemble de possibilités de choix d’équipements qui

permet de considérer la dimension de la propriété, l’intérêt d’un traitement collectif,

les méthodes de travail,… Parmi les procédés disponibles, les traitements

biologiques aérobies (stockage aéré et boues activées) constituent la part

prépondérante. Le principe de ces procédés est basé sur l’aération des effluents en

présence d’une biomasse qui dégrade progressivement la pollution organique.

Dans ce contexte, l’objectif global de ce travail est de développer un procédé

d’épuration des effluents phytosanitaires en utilisant les liqueurs mixtes du système

de traitement biologique par boues activées des effluents vinicoles comme biomasse

épuratrice. Les produits phytosanitaires devraient avoir deux effets :

- une réduction de la quantité de boues par leurs effets toxiques de façon à

limiter la production de boues. Actuellement en France, la production de

boues augmente et il est nécessaire de résoudre ce problème (Bougrier et al.,

2006).

- Une dégradation des matières actives phytosanitaires par une adaptation de

la biomasse résistante.

Cette étude doit permettre de définir les conditions de rejet des effluents

phytosanitaires dans les systèmes de traitement aérobie des effluents vinicoles pour

que les deux types d’effluents puissent être traités conjointement. Si l’idée et sa

mise en œuvre peuvent sembler simples au premier abord, on retrouve avec ce

dispositif la complexité des substrats, des populations microbiennes épuratrices et

leurs compétitions pour les nutriments.


4

Les différentes approches permettront d’évaluer le potentiel épuratoire des matières

actives dans un procédé par boues activées, d’identifier et de caractériser les

mécanismes de dégradation, d’analyser le comportement de la biomasse épuratrice

vis-à-vis des matières actives et de définir les conditions de fonctionnement du

traitement biologique.

Pour répondre à l’objectif du présent travail, la thèse se compose de 4 chapitres

principaux, présentés ci-après :

Le premier chapitre de ce travail permet de rassembler les connaissances disponibles

sur les propriétés des produits phytosanitaires, leurs impacts sur l’environnement et la

réglementation. Les phénomènes de dégradation physico-chimiques et biologiques sont

plus particulièrement mis en avant, puisqu’ils constituent une composante fondamentale

de notre travail. Dans un second temps, nous nous focaliserons sur les procédés

d’épuration des molécules phytosanitaires homologués par l’Arrêté du 12 septembre

2006 du Ministère de l’écologie et du développement durable. Ensuite, nous décrirons le

procédé de traitement biologique par boues activées en focalisant notre attention sur les

paramètres cinétiques le caractérisant et permettant d’évaluer l’adaptation de la

biomasse épuratrice aux produits phytosanitaires.

Le deuxième chapitre est consacré à l’exposé des matériels et méthodes. Outre la

description des méthodes analytiques utilisées pour mesurer les caractéristiques

physiques, chimiques ou biochimiques, nous préciserons les caractéristiques des pilotes

utilisés.

Dans le troisième chapitre, sont présentés les résultats obtenus. Dans un souci de

clarté, les deux premières parties sont consacrées à l’évaluation de l’efficacité du procédé

de dégradation des molécules phytosanitaires, la 3ème partie présente un dispositif

d’autocontrôle mis en place pour mesurer l’efficacité des procédés et la 4ème partie met

en œuvre le procédé de dégradation des effluents viti-vinicoles à l’échelle de pilote

dans des conditions plus proches du terrain.

� La première partie s’intéresse à la capacité d’adaptation de la biomasse épuratrice

à différentes matières actives phytosanitaires testées. Nous mettrons en

évidence le rôle de divers paramètres liés à la nature du pesticide et de la

biomasse.


5

� Dans la deuxième partie, sont présentés les efficacités épuratrices de deux types de

liqueur mixte : la première dégradant un effluent vinicole, la deuxième acclimatée à

un effluent viti-vinicole (mélange vin/pesticides). Grâce à ces essais, les conditions de

dégradation des produits phytosanitaires par la biomasse sont déterminées.

� La troisième partie décrit le dispositif d’autocontrôle mis en place pour mesurer

l’efficacité des procédés. Les expérimentations montrent l’effet inhibiteur des

pesticides sur l’activité métabolique (Adénosine-5-triphosphate (ATP)) des levures

Saccharomyces cerevisiae. Ces résultats permettent la mise en place d’un test

employé pour évaluer la dégradation des pesticides durant les différentes

expérimentations.

� La dernière partie s’intéresse à la mise en œuvre du procédé de dégradation des

effluents viti-vinicoles à l’échelle de pilote pour étudier conjointement

l’adaptation de la biomasse et l’élimination des produits phytosanitaires en

condition réelle.

La conclusion de ces travaux de thèse est réalisée au quatrième chapitre. Elle

permet une synthèse des principaux résultats obtenus lors de l’élaboration de ce

nouveau procédé en nous efforçant de mettre en perspective nos observations et les

conséquences pratiques qui pourraient en être tirées pour la gestion de ce dispositif

dans les exploitations agricoles. Enfin, les perspectives de ce travail seront

évoquées, en terme de complément d’expérimentations et d’utilisation future des

données acquises dans un objectif d’aménagement sur le terrain du procédé

d’épuration.

CHAPITRE I

SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

Partie bibliographique 1

6

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 1

Les produits phytosanitaires et leurs impacts environnementaux

Toutes les productions agricoles destinées à l’alimentation humaine ou animale ont

besoin d’être protégées contre les maladies et les attaques de ravageurs ou encore

contre la compétition des adventices. Les pertes de rendement des productions

agricoles dues aux maladies, aux ravageurs et aux adventices, peuvent représenter

jusqu'à 50 % dans certaines parties du monde (Asie, Afrique ou Amérique du sud)

(Oerke et Dehne, 1997). Depuis les années 90, la tendance semble être à la

stabilisation de la consommation en pesticides dans les pays développés et

particulièrement en France (Figure I.1). Ce phénomène est lié à l’évolution des

pratiques agricoles vis-à-vis des produits phytosanitaires : réglementation,

nouveaux produits sur le marché, mode de production raisonnée, …

Figure I.1. Tonnage des substances actives vendues en France entre 1999 et 2006 d’après UIPP (2007).

La viticulture consomme environ 50 % des produits phytosanitaires commercialisés

en France. En effet, c’est une culture pérenne et comme toute monoculture, elle est

favorable au développement de ravageurs et de champignons. Ainsi, le nombre de

produits phytosanitaires appliqués au cours d’une année oscille entre 7 et 33 selon

le mode de conduite de la vigne et la pression parasitaire de l’année (Thiollet,

2003). C’est pourquoi le secteur viticole prend en compte l’importance des

problèmes environnementaux provenant de leurs utilisations.


7

I.1.1. Les produits phytosanitaires : Caractéristiques Générales

I.1.1.1. Définition

Les produits phytosanitaires ou phytopharmaceutiques, appelés couramment

« pesticides », représentent toutes les substances chimiques utilisées pour

préserver les plantes cultivées.

Pour compléter cette définition, il est essentiel de rappeler que le terme produit

phytosanitaire désigne la substance active et les préparations commerciales

constituées d’une ou plusieurs substances actives. La substance active est la

molécule qui détruit ou empèche l’ennemi de la culture de s’installer. A cette

substance active, sont associés dans la formulation un certain nombre de formulants

(mouillants, solvants, anti-mousses,…) qui la rend utilisable par l’agriculteur.

En France, les produits phytosanitaires sont soumis à une réglementation pour leur

mise sur le marché. Pour ce faire, un dossier d’homologation doit être déposé

conformément à la Loi d’homologation du 22/12/72 du Ministère de l’agriculture.

L’homologation d’un produit se base sur l’évaluation de son efficacité, des risques

pour l’opérateur, le consommateur et l’environnement mais aussi sur l’identification

des produits de dégradation ainsi que des modalités de ces dégradations. Avant la

mise sur le marché, le dossier doit en particulier comporter des informations sur les

propriétés physico-chimiques de la substance active, les méthodes d’analyse, le

comportement dans l’environnement (sol, eau, air) et les éventuels effets

écotoxicologiques (Rivière, 2001).

Cette homologation nationale a été harmonisée au niveau Européen avec la

Directive Européenne 91/414/CEE du 15 juillet 1991, spécifiant les lois pour

l’évaluation du risque environnemental pour toute nouvelle substance active

phytosanitaire (Rivière, 2001).

Devant le nombre considérable de produits phytosanitaires homologués en France

(d’après l’IFEN (2003), plus de 400 matières actives autorisées entrant dans la

composition de quelques 6000 préparations commerciales), les fabricants et les

utilisateurs les classent suivant la nature de l’espèce cible : les fongicides, les

herbicides et les insecticides qui représentent à eux seuls 97 % des produits utilisés

(Figure I.2). A ceux-ci s’ajoutent les acaricides, les nématicides (contre les

nématodes), les rodonticides (contre les rongeurs), les taupicides (contre les


8

taupes), les molluscides (contre les limaces et les escargots), les corvicides et les

corvifuges (contre les oiseaux) et enfin les répulsifs.

Figure I.2. La répartition mondiale des produits phytosanitaires par catégorie en 2005 (UIPP, 2007).

Les Herbicides sont les pesticides les plus utilisés dans le monde toutes cultures

confondues (49 % du tonnage mondial en 2005). Ils permettent d’éliminer les

mauvaises herbes adventices des cultures. Ces herbicides sont dit de « pré-levée »

quand ils sont épandus avant la levée des adventices. Ces substances actives ont un

rôle antigerminatif ou racinaire et agissent au travers de leur persistance dans le sol

(ex : diuron, oryzalin,…). L’autre groupe d’herbicides est dit de « post-levée » car ils

agissent par contact après la levée des adventices (ex : gluphosinate

d’ammonium,…). Il est à noter que certaines substances actives agissent à la fois en

pré et post-levée des adventices (ACTA, 2004).

Les Insecticides sont destinés à détruire les insectes nuisibles et représentent 24 %

du tonnage mondial en 2005. Certains composés ont la propriété soit d’être toxique

par contact, soit de provoquer un empoisonnement rapide des insectes, car ils

traversent facilement leurs téguments cuticulaires.

Les Fongicides servent à combattre la prolifération des champignons

phytopathogènes et à lutter contre les maladies cryptogamiques qui causent de

graves dommages aux végétaux cultivés. Ces affections sont provoquées par

l’invasion des divers tissus des plantes par le mycélium de champignons

microscopiques. Les plus anciens fongicides connus sont des sels cupriques, le

soufre et certains de ses dérivés minéraux. Actuellement en France, ils sont les


9

moins utilisés en terme de tonnage pour l’ensemble des cultures mis à part en

viticulture. Par exemple, le cuivre et le soufre sont largement utilisés en viticulture

pour lutter contre le mildiou, l’oidium et botrytis. Les composés organiques

représentent la part la plus importante des fongicides commercialisés (Gavrilescu,

2005).

I.1.1.2. Caractéristiques chimiques

Les produits phytosanitaires sont composés de substances actives répertoriées selon

leur structure chimique, leur mode d’action et d’utilisation et leur interaction avec

l’environnement. Ils peuvent être principalement classés en considérant deux

critères : la classe chimique et l’organisme cible.

Les noms chimiques de ces molécules sont rarement courts et ne sont pas faciles

pour l’usage général, c’est pourquoi, les organismes de normalisation assignent des

noms communs aux substances actives. Actuellement, plus de 1000 de ces noms

officiels ont été assignés par l’Organisation Internationale de Normalisation (ISO), selon

un système établi dans la nomenclature (Gavrilescu, 2005).

L’identité d’une matière active pour déterminer la famille à laquelle elle appartient est

constituée :

- des propriétés physiques (température de changement d’état, solubilité,…),

- des propriétés chimiques (acidité, aptitude à subir l’hydrolyse,…),

- des propriétés organoleptiques (couleur, goût, activité toxique,…).

Les principaux groupes de molécules phytosanitaires employés en viticulture sont

présentés dans la Figure I.3. Les familles de molécules les plus utilisées, pour citer

quelques exemples, sont les carbamates (ex : le méritam zinc), les hétérocycles

azotés composés de plusieurs sous-familles comme les strobilurines (ex :

azoxystrobine), les amides (ex : folpel), les imides (ex : vinchlozoline), les

organophosphorés (ex : glyphosate) et les urées (ex : flufénoxuron). Les structures

chimiques de ces molécules sont différentes dans un même groupe (ex : les

hétérocycles azotés) aussi bien qu’entre les groupes. Les matières actives dans un

même groupe n’ont pas toutes la même toxicité et le même mode d’action. Ainsi,

dans la famille des carbamates, le mancozèbe est un fongicide, le molinate est un

herbicide et le carbosulfan est un insecticide.


10

Figure I.3. Classification des pesticides selon leur nature physico-chimique d’après ACTA, 2004.

I.1.1.3. Utilisation et mode d’action des produits phytosanitaires

Les substances actives ne sont jamais commercialisées à l’état pur. Que ce soit

individuellement ou, comme le plus souvent, en association, elles sont formulées

sous forme plus ou moins diluées (le mélange global contenant de 0,05 à 90 % de

matières actives) dans des spécialités commerciales qui renferment les adjuvants

(Fournier, 1989). Ces adjuvants sont de trois types :

� Les activateurs, qui amplifient l’activité de la matière active (tensioactifs,

mouillants, huiles,…) ;

� Les agents réduisant les pertes lors de l’épandage et le lessivage (les

épaississants, les moussants,…) ;

� Les produits de confort : ils rendent les manipulations plus aisées

(antimoussants, stabilisants d’émulsion ou suspension,…).

Les spécialités commerciales se présentent sous forme de formulations liquides

aqueuses ou non aqueuses (concentrés émulsionnables, concentrés solubles,

suspensions concentrées,…), de formulations sèches (poudres pour poudrage,

poudres mouillables, granulés sol,…) ou aérosols. Récemment, les fabriquants ont

développé de nouveaux types de formulations afin de limiter au maximum l’emploi

NON IONIQUE

Organo -Phosphorés

Chlorphyriphos éthyl Parathion

Fosetyl aluminium Glyphosate

Toluidines

Oryzalin Isopropalin Butraline

Pyrétrinoïdes

Alphamétrine Bifenthrine

Carbamates

Mancozèbe Molinate

Metirame-zinc Carbosulfan

Acide

Mecoprop Dicamba

Dichlorprop 2,4-D

IONIQUE

Basique

Atrazine Terbuthylazine

Hétérocycles Azotées

Amides/Amines

Dinocap Fluazinam

Spiroxamine Mefenoxam Cymoxanil

Folpel Isoxaben

Quinolèines

Quinoxyfène

Dérivées ac. cinnamiques

Diméthomorphe

Dodémorphe

Pyrimidines

Pyriméthanil

Pyroles

Cyprodinil Fludioxonil

Dérivées esters

Iprolicarbes Bupirimate

Strobilurines

Azoxystrobines Kresoxim methyl

ORGANIQUE

Cationique

Diquat Paraquat

Organo -Chlorés

DDT Lindane

Endosulfan Heptachlor

Urées

Flufénoxuron Isoproturon

NON ORGANIQUE PESTICIDES

Imides

Vinchlozoline Cinidon-ethyl Proximidone

Iprodone

Triazoles

Difénoconazole Penconazole

Produits minéraux

Soufre micronisé Sulfate de fer

Sulfate de cuivre Hydroxyde de cuivre


11

d’adjuvants organiques (solvants) et la formation de poussières (sachet dispersif),

et de diminuer les risques de pollutions générées par les emballages souillés.

Les produits phytosanitaires sont appliqués en fonction du type de formulation : le

plus souvent par pulvérisation sur les cultures, recouvrant ainsi les parties

aériennes des plantes et le sol, ou par incorporation dans le sol sous forme de

granulés. Les doses appliquées varient en fonction d’un nombre important de

facteurs tels que l’activité du produit, sa sélectivité, le type de culture et le stade de

croissance. Depuis l’évolution de la législation, des techniques agricoles et de la

chimie de synthèse, une réduction des doses en matières actives utilisées à

l’hectare a été observée. Pour exemple, des études menées depuis 2006 par la

Chambre d’Agriculture de Pyrénées Atlantiques ont mis en évidence une réduction

pouvant atteindre 50 % des doses de matières actives appliquées pour une

protection des cultures comparable : cette méthode est appelée « optidose »

(Chambre d’Agriculture, 2007).

L’application des traitements phytosanitaires peut être unique à un certain stade de

croissance de la culture ou bien fractionnée. Dans ce dernier cas, pour la vigne, les

traitements fongiques sont réalisés à plusieurs stades : pré et post-floraison,

formation de la grappe, pré et post-véraison. En 1993, pour le vignoble français, on

estime qu’une exploitation moyenne effectue environ 14 traitements phytosanitaires

dont 2 par des herbicides, 3 par des insecticides et 9 par des fongicides (Mietton-

peuchot, 2003).

Le mode d’action des produits phytosanitaires est fortement lié à leur nature. Ainsi

les herbicides ont deux types de comportement vis-à-vis des végétaux. Les uns de

contact demeurent sur les organes traités (ex : le diquat). D’autres se déplacent à

l’intérieur de la plante, ils sont dit systémiques (ex : le glyphosate, diuron). Leurs

modes d’action sont nombreux, par exemple, en bloquant les divisions cellulaires, la

photosynthèse ou en inhibant la biosynthèse des métabolites. Les insecticides,

administrés à l’insecte agissent principalement par perturbation de la transmission

de l’influx nerveux ou par inhibition de l’acétylcholinestérase. Enfin, les fongicides,

molécules chimiques les plus utilisées par la viticulture, agissent soit par action

directe par contact sur l’organisme visé (Botrytis cinerea,…) en troublant son

métabolisme (respiration, biosynthèse des métabolites,…), soit en stimulant les

défenses naturelles de la plante.


12

I.1.1.4. Origine et prévention de la pollution des eaux par les produits

phytosanitaires

En France, l’observation des produits phytosanitaires réalisée par l’Institut Français de

l’Environnement (IFEN) en 2000, portait sur 3000 points de surveillance des eaux

superficielles et souterraines (IFEN, 2003). Sur ces 3000 stations, 90 % de celles situées

sur des eaux de surface et 58 % de celles sur des eaux souterraines sont touchées par la

présence de pesticides. 148 pesticides différents sont retrouvés dans les eaux de surface

(sur 320 recherchés) et 62 dans les eaux souterraines (sur 292 recherchés). Au niveau

des cours d’eau, seuls 5 % des points présentent des concentrations compatibles avec le

développement sans risque de la vie aquatique et avec l’usage « eau potable ». Dans 40

% des cas, la présence de pesticides entraîne une qualité médiocre affectant de manière

plus ou moins importante la diversité biologique ou nécessitant des traitements

spécifiques d’élimination des pesticides, si ces ressources étaient utilisées pour

l’approvisionnement en eau potable. Seulement la moitié des prises d’eau superficielle

échantillonnées utilisées pour la production d’eau potable (56 %) présentent des teneurs

compatibles avec une distribution sans traitement spécifique aux pesticides (<0,1 µg.L-1).

La contamination des eaux par les produits phytosanitaires est généralement attribuée à

deux grands types de propagations : les pollutions diffuses et les pollutions ponctuelles.

Les pollutions diffuses sont liées à l’entraînement des produits phytosanitaires

épandus vers les eaux souterraines et de surface. Elles sont généralement limitées lors

d’une utilisation raisonnée des produits phytosanitaires. Le choix de produits moins

rémanents, de la réduction des doses par la méthode « optidose », de nouvelles

techniques culturales permettant de réduire le ruissellement diminueraient ce type de

pollution.

Les pollutions ponctuelles peuvent résulter des déchets générés par le nettoyage

interne et externe des instruments utilisés pour les traitements mais aussi d’une

mauvaise manipulation des produits lors de la préparation des bouillies. L’importance des

pollutions ponctuelles pour la contamination des eaux par les produits phytosanitaires a

été soulignée par de nombreuses études dont celle réalisée par l’Agence de l’Eau Seine-

Normandie. Cette étude menée durant 9 ans, et publiée en 1992, montre que plus de 75

% des pollutions sont de nature accidentelle. Ces pollutions résultent, pour l’essentiel,

d’une mauvaise manipulation des produits lors de la préparation de bouillies, lors de la

vidange et du rinçage du matériel de pulvérisation et seraient à l’origine de la majorité

des pollutions dues aux produits phytosanitaires (Figure I.4).


13

Figure I.4. Principales causes de pollutions ponctuelles (Agence de l’Eau Seine-normandie, 1992).

La réduction des pesticides dans l'eau, le sol, l'air est un objectif que se fixe

l'ensemble du monde agricole. L'effort a porté sur les conditions d'emploi des

produits et il vise notamment à limiter les risques de transfert dans

l'environnement.

Le principe de base des Bonnes Pratiques Agricoles (BPA) phytosanitaires est

d'utiliser le produit approprié, à la bonne dose, au bon moment et appliqué

correctement (UIPP, 2003). De plus, elles impliquent l'aménagement d'un local de

stockage, d'une aire de remplissage et de nettoyage du matériel de pulvérisation.

Ces recommandations générales sont définies par le CORPEN (Comité d'Orientation

pour la Réduction de la Pollution des Eaux par les nitrates, les phosphates, et les

produits phytosanitaires provenant des activités agricoles) et sont relatives aux

techniques d'application et de manipulation des produits phytosanitaires.

Ainsi, malgré une réglementation européenne et nationale de plus en plus complète,

des problèmes environnementaux persistent. Ces derniers sont étroitement liés à la

gestion et à l’utilisation de ces produits dans tous les systèmes de culture.

M auvaise manipulat io n de la bo uillie

46%

R enversement de la cuve

ple ine4%

Vidange du pulvérisa teur et lavage du

matérie l17%

M auvaise gest io n desemballages

18%

A utres15%


14

I.1.2. La dégradation des produits phytosanitaires

Les caractéristiques physico-chimiques pour étudier le devenir et la dégradation d’un

pesticide dans l’environnement sont :

� Au niveau physique :

La pression de vapeur saturante renseignant sur la volatilité d’un produit et la solubilité

dans l’eau à une température donnée.

� Au niveau chimique :

Les états ioniques (cationique, anionique, basique ou acide), les caractères

hydrophile/hydrophobe et la réactivité chimique, photochimique et biologique.

I.1.2.1. Généralités

Les propriétés intrinsèques des produits phytosanitaires (solubilité, volatilité,

polarité) et les conditions du milieu dans lequel ils se trouvent sont déterminantes

pour expliquer leurs comportements dans l’environnement.

Après l’application des pesticides, les molécules phytosanitaires lorsqu’elles

n’atteignent pas leur cible, se retrouvent dans l’environnement où elles subissent

trois processus majeurs : l’absorption, la dispersion (entraînement du produit par

ruissellement,…) ou la dégradation par des mécanismes complexes de

transformation. Les pesticides peuvent être dégradés par différents

processus (Johnson et al., 2003 ; Muszkat et al., 2002 ; Zertal et al., 2005):

photochimique, chimique et biologique. Le Tableau I.1 présente l’importance des

propriétés chimiques, physiques et structurelles qui influencent le pouvoir de

dégradation d’un composé organique (Boetther et Nyer, 2001).


15

Tableau I.1. Propriétés chimiques, physiques et structurelles influençant la dégradation d’un pesticide

(Boetther et Nyer, 2001).

DEGRADABILITE PROPRIETE

FACILEMENT DIFFICILEMENT

Solubilité dans l’eau Soluble insoluble

Taille moléculaire Petite Moyenne à grande

Groupes fonctionnels Peu Beaucoup

Nature chimique Molécule biologique Molécule créée par l’homme par voie

pétrochimique

Forme aliphatique chaînes droites jusqu'à 10 C.

un ou deux groupements aromatiques

alcanes de hauts poids moléculaires.

Chaînes ramifiées.

Hydrocarbures polyaromatiques.

Substitution sur les

groupements aromatiques -OH,-COOH,-CHO,-CO,-OCH3,-CH3 -F,-Cl,-NO2,-CF3,-SO3H,-NH2

Position de substitution sur

les groupements

aromatiques

Position para Position méta, ortho

Fonctions chimiques Alcools,aldéhydes, acides, esters,

amides

Alcanes, oléfines, éthers, cétones, acide

carboxilique, nitrile, chloroalcanes

I.1.2.2. Photodégradation

La photodégradation est la transformation chimique des pesticides en petits

métabolites par l’absorption du rayonnement lumineux (ultra-violet, infra-rouge,…)

et peut se produire sur les parties aériennes des végétaux, à la surface du sol et

dans l'air. La dégradation photochimique (photolyse) correspond à l’énergie radiante

des photons brisant les liaisons chimiques d'une molécule.

La photolyse directe implique l’absorption directe des photons par la molécule. La

photolyse indirecte implique l’absorption de l'énergie par une molécule contenue

dans une autre molécule qui a absorbé les photons. La cinétique de la réaction

dépend de l’énergie fournie pour casser les liaisons chimiques, de l’intensité

disponible et de la présence de composés intermédiaires de photolyse. La photolyse

est fonction du temps et de l’intensité d’éclairement des particules dissoutes et de la

concentration de la solution.

Tous les pesticides sont susceptibles d’être photodégradés. Les facteurs influençant

la photodégradation des pesticides sont (Gavrilescu, 2005) :

� L’intensité lumineuse,

� Le temps d’exposition,

� La méthode d’application,

� Les propriétés chimiques du pesticide.


16

L'étude du mécanisme de la photolyse des pesticides labiles est importante car elle

donne des informations de base sur leur devenir et leur persistance dans

l’environnement naturel lorsqu’ils sont notamment exposés à l’action de la lumière

du soleil (Kamiya et Nakamura, 1995). La photodégradation des molécules

phytosanitaires modifie les fonctions aromatiques (Tanaka et al., 1997 ; Faure et

Boule, 1997 ; Muszkat et al., 2002). L’étude de la phototransformation des

pesticides s’est portée sur des familles de molécules particulières:

� les urées substituées (Diuron, Monuron,…) (Tanaka et al., 1997 ; Jirkovsky et

al., 1997),

� les organophosphorés (Disulfoton, Pyrimiphos éthyl, Parathion,…) (Kamiya et

Nakamura, 1995 ; Guillard et al., 2001 ; Zamy et al., 2004),

� les imides (Vinchlozoline,…) étudiés seulement depuis quelques années

(Zertal et al., 2005).

Les pesticides qui sont appliqués sur les végétaux ou qui restent à la surface du sol

sont plus susceptibles d’être photodégradés que ceux pénétrant dans les sols. Par

ruissellement ou lessivage, les pesticides retrouvés dans les sols sont

majoritairement dégradés par voie chimique ou biologique.

I.1.2.3. Dégradation chimique

La dégradation chimique ou dégradation abiotique se produit par des réactions

incluant l’hydrolyse, l’oxydo-réduction et l’ionisation (Beltran et al., 2001). Les

réactions d'hydrolyse sont catalysées par la présence d'hydrogène ou d’ion

hydroxyde, d'où un taux de réaction fortement dépendant du pH (Gravilescu, 2005).

Ces réactions changent la structure du composé réagissant et peuvent modifier ses

propriétés. Selon les cas, le nouveau composé formé peut être plus ou moins

toxique. Différents auteurs ont défini plusieurs familles chimiques qui sont

susceptibles d’être hydrolisées, comme par exemple les amides (Morrica et al.,

2004 ; Kwon et al., 2004), les urées substituées (Sarmah et al., 2000), les

organophosphorés (Greenhalgh et al., 1980) et les organochlorés, ect…

La possibilité d'oxydation-réduction est un indicateur important car il permet de

définir l'état de l'oxydation et la structure chimique de la molécule phytosanitaire.

Le potentiel d’oxydo-réduction influence fortement les activités microbiennes et

donc la biotransformation ou la biodégradation des produits chimiques. Ainsi, des


17

micro-organismes présents dans des boues activées peuvent réduire le parathion en

aminoparathion par oxydation chimique (Laplanche, 1981). Les réactions d’oxydo-

réduction sont très lentes et certaines peuvent être catalysées par les ions

métalliques (Gavrilescu, 2005). Les réactions de réduction sont dépendantes du pH

et de l’évolution de la réduction. Par exemple, le deséthyl-atrazine et le deséthyl-

terbutylazine, deux produits de dégradation subissent en milieu suffisamment acide

une réaction d’oxydo-réduction produisant des ions chlorures. Cette réaction dépend

du pH et de la forme protéonique de ces composés (Colombini et al., 1998).

Les composés organiques, comme les pesticides, de nature acide ou basique

peuvent être affectés fortement par la concentration en ion (H3O+ et OH-) de l'eau.

Depuis les années 90, de nombreux pesticides sont utilisés à des concentrations très

faibles et sont des acides ou bases faibles. Ils ont une influence négligeable sur la

valeur du pH de l'eau. Cependant, le pH du solvant peut modifier la solubilité,

l’adsorption, la concentration et les caractéristiques toxiques. Par conséquent,

comme un toxique peut être ionisé par des conditions environnementales

spécifiques, les propriétés physiques et la réactivité chimique changeront avec le pH

(Mills et al., 1985).

I.1.2.4. Dégradation biologique

Le terme de dégradation correspond à la destruction d'une substance organique en

produits minéraux simples tels que l'eau, l'hydrogène, le gaz carbonique ou en

composé organique simple tels que le méthane et d'autres produits de fermentation.

La biotransformation est un processus complexe passant par des étapes

intermédiaires qui peuvent conduire à la formation de métabolites plus toxiques que

le produit initial.

La transformation des produits phytosanitaires par voie biochimique est

particulièrement importante par le fait que des micro-organismes vivants disposent

d'un ensemble d'enzymes, qui agissent comme un catalyseur des réactions de

catabolisme de nombreuses matières actives. La voie de dégradation la plus directe

(voie métabolique) peut amener le micro-organisme à utiliser la matière active

comme source d'énergie et de carbone, mais ce phénomène reste limité dans le cas

des pesticides. En réalité, la dégradation complète d'un pesticide se fait rarement

par un micro-organisme unique car il est en effet peu probable qu'un seul micro-

organisme possède toutes les enzymes nécessaires à cette minéralisation. La

dégradation biologique des produits phytosanitaires a été particulièrement étudiée


18

sur les différentes strates du sol et principalement dans la couche arable qui peut

contenir jusqu'à 109 germes par gramme de sol (Soulas et Fournier, 1978). Le sol

est composé d'une microfaune bactérienne et fongique qui est impliquée dans tous

ces mécanismes de dégradation.

Mécanismes de la dégradation

La capacité de certains micro-organismes à dégrader des pesticides peut avoir

plusieurs origines. En premier lieu, elle peut résulter de la présence chez les micro-

organismes d’un système enzymatique capable de catalyser une ou plusieurs étapes

de la dégradation d'une molécule. Ainsi Gravrilescu (2005) a montré que les

principaux mécanismes du métabolisme microbien des pesticides sont : l’oxydation,

la réduction et l’hydrolyse. L'oxydation est l’une des réactions les plus importantes.

Les enzymes impliquées dans la biodégradation sont des oxygénases, des

hydrolases, des péroxydases et des lactases qui peuvent fonctionner de façon

combinée (Bollag, 1982 ; Topp et al., 1997).

Des phénomènes de sélection de certaines souches pour leurs résistances à un

xénobiotique peuvent aussi intervenir. Mais, la capacité d'un organisme à dégrader

un produit peut aussi être liée à l'acquisition par la souche de caractères génétiques

nouveaux (Barik et Munnecke, 2003). Les principaux mécanismes de transfert

génétique sont la conjugaison, la transduction et la transformation. L’activation ou

l'acquisition par un micro-organisme d'un nouveau gène lui permet d'assurer la

dégradation totale d'un produit qui ne se transformait que partiellement, ce qui lui

donne un avantage écologique important.

Les gènes responsables de la dégradation des pesticides sont souvent portés par des

plasmides (kumar et al., 1999). En fonction de la nature du pesticide, on est amené

à distinguer deux comportements type chez les micro-organismes dégradant ces

substances : un comportement dit « métabolique » et un comportement dit « co-

métabolique ».

� Le comportement métabolique

Il correspond à la capacité pour un même micro-organisme de dégrader

complètement une partie ou la totalité d'une même molécule de pesticides en

assurant ainsi à la fois l'élimination du toxique et sa propre croissance à partir de

l'énergie et des éléments nutritifs. C’est le cas du champignon Aspergillus niger


19

(présent naturellement dans les sols) qui minéralise l’endosulfan, pesticide

organochloré (Bhalerao et Puranik, 2007).

� Le comportement co-métabolique

Ce comportement microbien explique la dégradation de la plupart des pesticides

actuellement commercialisés. Certaines souches microbiennes incapables d'assurer

à elles seules l'ensemble des étapes métaboliques conduisant à la dégradation totale

d'un produit sont cependant susceptibles d'intervenir dans certaines phases de la

transformation (Abdelhafid et Calvet, 1998). Lorsqu'elles peuvent assurer les

premières étapes de celle-ci, il y a presque toujours une disparition de l'effet

biologique initial du produit. Cependant, il y a alors un risque d'accumulation de

produits intermédiaires éventuellement toxiques pour certains organismes non

ciblés. Heureusement, le plus souvent, d'autres souches microbiennes sont alors

capables de poursuivre la transformation jusqu'à la destruction totale de la molécule

(Schrijver et De Mot, 1999 ; Pietro et al., 1992).

Influence des facteurs environnementaux

Des facteurs liés à l'environnement et aux caractéristiques propres du pesticide

peuvent influencer sa dégradation (Topp et al., 1997). Malgré le fait que les

différents facteurs puissent interagir entre eux, leurs effets sont généralement

considérés individuellement.

Il existe différents paramètres influençant la dégradation des pesticides :

� la nature du sol (structure, texture, flore microbienne, oxygénation, matières

organiques),

� la teneur en eau. L'eau est un solvant pour le pesticide et est essentielle pour

son transport dans la cellule,

� la température (optimale entre 20 et 30 °C). L'activité de la microfaune est le

résultat d'un ensemble de réactions enzymatiques dont les cinétiques sont

modifiées par la température (Krieger et al., 2000). Au-delà d'un certain

seuil, la température peut avoir un effet défavorable et au-dessus de 50° C,

la plupart des germes ne peuvent plus se développer,

� Le pH peut conditionner l'activité de la microfaune en agissant sur l'état

d'ionisation des enzymes, modifiant ainsi leur affinité pour le substrat (Hundt

et al., 1998).


20

Les caractéristiques physico-chimiques des molécules phytosanitaires peuvent

influencer leurs dégradations. La structure chimique d'un pesticide détermine son

comportement physique, sa toxicité, et sa valeur nutritive pour les micro-

organismes capables de le dégrader (Lal, 1983).

I.1.3. La stratégie française en matière de réduction de la pollution par les produits

phytosanitaires

La stratégie française est fondée sur une démarche combinée de prévention et

d'action contre les contaminants. Elle focalise son attention sur la recherche de la

protection des personnes et des milieux susceptibles d'être exposés vis-à-vis de

l'ensemble des produits phytosanitaires. Elle évalue les risques de pollutions diffuses

ou accidentelles, en vue de mettre en oeuvre des programmes basés sur la

prévention des pollutions ponctuelles et diffuses (pratiques agricoles raisonnées,

choix de produits moins toxiques, dispositifs de protection,…), le renforcement de

l’aspect réglementaire et la gestion des toxiques dont le traitement des effluents

agricoles.

I.1.3.1. La réglementation

Les produits phytosanitaires ne peuvent être mis sur le marché qu'après l'obtention

d'une autorisation de vente. Cette dernière n'est accordée que si le produit respecte

les exigences strictes contenues dans la directive 91/44/CEE entrée en vigueur en

1993. Ainsi, c'est aux industriels que revient la responsabilité de préciser les

conditions agricoles, phytosanitaires et environnementales spécifiques dans lequel le

produit peut être utilisé ou doit être utilisé (article 16, directive 91/44/CEE) (Klein

et Goedicke, 1993).

En France, jusqu'en 2006, la réglementation sur les produits phytosanitaires faisait

essentiellement référence au code de la santé publique et au code de

l'environnement. Par exemple, selon le Décret 89/3 de janvier 1989 découlant de la

Directive 80/778/CEE de juillet 1980 relatif aux eaux destinées à la consommation

humaine, les pesticides et les produits apparentés, tels que les insecticides

organochlorés persistants, organophosphorés et carbamates, les herbicides, doivent

avoir des valeurs de concentration inférieure ou égale aux valeurs de référence. Ces

références de qualité sont les suivantes : 0,1 µg.L-1 par substance individuelle (sauf

pour quatre d'entre elles : l’aldrine, la dieldrine, l’heptachlore et l’époxyde


21

d’heptachlore, pour lesquelles la limite applicable est de 0,03 µg.L-1, ce qui

correspond à la valeur guide de l’OMS) et de 0,5 µg.L-1 pour le total des pesticides

quantifiés.

De même, dans le but d'optimiser la surveillance de la qualité des eaux de captage,

la Loi sur l'eau (directive 98/83/CE) a mis en place des périmètres de protection des

captages d'eau potable. L'article 216/6 du code de l'environnement interdit le rejet

dans les cours d'eau de toute substance pouvant entraîner des effets nuisibles sur la

santé et des dommages sur la faune et la flore. Ce dispositif réglementaire est

complété par une série d'Arrêtés (432/2, 212/1 à 7 du code de l'environnement).

En matière de gestion des déchets phytosanitaires, la Directive 91/689/CEE du 12

décembre 1991 relative aux déchets dangereux inclue les déchets constitués de

produits phytopharmaceutiques (ou phytosanitaires). Ces déchets sont d'ailleurs

considérés comme Déchets Industriels Spéciaux (DIS). Il est donc formellement

interdit d'abandonner des déchets (emballages souillés, ...) dans le milieu naturel

ou de procéder à leurs brûlages à l'air libre. En ce qui concerne les emballages de

produits phytosanitaires, la société ADIVALOR (agriculteurs, distributeurs,

industriels pour la valorisation des déchets agricoles) prend en charge leurs

collectes, leurs valorisations et leurs éliminations.

Depuis le 12 septembre 2006, L’arrêté relatif à la mise sur le marché et à l’utilisation des

produits visés à l’article L 253-1 du code rural, fixe une réglementation sur l’utilisation et

le rejet des pesticides. Cela concerne les dispositions relatives à l’utilisation des produits,

à la limitation des pollutions ponctuelles, aux zones non traitées au voisinage des points

d’eau, et aux conditions à respecter pour l’épandage, la vidange et le rinçage du matériel

de pulvérisation. La dernière partie, décrit les dispositions relatives aux procédés de

traitement des effluents phytosanitaires et en particulier les modalités pour qu’un

procédé puisse être inscrit dans la liste des systèmes autorisés (n°219 Bulletin Officiel du

Ministère de l’écologie et du développement durable ; Annexe 1).

I.1.3.2. Réduction et récupération des volumes d’effluents

Depuis la parution en 2000 du Référentiel Production Intégrée du raisin par l’ITV

(Institut de Technologie de la Vigne), la démarche « production raisonnée » se

développe dans l'ensemble des régions viticoles (Rochard et al., 2001). La limitation

de l'impact environnemental des produits phytosanitaires passe par l'adaptation des

pratiques viticoles. Dans le cadre de la protection intégrée des cultures, la


22

viticulture s’oriente vers un mode de production qui associe à la fois des traitements

ciblés et basés sur une observation de la parcelle. En parallèle, la pratique du

rinçage à la parcelle se développe et est soutenue par les structures institutionnelles

(Rochard et al., 2001). Le rinçage à la parcelle en fin de traitement phytosanitaire

entre dans le cadre des Bonnes Pratiques Agricoles (BPA). Cette pratique préconisée

par les organismes institutionnels, tels que le CORPEN, consiste à diluer le volume

résiduel de bouillie phytosanitaire avec un volume d’eau au moins égal à 10 % du

volume nominal de la cuve ou au moins égal à cinq fois le volume résiduel diluable.

Le volume obtenu est ensuite pulvérisé sur une parcelle déjà traitée ou sur une zone

enherbée éloignée des points d'eau. Pour un fonds de cuve de 5 litres et un rinçage

en deux étapes les quantités résiduelles de produits peuvent être divisées par 200

(Debuissons, 2003).

La construction d'une aire de remplissage, de lavage et de collecte des effluents de

produits phytosanitaires est fortement recommandée. Il s'agit d'une surface

bétonnée située à proximité du local de stockage des produits phytosanitaires et à

l'écart des habitations ou des points d'eau. En amont de la cuve de collecte, un

dégrillage est réalisé au niveau du regard. Un déshuileur couplé à un dessableur doit

également être mis en place afin de retenir les hydrocarbures, les fractions de terre

et les débris végétaux éventuels présents sur le tracteur. Les déversements de

produits sur l'aire de lavage (effluents) sont collectés dans la cuve. Le volume de la

cuve est fonction du type de pulvérisateurs employés, du nombre de rinçages

effectués et du volume d’eau employé qui peut être très variable (10 à 30 L). La

cuve de stockage des effluents peut être reliée à un système de traitement. En

général, on peut considérer 0,2 à 0,3 m3 d’effluent par ha de vigne et par an

(Mietton-Peuchot, 2003).

I.1.3.3. Le traitement des effluents phytosanitaires

La dernière partie de l’arrêté du 12 septembre 2006 du Bulletin Officiel du Ministère de

l’écologie et du développement durable (Annexe 1) décrit les dispositions relatives aux

procédés de traitement des effluents phytosanitaires et en particulier les modalités pour

qu’un procédé puisse être inscrit dans la liste des systèmes autorisés. Actuellement, dans

le cas de la procédure, plusieurs procédés sont validés par le Ministère de l'écologie et du

développement durable pour le traitement des effluents phytosanitaires.


23

Le Tableau I.2 présente la liste des procédés de traitement des effluents phytosanitaires

validés. Les dispositifs d'épuration reposent sur trois principes de base :

� Destruction par incinération d'un concentrat obtenu par coagulation

floculation, par filtration et, ou osmose inverse,

� Dégradation des matières actives phytosanitaires par oxydation avancée,

� Dégradation biologique des molécules.

Tableau I.2. Liste des procédés de traitement des effluents phytosanitaires reconnus comme efficaces

par le MEDD (BO du Ministère de l'Ecologie du Développement Durable, 15 mars 2007).

Nom du

procédé

Détenteur

Types

procédés

Pré-

traitement utilisation

mise en

place Validation

Limite

d'efficacité

Déchets dangereux

générés

Durée de

traitement

minimum retenu

PHYTOPUR®

Michael

Paetzold

Osmose

inverse Oui

Viticulture

arboriculture

Propre ou

prestations 5 ans 2°<T° opt <45°

Boues de

prétraitement

membranes et filtres

500 à 650 l/h

SENTINEL®

Alba

environnement

(Distributeur

pour WMEC)

Floculation Oui Viticulture

arboriculture

Propre ou

prestations 5 ans

Concentration en

substances

actives < 0,5 %

Filtres et boues de

traitement 100 à 500 l/h

BF BULLES®

Alpha-o Filtration Oui Viticulture

Propre ou

prestations 5 ans

Ne pas apporter

des effluents

concentrés

Boues de

prétraitement et filtre 1000 ou 1800 l/h

PHYTOCAT®

Résolution

Photo

catalyse Oui

Viticulture

cultures

légumières

ZNA

Propre ou

prestations

5 ans (après

un an suivi

écotox)

Tenir hors gel Filtres et papiers

usagés 15 jours (0,5 m3)

PHYTOMAX®

Agro

Environnement

SA

Photo

catalyse Oui

Viticulture

arboriculture

Propre ou

prestations

5 ans (après

un an suivi

écotox)

Tenir hors gel

Boues de

prétraitement filtre et

papiers usagés

30 jours

PHYTOBAC®

Bayer

Cropscience

Lit

biologique Non

Toutes

cultures

ZNA (zone

non agricole)

Propre 5ans Pas d'apport

massif

Hydrocarbures, débris

végétaux et fractions

de terre issues du

prétraitement si

nécessaire

5 mois de

maturation sans

aucun apport

ADERBIO

STBR2®

Aderbio

Développement

Biologique Oui Viticulture

Arboriculture Propre

5 ans

(après un an

suivi écotox)

Ne pas apporter

des effluents

concentrés

Boues de traitement 30 jours

(continu)

VITIMAX®

Agro

environnement

SA

Biologique

boues

activées

Oui Viticulture Propre 5 ans

Pas d'apport

massif nuisible à

la vie

microbienne

Boues de

prétraitement

Une saison, hors

période activité

vinicole


24

Les procédés basés sur la concentration des produits phytosanitaires utilisent des

floculants et/ou des coagulants dans la cuve de stockage de l'effluent pour éliminer

les matières en suspension. Les boues issues de ce prétraitement sont récupérées et

sont traitées par incinération en centres agréés comme Déchets Industriels Spéciaux

(DIS).

Le surnageant obtenu après prétraitement est récupéré pour être épuré par un

procédé complémentaire:

� Filtration SENTINEL® et BF BULLES® : ces deux procédés utilisent du

charbon actif comme adsorbant. Il s'agit d'un transfert d'une phase liquide

contenant l'adsorbat (pesticides) vers une phase solide avec rétention des

solutés à la surface du charbon actif appelé adsorbant. En traitement de

finition du traitement des effluents viticoles, l’adsorption sur charbon actif

permet d’éliminer les concentrations résiduelles en produits phytosanitaires

(Mietton-Peuchot, 2003). Le concentrat de produits phytosanitaires est

évacué en DIS.

� l'osmose inverse PHYTOPUR® est une technique qui consiste à utiliser une

membrane semi-perméable au travers de laquelle, sous l’effet d’une différence de

pression les molécules d’eau diffusent tandis que la plupart des corps dissous

comme les pesticides sont retenus (Mietton-Peuchot, 2003).

Les procédés de dégradation physico-chimiques sont essentiellement des

traitements par oxydation chimique avancée. L'ensemble des technologies

d'oxydation chimique avancée reposent sur la formation de radicaux hydroxyles. Ces

derniers constituent une espèce chimique très réactive capable de transformer des

polluants organiques en composés minéraux. Les procédés d'oxydation avancée

pour le traitement des eaux de rinçage des pulvérisateurs sont des techniques

chimiques et photochimiques reprenant les phénomènes observés dans

l'environnement (Alliot et al., 2000). Les deux procédés actuellement validés par

l'arrêté sont PHYTOCAT® et PHYTOMAX® basés sur le principe de la photocatalyse.

Elle est fondée sur l'absorption de rayonnements ultraviolets par un semi-

conducteur en dioxyde de titane incorporé dans un média solide sur lequel ruisselle

l’effluent. En retournant à son état initial, le semi-conducteur fournit l'énergie

nécessaire à la dégradation des polluants organiques (Rochard et al., 2001).


25

Les procédés de dégradation biologiques sont basés sur la capacité des micro-

organismes à dégrader naturellement des molécules organiques. Actuellement, il

existe trois procédés biologiques validés, qui sont :

� Le biobac, appelé également biobed ou PHYTOBAC®, est basé sur le pouvoir

épurateur du sol. L'épuration intervient dans un bac étanche dans lequel est

introduit un mélange de terre, de tourbe et de paille maintenu en conditions

aérobies. Ce dispositif permet l’immobilisation ou la dégradation des

substances actives par des micro-organismes naturellement présents dans les

différents éléments introduits (Alliot et al., 2000). Le sol (terre de surface)

est riche en éléments nutritifs, la tourbe permet l'apport de bactéries et la

paille broyée sert de substrat carboné pour les micro-organismes (Rochard et

al., 2001).

� La station de traitement biologique aérobie en milieu liquide dénommée

STBR2® dégrade les effluents phytosanitaires à l’aide d’une biomasse

bactérienne spécifique. Les micro-organismes fournis sous forme lyophilisée

sont mis en culture et mélangés à l'effluent à traiter (ECOPULVI, 2003).

� Le système VITIMAX® est un procédé d'épuration par boues activées. Le

traitement est suivi d'une décantation à partir de laquelle les boues sont

renvoyées dans le bassin d’aération (Rochard et al., 2001). Le procédé a pour

principe de traiter les effluents phytosanitaires grâce aux boues activées des

unités d’épuration vinicoles. Dans le domaine des effluents vinicoles,

l’appellation « boues activées» traduit essentiellement une forte charge

volumique mais ne correspond pas aux valeurs conventionnelles de forte

charge massique. En effet, les concentrations de boues atteintes après

quelques semaines dans les bassins sont suffisamment élevées (5 à 10 g

MES.L-1) pour maintenir les charges massiques à des valeurs inférieures à

0,35 kg DBO5.MVS-1.j-1, et le plus souvent aux environs de 0,25 kg

DBO5.MVS-1.j-1. La pollution engendrée par les caves vinicoles a un caractère

saisonnier très marqué: forte pointe lors des vendanges, activité soutenue

jusqu’en janvier-février, et très peu de rejets de mai à août. C’est pendant la

période de faible rejet que la station d’épuration est utilisée pour traiter les

effluents phytosanitaires. Les procédures de validation de ce système se sont

effectuées à la même période que le travail de recherche présenté (validation

en mars 2007).


26

I.1.3.4. Le contrôle de l’épuration

Pour les effluents phytosanitaires traités par un des procédés décrits, des analyses

écotoxicologiques sont demandées avant d’autoriser le rejet dans le milieu naturel.

Le terme « écotoxicologie » a été introduit par Truhaut en 1969 et était dérivé des mots

«écologie» et «toxicologie». Jusque-là, les études de toxicologie environnementale

concernaient principalement les effets néfastes des toxiques sur l’homme.

L’écotoxicologie prend ainsi en compte les effets des produits chimiques dans le contexte

de l’écologie. Un test écotoxicologique est un essai expérimental déterminant l’effet d’un

ou de plusieurs produits sur un groupe d’organismes sélectionnés, dans des conditions

bien définies (Keddy et al., 1994).

Ces tests utilisent différents outils pour mesurer la toxicité d’un produit. Le moyen le plus

communément utilisé est la mesure de la mortalité ou de la reproduction, mais il y a un

intérêt croissant dans l’utilisation de paramètres plus sensibles. Les effets biochimiques,

physiologiques, reproductifs et comportementaux peuvent aussi apporter des mesures de

la toxicité. La plupart des tests de toxicité apportent une estimation de la dose de

matières toxiques qui affecte 50 % de la population.

Les mesures les plus communes sont la EC50, c’est-à-dire la concentration en toxique qui

engendre un effet à 50 % par rapport au témoin, ainsi que la NOEC « No Observed Effect

Concentration », la concentration de toxique maximale qui ne cause pas d’effet. Si les

tests sont effectués sur des « end points » autre que la mortalité, par exemple sur le

poids ou les réserves énergétiques, alors on définit une EC50. L’EC50 est la concentration

de polluant affectant 50 % de la population. En outre, selon le plan expérimental et les

concentrations de toxique choisies, d’autres valeurs peuvent être utilisées, comme la ECx

(avec x=20 par exemple). Ces termes sont illustrés sur la Figure I.5.


27

Figure I.5. Courbe dose-réponse d’un polluant des tests écotoxicologiques.

Ces tests de toxicité ou bioessais, demandés par l’Arrêté du 12 septembre 2006 se

réalisent sur une durée très courte (par rapport au temps de génération de l’organisme).

Ils impliquent généralement des concentrations élevées du polluant : De ce fait, les effets

à long terme des faibles concentrations ne sont pas mis en évidence. En effet, pour

exemple, l’EC50 du Diuron obtenu avec le test de bioluminescence de Vibrio fisheri (30

minutes) est 10 fois plus élevé que l’EC50 obtenu avec le test d’inhibition de la mobilité de

Daphnia magna (24 heures).

Les tests les plus utilisés en milieu aquatique et validés par l'arrêté du 12 septembre

2006 relatif à la mise sur le marché et à l’utilisation des produits phytosanitaires sont :

o Inhibition de la mobilité de Daphnia magna (norme NF ISO 6341)

Daphnia magna est un crustacé vivant à l'état naturel dans des points d'eau douce

stagnante. Ce micro-organisme se nourrit de phytoplancton et zooplancton en filtrant

l'eau. Le test est réalisé sur produit liquide ou lixiviat frais, en condition contrôlée (à

20°C). On mesure à 24 heures le taux d'immobilisation d'une population de Daphnia

magna pour différentes concentrations du produit étudié dans le milieu de culture. Le test

comprend un essai préliminaire et un essai définitif. La sensibilité du matériel biologique

est contrôlée par un test au dichromate de potassium qui permet de calculer une

immobilisation corrigée tenant compte de l'état physiologique de la population de

Daphnia magna. Les résultats sont donnés sous la forme d’EC50 qui est la concentration

en substance active efficace pour l'immobilisation de 50 % d'un lot de Daphnia magna

soumis au test pendant une période d'exposition déterminée (24 heures).

NOEC EC20 EC50

Concentration en polluant

Effe

t su

r le

s m

icro

-org

anis

me

s e

n %

0

20

50


28

o Inhibition de la croissance de Pseudokirchneriella subcapitata (norme NF

ISO 8692)

On utilise l'algue Pseudokirchneriella subcapitata en phase exponentielle de croissance,

en présence d'éléments nutritifs, sous lumière blanche continue et dans un milieu agité à

23 °C. Les concentrations testées sont définies par un essai préliminaire conduit en 48 ou

72 heures. Au bout de 72 heures, l'inhibition de la croissance est mesurée.

I.1.4. Conclusion

Dans le cadre de la viticulture intégrée, une gestion optimale des reliquats et des

eaux de rinçage de pulvérisation s'est avérée obligatoire suite à l'Arrêté du 12

septembre 2006 du Ministère de l'écologie et du développement durable.

L'adaptation et la gestion de la pulvérisation peuvent permettre de réduire à la source

des déchets de produits phytosanitaires. Cependant, compte tenu des spécificités

viticoles, il a été développé différents concepts d'aires de lavage associés à des

traitements d'épuration. Le traitement des produits phytosanitaires a pu être envisagé

car les molécules développées par les firmes sont de plus en plus biodégradables.

En effet, les propriétés intrinsèques des produits phytosanitaires (solubilité, volatilité,

polarité) sont des facteurs clés pour leurs dégradations chimique et biologique. Pour

certaines molécules, ces mécanismes de dégradation ont été largement étudiés dans le

milieu naturel.

Des procédés physico-chimiques homologués peuvent permettre l’élimination des

pesticides : la coagulation-floculation est utilisée en prétraitement pour limiter les

concentrations du traitement ultérieur ; l’osmose inverse permet la concentration des

résidus et la photocatalyse est un procédé de dégradation des matières actives

organiques.

Une des alternatives à ces procédés est l’utilisation de procédés biologiques (biomasse

spécifique ; biobed) ou boues activées qui sont plus respectueux de l'environnement et

moins coûteux en énergie.


29

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE 2

Traitement biologique par boues activées

I.2.1. Généralités

I.2.1.1. Description du procédé par boues activées

La Figure I.6 présente schématiquement le procédé d'épuration par boues activées.

Le réacteur biologique aérobie ou bassin d'aération contient les micro-organismes

qui assurent l’épuration. Des bactéries, des protozoaires, parfois des champignons,

des rotifères et des nématodes constituent essentiellement la microfaune, appelée

communément boues activées. Les bactéries constituent le groupe le plus important,

responsable principalement de l'élimination de la pollution et de la formation de

petits amas appelés flocs. Le mélange d'eau usée et des flocs bactériens est

nommée liqueur mixte. L'air fourni au niveau du bassin permet l'apport d'oxygène

aux micro-organismes et le brassage des flocs. La séparation de l'eau épurée et de

la boue est assurée par un clarificateur, cette opération étant rendue possible par la

décantabilité des flocs. Une partie des boues séparées est réinjectée dans le bassin

d'aération afin de maintenir une masse biologique constante et suffisante pour

entretenir le procédé.

Figure I.6. Principe du procédé d’épuration par boues activées.

I.2.1.2. Les différentes origines de pollution et normes de rejet

Les effluents sont des milieux très complexes et sujets à de grandes variabilités en

composition, concentration, débit et température. La caractérisation d'une eau usée

se fait par l'analyse de certains paramètres globaux.

Prétraitement

Extraction des boues Recirculation des boues

Effluent épuré


30

� La pollution d'origine carbonée :

Les principales mesures pour évaluer la pollution d’un effluent sont la DBO5, la DCO

et le COT. L'épuration naturelle étant un phénomène biologique, la caractérisation

de la pollution de l'eau par les besoins respiratoires des bactéries épuratrices est

représentée par la Demande Biochimique en Oxygène (DBO). La mesure la plus

fréquemment employée est celle de la DBO mesurée après cinq jours à 20 °C, et qui

correspond à la durée nécessaire pour l'oxydation des composés organiques

carbonés contenus dans un échantillon, en CO2 et H2O. c'est une mesure de la

matière organique biodégradable, on la note DBO5 (Norme NF EN 1899-1).

Cependant, la présence de matières organiques difficilement oxydables par voie

biologique, font que la DBO5 doit être accompagnée par la mesure de Demande

Chimique en Oxygène (DCO)(Norme NF T 90-101). Cette mesure de DBO5 est

difficile à utiliser et à exploiter dans le cas d’effluents toxiques qui peuvent inhiber

fortement l’activité des micro-organismes sur 5 jours. La demande chimique en

oxygène représente l'oxygène nécessaire à l'oxydation de tout le matériel

organique, sous réserve que celui-ci soit oxydable. Le rapport DBO5/DCO représente

la biodégradablilité de la matière organique carbonée. En général celui-ci est

compris entre 1,5 et 2,5 pour un effluent urbain. On distingue la DCO particulaire de

la DCO soluble déterminée après filtration. La DCO des effluents vinicoles est à

certaines périodes de l’année très élevée, de l’ordre de 10 g.L-1. Les deux mesures

peuvent être complétées par la mesure du Carbone Organique Total ou COT. Cette

mesure peut être combinée avec les deux autres, le rapport DCO/COT variant alors

de 0,6 à 4 pour un effluent urbain.

� Autres paramètres:

Le phosphore est présent sous forme dissoute et colloïdale (orthophosphate assimilé

par les bactéries durant leur phase de croissance) et sous forme particulaire qui

regroupe le phosphore incorporé dans les organismes ainsi que le phosphore associé

à des particules minérales. On définira le Phosphore Total (PT) ainsi que le

phosphore provenant des orthophosphates (P-PO43-). Une eau usée est caractérisée

par sa teneur en azote total (NT) englobant les différentes formes d'azote. C'est-à-

dire l'azote réduit ou Kjeldhal (NTK) et l'azote oxydé sous forme de nitrite (NO2-)

ou/et de nitrate (NO3-). L'azote total comprend l'azote ammoniacal et l'azote

organique. Les effluents vinicoles sont déficients en azote (N-assimilable <10 mg.L-

1) et le rapport classiquement considéré en effluent urbain (DBO5/N/P = 100/1/0,1)

n’est pas respecté sur les unités de traitement biologique des effluents vinicoles

(Gomez et al., 1999). En effet, il n’y a généralement pas de réajustement en azote.


31

D'autres paramètres comme le pH, la turbidité, la conductivité et les matières en

suspension caractérisent un effluent. Les normes de rejet sont données dans

l’annexe 2. Elles fixent les exigences épuratoires minimales et les plus fortes ainsi

que les dépassements autorisés sur les unités d’épuration.

I.2.1.3. Paramètres spécifiques du procédé par boues activées

Les paramètres suivants servent à caractériser le traitement par boues activées.

� La concentration en biomasse :

Les trois paramètres couramment utilisés sont les matières en suspension (MES),

les matières sèches (MS) et les matières volatiles (MVS).

- Les Matières En Suspension (MES) en g.L-1, représentent les particules organiques,

les particules minérales, les cellules actives et les débris cellulaires du surnageant et

de la liqueur mixte.

- Les Matières Sèches (MS) en g.L-1, correspondent à l'ensemble des matières en

solution et en suspension.

- Les Matières Volatiles Sèches (MVS) en g.L-1, désignent la fraction organique des

matières sèches. Ce paramètre est assimilé à la fraction de la matière vivante.

� les charges :

Si on note QEB, le débit journalier d’eau brute à traiter, V le volume de la liqueur

mixte et S la concentration en substrat à l'entrée de l’unité exprimée en DBO5 ou

DCO avec X la concentration de la liqueur mixte exprimée en MES, MS ou MVS, il est

possible de définir les charges, volumique et massique qui caractérisent une unité

d’épuration (Praderie, 1996).

La Charge Volumique (Cv) ou charge organique, représente la masse de pollution

arrivant journalièrement sur la station par unité de volume de bassin. Cv est

exprimé en Kg/(m3.j.).

La Charge Massique (Cm) est le rapport entre la masse de pollution entrant

journalièrement dans la station et la masse de boues contenue dans la station.

En traitement biologique, les charges volumique et massique sont associées

(Tableau I.3).

QEB S

V Cv=

Cv

XCm= =

QEB S

VX


32

Tableau I.3. Charges massique et volumique.

Faible charge

aération prolongée moyenne charge forte charge

Cm (Kg DBO5/KgMES.j) Inférieur à 0,07 Entre 0,15 et 0,4 Entre 0,4 et 1,2

Cv (Kg DBO5/m3.j) Inférieur à 0,40 Entre 0,5 et 1,5 Entre 1,5 et 3

Les unités de traitement biologique d’effluents vinicoles sont dimensionnées pour

des moyennes ou faibles charges mais les charges sont en réalité très variables au

cours de l’année.

� Autres paramètres :

Le Temps de Rétention Hydraulique (TRH) correspondant au temps de passage de

l'effluent dans la station est exprimé généralement en heure (h).

Le Temps de Rétention (TR) ou âge de la boue (θ) est le rapport entre la masse de

boues contenue dans la station sur la masse de boues extraite par jour (j). Qp est le

débit de purge ou d'extraction et Xp la concentration de purge ou d'extraction.

I.2.2. Caractérisation et composition du floc biologique de boues activées -

comportement face à un toxique

En réacteur biologique, les systèmes bactériens développant des cultures en

suspension sont les plus utilisés. Ils sont constitués de matières inertes et de

biomasse agglomérée grâce aux polysaccharides exogènes des bactéries (Massé,

2004). Le plus couramment employé pour citer ces agglomérats est le terme de floc.

La caractérisation du système boues activées passe par la caractérisation des deux

principaux constituants, à savoir la population microbienne et les constituants du

floc.

I.2.2.1. Caractéristiques de la population microbienne

La biomasse active au cours du processus d'épuration biologique par boues activées

est d'une grande complexité. Il s'agit d'une véritable culture mixte (mélanges

QEB

V TRH =

Qp Xp

VX θ =


33

d’eaux usées et de flocs) composée de nombreuses espèces différentes soumises à

des phénomènes biologiques très divers. Les processus biologiques par boues

activées mettent en jeu des réactions en chaîne de libération d'énergie

(catabolisme) et de synthèse cellulaire (anabolisme). Le catabolisme fournit

l'énergie nécessaire à la biosynthèse. Pour la réaction d'anabolisme, il est

nécessaire de fournir une source de carbone à la cellule pour la synthèse des

constituants cellulaires. Selon la forme chimique du carbone utilisé, et d'une façon

plus générale, les besoins nutritionnels de la microfaune, les micro-organismes

épurateurs, ont été classifiés (Edeline, 1993). La présence d'une culture bactérienne

dans le bassin d'aération entraîne le développement d'une microfaune composée

principalement d'organismes prédateurs et est représentée par les protozoaires et

les métazoaires. L'ensemble de ses micro-organismes composent ainsi l'édifice

biologique de la station d'épuration. Les principales relations au sein du peuplement

biologique sont complexes et basées sur des relations de prédation, de compétition

voire de cannibalisme (Figure I.7).

Figure I.7. Principales relations au sein de l’édifice biologique boues activées.

Cette population biologique se développe et subit une pression sélective entre les

différentes espèces. A titre d'exemple, le dénombrement d'une population prélevée

sur une station biologique activée dans le domaine de l'aération prolongée et avec

un fonctionnement stable est le suivant :

� Métazoaires (1 à 5.105 individus/litre de boues)

� Protozoaires (107 individus/litre de boues)

� Bactéries (1012 individus/litre de boues)

SUBSTRAT =

Matière organique

BACTERIES

PROTOZOAIRES METAZOAIRES

Transformation de la pollution

PRODUCTEURS PRIMAIRES

Clarification de l’eau interstitielle

PREDATEURS

�� Sens Prédateur - Proie


34

Les espèces bactériennes les plus souvents présentes dans les boues activées sont

les Pseudomonas, Flavobacterium, Achromobacter, Chromobacterium, Azotobacter,

Micrococcus, Bacillus, Alkaligenes, Arthobacter, Acinobacter, Mycobacterium,

Aeromonas, Nocardia et Lophomonas (Pitter et Chudoba, 1990). Ces micro-

organismes unicellulaires, de différentes formes (sphérique, cylindrique,...), ont une

taille de l'ordre de quelques microns (de 0,5 à 5 µm), à l'exception des bactéries

filamenteuses de longueur souvent supérieure (de 10 à plus de 500 µm). Les

bactéries présentes dans les boues activées sont pour la plupart aérobies

facultatives, gram négatif, mobiles et provenant essentiellement du sol ou des eaux

(Calner et al., 1999). Les bactéries jouent un rôle essentiel dans l'épuration

biologique par rapport aux autres organismes. Il est basé essentiellement sur la

croissance floculée des bactéries. Ce type de croissance est obtenu dans des

conditions bien précises du métabolisme bactérien. De plus, elles sont caractérisées

par une grande surface d'échange avec le milieu extérieur, des vitesses de

multiplication élevées, des richesses enzymatiques importantes et de grandes

possibilités d'adaptation aux différents paramètres physico-chimiques.

La microfaune est composée d'animaux microscopiques de population importante

puisque l'on dénombre des populations de l'ordre de 107 individus par litre de

liqueur mixte aérée. Elle est essentiellement représentée par :

- Des protozoaires qui peuvent composer jusqu'à 5 % du poids sec des matières en

suspension, de taille moyenne comprise entre 5 à 300 µm et de forme très variable,

- Des métazoaires, organismes multicellulaires de taille pouvant être supérieure au

millimètre.

La très grande majorité de la microfaune des boues activées est bactériophage mais

certains organismes peuvent participer à l'assimilation directe de la matière

organique (cas de quelques flagellés) ou être prédateurs d'autres protozoaires. Dans

la plupart des cas, les bactéries doivent être facilement disponibles donc présentes

dans le milieu interstitiel ou à la surface du floc, bien que certains protozoaires ou

métazoaires se nourrissent de bactéries situées à l'intérieur du floc (holotriches,

rotifères). La microfaune biologique participe également à l'affinage du processus de

traitement des eaux par une ingestion très importante de bactéries de l’eau

interstitielle et produit une grande quantité de mucus qui contribue à la formation

des flocs. La microfaune biologique est répertoriée en annexe 3. L'analyse

écologique de la microfaune apporte certaines informations relatives aux conditions

de fonctionnement d’une station d'épuration. Par exemple, le profil biologique de la

boue est fonction de la charge appliquée (Tableau I.4). On peut ainsi rencontrer


35

certaines espèces communes aux trois types de boues activées mais avec une

fréquence d’apparition toutefois plus importante pour un procédé fonctionnant sous

de fortes charges. Généralement, on retient que pour les fortes charges, ce sont les

protozoaires qui constituent l'espèce majoritairement représentée (Vorticelles,…). En

faible charge, ce sont les métazoaires (rotifères, nématodes,…), ainsi que certains

protozoaires ciliés qui sont le plus souvent observés (Eikelboom, 1981).

Tableau I.4. Classification de la faune des boues activées en fonction de la charge massique

(Verdy, 1987).

Types d’organismes Présence en

forte charge

Présence en

moyenne charge

Présence en faible

charge

Bacteries +++ ++ ++

Flagellées ++ ++ +

Holotriches ++ ++ +

Péritriches ++ ++ +

Hypotriches + ++ ++

Nématodes - + +

Rhyzopodes - - +

Rotifères - - ++

Oligothètes - - +

Gastrotriches - - +

Tardigrades - - +

Le vieillissement de la boue joue un rôle dans l'évolution de la microfaune. Le

schéma classique de l'évolution (Figure I.8) donne tout d'abord l'apparition des

formes libres puis fixées, suivie par les formes exploitant la matière organique

stabilisée. En résumé, les bactéries et les flagellés précèdent les ciliés libres puis

fixés. Les rotifères apparaissent en dernier lieu (Verdy, 1987).

Figure I.8. Evolution des populations des boues activées d’après Verdy (1987).

Fin de traitement Aération prolongée

Nombre de Micro-organismes

Age de la culture

1

2 34

5

Début de traitement Phase transitoire

1 Bactéries

Flagellés

Ciliés libres

2

3

4

5

Ciliés fixés

Rotifères


36

I.2.2.2. Caractéristiques d’un floc

Les boues activées sont constituées de flocs de matière inerte et de biomasse

assemblée grâce aux polysaccharides des bactéries (Massé, 2004).

I.2.2.2.1. Structure et nature d’un floc

Figure I.9. Représentation schématique du floc bactérien (Urbain et al., 1994).

C2+

C2+

C2+

C2+Cations divalents

Particules minérales

Polymères exocellulaires

PO4n-

OH

COO-

N+

Site hydrophobe

-

n


37

Les boues activées sont constituées de micro-organismes, de particules

inorganiques (phosphates, silicates,...), de cations multivalents ainsi que de

polymères exocellulaires de masse moléculaire élevée (figure I.9). Les flocs sont

constitués de micro-colonies de l'ordre de 5 à 15 µm (Li et Ganczarczyk, 1988). Le

floc, souvent chargé négativement, est le résultat d'interactions physico-chimiques

entre des micro-organismes (principalement des bactéries), les particules minérales

(silicates, oxydes de fer,...), de polymères exocellulaires et de cations multivalents.

Les cations divalents, du moins Ca2+ et Mg2+, ayant des affinités spécifiques avec

chacun des polymères, sont en quelque sorte des agents de liaison (Urbain et al.,

1993). Cette structure complexe présente différents niveaux d'organisation. La

présence des exopolymères garantit les interactions entre toutes les particules. Ces

polymères sont un mélange complexe de polysaccharides aminés ou phosphatés, de

protéines et d’ADN ; ce qui donne une charge globale négative à la paroi cellulaire

(Liu et Huang, 2005 ; Neyens et al., 2004 ; Tsuneda et al., 2003). Avec la présence

de charges positives telles que le magnésium ou le calcium, une liaison entre les

parois cellulaires voisines est assurée, même si cette force d’interaction demeure

faible (de l'ordre de 6kJ/mol). Quelques caractéristiques physico-chimiques comme

la taille, la surface de contact, la forme, la teneur en eau, la porosité,

l’hydrophobicité de la paroi cellulaire et le type et la quantité d’exopolymères,

conditionnent au niveau microscopique les propriétés de décantation des boues

(Liao et al., 2001 ; Willen et al., 2003). La formation des flocs dépend des contacts

entre les différentes sous particules qui les constituent et qui fixeront l'attitude de

décantation (Metcalf et Eddy, 1969). Les flocs présentent une structure peu dense

et hétérogène (densité comprise entre 1,02 et 1,06) dont la cohésion est assurée

par des liaisons de type hydrogène et de type Van Der Walls. Il existe également

des interactions électrostatiques (répulsives ou attractives), hydrophobes-

hydrophobes, hydrophiles-hydrophiles (Willen et al., 2003).

La proportion entre le nombre de cellules et les polysaccharides exocellulaires est

différent selon le floc considéré. Le floc n'est donc pas le résultat de l'association

d'un nombre défini de sous éléments dont les rapports entre eux resterait identique

(floc=(bactéries, particules,...) X n) (Urbain et al., 1993). La Figure I.10, représente

un exemple de floc obtenu durant l'épuration des eaux usées par boues activées.


38

Figure I.10. Photographie au microscope optique (X100) de flocs de boues activées.

I.2.2.2.2. Rôle des composés exocellulaires dans la formation d’un floc

Les polymères exocellulaires retrouvés dans la formation du floc peuvent avoir des

origines différentes ; ils peuvent avoir été relargués par les micro-organismes

(protéines, ADN, polysaccharides, et lipides) mais ils peuvent venir directement de

l’effluent à traiter (cellulose, acides humiques,...). Les polymères libérés par les

bactéries n'ayant pas tous la même origine, leur caractérisation est parfois délicate

car il existe plus de 1000 composés impliqués dans la formation de métabolites

(Daigger et Grady, 1982).

Les polymères produits par les micro-organismes proviennent :

� Des composés libérés par les micro-organismes et de leur interaction avec un

nouvel environnement,

� Des composés produits lors de la métabolisation du substrat au cours de la

croissance des micro-organismes,

� Des composés relargués durant la lyse et la dégradation des micro-

organismes (Chudoba, 1985).

Les premiers sont produits dans le but de rétablir un équilibre des concentrations au

travers de la membrane cellulaire. Il est possible que ce relargage évite

l'accumulation au sein de la cellule de métabolites intracellulaires dont la trop forte

concentration aurait un effet inhibiteur (Daigger et Grady, 1982).

Les polymères relargués durant les périodes de croissance et de multiplication ont

en effet deux origines :

- Alors que de nouvelles cellules sont créées, les anciennes structures sont

modifiées et les fragments issus de ces modifications sont rejetés dans le milieu de

culture ; ils correspondent également à des composés intracellulaires que libèrent

les bactéries (Hejzlar et Chudoba, 1986).


39

- Dans le deuxième cas, c'est-à-dire lors de la lyse des cellules, les composés

relargués par les micro-organismes correspondent à leurs contenus et dont certains

ne peuvent pas être utilisés par les cellules encore viables comme substrat. Ils

constitueraient une partie de ce qui est appelée la « DCO dure » en traitement des

effluents.

Bien que produits dans des conditions différentes, les polymères bactériens ont une

composition identique car ils contiennent les mêmes sucres, les mêmes acides

aminés (Hejzal et Chudoba, 1986). Tous ces composés se retrouvent dans les

polysaccharides à partir desquels sont formées les enveloppes et les parois des

cellules bactériennes. Ainsi, on retrouve donc dans le milieu des composés

complexes de polysaccharides, de phospholipides et de protéines. On fait souvent la

distinction entre les polymères, considérés comme assimilables par les micro-

organismes, et ceux non assimilables car peu biodégradables. Les composés issus

essentiellement des parois cellulaires (les polysaccharides extracellulaires) sont très

dominants et sont considérés comme non biodégradables alors que les composés

issus de la cellule (acide nucléique,...) sont facilement assimilés par les micro-

organismes. Les polymères extracellulaires sont indispensables à la formation du

floc et influencent également la décantabilité de la suspension et son aptitude à la

dégradation. Toute mise en place d'un procédé basé sur un système biologique doit

prendre en compte la formation de ces produits bactériens, susceptibles de modifier

la décantation, la dégradation mais aussi la qualité de l’effluent à traiter.

Andreadakis (1993) note que la présence de ces polymères en grande quantité peut

être gênant. Leur libération trop abondante et leur accumulation entraîne une

détérioration des propriétés relatives à la décantabilité et la floculation de la

suspension. Ainsi, Liu et Huang (2005), ont observé le même phénomène sur des

boues activées nourries avec de l’acétate durant 20 jours. Il est remarqué une

corrélation positive (R2=0,943) entre la biofloculation et les concentrations en EPS

inférieures à 5,5 mg COT.g-1 MS. Pour des concentrations supérieures à 5,5 mg

COT.g-1 de MS est observée une corrélation négative entre la biofloculation et les

concentrations en EPS (R2=0,771). L'accumulation de ces polymères dans le milieu

de culture peut également être responsable d'une diminution des vitesses

spécifiques de dégradation du substrat (Chudoba, 1985). Il semblerait que cette

inhibition provienne de l'accumulation de métabolites particuliers de nature humique

qui seraient partiellement adsorbés sur les flocs par interaction avec les

polysaccharides et les exopolymères et qui entraînerait le recouvrement des cellules

(Souza Melo, 1984).


40

I.2.2.3. Incidence des pesticides sur l’épuration biologique

L’évolution des procédés de traitement biologique par boues activées a permis

d’envisager l’épuration de toxiques tels que les pesticides. Actuellement, peu de

publications traitent de l’épuration biologique des molécules phytosanitaires. Les

publications concernant cette dégradation étudient principalement l’effet des

herbicides (triazines,..) sur la biomasse active des boues activées. Différentes

études sur la dégradation des herbicides par boues activées ont montré que la

majorité étaient dégradés à plus de 90 %. Ainsi, les phénoxyl-acides (2,4-DP, MCPP,

MCPA, …) sont dégradés après acclimatation des micro-organismes à environ 98 %

(Gonzales et al., 2006 ; Ziper et al., 1999). Zipper et al. (1999) ont utilisé le 2,4-D

comme source d’énergie et de carbone pour le développement de cultures

bactériennes. Nitschke et al. (1999) ont quant à eux démontré que les phénoxy-

acides (mécoprop) sont dégradés à 100 % par boues activées et que l’effluent rejeté

n’est pas toxique pour le milieu environnemental. Le lindane est dégradé de 67 à 91

% par boues activées municipales. Il a été remarqué une diminution importante des

matières en suspension de la liqueur mixte, soit une diminution de la biomasse

active, ce qui n’affecte pas la demande chimique en oxygène (96 %) et l’azote total

(98 %) (Kipopoulou et al., 2004). De plus, seulement 0,1 à 2,8 % du lindane est

concentré dans les boues. La diminution de biomasse a été aussi constatée par

Visvanathan et al. (2005), observant une diminution de 10 % avec une dégradation

d’environ 99 % du pentachlorophénol.

La biomasse active dégradant les molécules phytosanitaires semble être de nature

bactérienne. Hirooka et al. (2006) ont montré que les micro-organismes dégradant

les toxiques en composés minéraux sont : Pseudomonas spp., Acaligenes spp.,

Azotobacter spp., Rodococus spp., Phaerochaere spp. et Chriptococus spp. Par

contre, Barik et Munnecke (1984) montrent que certains herbicides comme les

triazines (terbutylazine) et les phénylurées (isoproturon) ont un pourcentage de

dégradation ne dépassant pas 20 %. Ils ne sont pas dégradés, mais absorbés

directement à la surface du floc des boues activées (Nitschke et al., 1999).

Des procédés de traitement anaérobies ont été développés pour la digestion de

différents fongicides. Ces procédés utilisent majoritairement des boues issues de

traitements municipaux qui sont acclimatées aux différents toxiques. Ces procédés

sont aussi efficaces que les procédés de traitement aérobies (Parker et al., 1994).

Les organochlorés comme le pintachlorophénol sont dégradés à plus de 99,5 %

(Schen et al., 2005) mais on remarque une modification de la structure des flocs par


41

l’apparition de bactéries filamenteuses et de flocs plus denses (Ribarova et al.,

2002). Les triazines non dégradées par boues activées, sont dégradées à environ 90

% (atrazine) malgré une diminution significative de 50 % de la biomasse active

(Ghosh et al., 2001). La nature du substrat peut influencer la dégradation. Ainsi, la

dégradation du malation, du glusation et du dimétioate, en présence de glucose est

accélérée d’approximativement 50 % (Barik et Munnecke, 1984). Le pH de la boue

activée influence la dégradation. Pour exemple, le dodémorphe, à des pH inférieurs

à 7, se dégrade moins facilement par le procédé car sa solubilité dans l’eau diminue

(Vorkamp et al., 2003).

La dégradation en laboratoire de différents pesticides par des souches de bactéries a

également été étudiée. Le glyphosate (500 mg.L-1) a notamment pu être dégradé

par Pseudomonas spp. à 96 % (Heitkamp et Adams, 1992). L’alicarbe peut être

dégradé totalement par des bactéries après quatre jours de contact (Kok et al.,

1999). D’autres études utilisant des mélanges de micro-organismes ont permis la

dégradation du DNOC et du 2,4-DNP. Ces micro-organismes sont des souches issues

du sol tels que Chlamidomonas spp. , Anabanea spp.,… (Hirooka et al., 2006 ; Gisi

et al., 1997).

En fonction de la nature du pesticide, des métabolites présents et de la micro-faune

qui compose les boues, l’efficacité des traitements est très variable. La difficulté est

de déterminer les conditions optimum des traitements biologiques des molécules

phytosanitaires.

I.2.3. Mécanismes de transfert et de réaction d’une culture microbienne

I.2.3.1. Transfert du substrat à travers un floc

Dans le cas particulier du procédé par boues activées, le substrat, avant de parvenir

à proximité de la cellule, doit pénétrer le floc (Figure I.11).


42

Figure I.11. Schéma d’un floc bactérien.

Aux mécanismes traditionnels de transfert au niveau de la cellule, s'ajoute le

mécanisme particulier du transfert dans le floc. Ce type de transfert est

essentiellement diffusionnel et le processus peut se faire de différentes manières.

Il est possible de considérer le milieu comme homogène, ce qui signifie que

l'ensemble du floc a une activité apparente uniforme. Le floc semble être un milieu

ou les micro-organismes viables peuvent être répartis uniformément dans un gel

intercellulaire ou chaque micro-organisme le constituant est entouré d'une zone de

métabolisation elle-même entourée d'une zone de transport diffusionnel (Atkinson et

David, 1974). On peut également considérer le floc comme un noyau de cellules

vivantes enveloppées d'une couche de polymères (Evilevich et al., 1978) ou comme

un noyau interne enveloppé de deux zones ; un film liquide et une zone active

(Figure I.12).

Figure I.12. Shématisation du floc selon différents modèles :A. Atkinson et Davies (1974) ; B. Evilevich

et al. (1978) ; C. Rodrigues et al. (1984).

Gel intracellulaire

Zone de métabolisation

Zone de transfert diffusionnel

Enveloppe de biopolymères

Noyau de cellules vivantes

Zone active

Film liquide

Noyau interne

A. B. C.

Métazoaires

Métazoaires

Protozoaires

Protozoaires Vorticelles

FLOC

BACTERIEN

Substrat Bactérie


43

I.2.3.2. Transfert et métabolisation du substrat dans un organisme

Au niveau d'une cellule bactérienne indépendante, les mécanismes globaux de

transfert et d'assimilation du substrat, dont la Figure I.13 représente le principe, se

décompose en cinq processus de base (De Souza Melo, 1984) :

Figure I.13. Mécanismes de transfert et de réaction dans une culture bactérienne.

• Transport :

Le transfert externe correspond au mouvement des molécules formant le substrat

au voisinage de la cellule (la mobilité relative de la cellule étant alors essentielle et

prenant une place primordiale). Il est lié au potentiel chimique et aux forces

hydrodynamiques locales influençant l’épaisseur de la couche limite. Le transfert

interne, diffusionnel ou perméatif du substrat à l'intérieur de la cellule via la

membrane permet la métabolisation des éléments nutritifs.

• Adsorption :

Elle correspond aux processus mis en oeuvre par les micro-organismes pour capter

un substrat, essentiellement non soluble, sur la paroi de la cellule ou dans l'espace

périplasmatique ; ce phénomène représente la biosorption.

Adsorption

Hydrolyse

Diffusion

Particule de matière organique en suspension

Substrat soluble Perméation

METABOLISATION DU

SUBSTRAT

INTERIEUR DE LA CELLULE

ENVIRONNEMENT

MEMBRANE

Transfert interne Transfert externe


44

• Prédigestion :

La matière organique est ensuite dégradée à l'extérieur de la cellule. La prédigestion

est généralement une hydrolyse (liquéfaction des graisses, des amidons et des

protéines) qui entraîne une solubilisation et une diminution de la taille des

particules ; seules les grosses molécules et les colloïdes étant concernés.

• Perméation :

Le substrat, une fois solubilisé, franchit la membrane cellulaire et pénètre dans la

cellule. Ce transfert peut se faire par diffusion simple ou facilitée grâce aux enzymes

de la membrane cellulaire qui jouent le rôle de transporteur.

• Réaction :

La réaction correspond à la métabolisation du substrat qui se traduit par

l'élimination du substrat, la libération d'énergie et la création de nouveaux

matériaux (nouvelle cellule, métabolites,...). Les deux aspects du métabolisme sont

le catabolisme et l'anabolisme. Le catabolisme correspond à l'ensemble des

réactions qui permettent la récupération d'énergie biologiquement utilisable et la

production de métabolites de base à partir des substrats organiques ou des réserves

cellulaires. L'anabolisme représente l’ensemble des réactions qui permet les

synthèses cellulaires à partir des métabolites de base issus du catabolisme et

d'éléments du milieu (Arnaud et Guiraud, 1993). Chacun de ces types de réaction

fait intervenir des enzymes qui sont des catalyseurs spécifiques.

Un produit phytosanitaire sera biodégradable si lors de toutes ces étapes, il ne

perturbe pas de façon définitive le fonctionnement de la cellule.

I.2.4. Modélisation des cinétiques de réaction

Il existe une multitude de modèles plus ou moins complexes qui rendent compte des

phénomènes de transfert de réaction (anabolisme, catabolisme, relargage,

viabilité,...). Ces modèles peuvent être regroupés de différentes façons, par

exemple selon leur domaine d'application. La plupart des modèles concernant les

procédés biologiques sont basés sur le modèle de MONOD (1942).

I.2.4.1. Rappel du modèle de MONOD

Monod (1942), analysant la courbe de croissance bactérienne d'une culture pure, a

proposé d'exprimer la vitesse spécifique de croissance (µ) en fonction de la


45

concentration en substrat (S) à l'instant (t) par une relation empirique déduite, par

analogie de l'équation établie par Michaelis et Menten pour les enzymes :

Où :

µ vitesse spécifique ou taux de croissance (T -1)

µmax vitesse spécifique maximale ou taux de croissance maximale (T -1)

S concentration en substrat au temps t (M L-3)

X concentration en biomasse au temps t (M L-3)

Ks concentration seuil -valeur de S pour laquelle µ=µm/2 (M L-3)

Rx= dX/dt vitesse de formation de biomasse (M L-3 T-1)

Rs= dS/dt vitesse de consommation du substrat (M L-3 T-1)

Y rendement ou taux de conversion

Ce modèle décrit très bien la phase de croissance exponentielle ainsi que le début

de la phase de ralentissement d'une culture pure mais également celle, sur le plan

qualitatif tout au moins, d'une culture mixte (Wisniewski, 1994). La phase de déclin

n'est toutefois pas décrite par le modèle de Monod. L'introduction d'une constante

de décès Kd dans l'équation 1 permet de remédier à cette insuffisance (Lendenman

et al., 2000). Cette phase de déclin correspond à une forte carence en substrat

initial voire à une modification complète des ressources organiques dans le milieu

par accumulation de métabolites secondaires.

I.2.4.2. Spécificité des autres modèles

De nombreux modèles permettent de décrire la croissance bactérienne en condition de

substrat limitant. Dans le Tableau I.5., Les modèles appliqués au procédé par boues

activées ont été rassemblés (Lendenman et al., 2000). Toutes ces équations établissent

une relation entre le taux spécifique de croissance µ et la concentration en substrat

limitant S. Aujourd'hui, Le modèle de Monod est encore largement utilisé pour décrire la

croissance microbienne dans les procédés biotechnologiques. Néanmoins, cette équation

a souvent été remise en question, c'est pourquoi plusieurs modèles alternatifs ont été

proposés. Le problème inhérent à la plupart de ces modèles reste l'évaluation précise des

données expérimentales pour la validation des différents modèles de croissance. Chaque

modèle a une forme proche du modèle de Monod mais ceux qui en sont dérivés, sont

plus complexes que celui-ci.

µmax S

Ks +S µ = Rx = µ. X Rs = (µ/Y) . X

1. 2. 3.


46

Tableau I.5 : Modèles applicables à la cinétique des boues activées.

T, constante de saturation dans le modèle de Teissier; x, constante déterminée expérimentalement dans le

modèle de Moser; Ki, constante d'inhibition dans le modèle de Haldane; m, maintenance; L, constante de

diffusion dans le modèle de Powell.

SK

S

S

max +µ=µ

Monod (1942)

))T

Sexp(1(max −−µ=µ

Teissier (Gaudy et al., 1967)

)SK1

1(

S

max χ−χ ⋅+µ=µ

Moser (1958) i

2

S

max

K

SKS

S

++µ=µ

Haldane (1930)

mSK

S)m(

S

max −+

+µ=µ

Herbert (Lendenman et al., 2000)

++⋅⋅−

⋅++µ=µ

2S

Smax )SLK(

SL41

L2

SLK

Powell (Lendenman et al., 2000)

Plusieurs auteurs ont comparé ces modèles entre eux en calculant les constantes du

modèle correspondant. Pour cela, ils ont fait varier les substrats, le milieu de croissance

ou la méthode de détermination des paramètres. Ainsi, Gaudy et al., (1967) ont comparé

le taux de croissance pour des boues activées alimentées par du glucose en utilisant

deux modèles différents. Dans ce cas, suivant les conditions expérimentales le taux de

croissance (µmax) est compris entre 0.36 h-1 pour le modèle de Monod et 0.68 h-1 pour le

modèle de Teissier et Moser. Kumaran et Paruchuri (1996) ont comparé les modèles de

Monod et de Haldane pour des monocultures (Acinetobacter, Pseudomonas) et des

cultures mixtes pour la biodégradation du phénol et ont observé le même phénomène.

Les valeurs trouvées pour µmax dans ces conditions se situent entre 0.3 h-1 pour le

modèle d’Haldane et 0.7 h-1 pour le modèle de Monod. La variation observée entre les

modèles est légère pour la détermination du taux de croissance pour Lendenman et al.,

(2000) qui ont comparé les modèles de Monod, Herbert, Powell et Teissier pour des

cultures d'Escherichia coli pour la dégradation du galactose (Tableau I.6). La variation

observée dans les mêmes conditions expérimentales pour les différents modèles n’est

que de 0,1 dans la détermination du µmax. Les variations sont observées pour la

constante Ks.

Tableau I.6. Paramètres cinétiques quantifiés par différents modèles (Lendenman et al., 2000).

Modèles µmax (h-1) Ks (µg.L-1)

MONOD 0,920 98,2

HERBERT 0,762 72,6

POWELL 0, 764 73,3

TESSIER 0,603 63,7


47

La comparaison des différents modèles permet de conclure que le modèle de Monod est

le modèle le plus adapté pour décrire la croissance microbienne d'une monoculture et

caractériser la consommation d'une source unique de carbone. Il s'avère cependant que

ce modèle est aussi le plus utilisé pour décrire les procédés à boues activées. C'est

d'ailleurs le modèle le plus largement rependu pour calculer les constantes biologiques

d'une boue activée.

I.2.4.3. Utilisation actuelle du modèle de Monod pour la dégradation des

toxiques

Peu de publications utilisent le modèle de Monod pour étudier la dégradation d’un toxique

par une biomasse. En effet, les molécules toxiques testées à des concentrations

importantes ne sont pas considérées comme un substrat mais comme un inhibiteur de la

biomasse. Cependant, quelques auteurs considèrent un composé toxique comme un

substrat biodégradable. Ainsi, Beltrame et al. (1982) utilisent une solution qui contient

2,4-dichlorophénol (DCP) comme substrat pour des boues activées en conditions stable.

La boue adaptée est capable de dégrader le DCP, sans évidence d'inhibition de la

biomasse jusqu’à une concentration de 156 mg.l-1 de DCP.

I.2.5. Conclusion

Les modèles relevés dans la littérature sont pour la plupart délicats à utiliser,

notamment les modèles qui prennent en compte les divers processus d’assimilation

du substrat. Leurs difficultés sont souvent liées au nombre élevé de paramètres plus

ou moins ajustables auxquels ils font appel pour décrire les différents processus.

Nous retiendrons surtout que la description d’un même mécanisme ou du

comportement d’une culture peut être représentée par un très grand nombre de

modèles qui dépendent chacun des hypothèses émises pour représenter au mieux la

réalité. Dans le cas de la détermination des paramètres cinétiques, le choix d’un

modèle est donc délicat. Il dépend bien évidemment des paramètres que l’on juge

importants dans le type d’étude considéré mais également des moyens mis à

disposition pour l’acquisition des données concernant la croissance et l’activité de la

biomasse.

CHAPITRE II

MATERIELS ET METHODES

Matériels et Méthodes

48

MATERIELS ET METHODES

Afin de mettre en évidence la biodégradabilité des molécules phytosanitaires

l’utilisation de différents pilotes a été nécessaire. Par ailleurs, la mise en place de

tests écotoxicologiques ainsi que de nouvelles méthodes d'analyse des résidus

phytosanitaires a été réalisée.

II.1. Description des pilotes

II.1.1. Bioréacteur

Le bioréacteur reproduit les conditions d'un bassin d'aération d'une station d'épuration

par boues activées. Le bioréacteur Braun® d’une capacité de 30 litres est agité par 3

turbines de Rushton et aéré par une couronne perforée. Plusieurs sondes lui sont

associées afin de réguler et contrôler divers paramètres : pH, oxygène, température,

niveau et présence de mousse. Ces capteurs sont couplés à des pompes permettant

d'alimenter le milieu en anti-mousse ou en substrat, d'extraire des boues, d'injecter une

base (soude) et un acide (acide sulfurique) pour réguler le pH (Figure II.1).

Figure II.1. Schéma du bioréacteur de 30 L.

Tous les paramètres tels que le débit d'air, la concentration en oxygène dissous, la

vitesse d'agitation, le pH, la température et le débit des pompes, sont pilotés par une

unité de configuration directement reliée au bioréacteur ou par un ordinateur.

Niveau

Température pH

Oxygène

Mousse

AIR

Effluent à traiter, Q

Liqueur mixte, Q

Base

Acide

(H SO


49

II.1.2. Jar-test aéré

Un jar-test est utilisé pour déterminer l’incidence de différents paramètres (concentration en

phytosanitaires, nature des molécules,…) (Figure II.2). Doté de pales rotatives, d’un

régulateur d’agitation qui contrôle le nombre de rotations par minute, d’un minuteur, et de

bulleurs destinés à apporter l’oxygène nécessaire à la respiration des boues, ce dispositif

permet d’appliquer les mêmes modalités de fonctionnement à six béchers de un litre. La

concentration en oxygène est mesurée par une sonde plongée régulièrement dans les béchers

(LDO HACH Lange).

Figure II.2. Schéma du jar-test aéré.

II.2. Molécules phytosanitaires

II.2.1. Concentrations des pesticides

Après un rinçage à la parcelle, la cuve de pulvérisation contient un effluent phytosanitaire

dont les concentrations en matières actives ont été calculées selon la méthode suivante.

En fin de pulvérisation des produits phytosanitaires, il reste un volume résiduel en fond

de cuve estimé à 10 L. La cuve de rinçage doit avoir une capacité de 10 % du volume

total de la cuve du pulvérisateur (300 L), soit 30 litres. Le viticulteur ajoute les 30 Litres

d’eau claire au volume du fond de cuve et pulvérise à nouveau le mélange. Il reste alors

un fond de cuve de 10 litres. Le viticulteur revient sur son domaine et lave son

pulvérisateur avec un volume d’eau claire égal à 5 % du volume total de la cuve, soit 15

Minuteur

Régulateur d’agitation

air

Bécher

Pale d’agitation


50

Litres. Ces eaux de lavage constituent l’effluent à traiter. Le calcul des concentrations en

pesticides après un rinçage à la parcelle est reporté dans l’annexe 4.

II.2.2. Les matières actives phytosanitaires

Les pesticides sélectionnés sont utilisés principalement dans le traitement chimique

des vignes de la région Bordelaise. Les molécules sont définies après avoir étudié

chez des viticulteurs plusieurs cahiers de traitement. Chaque groupe de molécules

phytosanitaires est représenté. Tous les pesticides sont fournis par plusieurs

industriels (OPTIMAGRO, CAPISCOL, BASF, SYNGENTA, CEREXAGRI, MONSANTO et

BAYER-CROPSCIENCE). Pour réaliser les différentes expérimentations, des matières

actives phytosanitaires pures (FLUKA) et des produits phytosanitaires commerciales

sont utilisées. Le Tableau II.1 correspond à la liste des matières actives pures et

leurs concentrations sont calculées pour un rinçage à la parcelle. Le Tableau II.2

présente les matières commerciales utilisées dans le Chapitre III.partie 2. Afin de

représenter au mieux un effluent viticole réel, les concentrations ont dû être

ajustées en tenant compte du nombre d’applications probable sur la vigne de chacun

des produits commerciaux.

Tableau II.1. Matières actives phytosanitaires pures

Matières Actives Formule chimique Famille chimique Activité Concentrations à

un rinçage à la parcelle (mg.L-1)

Azoxystrobine C22H17N3O5 strobilurine fongicide 170 Chlorpyriphos éthyl C9H11Cl3NO3PS organo-phosphoré insecticide 260

Cymoxanil C7H10N4O5 amide fongicide 800 Cyprodinil C14H15N3 pyrrole fongicide 1000

Difénoconazole C19H17Cl2N3O3 triazole fongicide 20 Dimétomorphe C21H22CINO4 dérivé acide cinnamique fongicide 200

Diuron C9H10N2OCl2 urée substituée herbicide 990 Fludioxonil C12H6F2N2O2 pyrrole fongicide 330

Folpel C9H4Cl3NO2S imide fongicide 1000 Fosétyl aluminium C6H18AlO9P3 organo-phosphoré fongicide 1010

Glyphosate C3H8NO5P organo-phosphoré herbicide 720 Hexaconazole C14H17Cl2N3O triazole fongicide 170

Mancozèbe [-SCS.NHCH2CH2NHCS.S.Mn-]x

(Zn)y carbamate fongicide 110

Oryzalin C12H18N4O6S toluidine herbicide 130 Quinoxyfène C15H8Cl2FNO quinoléine fongicide 34 Vinchlozoline C12H9NO3Cl2 Imide fongicide 500


51

Tableau II.2. Matières commerciales phytosanitaires

Concentrations à un rinçage à la parcelle Matières

commerciales Matières actives Formules chimiques matières actives

(mg.L-1)

matières commerciales

(mg.L-1)

Cymoxanil C7H10N4O3 50 ANTEOR

Folpel C9H4Cl3NO2S 428 640

MANGEOS Alphamétrine C22H19NO3Cl2 4 60

BOUILLIE

BORDELAISE Sulfate de cuivre CuSO4 40 200

FLUDIOSOUFRE Soufre S 693 700

SCALA Pyriméthanil C12H13N3 50 50

CASCADE Flufénoxuron C21H11ClF6N2O3 17 17

Mancozèbe [-SCS.NHCH2CH2NHCS.S.Mn-

]x (Zn)y 614 EPERON

PEPITE Méfénoxam C15H21NO4 37

960

MICROTHIOL Soufre S 2510 3410

FORUM Dimétomorphe C21H22CINO4 128 128

Diquat C12H12N2 67 GRAMOXONE

Paraquat C12H14N2 22 89

ROUNDUP Glyphosate acide C3H8NO5P 768 768

ALIETTE EV Fosétyl aluminium C6H18AlO9P3 168 210

Cyprodinil C14H15N3 192 SWITCH

Fludioxonil C12H6F2N2O2 128 512

Les propriétés des matières actives utilisées sont répertoriées dans le Tableau II.3.

(FOOTPRINT, 2007). Ces paramètres sont nécessaires pour l’exploitation des

résultats de toxicité et de biodégradabilité des pesticides dans les liqueurs mixtes.

Le coefficient de partage octanol/eau (Log P) est important car il traduit le caractère

lipophile de la molécule et donc sa tendance à la bioaccumulation en particulier, si le

Log P est supérieur à 3. On considère que la molécule est polaire si le Log P est

inférieur à 1,5 et non polaire s’il est supérieur à 4-5. Koc est le coefficient de

partage carbone organique/eau. Il définit le potentiel de rétention des matières

actives sur la matière organique du sol.


52

Tableau II.3. Propriétés des molécules actives phytosanitaires

Masse

moléculaire g.mol-1

Hydrolyse à pH=7

Solubilité eau

(mg/L)

Koc (mg/g)

Log P

EC50

(48 h) daphnies (mg/L)

EC50 (96 h) algues (mg/L)

Azoxystrobine* 403,4 stable 6,7 423 2,5 0,26 0,36 Chlorpyriphos 350,6 stable 1,4 6925 4,7 0,017 0,48 Cyprodinil* 225,3 non persistant 13 1706 4 0,22 2,6 Cymoxanil 198,2 non persistant 890 145 0,67 27 0,231 Diquat 344,1 stable 718 000 2 184 750 -4,6 1,2 0,011 Difénoconazole* 406,3 stable 15 3 760 4,2 0,77 1,2 Dimétomorphe 387,9 modérée 0,03 348 2,68 10,6 29,2 Diuron* 233,1 stable 35,6 1067 2,87 5,7 0,0027 Folpel* 296,6 non persistant 0,8 304 3,02 0,68 10 Flufénoxuron 488,8 persistant 0,043 3200 4,01 0,000065 0,00395 Fludioxonil 248,2 stable 1,8 145405 4,12 1,1 0,092 Fosétyl d'aluminium 354,1 stable 110000 1703 -2,1 100 5,9 Glyphosate* 168,1 instable 10500 21699 3,2 11 4,4 Hexaconazole* 314,2 modérée 18 1040 3,9 2,9 1,7 Mancozèbe* 271,2 stable 6,2 2000 1,33 0,073 1,1 Oryzalin 346,4 stable 2,5 600 3,73 1,4 51 Paraquat 186,3 stable 620000 1 000 000 -4,5 4,38 0,00023 Pyriméthanil* 199,3 stable 121 301 2,84 2,9 1,2 Quinoxyfène* 308,1 instable 0,047 22929 4,66 0,08 0,027 Soufre 32,1 stable 0,001 2255 0,23 5000 100 Sulfate de cuivre 249,2 148000 -0,17 2,3 0,026 Vinchlozoline 286,1 non persistant 3,4 100 3,02 3,65 1,02

* molécules dont les métabolites sont identifiés (Annexe 5).

II.3. Méthodes d’analyses

II.3.1. Analyses de l’effluent initial et traité

Les analyses de différents paramètres physico-chimiques permettent d’évaluer

l’efficacité des traitements biologiques.

La demande chimique en oxygène « DCO » : la DCO est quantifiée selon la

microméthode HACH-Lange et approuvée par l’USEPA. Cette méthode repose sur une

minéralisation des matières organiques de l’effluent à 150°C, pendant deux heures en

présence de réactifs adéquats (dichromate de potassium, sulfate d'argent et Mercure). La

mesure repose sur la réduction des ions dichromates (Cr2O72-) en ion chrome (Cr3

+). A la

fin de la minéralisation, la couleur de l’échantillon est fonction de l'excès de dichromate.

La mesure est effectuée à l'aide d'un spectrophotomètre de longueur d'onde610 nm.

Le carbone organique total « COT » : le COT est mesuré par la méthode directe

développée par la société HACH-Lange. La méthode repose sur une acidification (0.4 ml

solution tampon, pH 2.0) puis une minéralisation (persulfate ; 105 °C pendant 2 h) de

l'échantillon pour transformer le carbone organique en dioxyde de carbone. Pendant la

minéralisation, le dioxyde de carbone produit diffuse dans une solution d'indicateurs de

pH. En fin de minéralisation, l'intensité colorante proportionnelle à la quantité de CO2

formé est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre de longueur d'onde 600 nm.


53

Les matières en suspensions « MES » : la mesure de la concentration en MES est

faite selon la méthode normalisée AFNOR NF-T 90-105. La méthode consiste à filtrer

sous vide un volume de suspension connu sur un filtre en fibres de verre préalablement

pesé (WATHMANN GF 1,2 µm). Le filtre ainsi obtenu est séché à l’étuve à 105 °C pendant

24 heures, refroidi au dessicateur puis pesé. La concentration en MES est ainsi donnée

par différence entre les deux pesées, ramenée au volume filtré.

La turbidité : Elle désigne l’intensité du trouble d’une solution. Elle se mesure à l’aide

d’un turbidimètre (HACH-Lange). Les mesures sont effectuées sur les surnageants

obtenus après ½ h de décantation. La valeur obtenue est exprimée en unité de turbidité

néphélométrique (NTU).

Dosage du phosphore total « Pt » et de l’orthophosphate « PO43 -» : le Pt et le

PO43- sont mesurés par la méthode directe développée par la société HACH Lange. Le

phosphore présent sous formes organique et inorganique est converti en orthophosphate.

Le pré-traitement de l'effluent par le persulfate en milieu acide à chaud (150 °C pendant

30 min) permet l'oxydation et l'hydrolyse de ces composés. PO43 -réagit avec le

molybdate en milieu acide pour produire un complexe phosphomolybdate. Ce complexe

est alors réduit par l'acide ascorbique (0,4 mL). A la fin de la réaction, l'intensité

colorante est mesurée à l'aide d'un spectrophotomètre à 600 nm de longueur d'onde.

Dosage de l’adénosine-5-triphosphate « ATP » : l’ATP est mesuré par la

méthode directe développée par la société BIOTRACE. La méthode utilise un

préleveur d'échantillons sous forme de bâtonnet ; AQUA-Trace. Le bâtonnet de

prélèvement liquide contient tous les réactifs. En présence de l’ion Mg2+, d'ATP et de

dioxygène, la luciférine est oxydée sous l'action de la luciférase en oxyluciférine

avec production de lumière. La lumière émise par la réaction enzymatique est

mesurée par un bioluminomètre Uni-Lite BIOTRACE®.

Dosage des Substances Polymériques Exocellulaires « EPS » :

- Dosage des protéines et des substances humiques

Les protéines sont dosées suivant la méthode de Lowry modifiée par Frolund (1995). Elle

consiste à former un complexe entre les liaisons peptidiques et le sulfate de cuivre

CuSO4, en milieu alcalin. Ce complexe réduit alors les acides phosphomolybdiques et

phosphotungstiques du réactif Phénol-Folin-Ciocalteau pour donner un second complexe

de couleur bleue, mesuré au spectrophotomètre à 750 nm. Toutefois, lors de l’utilisation

de cette méthode, Davis (1988) met en évidence des interférences lors de la lecture au


54

spectrophotomètre dues aux substances humiques. Frolund et al. (1995) ont modifié

alors la méthode établie par Lowry pour prendre en compte les substances humiques

dans la mesure des protéines. Cette méthode est basée sur la mesure du développement

de couleur en présence et en l’absence de CuSO4. En présence de CuSO4, aussi bien les

protéines que les substances humiques sont dosées. En l’absence de CuSO4, le

développement de couleur est dû aux composés humiques et aux acides aminés

chromogènes, alors que la coloration développée par l’albumine de sérum bovin (BSA)

est réduite de 20 % (Frolund et al., 1995).

A partir des absorbances lues (Abs), il est alors possible de déterminer l’absorbance des

protéines et des substances humiques:

Abs totale avec CuSO4 = Abs protéines + Abs substances humiques

Abs totale sans CuSO4 = 0,2*Abs protéines + Abs substances humiques

Des deux premières équations, il vient :

Abs protéines = 1,25* (Abs totale avec CuSO4 – Abs totale sans CuSO4)

Abs substances humiques = Abs totale sans CuSO4 – 0,2*Abs protéines

Le protocole opératoire de dosage des protéines et des substances humiques est décrit

dans le Tableau II.4.

Tableau II.4 : Protocole de dosage des protéines et substances humiques

En présence de CuSO4 En absence de CuSO4

5 mL de (F) 5 mL de (H)

+ 1 mL d’échantillon

Homogénéisation au vortex

Repos pendant 10 minutes à température ambiante

+ 0,5 mL de (G)


Repos 15 min à l’obscurité



Lecture à 750 nm contre un blanc réactif

(tampon phosphate)

(A): CuSO4.5H2O (1% m/V)

(B): Tartrate de Potassium et de Sodium (2% m/V)

(C): NaOH (0,2M)

(D): Carbonate de Sodium (4% m/V)

(E): Réactif de Folin (2N)

(F): 49mL (D) + 49mL (C) + 1mL (A) + 1mL (B)

(G): (E) / 2

(H): 49mL (D) + 49mL (C) + 1mL eau + 1mL (B)


55

Les concentrations en protéines et en substances humiques sont établies à partir de

gammes étalon réalisées, respectivement, avec de l’albumine de sérum bovin (Sigma

Aldrich) et des acides humiques (Fluka).

- Dosage des polysaccharides

La méthode colorimétrique utilisée est établie par Dubois et al. (1956). L’échantillon est

chauffé en présence d’acide sulfurique et de phénol. Les polysaccharides sont hydrolysés

pendant le chauffage par l’acide sulfurique, puis les monosaccharides sont déshydratés

par le phénol (coloration orange). Le protocole opératoire de dosage des polysaccharides

est décrit dans le Tableau II.5.

Tableau II.5. Protocole de dosage des polysaccharides

Polysaccharides

1 mL de Phénol à 5 % m/V

+ 1 mL d’échantillon


5 mL d’H2SO4 concentré

Bain marie à 100°C pendant 5 min


Lecture à 492 nm contre un blanc réactif (tampon phosphate)

La concentration en polysaccharides est établie à partir d’une gamme étalon réalisée

avec du glucose (D-glucose, anhydrique, 99 %).

Dosage des matières actives phytosanitaires : l'analyse des différentes

molécules actives est réalisée par Chromatographie Liquide Haute Performance

(HPLC) SHIMADZU LC-10 ATVP avec une colonne de séparation Nucléosil C18,

Machrey nagal AG et un détecteur SHIMADZU UV-VIS. La phase mobile utilisée est

présentée dans le Tableau II.6. Pour déterminer les concentrations en matières

actives phytosanitaires dans les effluents, une gamme étalon avec les différentes

molécules à analyser est réalisée. Dans le cas du dosage des matières actives dans

les échantillons d'effluents, un volume de 5 mL d’échantillon est évaporé à sec à 5

°C. le résidu est dilué dans 5 mL de phase mobile. L’échantillon est filtré à 0,45 µm

sur une membrane en polypropylène (PP) avant son injection dans la colonne.


56

Tableau II.6. Phase mobile utilisée en HPLC

Les autres molécules sont dosées par le laboratoire, accrédité COFRAC, CARSO

France.

Détermination de la toxicité aiguë par inhibition de « Thamnocephalus

platyurus » : la toxicité est quantifiée selon la méthode Microbiotest®. Ce kit

rapide est basé sur l’ingestion ou non par les crustacés Thamnocephalus platyurus

de microsphères rouges, lorsque les crustacés sont mis en contact avec l’effluent.

Au cours de l’observation, les crustacés qui sont devenus rouges, sont comptés

comme résistants à l’eau polluée (Figure II.3). Pour la détermination du

pourcentage d’inhibition, chaque mesure est triplée.

Matières actives Phase mobile Détecteur UV-VIS Débit

Azoxystrobine Acétonitrile/eau : 50/50 220 nm 1,4 ml/min Chlorpyriphos éthyl Acétonitrile/eau : 80/20 225 nm 1,4 ml/min

Cymoxanil Acétonitrile/eau : 30/70 240 nm 1,4 ml/min Dimétomorphe Acétonitrile/eau acidifiée : 40/60 240 nm 1 ml/min

Diuron Acétonitrile/eau : 50/50 225 nm 1,4 ml/min Fludioxonil Acétonitrile/eau : 50/50 265 nm 1,4 ml/min

Folpel Acétonitrile/eau : 40/60 225 nm 1,4 ml/min Quinoxyfène Acétonitrile/eau acidifiée : 80/20 236 nm 1,4 ml/min Vinchlozoline Acétonitrile/eau : 70/30 225 nm 1,4 ml/min


57

Figure II.3. Protocole expérimental du test écotoxicologique.

S : Standard ; T : témoin eau ; E : Echantillon

Crustacés déshydratés + 1 mL d’eau

5 ml d’échantillon ou

5 ml d’eau témoin

S

S

T1 T2 T3

E1 E2 E3

Incubation 40 h. à 25°C

Repos 1 h.

500 µl de crustacés hydratés

S T1 T2 T3 S E1 E2 E3

Microsphères colorantes

Fixateur

S T1 T2 T3 S E1 E2 E3

S T1 T2 T3 S E1 E2 E3

200 µl de microsphères colorantes

Incubation 30 min. à 25 °C

3 gouttes de fixateur et repos 5 min.

Prélèvement de 200 µl placé entre lame et lamelle Observation microscopique (grossissement X100)

Photo d’un crustacé mort lors de la mise en contact avec le toxique.

Photo d’un crustacé après ingestion des microsphères rouges.


58

II.3.2. Analyses des boues

Volume de boue « Vb » : Il correspond au volume de boues après 2 h de décantation

de la liqueur mixte dans un cône d’Imhoff. Si le volume de boue décanté est inférieur à

100 mL, alors la quantité de boues présente dans le bioréacteur est insuffisante. Lorsque

le volume est compris entre 100 mL et 750 mL, la quantité de boues présente dans le

bioréacteur est suffisante. Par contre, si le volume est supérieur à 750 mL, il y a un

développement de bactéries filamenteuses ou une trop forte concentration en boues.

Analyse microscopique : l'examen microscopique des boues est effectué à l’aide d’un

microscope équipé d'un système de photographie instantanée. Il permet de déterminer

l’état de floculation des boues et les micro-organismes indicateurs du traitement

biologique des effluents. La présence ou l’absence de certains micro-organismes permet

d’évaluer la qualité de la boue.

Les matières sèches « MS » et les matières volatiles « MVS » : les mesures de la

concentration en MS et MVS sont réalisées selon la méthode normalisée AFNOR NF-T 90-

105. La méthode consiste à prélever un volume de suspension qui est séché à l’étuve à

105°C pendant 24 heures, refroidi au dessiccateur puis pesé. La concentration en MS est

donnée par différence entre les deux pesées, ramenée au volume. La concentration de

MVS est obtenue après calcination du résidu précédent à 550°C pendant deux heures,

refroidi au dessiccateur.

Dosage des matières actives phytosanitaires : l'analyse des différentes

molécules actives est réalisée par Chromatographie Liquide Haute Performance

(HPLC) SHIMADZU LC-10 ATVP avec une colonne de séparation Nucléosil C18,

Machrey-Nagal AG et un détecteur SHIMADZU UV-VIS. La phase mobile utilisée est

présentée dans le Tableau II.6. La méthode d'extraction des molécules

phytosanitaires dans les boues a été mise au point au laboratoire et est décrite sur

la Figure II.4.


59

Figure II.4. Méthode d’extraction des matières actives phytosanitaires contenues dans les boues

Les équipements (bioréacteur et jar-test) serviront à étudier l’épuration des effluents par

procédés à boues activées (effluents vinicoles, matières actives et produits phytosanitaires ;

effluents viti-vinicoles de synthèse). Les efficacités d’épuration et les comportements de la

biomasse seront quantifiés par méthodes d’analyses qui ont été présentées dans ce chapitre.

Standard

Ultrasons (5 minutes) +

Agitation mécanique (1 h)

Lyophilisation + Broyage à N2

Extraction dans 20 mL de solvant Dichlorométhane/Méthanol (60/40)

Ultrasons (30 min.) +

Filtration (filtre wathman n°1)

Evaporation des 3 filtrats +

Dosage par HPLC

X 3

Echantillon 100 mL de solution de

pesticide à une concentration de deux

rinçages à la parcelle

100 g de boues concentrées,

10 min. ; 2000 rpm

CHAPITRE III

RESULTATS ET DISCUSSION

Partie résultats et discussion 1

60

PARTIE RESULTATS ET DISCUSSION 1

Dégradation biologique des matières actives phytosanitaires

La mise en place de différents procédés d’épuration des effluents viticoles (eau de lavage

des pulvérisateurs) et vinicoles (eau de lavage du matériel vinaire) c’est imposé au

secteur viticole. L’amélioration de la biodégradabilité des pesticides et le développement

des bonnes pratiques agricoles permettent d’envisager le développement d’un procédé de

traitement biologique économique pour le viticulteur. Kipopoulou et al. (2004) ont étudié

la dégradation du Lindane par différents micro-organismes présents dans les boues

activées urbaines et industrielles (agroalimentaires). Ces travaux montrent que la

biodégradation d'un pesticide est un processus complexe qui dépend de l'interaction de

plusieurs facteurs (oxygène, pH, température ou alimentation). La biodégradabilité est

fonction de la structure chimique et de la concentration des composés, de leurs

interactions et des conditions environnementales. Cette partie présente l’effet de chaque

molécule active pure sur des liqueurs mixtes vinicoles produites au laboratoire à partir de

boues d’origine urbaine.

III.1.1. Dégradation biologique des effluents vinicoles

Le but de l’étude de la dégradation biologique des effluents vinicoles est d'évaluer le

potentiel épuratoire du procédé par boues activées de matières organiques facilement

métabolisables. Les différentes analyses physico-chimiques et des observations

microscopiques ont déterminé la capacité de la biomasse à s’acclimater rapidement à un

nouveau substrat.

III.1.1.1. Mode opératoire

III.1.1.1.2. Caractéristiques physico-chimiques et biologiques des

boues activées initiales

Les boues activées sélectionnées pour les expérimentations ont été collectées à

deux reprises (Br1 et Br2) dans un bassin d'aération traitant des effluents urbains à

Latresne (33), France. L’unité est constituée d’étapes physiques et biologiques

traitant en totalité des effluents provenant de rejets urbains.


61

Tableau III.1. Paramètres initiaux des liqueurs mixtes issues du traitement biologique de Latresne.

Les paramètres physico-chimiques qualifiant la liqueur mixte urbaine sont listés

dans le Tableau III.1. La liqueur mixte initiale introduite dans le bioréacteur 1 (Br1)

à une pollution organique (DCO = 830 mg.L-1), un volume de boues faible signe

d'une bonne décantation car les matières sèches présentes dans le milieu sont de

l'ordre de 9,5 g.L-1. La liqueur mixte introduite dans le bioréacteur 2 (Br2) a une

pollution organique moyenne d'environ 300 mg.L-1, une décantabilité de boues

moyenne (550 mL.l-1) avec une teneur en matières sèches d'environ 3 g.L-1.

Tableau III.2. Observation des micro-organismes des boues activées de Latresne.

X densité faible (<5 organismes/lame) ; XX densité moyenne ; XXX densité forte/abondance (non quantifiable)

Br 1 Br 2

bacteries libres XXX XX

Flocs XXX X

Observations bactéries filamenteuses XXX XXX

petits flagellés XX XXX

grands flagellés

Euglypha X sarcodines thécamébiens

Arcella X

Paramecium x

Holophya X

Litonotus

Chilodomela xx

ciliés holotriches

Trachelophyllum XX

vorticelle pédoncule

court

Opercularia X ciliés peritriches

Zoothammium

Apidisca XXX XX

Protozoaires

ciliés spirotriches Euplote XX

Monogononta X rotifères

Digononta

nématodes Métazoaires

oligotèches Alelosama

Analyses Valeurs initiales Br 1 Valeurs initiales Br 2

Le substrat

DCO 830 ± 86 mg.L-1 326 ± 54 mg.L-1

La biomasse

Volume de boues 350 ± 14 mL.L-1 550 ± 164 ml.L-1

Turbidité 62 ± 19 NTU 12,7 ± 4 NTU

Matières sèches 9,57 ± 0,2 g.L-1 3,08 ± 0,53 g.L-1


62

D’après la classification des différents micro-organismes présents dans les deux

liqueurs mixtes (Tableau III.2) ; Il est remarqué que la liqueur mixte de Br1 est

plutôt issue d’une unité de traitement à forte charge car la biomasse est importante

avec une dominance de bactéries et de ciliés libres (Vedry, 1996). En parralèle, la

liqueur mixte de Br2 est plutôt de charge moyenne puisque la biomasse active est

composée de ciliés fixés et libres, de sarcodines et de petits flagellés. Ainsi, la

liqueur mixte du bioréacteur 2 est plus variée en micro-organismes que la liqueur

mixte du bioréacteur 1 (Vedry, 1987).

III.1.1.1.3. Protocole d’essai

Les expérimentations sont effectuées sur le bioréacteur de 30 L (chapitre II. 1.1.). Au

cours des expériences, la charge volumique est fixée à 0,9 kg DCO.m-3.j-1 et la biomasse

est maintenue à X= 6 g.L-1 avec une charge massique 0,15 g DCO.g MES-1.j-1.

Lors de l’expérimentation, les paramètres du bioreacteur sont comme suit : 150 tr.min-1,

4 mg O2.L-1, pH=7 à 20 °C. Le volume de liqueur mixte est de 20 litres ; les boues sont

aérées en continu et maintenues en suspension par un agitateur. Deux litres d’effluent

sont soutirés chaque jour et un volume équivalent d’effluent d’entrée est rajouté. Les

boues non utilisées par les analyses sont réintroduites. La Figure III.1 schématise

l’expérimentation.

Expérimentation 1 : L’effluent d’entrée du bioréacteur Br1 est un vin rouge jeune sulfité

et non enzymé représentant un effluent type de soutirage (nettoyage de cuverie). Il est

stocké à – 4 °C pour éviter une prolifération importante des micro-organismes. La DCO

de l’effluent est de 175 g.L-1. L’effluent est dilué pour obtenir 2 L d’effluent pour

alimenter le bioréacteur à une charge volumique de 0,9 g DCO.L-1.j.

Expérimentation 2 : L’effluent d’entrée du bioréacteur Br2 représente un effluent de

nettoyage de filtres produit par une cave vinicole. Il est stocké à – 4°C pour éviter une

prolifération importante des micro-organismes. L’effluent de filtration est dilué pour

obtenir 2 L d’effluent qui servira à nourrir quotidiennement le bioréacteur permettant

d’avoir une charge volumique de 0,9 g DCO.L-1.j. La DCO de l’effluent est de 272 g.L-1.

Les deux effluents type sont ajustés en azote et phosphore pour faciliter la dégradation

des micro-organismes. Le rapport est tel que : DCO/N/P = 150/10/1 (Leon-Cruz, 1999).

Chaque jour, l’effluent d’entrée (2 L) est collectés pour les analyses. Dans les

expériences, les échantillons de liqueur mixte collectée sont séparés en trois aliquotes,


63

tous analysés indépendamment les uns des autres pour déterminer l'incertitude

expérimentale.

Dans les expériences, les échantillons collectés à plusieurs intervalles de temps ont été

analysés. L’observation de l’épuration s’effectue sur une période de 50 jours. L’évolution

de la biomasse est déterminée en utilisant les Matières Sèches (MS), les Matières En

Suspension (MES), la turbidité et le volume de boues. Pour évaluer la performance du

pilote, la DCO est mesurée dans l'effluent. Pour compléter l’expérimentation, un suivi de

l’évolution des micro-organismes ainsi que de la toxicité est effectué.

Figure III.1. Récapitulatif des expérimentations.

III.1.1.2. Etude de la dégradation des effuents vinicoles

Elle présente l’évolution des paramètres dans le temps pour déterminer

l’acclimatation des boues municipales aux effluents vinicoles afin de nous fournir

une liqueur mixte vinicole stable pour l’étude avec les produits phytosanitaires.

III.1.1.2.1. Evolution de la DCO

La Figure III.2 représente l’évolution de la DCO totale du surnageant au cours de

l’expérimentation 1 et 2.

AIR

bioréacteur V=20 litres de liqueur mixte

2L Effluent vinicole en

entrée / jour

2L de boues activées en sortie/jour

Recirculation des boues

pH non régulé

Vitesse d’agitation =150 rpm

TRH = 10 jours

Oxygène à 4mg.L -1

Expérimentation 1 (BR1)

Effluent de soutirage

100 mL de vin rouge avec 2,9 g de KNO3 et 0,82 g de KH2PO4 complété à 2 litres d’eau minérale

Expérimentation 2 (BR2)

Effluent de filtration

100 mL de vin rouge avec 60 g de levures Saccharomyces cerevisiae, 2 g de bentonite, 50 g de Diatomées (Diatomyl), 2,6 g de KNO3, 0,82 g de KH2PO4 complété à 2 litres d’eau minérale.


64

Figure III.2. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) en traitement biologique.

Toute biomasse en présence d’un nouveau substrat subit une phase d’acclimatation qui

est visualisée par les fluctuations de DCO sur la Figure III.2. La biomasse s’adapte et

permet ensuite la réduction de la DCO. Le temps d’adaptation est inférieur à 50 jours. Au

50ème jour, la DCO est de 201 mg.L-1 pour Br1 et de 170 mg.L-1 pour Br2 soit inférieure à

300 mg.L-1 qui est la valeur limite du rejet des effluents vinicoles, conformément à la

législation du décret du 15 mars 1999. Ainsi, les fluctuations de la DCO observées

correspondent au temps d'adaptation de la biomasse. Bouhabila (1999) a observé ce

phénomène dans un bioréacteur à membranes immergées ce qui tend à démontrer que

la variation de la DCO est due à l’acclimatation des micro-organismes.

III.1.1.2.2. Comportement des boues

� Production de boues et variation du pH

Figure III.3. Evolution du volume de boues (Vb) et du pH au cours du traitement biologique.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 3 5 7 10 20 27 32 38 49 Temps (jours)

Vb (ml.L-1)

1,00

3,00

5,00

7,00

9,00

11,00

13,00 pH

BR2 (Vb) BR1 (Vb)

BR1 (pH) BR2 (pH)

0

200

400

600

800

1000

0 10 20 30 40 50

Temps (jours)

DCO mg.L-1

BR1 BR2


65

L’évolution du volume de boues et du pH dans Br1 et Br2 est présentée dans la

Figure III.3. Les mesures sont réalisées à partir du premier jour d’ajout (t = 0) et

suivies pendant 49 jours. Ces mesures permettent de voir rapidement les problèmes

d’un traitement biologique.

Dans les 2 bioréacteurs (Br1 et Br2), le pH se maintient entre 6,5 et 7,5 avec de faibles

variations au cours du temps. Ainsi, sans stabilisation du pH par ajout d’acide ou de base

celui-ci se maintient à un pH neutre (pH = 7).

Dans le bioréacteur Br1, le volume de boues initial est de 350 mL.L-1 dans la liqueur

mixte urbaine. Lors de l’ajout du substrat vinicole de soutirage (T = 0 j), celui-ci

augmente à environ 800 mL.L-1 indiquant une défloculation rapide des micro-organismes

en présence d’un nouveau substrat. Le même phénomène est observé avec la liqueur

mixte du bioréacteur 2, qui a un volume de boues initial à 550 mL.L-1 qui double lors de

l’ajout du substrat vinicole de filtration.

Dès le début du traitement, le volume de boues est relativement élevé puisqu’il est

supérieur à 750 ml et entraîne des difficultés de décantation jusqu’au 20ème jour

environ. Ensuite, le volume de boues diminue progressivement dans les deux cas.

Le volume de boues obtenu dans les deux expérimentations est de quantité

« satisfaisante » pour déterminer l’incidence des pesticides sur la biomasse

(chapitre III.1.2. La dégradation des molécules actives phytosanitaires par boues

activées) puisqu’il est compris entre 400 et 700 mL. La diminution du volume de

boues est due à l’acclimatation des micro-organismes qui s'agglomèrent pour former

des flocs décantables.

� Evolution des Matière Sèches et de la turbidité

L'évolution des matières sèches représente en majorité la biomasse présente dans

les liqueurs mixtes. La Figure III.4, indique que les matières sèches (MS) dans le

Br2 sont relativement stables (4 g.L-1) tout au long du traitement biologique. Par

contre, dans Br1, il y a une chute des teneurs en MS jusqu’à 20 jours de traitement

puis une stabilisation à environ 4 g.L-1 de MS.


66

Figure III.4. Evolution des teneurs en Matières Sèches (MS) et en turbidité au cours du traitement biologique.

La turbidité représente les matières non décantées dans l'effluent de sortie (Figure III.4).

Dans Br2, La turbidité augmente jusqu'à une valeur maximale au 10ème jour de

traitement (790 NTU) puis diminue progressivement jusqu'à des valeurs de turbidité

inférieures à 200 NTU.

Dans Br1, la turbidité est globalement plus faible tout au long de l’acclimatation (< 604

NTU). Au début (t=0), la turbidité est de l’ordre de 62 NTU pour augmenter rapidement

dès le deuxième jour, signe d’une acclimatation des micro-organismes épuratoires. Après

deux jours en contact avec l’effluent vinicole, la turbidité décroît régulièrement pour se

stabiliser à des valeurs très faibles, de l’ordre d’une dizaine d’unités néphélométriques.

� Aspect microscopique des boues

A la fin du traitement biologique, les boues acclimatées aux effluents vinicoles sont

moins variées en micro-organismes (Tableau III.3 et Tableau III.4). Pour le

bioréacteur 1, en fin de traitement, les flocs sont plus denses. Il y a moins de

bactéries libres, de ciliés et de sarcodines mais une apparition de rotifères.

Cette évolution des micro-organismes est signe d'une aération prolongée et d’un

âge élevé des boues. La présence de métazoaires de la famille des rotifères indique

un fonctionnement stable et une épuration poussée (Calner et al., 1998).

0

2

4

6

8

10

12

0 3 5 7 10 20 27 32 38 49

Temps (jours)

MS (mg.L-1)

0

200

400

600

800

1000Turbidité (NTU)BR1 (MS) BR2 (MS)

BR1 (Turbi) BR2 (Turbi)


67

Tableau III.3. Observation des micro-organismes des boues activées de l’expérimentation 1.


initial En cours Fin d’acclimatation

bacteries libres XXX XXX X

flocs XXX XX XXX

Observations bacteries filamenteuses XXX X X

petits flagellés XX XX

grands flagellés

euglypha XX

proteus x

hartamanelia X

sarcodines

thécamébiens

arcella XXX X

paramecium xx

holophya X ciliés holotriches

chilodomela XX

vorticelle pédoncule court XXX XX

vorticelle pédoncule long XX ciliés péritriches

epistylis X

Protozoaires

ciliés spirotriches apidisca XX

monogononta X XX Métazoaires rotifères

digononta

L’observation des micro-organismes des boues activées du bioréacteur 2 indique la

présence de bactéries filamenteuses avec une mauvaise floculation. La présence des

bactéries libres n'a pas varié au cours du traitement.

Les protozoaires nombreux en début et en cours de traitement sont peu présents en fin

d'expérimentation. Les protozoaires de la famille des flagellés ont disparu et ont laissé

place à un développement de Sarcodines et de thécamébiens.

Le développement de cette famille de protozoaires est lié à la stabilité du système

entraînant une bonne qualité des eaux de sortie. En parallèle, le développement de

métazoaires de type rotifère indique lui aussi un bon fonctionnement de l'installation

mais avec un âge de boues élevé (Calner et al., 1998).


68

Tableau III.4. Observation des micro-organismes des boues activées de l’expérimentation 2.


initial En cours Fin d’acclimatation

bacteries libres XX XX XX

Flocs X X XX

Observations bacteries filamenteuses XXX XXX XXX

petits flagellés XXX

grands flagellés

euglypha x XX XXX

Mayorella XX

proteus XX

hartamanelia XX

sarcodines thécamébiens

arcella x XX XXX

paramecium X

chaenea XX ciliés holotriches

trachelophyllum XX XXX

vorticelle pédoncule court X

vorticelle pédoncule long XX

epistylis X

opercularia x

ciliés péritriches

zoothammium X

Protozoaires

ciliés spirotriches apidisca XX XX

monogononta Métazoaires rotifères

digononta X XXX

L'observation des liqueurs mixtes des bioréacteurs 1 et 2 indique que l'évolution des

micro-organismes est similaire. En effet, les liqueurs mixtes contiennent les mêmes

familles de protozoaires et de métazoaires. Le développement de cette microfaune

montre que les effluents vinicoles sont facilement biodégradables et que les effluents de

sortie sont de bonne qualité.

III.1.1.3. Comparaison des deux modalités

La biomasse en présence d’un nouveau substrat subit une phase d’acclimatation.

Pour les deux expérimentations, au 50ème jour de traitement biologique, la DCO est

conforme à la législation. Les micro-organismes sont adsorbés à la surface des flocs

pendant une courte période après la mise en contact du nouveau substrat avec la

liqueur mixte provoquant une diminution de la DCO et favorisant la croissance de la

biomasse. Par la suite, certains métabolites sont relargués sous forme solubilisée

avant de subir une deuxième étape de dégradation (Cresson et al., 2006). Ainsi, les

fluctuations de la DCO observées correspondent au temps d'adaptation de la

biomasse. Les matières sèches sont relativement stables tout au long des

traitements biologiques et sont de l'ordre de 5 g.L-1.


69

A la fin d’acclimatation biologique, les boues acclimatées aux effluents vinicoles sont

moins variées en espèces de micro-organismes. L'observation des liqueurs mixtes du

bioréacteur 1 et 2 indique une évolution similaire des micro-organismes. En effet, les

liqueurs mixtes contiennent les mêmes familles de protozoaires et de métazoaires. Le

développement de cette microfaune montre que les effluents vinicoles sont facilement

biodégradables et que les effluents de sortie sont de bonne qualité. Le volume de boue

obtenue dans les deux expérimentations est compris entre 400 et 700 mL.L-1. La

diminution du volume de boues est due à l’acclimatation des micro-organismes qui

s'agglomèrent pour former des flocs décantables.

Ainsi, dans les deux modalités, après 50 jours, les valeurs de DCO, de matières sèches,

de volume de boues et de la turbidité sont similaires pour les deux essais. La seule

différence observée se situe au niveau de la nature même des micro-organismes

présents dans les boues.

L’évaluation de l’efficacité de la dégradation des pesticides par les différentes

microfaunes permettra d'évaluer l'efficacité épuratoire des micro-organismes présents.

Cette évaluation repose essentiellement sur des analyses de DCO, de

phosphore/phosphate et des analyses de résidus de pesticides sur l’effluent et sur les

boues. L'évolution de la biomasse est quantifiée par des mesures de volume de boues, de

matières sèches, de matières en suspension, de turbidité et d’exopolymères cellulaires. A

ces analyses, se sont ajoutés des tests d’écotoxicité permettant d’évaluer la dégradation

des pesticides et leurs toxicités sur l’environnement à des concentrations de un rinçage à

la parcelle.

III.1.2. La dégradation des molécules actives par boues activées

Le but de l’expérimentation est d'évaluer le potentiel épuratoire du procédé par boues

activées pour la dégradation de différentes molécules phytosanitaires. Les analyses

physico-chimiques et des observations microscopiques ont déterminé la capacité de la

biomasse à éliminer cette pollution toxique.

III.1.2.1. Les molécules phytosanitaires

Le Tableau III.5 représente les matières actives sélectionnées pour les

expérimentations. Les concentrations des pesticides sélectionnés correspondent à

celles retrouvées après lavage et rinçage du matériel de pulvérisation (un rincage à

la parcelle).


70

Tableau III.5. Récapitulatif des molécules actives phytosanitaires testées.

III.1.2.2. Protocole d’essai

Le dispositif jar-test applique les mêmes modalités de fonction à plusieurs récipients à la

fois. Il est constitué de six récipients en verre d’une capacité d’un litre dans lesquels des

hélices permettent d’agiter la liqueur mixte. La durée et l’intensité de la rotation sont

définies par le manipulateur. De plus, un système d‘aération via un compresseur permet,

à l’aide de frittés d’aquarium, d’aérer les boues (Figure III.5).

Figure III.5. Descriptif du procédé expérimental

Les boues activées sont acclimatées aux effluents vinicoles dans le bioréacteur de 30

litres : Br1 liqueur mixte produite à partir d’un effluent de soutirage ; Br2 liqueur mixte

Matières Actives Famille chimique Concentrations

(mg.L-1)

Azoxystrobine strobilurine 170 Chlorpyriphos éthyl organo-phosphoré 260

Cymoxanil amide 800 Cyprodinil pyrrole 1000

Difénoconazole triazole 20 Dimétomorphe dérivé acide cinnamique 200

Diuron urée substituée 990 Fludioxonil pyrrole 330

Folpel imide 1000 Fosétyl aluminium organo-phosphoré 1010

Glyphosate organo-phosphoré 720 Hexaconazole triazole 170

Mancozèbe carbamate 110 Oryzalin toluidine 130

Quinoxyfène quinoléine 34 Vinchlozoline imides 500

rotation à 60 rpm

sonde à oxygène

900 mL de liqueur mixte issue du bioréacteur nourrie avec 99 mL de

solution de pesticides à un rinçage à la parcelle et 1 mL de méthanol


71

produite à partir d’un effluent de filtration. Considérant les conditions de fonctionnement

d’un système d’épuration, la proportion entre le volume de liqueur mixte et les effluents

viticoles introduits est fixée à 1/10, soit pour un volume d’un litre : 900 mL de liqueur

mixte et 100 mL d’effluent (concentration en pesticides correspondant à un rinçage à la

parcelle). On dissout le pesticide dans 1 mL de méthanol avant de compléter la fiole

jaugée de 100 mL au trait de jauge car les pesticides testés sont difficilement solubles

dans l’eau. Le témoin utilisé est composé de 1 mL de méthanol et de 99 mL d’eau

minérale.

Dans chaque bécher, à 900 mL de Liqueur mixte produite à partir d’un effluent de

soutirage (LM-soutirage) ou d’un effluent de filtration (LM-filtration) est ajouté 100 mL

d’une solution de pesticides à une concentration à un rinçage à la parcelle.

La biodégradation est suivie selon le mode opératoire suivant : après l’introduction de la

solution de pesticides, l’agitation est fixée à 60 rpm. L’observation de l’épuration des

pesticides s’effectue sur une période de 8 jours. Après 8 jours de traitement, l’effluent et

les boues sont séparées en laissant décanter pendant 30 minutes dans le Jar-test. Les

boues sont centrifugées 10 minutes à 4°C et à 2000 tours/minute pour être lyophilisées.

On conserve les échantillons (effluent + boues) à – 4°C.

Pour suivre l’évolution de la dégradation, les analyses suivantes sont effectuées : la

couleur, l’odeur, les matières sèches (MS), les matières en suspension (MES), le volume

de boues, les polysaccharides, la demande chimique en oxygène (DCO), le phosphore et

le phosphate, l’identification et la recherche des micro-organismes, les analyses

chromatographiques et l’écotoxicité.

III.1.2.3. Etude de la biodégradation

III.1.2.3.1. Evolution de la DCO

Le Tableau III.6 présente le résultat des DCO du témoin et les DCO de chaque

pesticide après traitement biologique. Le tableau est complété par l’évolution des

DCO au cours de la dégradation (annexe 6).

La DCO résiduelle correspond à la différence entre la DCO finale obtenue entre le témoin

et les essais. Le pourcentage d'efficacité du traitement biologique, pour le témoin, est de

l'ordre de 89-90 % dans les deux expérimentations. L’efficacité observée correspond à la

dégradation d’une solution contenant 1 % de méthanol qui est utilisée pour la dissolution

des molécules hydrophobes comme les pesticides.


72

Tableau III.6. DCO (mg O2.L-1) avant (T= 0 jours) et après traitement (T= 8 jours) biologique des pesticides,

la DCO résiduelle et le pourcentage d’efficacité.

L’efficacité globale épuratoire des liqueurs mixtes issues des traitements d’un effluent de

soutirage et de filtration est similaire et de l’ordre de 86 - 88 %. Cette constatation est

également observée pour les teneurs en DCO résiduelles. Globalement, ces deux liqueurs

mixtes dégradent la matière organique avec un rendement épuratoire satisfaisant pour

huit jours de traitement biologique. La DCO résiduelle est positive, signe d’une plus

mauvaise dégradation de la matière organique lorsqu’il y a un produit phytosanitaire. Si

on compare les pourcentages d’efficacité épuratoire entre les différentes molécules

phytosanitaires, il est observé des écarts importants.

Avec la liqueur mixte du traitement des effluents de soutirage, seul cinq pesticides ont

des pourcentages d’efficacité inférieurs à celui du témoin. Ces derniers sont représentés

en orange dans le Tableau III.6. Pour exemple, le rendement épuratoire des liqueurs

mixtes le plus faible est obtenu en présence de folpel. Celui-ci n’est alors que de 78 %.

LM - soutirage LM - filtration

T=0 jours

(initial)

T=8 jours

final efficacité (%) résiduelle

T=0 jours

(initial)

T=8 jours

final efficacité (%) résiduelle

Témoin 1514 ± 157 174 ± 33 89 1540 ± 208 149 ± 79 90

Folpel 1643 ± 171 368 ± 70 78 194 2588 ± 349 118 ± 63 95 -31

Hexaconazole 1722 ± 179 165 ± 31 90 -9 1817 ± 245 544 ± 290 70 395

Fosetyl aluminium 1724 ± 179 173 ± 33 90 -1 1820 ± 246 377 ± 201 79 228

Oryzalin 1614 ± 168 178 ± 46 89 4 ND ND ND ND

Cyprodinil ND ND ND ND 1876 ± 253 117 ± 62 94 -32

Mancozèbe 1775 ± 184 293 ± 55 83 119 1578 ± 213 348 ± 185 78 199

Glyphosate 1652 ± 172 191 ± 36 89 17 1799 ± 243 771 ± 411 57 622

Azoxystrobine 1643 ± 170 211 ± 40 87 37 1494 ± 202 135 ± 72 91 -14

Chlorpyriphos éthyl 1703 ± 176 245 ± 47 86 71 2543 ± 343 107 ± 57 96 -42

Cymoxanil 1661 ± 172 247 ± 47 85 73 2606 ± 352 120 ± 64 95 -29

Dimétomorphe 1643 ± 170 290 ± 55 82 116 2588 ± 349 123 ± 66 95 -26

Difénoconazole ND ND ND ND 1825 ± 246 101 ± 54 94 -48

Diuron 1661 ± 172 252 ± 47 85 78 2606 ± 352 133 ± 71 95 -16

Fludioxonil 1643 ± 170 193 ± 50 88 19 1460 ± 197 102 ± 54 93 -49

Quinoxyfène 1653 ± 172 244 ± 46 83 70 1799 ± 243 143 ± 76 92 -6

Vinchlozoline 1653 ± 172 218 ± 41 84 44 1799 ± 243 186 ± 99 90 37

Min - Max 78 à 90 -9 à 194 57 à 96 -49 à 622

Moyennes 86 60 88 79


73

Avec la liqueur mixte du traitement des effluents de filtration, seulement quatre

pesticides ont des pourcentages d’efficacité inférieurs à celui du témoin. Ces derniers

sont représentés en orange dans le Tableau III.6. Pour exemple, le rendement épuratoire

des liqueurs mixtes le plus faible est obtenu en présence de glyphosate. Celui-ci n’est

alors que de 57 %.

Pour les deux expérimentations, il est observé en moyenne une teneur en DCO résiduelle

en fin de traitement biologique des molécules phytosanitaires, positives pour les liqueurs

mixtes issues du traitement des effluents de soutirage et inversement, négatives pour les

liqueurs mixtes issues du traitement des effluents de filtration.

Ces résultats indiquent que les liqueurs mixtes vinicoles ne perdent pas leur potentiel

épuratoire lorsqu’elles sont en contact avec les molécules phytosanitaires. L’abattement

moyen des teneurs en DCO est toutefois moins important en présence de pesticides

qu’en absence.

III.1.2.3.2. Evolution du phosphore total et du phosphate

Les composés phosphatés dans la culture des boues activées jouent un rôle

essentiel pour la croissance et la formation des flocs (Wu et Okrutny, 1982).

L'évolution de ces composés est représentée dans le Tableau III.7.

Avec la liqueur mixte du traitement des effluents de soutirage, les teneurs en

phosphore à la fin du traitement biologique des différents pesticides sont plus

faibles que pour le témoin. Il y a donc une consommation ou une absorption du

phosphore par les micro-organismes présents dans les boues. La présence de

molécules contenant déjà du phosphore comme le chlorpyriphos éthyl, le fosétyl

aluminium et le glyphosate rentre faiblement en compte dans les teneurs en

phosphore retrouvé. Il est observé le même phénomène pour le phosphate présent

dans les effluents après traitement biologique (annexe 7).

Avec la liqueur mixte du traitement des effluents de filtration, les teneurs en phosphore

total et en phosphates dans les effluents contenant les pesticides sont plus élevées que

pour le témoin. Cette augmentation des teneurs en phosphore et en phosphate est

observée dans la majorité des pesticides sauf pour l’azoxystrobine, le cyprodinil, le

mancozèbe, le fludioxinil et le difénoconazole.


74

Tableau III.7. Evolution du phosphore total (mg.L-1) avant et après traitement biologique de chaque pesticide et

son pourcentage d’augmentation.

LM-soutirage LM-filtration

Phosphore total (final) Augmentation (%) Phosphore total (final) Augmentation (%)

Témoin 231± 53 157 ± 30

Folpel 185 ± 42 - 20 263 ± 72 40

Hexaconazole 216 ± 49 -6 366 ± 100 57

Fosétyl aluminium 207 ± 47 -10 411± 112 62

Cyprodinil ND ND 123 ± 33 -22

Oryzalin 193 ± 44 -16 ND ND

Mancozèbe 261 ± 60 13 114 ± 31 -27

Glyphosate 165 ± 38 -29 399 ±109 61

Azoxystrobine 226 ± 52 -2 125 ± 34 -20

Chlorpyriphos éthyl 194 ± 44 -16 308 ± 84 49

Cymoxanil 211 ± 48 -9 259 ± 71 39

Diméthomorphe 212 ± 49 -8 262 ± 71 40

Diuron 178 ± 41 -23 236 ± 64 33

Fludioxonil 133 ± 30 -42 127 ± 35 - 19

Difénoconazole ND ND 128 ± 35 - 18

Quinoxyfène 202 ± 46 -13 388 ± 106 59

Vinchlozoline 180 ± 41 -22 384 ± 105 59

Min - Max -42 -13 -27 -62

Moyennes - 14,5 27

L'augmentation de ses teneurs est liée à une libération du phosphore total par la

biomasse présente dans les boues ou lors des lyses bactériennes. Au cours de la

dégradation des molécules phytosanitaires, la microfaune s'adapte à ce nouveau

substrat. Différents auteurs ont observé le même phénomène lors de la dégradation du

4-chlorophénol (Wang et al., 1999). Pour exemple, ce substrat lorsqu'il est mis en

contact avec une culture d’Alcaligenes eutrophus a une acclimatation rapide avant de

pouvoir le dégrader et peut aussi entraîner une inhibition complète lorsque la

concentration en toxique est trop élevée. Lors de la phase d’acclimatation, il y a un

relargage par les micro-organismes de différents métabolites provenant de la

dégradation du substrat (Hirooka et al., 2006). Ces phénomènes d’adsorption et de

relargage du phosphore sont complexes sur des matrices biologiques. De très nombreux

paramètres interviennent : pH, potentiel redox, nature chimique du phosphore,… (Gomez

et al., 1999).


75

III.1.2.3.3. Evolution de la concentration en pesticides dans l’effluent

Dans l’effluent après traitement biologique, seulement 9 des 16 pesticides testés ont

été recherchés. Les résultats de ces analyses sont présentés sur le Tableau III.8.

Tableau III.8. Evolution de la teneur en pesticides (mg.L-1) avant et après traitement biologique de chaque

pesticide dans l’effluent et pourcentage d’élimination.

Liqueur mixte LM-soutirage LM-filtration

avant traitement

(mg/L)

après traitement

(mg/L) % d’élimination

après traitement

(mg/L) % d’élimination

Azoxystrobine 17,3 3,2 81,5 0,933 95

Chlorpyriphos

éthyl 26,7 1,5 94 ND ND

Cymoxanil 80,5 2,4 97,0 6,5 92

Dimétomorphe 19,7 2,5 87 7,65 61

Diuron 98,7 5,8 94,1 17,34 82

Fludioxonil 107,7 8,2 92,3 0,83 97

Folpel 100,0 0,1 99,9 0,6 99

Quinoxyfène 3,3 0,026 99,2 1,65 50

Vinchlozoline 50,1 1,33 97,3 ND ND

Dans les deux expérimentations, la majorité des pesticides analysés sont éliminés à plus

de 80 % mais l’efficacité varie en fonction de la nature du pesticide. Cependant, le

quinoxyfène, et le dimétomorphe ne sont éliminés qu’à 60 % et 50 % dans la liqueur

mixte issue du traitement des effluents de filtration. Les pesticides sont, soit dégradés,

soit absorbés sur les boues (Ribanova et al., 2002). Le dosage dans les boues doit

permettre de faire un bilan global de l’efficacité de l’épuration.

III.1.2.3.4. Evolution de la concentration en pesticides dans les boues

Les résultats des analyses des pesticides dans les boues apparaissent dans le

Tableau III.9.


76

Tableau III.9. Evolution de la teneur en pesticides dans les boues (µg.g-1 de MS) avant et après traitement

biologique de chaque pesticide.

Dans les deux expérimentations, les résultats mettent en évidence la faible teneur en

pesticides dans les boues après traitement. Les concentrations de résidus varient en

fonction de la nature du pesticide. Dans les liqueurs mixtes du traitement des effluents

de soutirage, les plus fortes concentrations de produits trouvés dans les boues sont le

folpel et le chlorpyriphos éthyl. Par contre, les autres pesticides analysés montrent des

teneurs très faibles < 0,1 mg/g de MS. Dans les liqueurs mixtes du traitement des

effluents de filtration, le fludioxonil est retrouvé en quantité importante par rapport aux

autres pesticides mais sa concentration initiale est elle aussi très élevée.

Tableau III.10. Bilan global de l’épuration avant et après traitement biologique de chaque pesticide

On remarque que la liqueur mixte issue du traitement de soutirage épure à 93 %

contrairement à la liqueur mixte issue du traitement de filtration qui ne dégrade qu’à 84

% (Tableau III.10).

Dans les deux expérimentations, les résultats obtenus montrent que les teneurs sont

globalement faibles dans les boues après le traitement et ne modifient pas le

pourcentage de dégradation global. Les pesticides sont dégradés par la biomasse et sont


Liqueur mixte Boues Boues

Matières Actives avant traitement (mg.L-1)

après traitement (µg/g de MS)

après traitement (µg/g de MS)

Azoxystrobine 17,3 16,6 8,3

Chlorpyriphos ethyl 26,7 106 ND

Cymoxanil 80,5 59 40

Dimethomorphe 19,7 ND 93,8

Diuron 98,7 ND 17,5

Fludioxonil 107,7 ND 765,9

Folpel 33,1 234 1,7

Quinoxyfène 3,3 3,3 1,5


Liqueur mixte Liqueur mixte Liqueur mixte

Matières Actives avant traitement (µg.L-1)

après traitement

(µg.L-1)

% de

dégradation

après traitement

(µg.L-1)

% de

dégradation

Azoxystrobine 17 300 3249 81 950 95

Chlorpyriphos éthyl 26 700 1821 93 ND ND

Cymoxanil 80 500 2602 97 6653 92

Dimétomorphe 19 700 ND ND 8035 59

Diuron 98 700 ND ND 17422 82

Fludioxonil 107 700 ND ND 2431 98

Folpel 33 100 1024 97 608 98

Quinoxyfène 3 300 127 96 1654 50


77

absorbés par celle-ci. Les résultats obtenus sont similaires à ceux obtenus par

Kipopoulou et al., 2004. Ils démontrent que le lindane, pesticide organochloré à une

concentration de 100 µg.L-1 est épuré par des boues activées municipales à 67-91 %

dans l’effluent et seulement 0,1 - 2,8 % se retrouvent dans les boues en 23 jours.

III.1.2.4. Comportement des boues

L'observation macroscopique des liqueurs mixtes montre une couleur et une odeur qui ne

varient pas au cours du temps. Les boues sont de couleur marron clair signe d’une bonne

aération et d’une bonne métabolisation du substrat par les micro-organismes.

III.1.2.4.1. Le volume de boues

Le Tableau III.11 présente les résultats de la différence entre le volume de boues du

témoin et le volume de boues de chaque pesticide après traitement biologique.

Tableau III.11. Evolution du volume de boues (mL.L-1 de liqueur mixte) après traitement biologique.


Final (mL.L-1) Augmentation (%) Final (mL.L-1) Augmentation (%)

Témoin 332 ± 38 150 ± 37

Folpel 284 ± 33 - 14 81 ± 20 - 47

Hexaconazole 313 ± 36 - 6 269 ± 66 44

Fosétyl aluminium 338 ± 39 2 325 ± 80 54

Oryzalin 381± 46 13 ND ND

Cyprodinil ND ND 306± 75 51

Mancozèbe 356 ± 41 7 200 ± 49 25

Glyphosate 325 ± 37 - 2 594 ± 147 75

Azoxystrobine 270 ± 31 - 19 175 ± 43 14

Chlorpyriphos éthyl 356 ± 41 7 131 ± 32 - 13

Cymoxanil 285 ± 33 - 14 131 ± 32 -13

Dimétomorphe 264 ± 30 - 20 113 ± 28 - 25

Difénoconazole ND ND 188 ± 46 20

Diuron 318 ± 36 - 4 175 ± 43 14

Fludioxonil 325 ± 37 - 2 269 ± 66 44

Quinoxyfène 419 ± 48 21 250 ± 62 40

Vinchlozoline 381 ± 44 13 250 ± 62 40

Mini - Maxi -20 à 21 -47 à 75

Moyennes - 1 21

Globalement, le volume de boues après traitement biologique par des liqueurs mixtes

issues de l’épuration d’un effluent de soutirage est similaire au témoin, contrairement

aux liqueurs mixtes issues de l’épuration de l’effluent de filtration.


78

Par exemple, le glyphosate provoque une augmentation du volume de boues de 75 % et

le folpel réduit le volume de 47 %. Dans les liqueurs mixtes issues du traitement de

l’effluent de filtration, l’augmentation du volume de boues est remarquée pour 11 des

molécules :

azoxystrobine ≈ diuron < difénoconazole <mancozèbe< quinoxyfène ≈ vinchlozoline

< hexaconazole ≈ fludioxinil < cyprodinil <fosétyl al < glyphosate

Après huit jours de traitement biologique, la décantabilité des boues issues de l’épuration

d’un effluent de soutirage, en présence de molécules phytosanitaires a évolué de manière

similaire au témoin. Néanmoins, les liqueurs mixtes issues d’un effluent de filtration

ayant dégradées les molécules phytosanitaires, ont un volume de boues supérieur à celui

du témoin. Ce phénomène est lié à la modification des teneurs en micro-organismes, à la

nature même de la microfaune ou à une déstructuration des flocs (Ribarova et al., 2002).

Par ailleurs, les métazoaires et les protozoaires qui sécrètent une grande quantité de

mucus contribuent à la formation des flocs et peuvent être affectés par les toxiques.

III.1.2.4.2. Les matières en suspension

Tableau III.12. Evolution des matières en suspension (g.L-1) avant et après traitement biologique de chaque

pesticide


Final (mg.L-1) Augmentation (%) Final (mg.L-1) Augmentation (%)

Témoin 133 ± 52 - 220 ± 21 -

Folpel 150 ± 45 11 240 ± 23 8

Hexaconazole 175 ± 53 32 350 ± 33 37

Fosétyl aluminium 245 ± 74 46 280 ± 27 21

Cyprodinil ND ND 50 ± 5 - 77

Oryzalin 132 ± 40 - 1 ND ND

Mancozèbe 215 ± 65 38 300 ± 29 27

Glyphosate 180 ± 54 26 330 ± 31 33

Azoxystrobine 150 ± 45 11 230 ± 22 4

Chlorpyriphos éthyl 280 ± 84 52 210 ± 20 -4

Cymoxanil 150 ± 45 11 310 ± 29 29

Dimétomorphe 150 ± 45 11 390 ± 37 43

Diuron 100 ± 30 - 25 310 ± 29 29

Fludioxonil 132 ± 40 - 1 150 ± 14 - 32


Quinoxyfène 135 ± 41 1 170 ± 16 - 23

Vinchlozoline 133 ± 40 0 210 ± 20 - 4

Mini - Maxi -25 à 52 -77 à 43

Moyennes 15 3


79

Le Tableau III.12 présente les matières en suspension du témoin et les matières en

suspension de l’effluent après dégradation de chaque pesticide. L’augmentation des

matières en suspension observée dans les deux expérimentations peut-être due à une

défloculation des boues ou à une prolifération de bactéries libres dans l’effluent.

Certaines molécules montrent des comportements similaires : le mancozèbe, le

glyphosate, l’hexaconazole et le fosétyl al. Dans les liqueurs mixtes issues du traitement

des effluents de filtration, en présence de ces pesticides, les teneurs en DCO et MES

augmentent dans le surnageant et parallèlement il y a une augmentation du volume de

boues. Ce phénomène est dû à une défloculation ou à une modification du floc le rendant

plus léger soit moins décantable (Ribarova et al., 2002).

III.1.2.4.3. Les matières sèches

Le Tableau III.13 présente le résultat des matières sèches du témoin et les matières

sèches de chaque pesticide après traitement biologique. Le tableau est complété par

l’évolution de matières sèches au cours de la dégradation (annexe 8).

Tableau III.13. Evolution des matières sèches (g.L-1) avant et après traitement biologique des pesticides


Initiale (g.L-1) Finale (g.L-1) réduction (%) initial (g.L-1) Final (g.L-1) réduction (%)

Témoin 3,79 ± 0,07 3,43 ± 0,49 9,5 3,47 ± 1,19 3,26 ± 0,53 6

Folpel 3,78 ± 0,07 3,95 ± 0,18 -4,5 4,42 ± 1,51 4,55 ± 0,74 -3

Hexaconazole 3,72 ± 0,07 2,91 ± 0,14 22 4,51 ± 1,55 3,14 ± 0,51 30

Fosétyl aluminium 3,72 ± 0,07 2,69 ± 0,17 28 4,76 ± 1,63 4,14 ± 0,68 13

Cyprodinil ND ND ND 2,37 ± 0,81 1,59 ± 0,26 33

Oryzalin 3,87 ± 0,07 3,72 ± 0,20 4 ND ND ND

Mancozèbe 3,72 ± 0,07 2,76 ± 0,17 26 2,45 ± 0,84 2,06 ± 0,34 16

Glyphosate 3,72 ± 0,07 2,95 ± 0,15 21 4,88 ± 1,67 3,63 ± 0,59 26

Azoxystrobine 3,78 ± 0,07 2,98 ± 0,14 21 2,27 ± 0,44 2,09 ± 0,34 8

Chlorpyriphos éthyl 3,72 ± 0,07 3,03 ± 0,16 19 4,61 ± 1,58 3,96 ± 0,65 14

Cymoxanil 3,78 ± 0,07 3,43 ± 0,16 9,5 4,55± 1,56 3,82 ± 0,63 16

Dimétomorphe 3,78 ± 0,07 3,87 ± 0,14 - 2,5 4,73 ± 1,62 4,10 ± 0,67 13

Diuron 3,78 ± 0,07 3,28 ± 0,17 13 4,48 ± 1,53 4,71 ± 0,77 -5

Fludioxonil 3,87 ± 0,07 3,33 ± 0,19 14 2,70 ± 0,92 2,09 ± 0,34 23

Difénoconazole ND ND ND 2,87 ± 0,98 1,98 ± 0,32 31

Quinoxyfène 3,87 ± 0,07 3,07 ± 0,20 21 4,27 ± 1,46 2,66 ± 0,44 38

Vinchlozoline 3,87 ± 0,07 3,37 ± 0,19 13 4,25 ± 1,45 3,52 ± 0,58 17

Mini - Maxi - - 4,5 à 28 -5 à 38

Moyennes 15 17


80

Après traitement biologique, en présence de molécules phytosanitaires, les liqueurs

mixtes issues du traitement des effluents vinicoles voient leurs matières sèches diminuer

de 15 %. Ce phénomène est remarqué pour 11 des 14 pesticides testés dans les liqueurs

mixtes issues du traitement des effluents de soutirage et pour 13 des 15 pesticides

testés dans le deuxième cas. La réduction des matières sèches peut aller jusqu'à 28 %

avec le fosétyl d’aluminium et 38 % avec le quinoxyfène.

De façon générale, les quatre pesticides (mancozèbe, hexaconazole, glyphosate, fosétyl

aluminium) identifiés précédemment ont un effet très important sur la biomasse

puisqu’ils correspondent à ceux qui provoquent aussi la plus grande diminution des

matières sèches.

Cette nette diminution des matières sèches après traitement biologique est liée à une

diminution du nombre, de la nature des micro-organismes ou d’une modification de la

structure des flocs.

III.1.2.4.4. Evolution des micro-organismes

Après traitement biologique, la microfaune présente dans les boues activées des

deux expérimentations est répertoriée sur les Figures III.6 et III.7 ainsi qu’en

annexe 9.

0

2

4

6

8

10

12

Tem

oin

Azo

xyst

robin

e

Diu

ron

Chlo

rphyri

phos

eth

yl

Manco

zèbe

Gly

phosa

te

Folp

el

Dim

éth

om

orp

he

Cym

oxanil

Quin

oxyfè

ne

Fludio

xonil

Hexaco

nazo

le

Fose

tyl

alu

min

ium

Vin

chlo

zolin

e

Ory

zalin

Fréquence des micro-organismes Rotifères

CiliésSarcodinesFlagellés

Figure III.6. Evolution de la microfaune dans la liqueur mixte issue du traitement des effluents de soutirage.


81

Globalement, on remarque que dans les deux expérimentations, la fréquence

relative de la microfaune est plus importante dans le témoin qu’en présence de

matières actives phytosanitaires.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Tem

oin

Azo

xyst

robin

e

Diu

ron

Chlo

rphyri

phos

eth

yl

Manco

zèbe

Gly

phosa

te

Folp

el

Dim

éth

om

orp

he

Cym

oxanil

Quin

oxyfè

ne

Fludio

xonil

Hexaco

nazo

le

Fose

tyl

alu

min

ium

Vin

chlo

zolin

e

Difénoco

nazo

le

Cypro

din

il

Fréquence des micro-organismes

RotifèresCiliésSarcodinesFlagellés

Figure III.7. Evolution de la microfaune dans la liqueur mixte issue du traitement des effluents de filtration.

Dans la liqueur mixte issue du traitement des effluents de soutirage, le témoin

contient peu de bactéries libres. Seulement quatre pesticides (azoxystrobine,

diuron, folpel et cymoxanil) entraînent une augmentation des bactéries libres et une

diminution de la qualité des flocs. Au niveau de la microfaune, il est très difficile de

pouvoir déterminer l'influence des pesticides. Il est cependant remarqué l'apparition

de nouveaux micro-organismes holotriches de grande taille (colpidium; chilodonella;

holophrya) se développant car il y a apparition de bactéries libres dont ils se

nourrissent (Figure III.8).


82

Figure III.8. Exemple de structure du floc bactérien dans la liqueur mixte de soutirage après traitement

biologique des pesticides. A. Témoin ; B. Folpel.

La disparition de péritriches (vorticelles) en présence de pesticides indique une

toxicité de l’effluent. Certains pesticides inhibent le développement de certaines

souches de thécamébiens (arcella), de spirotriches (euplote) et de sutoriens

(podophrya). Cette microfaune qui fluctue en fonction de la nature du pesticide

indique une stabilité du système et un apport satisfaisant d'oxygène. La présence de

rotifères indique que l'effluent traité est plutôt concentré mais que l'épuration est

stable. Il semble donc que la microfaune qui se développe est adaptée à des

effluents de qualité moyenne à médiocre, ce qui correspond à la nature même des

effluents phytosanitaires.

Dans la liqueur mixte issue du traitement des effluents de filtration, le témoin

contient quelques bactéries libres. Seulement un pesticide, le mancozèbe, entraîne

une augmentation des bactéries libres et une diminution de la qualité des flocs

(Figure III.9).

Figure III.9. Exemple de structure du floc bactérien dans la liqueur mixte de filtration après traitement

biologique des pesticides. A. Témoin ; B. Mancozèbe.

A B

A B


83

La majorité des pesticides n’a pas d'effet sur la structure des flocs. Au niveau de la

microfaune, il est très difficile de pouvoir déterminer l'influence des pesticides. Il est

cependant remarqué l'apparition de nouveaux micro-organismes péritriches

(vorticella) et de spirotriches (aspidisca) indiquant une bonne épuration. Leur

dominance est liée à un apport plus élevé de matière organique dans le milieu. La

disparition des holotriches (chaena ; colpidium) en présence de pesticides indique

que l'effluent phytosanitaire est considéré comme une source de carbone

importante. Leur densité est liée aux nombres de petits flagellés présents dans

l'effluent.

III.1.2.4.5. Evolution des polysaccharides

Witzig et al. (2002) pensent qu’une trop grande sécrétion de polysaccharides

pourrait avoir lieu dès que les micro-organismes sont en présence de substances

toxiques. Les teneurs en polysaccharides après traitement biologique de chacun des

pesticides sont représentées dans le Tableau III.14.

Tableau III.14. Evolution des polysaccharides après traitement biologique de chaque pesticide.

LM- soutirage LM-filtration

Final (mg.L-1) Augmentation (%) Final (mg.L-1) Augmentation (%)

Témoin 27,58 ± 7,67 31,34 ± 6,53

Folpel 29,94 ± 2,45 8 15,73 ± 1,23 - 50

Hexaconazole 20,98 ± 0,24 - 24 21,85 ± 3,03 - 30

Fosétyl aluminium 21,93 ± 3,22 - 20 27,41 ± 6,32 - 13

Cyprodinil ND ND 18,62 ± 2,37 - 40

Oryzalin 26,92 ± 6,18 - 2 ND ND

Mancozèbe ND ND ND ND

Glyphosate 16,73 ± 0,70 - 39 9,31 ± 0,67 - 70

Azoxystrobine 22,17 ± 4,17 - 20 17,99 ± 2,33 - 43

Chlorpyriphos éthyl 27,58 ± 3,37 0 20,76 ± 4,45 - 34

Cymoxanil 18,20 ± 1,46 - 34 ND ND

Dimétomorphe 20,74 ± 1,34 - 25 27,37 ± 1,22 - 13

Diuron 21,72 ± 1,72 - 21 17,86 ± 3,58 - 43

Fludioxonil 20,26 ± 3,52 - 27 18,63 ± 2,08 - 41

Difénoconazole ND ND 20,52 ± 5,53 - 35

Quinoxyfène 30,58 ± 4,26 10 11,51 ± 0,41 - 63

Vinchlozoline 35,58 ± 2,58 22 30,14 ± 3,14 - 4

Mini-Maxi -39 à 22 -70 à -4

Moyenne - 13 -37


84

De manière générale, contrairement à Witzig et al.(2002), les teneurs en polysaccharides

sont plus faibles après dégradation des molécules phytosanitaires que dans le témoin.

Les polysaccharides sont des exopolymères synthétisés par la biomasse et

contribuent à la formation des flocs. Les polymères produits par les micro-

organismes proviennent des composés libérés, des composés produits lors de la

métabolisation du substrat lors de la croissance des micro-organismes et des

composés relargués durant la lyse des cellules (Chudoba, 1985).

La diminution des teneurs en polysaccharides en présence de molécules

phytosanitaires est liée à la nature de l’effluent qui est faiblement biodégradable.

Ainsi, d’après Massé (2004), les boues ont une concentration en exopolymères

solubles d’autant plus importante que les effluents ont une fraction élevée de

substrats facilement biodégradables. Pour cette raison, les effluents industriels

difficilement biodégradables conduisent à des teneurs plus faibles en exopolymères.

Par ailleurs, Sponza (2003) indique qu’il faut qu’il y ait lyse des cellules pour avoir

une libération des exopolymères. Il est possible que les produits phytosanitaires

entraînent essentiellement une inhibition métabolique en raison de leur faible

concentration et une non lyse des cellules.

III.1.2.5. Toxicité des effluents

Le test rapidtox développé par microbiotest® mesure la toxicité aiguë des molécules

toxiques sur la viabilité d'un invertébré Thalmocephalus platiryus. Ce test présenté

sous forme de kit permet de mesurer rapidement la toxicité et de déterminer un

pourcentage d'inhibition.

Les résultats de toxicité après traitement biologique avec chacun des pesticides

testés apparaissent dans le Tableau III.15. Les valeurs initiales de toxicité sont

supérieures à 70 % ; soit la valeur maximale de toxicité en présence d’une forte

concentration en pesticides.


85

Tableau III.15. Toxicité de l’effluent après traitement biologique de chaque pesticide.


% d’inhibition % d’inhibition

Témoin 7 14

Folpel 40 70

Hexaconazole 40 49

Fosétyl aluminium 37 41

Cyprodinil ND ND

Oryzalin 46 ND

Mancozèbe 58 66

Glyphosate 15 ND

Azoxystrobine 55 61

Chlorpyriphos éthyl 35 53

Cymoxanil 25 ND

Dimétomorphe 59 55

Diuron 56 37

Fludioxonil 41 ND

Difénoconazole ND ND

Quinoxyfène 58 41

Vinchlozoline 56 58

Moyenne essais 44 53

Dans les deux expérimentations, les résultats montrent que l'effluent de sortie de chacun

des essais phytosanitaires a un pourcentage d’inhibition supérieur au seuil de toxicité

(20%). Ce seuil correspond au seuil de concentration maximale de toxique qui ne cause

pas d’effet sur le micro-organisme (NOEC).

Pour les deux expérimentations, le pourcentage d'inhibition est supérieur à 50 % pour six

des quatorze pesticides testés. Par contre, seul le glyphosate à une toxicité inférieure de

20 % et plus ou moins similaire à celle du témoin. En effet, le glyphosate est rapidement

hydrolysé en AMPA qui est faiblement toxique : test de mobilité Daphnia magna 48 h,

EC50 glyphosate= 11 mg.L-1 et EC50 AMPA= 690 mg.L-1 (Footprint, 2007).

L'effluent après traitement biologique de chacun des pesticides est épuré à plus de 80 %

d'après les analyses physico-chimiques mais d'après les résultats obtenus en écotoxicité,

il semble toujours toxique après huit jours de traitement biologique.


86

III.1.3. Discussion

Pour déterminer la performance d'une microfaune à dégrader différentes molécules

phytosanitaires utilisées régulièrement dans la région bordelaise, plusieurs

paramètres ont été sélectionnés. Ils ont permis d'identifier le comportement des

boues face aux toxiques mais aussi d'évaluer l'efficacité épuratoire des micro-

organismes. L’efficacité globale épuratoire des liqueurs mixtes issues des

traitements d’un effluent de soutirage et de filtration est similaire et de l’ordre de 86

- 88 %. Globalement, ces deux liqueurs mixtes dégradent la matière organique

phytosanitaire avec un rendement épuratoire satisfaisant pour huit jours de

traitement biologique. Les pourcentages obtenus en efficacité épuratoire sont

similaires aux résultats obtenus par Ghosh et al., (2001) qui ont démontré que

l’Atrazine par traitement anaérobie de cinq jours pouvait être épurée à 81 % de

DCO. En procédé aérobie par boues activées, Marrot et al. (2007) ont démontré que

le phénol (1,0 g.L-1), de toxicité importante pouvait être épuré à 98,6 % en DCO.

Ces résultats indiquent que les liqueurs mixtes vinicoles ne perdent pas leur potentiel

épuratoire lorsqu’elles sont en contact avec les molécules phytosanitaires. L’abattement

des teneurs en DCO est toutefois moins important en présence de pesticides qu’en

absence. Il existe des variabilités entre les deux types de liqueur mixte ; ce qui implique

l’interdépendance entre la nature de la liqueur mixte et la nature des matières actives.

Ainsi Barik (1984), a démontré que des souches de bactéries Pseudomonas présente

dans les boues activées utilisaient les pesticides (malathion, glusathion et diméthioate)

comme source de carbone mais que chaque souche de Pseudomonas était spécialisée

pour dégrader un pesticide donné.

Les nutriments azotés et phosphorés ajoutés quotidiennement dans l'effluent

vinicole de soutirage et de filtration ont pour objectif de favoriser la croissance de la

biomasse (Wu et Okrutny, 1982). Dans les liqueurs mixtes issues du traitement des

effluents de soutirage, il y a une réduction de 15 % des teneurs en phosphore total

par rapport au témoin et inversement, les liqueurs mixtes de filtration rejettent du

phosphore total et du phosphate. Ce mécanisme pourrait provenir d'une lyse des

cellules ou d'une absorption de ces composés à la surface des micro-organismes.

La biomasse est évaluée par les teneurs en matières sèches. Après traitement

biologique, en présence de molécules phytosanitaires, les liqueurs mixtes issues du

traitement des effluents vinicoles voient leurs matières sèches diminuer de 15 %. La

diminution des concentrations en biomasse en présence d'un toxique a été


87

démontrée par Visvanathan et al. (2005) en étudiant la biodégradation du

pentachlorophénol (PCP) par un bioréacteur à membrane, pour une concentration en

PCP de 10 mg/L avec un temps de séjour de cinq à six semaines. Ce phénomène est

a été attribué par l’auteur à une modification de la structure des flocs, du nombre et

de la composition de la microfaune.

En parallèle, il a été remarqué une augmentation des matières en suspension dans les

effluents après dégradation des différentes molécules phytosanitaires. Cette

augmentation de matières en suspension est liée notamment à une prolifération de

bactéries libres dans l’effluent ou à une défloculation des boues. Dans les liqueurs mixtes

issues du traitement des effluents de soutirage, il n’y a pas de diminution du volume de

boues mais une augmentation des MES en présence de molécules phytosanitaires due à

une défloculation des boues. Inversement, les liqueurs mixtes issues du traitement des

effluents de filtration en contact avec des pesticides voient leur volume de boues

augmenter de 20 % avec un maintien des teneurs en MES par rapport au témoin lié à la

bentonite composant l’effluent de filtration qui est par ailleurs, un adjuvant de floculation

pour la clarification des vins. De plus, certaines molécules montrent des comportements

similaires : le mancozèbe, le glyphosate, l’hexaconazole et le fosétyl al. Dans les liqueurs

mixtes issues du traitement des effluents de filtration, en présence de ces pesticides, les

teneurs en DCO et MES augmentent dans le surnageant et parallèlement, il y a une

augmentation du volume de boues. Ce phénomène confirme la modification de la

structure du floc (Ribarova et al., 2002).

L'influence des pesticides est aussi observée sur la population microbienne.

Globalement, dans les 2 liqueurs mixtes vinicoles, la fréquence relative de la

microfaune est plus importante dans le témoin qu’en présence de matières actives

phytosanitaires. On remarque qu’en présence de pesticides, les boues produites à

partir de l’effluent de soutirage voit une augmentation des bactéries libres,

provoque une déstructuration des flocs et une inhibition de certaines familles de

micro-organismes comme les thécamébiens, les spirotriches et les sutoriens.

Certains pesticides n'ont pas d'effet sur la structure des flocs et il y a apparition de

micro-organismes péritriches et sprirotriches indicateurs d'une bonne épuration

(Calner et al., 1998). Cette modification des espèces composant le floc influence la

production de polysaccharides.

Les polysaccharides sont des composés polymères extracellulaires qui sont sécrétés

par les micro-organismes (Massé, 2004). Les deux expérimentations montrent des

teneurs en polysaccharides plus faibles dans l'effluent en contact avec les pesticides


88

que dans le témoin. Après traitement biologique, dans les liqueurs mixtes issues du

traitement de l’effluent de filtration, il est remarqué une diminution de 24 % des

teneurs en polysaccharides en contact avec les molécules phytosanitaires. Sponza

(2003) indique qu’il faut qu’il y ait lyse des cellules pour avoir une libération des

exopolymères. Il est possible que les produits phytosanitaires entraînent une

inhibition du métabolisme des micro-organismes en raison de leurs faibles

concentrations et non une lyse des cellules.

L'analyse des effluents de sortie après traitement biologique des différents

pesticides a montré un fort potentiel d'épuration des boues activées. On remarque

que la liqueur mixte issue du traitement de soutirage épure à 93 % contrairement à

la liqueur mixte issue du traitement de filtration qui elle ne dégrade qu’à 84 %.

L'analyse des boues après traitement biologique montre que dans les deux

expérimentations, les pesticides ne sont pas accumulés mais dégradés par les

liqueurs mixtes. Plusieurs auteurs ont étudié la dégradation par boues activées de

différentes molécules phytosanitaires et ont démontré que la majorité des pesticides

pouvait être dégradée : PCP (10 mg.L-1) à 99% dans l’effluent en 12 heures par un

bioréacteur à membrane (Visvanathan et al., 2005) ; PCP (200 mg.L-1) à 99 % dans

l’effluent en 20 heures par un bioréacteur anaérobie à flux accendant (Shen et al.,

2005). Le lindane, pesticide organochloré à une concentration de 100 µg.L-1, est

épuré à 67-91 % dans l’effluent et seulement 0,1 - 2,8 % se retrouvent dans les

boues en 23 jours par des boues activées municipales (Kipopoulou et al., 2004).

En parallèle, des analyses de toxicité des effluents de sortie ont été réalisées. Les

analyses de toxicité permettent de déterminer la capacité d'un effluent à être rejeté

dans un milieu naturel. Les deux expérimentations démontrent que malgré une

épuration supérieure à 80 %, les traces de résidus de matières actives

phytosanitaires sont encore toxiques pour le milieu extérieur après un traitement de

8 jours. Blibanova (2000) a démontré que le micro-organisme Thalmocephalus

platiryus utilisé dans nos essais est neuf fois plus sensible au toxique que Daphnia

magna.


89

III.1.4. Conclusion

Cette expérimentation démontre que le procédé par boues activées du traitement

des effluents vinicoles peut être utilisé pour épurer les effluents phytosanitaires. La

dégradation des molécules phytosanitaires est fonction de la nature de la

microfaune présente dans les boues activées.

La liqueur mixte issue du traitement de soutirage épure à 93 % contrairement à la

liqueur mixte issue du traitement de filtration qui elle ne dégrade qu’à 84 %.

D'après ces expérimentations une biomasse acclimatée à un effluent de soutirage

semble plus facilement dégrader les molécules phytosanitaires qu'un effluent de

type filtration. Cette biomasse, en subissant un stress dû à l’ajout de molécules

toxiques, se déflocule rapidement, libère des bactéries libres dans le surnageant qui

sont en contact direct avec le substrat à dégrader. Par ailleurs, l’effluent de

soutirage est représentatif des différentes étapes de la vinifications (nettoyage de

l’ensemble de l’équipements,…).

La défloculation observée est un problème majeur dans le traitement biologique par

boues activées puisqu’elle empêche une bonne décantation de l'effluent. La biomasse

acclimatée à un effluent de filtration épure moins facilement des matières actives

phytosanitaires ; elle subit un stress mais ne déflocule pas. Ce phénomène est dû à la

présence de bentonite qui est un adjuvant de filtration qui contribue à la floculation des

boues.

L'effluent vinicole de soutirage sera utilisé dans les autres expérimentations pour

déterminer les différents paramètres de la dégradation d’un mélange de molécules

phytosanitaires.


90


Dégradation biologique d’un effluent phytosanitaire

L’expérimentation précédente nous a permis de démontrer que les liqueurs mixtes

vinicoles pouvaient dégrader à plus de 80 % les matières actives phytosanitaires

principales que l’on peut retrouver dans un effluent viticole. Lorsque les molécules sont

épurées individuellement, le comportement des boues activées est dépendant des

matières actives apportées dans la liqueur mixte.

Dans ce chapitre, nous reconstituerons un effluent synthétique viticole à partir de

familles de molécules sélectionnées. Les interactions entre les molécules et la biomasse

active vont affecter d’une part l’épuration des matières actives et d’autre part le

comportement des micro-organismes de la liqueur mixte. Ainsi, le travail proposé a pour

objectif de déterminer les modifications engendrées par l’apport d’un effluent viti-vinicole

dans une unité de traitement biologique d’effluent vinicole.

Pour identifier les effets des pesticides sur la biomasse, nous étudierons dans un premier

temps l’évolution des paramètres du traitement biologique lors de l’ajout d’un effluent

viticole concentré (fond de cuve vrai du matériel de pulvérisation) au cours du traitement

d’un effluent vinicole.

Dans un deuxième temps, nous étudierons l’influence de la concentration en produits

phytosanitaires pour évaluer l’intérêt des rinçages à la parcelle sur la qualité de

l’épuration et le fonctionnement de la biomasse. Cet effet sera quantifié sur 24 h pour

mettre en évidence l’impact immédiat des toxiques sur l’activité des boues activées. Les

résultats obtenus sur une semaine de traitement sont présentés en annexe 10.

III.2.1. L’effluent et la biomasse initiale

L’effluent initial est constitué de l’effluent de soutirage type (chapitre III.1) et d’un

mélange de produits phytosanitaires. La biomasse initiale provient d’une unité de

traitement d’effluents urbains (Latresne, 33) dont les caractéristiques sont indiquées

dans le tableau III.16.


91

L’unité fonctionne à une charge volumique de 0,8 kg.DBO5.m-3.jour-1 et une charge

massique de 0,2 kg DBO5.kg-1 MS-1.Jour-1.

Tableau III.16. Paramètres initiaux des liqueurs mixtes issues du traitement biologique de Latresne.

Le Tableau III.17 représente les produits phytosanitaires constituant le mélange qui

alimente le bioréacteur de 30 litres (Chapitre matériels et méthodes ; II.1.). Les

concentrations sélectionnées correspondent aux fonds de cuve (vrai) du matériel de

pulvérisation. Pour acclimater une liqueur mixte vinicole à un effluent

phytosanitaire, un litre de solution de chaque pesticide est préparé et 100 mL de

chaque solution est mélangée pour former l’effluent synthétique qui contient 14

pesticides pour une concentration totale de 5000 mg.L-1 de matières actives.

Tableau III.17. Produits phytosanitaires composant l’alimentation des boues activées.

Matières

commerciales Matières actives

Concentrations matières

actives (mg.L-1)

Concentrations matières

commerciales (mg.L-1)

Cymoxanil 50 ANTEOR

Folpel 428 640

MANGEOS Alphametrine 4 60

CASCADE Flufénoxuron 17 17

Mancozèbe 614 EPERON PEPITE

Méfénoxam 37 960

MICROTHIOL Soufre 2510 3,410

FORUM Dimétomorphe 128 128

Diquat 67 GRAMOXONE

Paraquat 22 89

ROUNDUP Glyphosate acide 768 768

ALIETTE EV Fosétyl aluminium 168 210

Cyprodinil 192 SWITCH

Fludioxonil 128 512

MELANGE

PHYTOSANITAIRE

100 mL de chacun des

produits commerciaux environ 5 g/L Environ 7 g/L

L’alimentation du bioréacteur s’effectue avec le mélange de pesticides et l’effluent

de soutirage pour obtenir une concentration en DCO de 9 g.L-1 et une concentration

en pesticides de 2500 mg.L-1. Le temps de séjour hydraulique est fixé à 10 jours. la

charge volumique est fixée à 0,9 kg DCO m-3.jour-1 et la concentration en matières

Analyses Valeurs initiales

DCO 1452 ± 2,64 mg.L-1

Volume de boues 640 ± 14 mL.L-1

Turbidité 58 ± 0,2 NTU

Matières sèches 6,6 ± 0,7 g.L-1

Matieres Volatiles sèches 1,49 ± 0,2 g.L-1

Matières en suspension 157 ± 20 mg.L-1

Adénosine-5-triphosphate 123516 ± 27650 RLU


92

sèches est maintenue à X = 6 g.L-1 avec une charge massique de 0,15 kg DCO.kg

MES-1.jour-1. Lors de l’expérimentation, les paramètres du bioréacteur sont : 150

tr.min-1, 4 mg O2.L-1, pH=7 à 20 C°.

Pour l’étude avec différentes concentrations en produits phytosanitaires, les essais

sont effectués en jar-test et les matières actives sont mélangées directement dans

du vin pour limiter les volumes injectés (Figure III.10). La liqueur mixte provient du

bioréacteur qui a été alimenté avec des effluents vinicoles ou viti-vinicoles suivant

les essais.

Entrée : 3 litres d’effluents vinicoles Entrée : 2 litres d’effluents viti-vinicoles

air air

Figure III.10. Descriptif du disposif expérimental utilisé

Liqueur mixte vinicole Liqueur mixte viti-vinicole

Sortie : 3 litres de liqueur mixte

Sortie : 2 litres de liqueur mixte

Prélèvement des liqueurs mixtes

V = 30 L V = 20 L Transfert 20 L de liqueur mixte à τ = 20 jours

THR = 10 jours

Rotation à 60 rpm

Sonde à oxygène

Jar-test (X 6)

Témoin : Ajout S0 = 164 mg.L-1 à

1312 mg.L-1 de DCO de vin

ou

Essai : Ajout S0 = 164 mg.L-1 à 1312

mg.L-1 de DCO de vin contenant le

mélange de pesticides à 5 g.L-1


93

III.2.2. Etude de l’épuration des effuents viti-vinicoles

III.2.2.1. Evolution de la DCO

La Figure III.11. indique l’évolution de la DCO totale au cours du temps. La courbe rouge

correspond à la phase d’acclimatation à l’effluent vinicole. La courbe verte représente la

phase d’alimentation avec l’effluent viti-vinicole.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

DCO (mg.L-1)

Figure III.11. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) au cours du traitement biologique.

(♦) adaptation à l’effluent vinicole ; (�) dégradation de l’effluent viti-vinicole.

Le mélange phytosanitaire a une DCO faible (de l’ordre de 200 mg.L-1) en comparaison

de l’effluent vinicole ajouté conjointement qui a une DCO de 9 g.L-1. Ce paramètre n’est

pas adapté à la mesure de l’épuration des matières actives mais il peut nous permettre

de voir si l’épuration des effluents vinicoles est affectée par la présence de toxiques. De

plus, une augmentation de DCO peut provenir d’une lyse des micro-organismes ou d’un

stress modifiant leur métabolisme.

Une première phase d’acclimatation est observée avec un pic de DCO à 8 jours de

traitement d’effluent vinicole. Ce phénomène important est peu visualisé dans le

traitement des effluents viti-vinicoles à 35 jours de traitement. Nous n’observons pas de

modification de la DCO lors de l’ajout des produits phytosanitaires pendant 10 jours ; par

contre, elle augmente ensuite. Ceci peut être lié à de nombreux phénomènes comme la

présence de micro-organismes libres dosés dans le surnageant ou à des modifications

diverses de la biomasse active (exopolymères).

L’augmentation de la DCO est liée à la phase d’adaptation de la liqueur mixte à l’effluent

viti-vinicole (≥ 25 jours). Cette phase est presque deux fois plus longue que la phase

d’acclimatation à l'effluent vinicole (13 jours). Ce phénomène peut s’expliquer par la

toxicité des pesticides qui inhibent partiellement l’activité des micro-organismes.


94

III.2.2.2. Comportement des boues activées

III.2.2.2.1. Evolution des Matières Sèches (MS), des Matières

Volatiles (MVS)

Les matières sèches et les matières volatiles permettent d'évaluer la biomasse au sein de

la boue activée. Les Figures III.12 et III.13 visualisent leurs évolutions au cours de

l’expérience.

Lors de la dégradation des effluents vinicoles, la chute en matières sèches peut être

expliquée par le changement de nature du substrat. A l’ajout de l’effluent viti-vinicole, la

concentration de matières sèches diminue jusqu’à 30 jours.

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

MS (g.L-1)

Figure III.12. Evolution en matières sèches (MS) au cours du traitement biologique.


Par ailleurs, les matières volatiles correspondent à la fraction organique des matières

sèches. Le contrôle de ce paramètre permet d'évaluer la biomasse au sein de la boue

activée. On peut remarquer que la teneur en biomasse épuratrice suit globalement les

teneurs en matières sèches.

0

1

2

3

4

5

6

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Temps (jour)

MVS (g.L-1)

Figure III.13. Evolution des teneurs en matières volatiles (MVS) au cours du traitement biologique.



95

La Figure III.14 montre que le rapport MVS/MS reste stable (0,75) pendant le

traitement des effluents vinicoles (20 jours) et les 20 premiers jours d’alimentation

avec les effluents viticoles. Cette valeur est classiquement rencontrée en traitement

d’effluent urbain par boues activées (Praderie, 1996). Dans les derniers jours, de

fortes variations sont observées montrant l’impact cumulatif sur la biomasse de

l’alimentation en produits phytosanitaires.

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

MVS/MS

Figure III.14. Evolution du rapport MVS/MS au cours du traitement biologique.


III.2.2.2.2. Evolution des matières en suspension (MES) et de la

turbidité

Dans notre étude, l’évolution des MES et de la turbidité nous permet surtout d’évaluer les

phénomènes de défloculation et de développement des bactéries libres. Dans la pratique

ces paramètres estiment la qualité de l’eau.

Les Figures III.15 et III.16 représentent respectivement l’évolution des matières en

suspension et de la turbidité au cours de l’expérimentation.

La mesure de la qualité des surnageants des boues alimentées avec l’effluent viti-vinicole

montre des turbidités et des matières en suspension qui augmentent au fur et à mesure

du traitement. Ces valeurs sont corrélées avec des observations microscopiques qui

révèlent la présence importante de bactéries libres dans le surnageant. Les pesticides

provoquent une défloculation des boues qui est parfois visible à l’œil nu.


96

0

50

100

150

200

250

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

MES (mg.L-1)

Figure III.15. Evolution des matières en suspension (MES) au cours du traitement biologique.


Par ailleurs, la forte teneur en matières en suspension au début du traitement des

effluents vinicoles provient de la phase d’acclimatation de la biomasse (chapitre III.1.).

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

Turbidité (NTU)

Figure III.16. Evolution des turbidités au cours du traitement biologique.


Le phénomène de défloculation est à prendre en compte pour l’épuration des produits

phytosanitaires par boues activées. Il sera nécessaire d’effectuer une floculation avant le

rejet dans le milieu naturel ou de mettre un traitement complémentaire (filtration sur

sable ou lit de roseaux).

III.2.2.2.3. Evolution du volume de boues

Le volume de boues permet de caractériser la décantabilité des boues. La Figure III.17

représente l’évolution du volume de boues au cours de l’expérimentation. On observe

que pour la boue acclimatée à un effluent vinicole, le taux de boues est très élevé alors

que les matières sèches diminuent de façon importante. Cette observation nous laisse

penser que la structure des flocs est modifiée.


97

Par ailleurs, l’effluent n’a pas été réajusté en azote et phosphore pour se rapprocher des

conditions de fonctionnement des unités existantes de traitement des effluents vinicoles.

Or, le vin est un substrat déficient en azote et phosphore: N total d’un vin rouge de 100

à 700 mg.L-1; PO4 = 200 à 500 mg.L-1. Un rapport C/N/P déséquilibré peut perturber le

fonctionnement des boues activées.

0

200

400

600

800

1000

1200

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Temps (jour)

Vb (ml.L-1)

Figure III.17. Evolution du volume de boues (Vb) au cours du traitement biologique.


La présence de pesticides dans l’effluent viti-vinicole a pour effet de faire chuter le

volume de boues. Cette constatation n’est pas forcément liée à une mauvaise

acclimatation de la liqueur mixte viti-vinicole mais à une restructuration des flocs due à

un nouveau substrat à dégrader. Les micro-organismes ne se retrouvent pas uniquement

sous forme floculée mais libres dans le surnageant, ce qui confirme les évolutions de

matières en suspension.

III.2.2.2.4. Evolution de l’ATP total

En parallèle, les mesures d’activité de la biomasse sont quantifiées dans l’effluent par

dosage de l’adénosine-5-triphosphate (ATP), molécule énergétique synthétisée par les

micro-organismes (Figure III.18). L’activité de dégradation des micro-organismes dans la

liqueur mixte vinicole a bien lieu car celle-ci est mise en évidence par une production

importante d’ATP (Remond et Walen, 2007). Cependant, on remarque une forte chute de

la production d’ATP immédiatement après l’introduction des pesticides dans la liqueur

mixte. De plus, la synthèse d’ATP ne reprend qu'au 31ème jour du traitement.


98

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

160000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45Temps (jour)

ATP (URL)

Figure III.18. Evolution des teneurs en ATP au cours du traitement biologique.


La biomasse en présence des pesticides subit une phase d’acclimatation et l’effet

toxique sur la population de micro-organismes se traduit par de faibles teneurs en ATP. A

partir du 34ème jour, la biomasse résistante s’adapte et dégrade les pesticides en

produisant de l’énergie sous forme d’ATP.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

0 3 7 9 13 16 21 24 26 32 34 38 40 42

Temps (jours)

ATP/MVS

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

DCO (mg/L)

Figure III.19. Evolution de la DCO et du rapport ATP/MVS au cours du traitement biologique.

(♦) DCO totale; (�) Rapport ATP/MVS (URL/g.L-1)

Le rapport ATP/MVS représente la fraction de solide correspondant à la biomasse

active des matières volatiles mesurées. La Figure III.19 montre sur un même

graphique l’évolution de la DCO et de ce rapport. La première partie de la courbe

ATP/MVS a une allure semblable à celle de l’ATP car les MVS sont relativement

constantes pendant les 20 premiers jours. A partir de 30 jours le rapport augmente

de facon importante ainsi que les concentrations en DCO totales ; ce qui traduit une

libération d’ATP dans la liqueur mixte.


99

III.2.2.3. Discussion

Cette expérimentation a permis d'étudier l’impact des pesticides sur une biomasse

acclimatée à un effluent phytosanitaire concentré. L'évolution de la DCO nous montre

une acclimatation rapide de la biomasse aux substrats vinicoles en début de traitement.

Dans le cas des effluents vinicoles, la fraction carbonée biodégradable est importante.

Lors de l’ajout des molécules phytosanitaires à ce substrat, on remarque qu'il n'y a pas

d'augmentation de la DCO. La biomasse en présence de pesticides dégrade la charge

organique apportée par le vin. Cette dégradation par la biomasse signifie donc qu'elle

s'est acclimatée. Ces résultats avec un mélange de produits phytosanitaires sont

similaires à ceux obtenus avec les molécules testées de manière individuelle (Chapitre

III. partie I).

Lors de l’adaptation de la biomasse aux substrats vinicoles, le volume de boues est

supérieur à 750 mL. L'effluent de sortie est limpide avec peu de matières en suspension.

A l’ajout de l'effluent viti-vinicole, le volume de boues chute et les matières en

suspension et la turbidité augmentent. Les produits phytosanitaires destructurent les

flocs. L'effluent de sortie est chargé en bactéries libres. Ribarova et al. (2002) observent

la modification du floc bactérien lors de l’ajout de 4 mg de pentachorophénol dans 5 L de

liqueurs mixtes urbaines en condition anaérobie. Durant la dégradation, les boues

fortement floculées se défloculent et forment des flocs compacts granulaires.

L'activité de la biomasse est quantifiée par la mesure d’adenosine-5-triphosphate (ATP).

Lors de l'acclimatation de la liqueur mixte urbaine aux effluents vinicoles, les quantités

d'ATP totales sont fluctuantes mais très élevées. Dans le cas de l’ajout de l'effluent viti-

vinicole, la teneur en ATP chute immédiatement. Cette mesure montre l'effet toxique des

pesticides sur le métabolisme de la biomasse. Remond et Whalen (2007) proposent de

suivre une unité de traitement d’effluent urbain par la mesure de l’ATP. Ils considèrent

qu’une modification de l’ATP anticipe un dysfonctionnement des bioréacteurs. De plus, ils

proposent une valeur optimale d’ATP pour laquelle l’unité de traitement assurerait une

efficacité maximale.

L’effet toxique ne s'accompagne pas d'une chute des teneurs en biomasse puisqu'elle est

stable à environ 2,5 g.L-1 de MS. A partir de 14 jours après l’ajout des molécules

phytosanitaires, les teneurs en ATP augmentent ; signe d'une reprise d'activité de la

biomasse. Cette reprise semble très importante car le rapport ATP/MVS augmente

rapidement.


100

III.2.3. Influence de la concentration en produits phytosanitaires

L’expérimentation a pour objectif de définir les meilleures conditions de rejet des

effluents viticoles dans le système de traitement aérobie des effluents vinicoles, afin que

les deux types d’effluents puissent être traités à partir d’un même système.

Pour l’épuration des effluents phytosanitaires, deux cas peuvent se présenter :

- l’effluent phytosanitaire collecté sur une année est introduit lorsque l’unité de

traitement vinicole reçoit peu d’effluents (période de juin à août). Dans ce cas, la

biomasse est adaptée à un effluent vinicole et commence à recevoir à un moment

donné l’effluent viti-vinicole. En septembre, l’unité ne reçoit à nouveau que

l’effluent vinicole.

- l’effluent phytosanitaire est envoyé toute l’année sur l’unité de traitement

biologique vinicole. Ainsi, la biomasse est continuellement adaptée à un effluent

de type viti-vinicole.

Pour l’expérimentation, une liqueur mixte adaptée à un effluent vinicole (effluent de

soutirage) et un autre à un effluent viti-vinicole (effluent de soutirage contenant des

pesticides) sont préparées. Après 50 jours d’alimentation (4 fois le temps de séjour

hydraulique), des échantillons de liqueurs mixtes sont prélevés et sont alors introduits

dans différents béchers pour réaliser les expérimentations. Pour cinq concentrations

testées (Tableau III.18), les effluents vinicoles (A, A’) ou viti-vinicoles (B, B’) sont

introduits dans les béchers de un litre de liqueur mixte.

Tableau III.18. Concentrations initiales de l’effluent vinicole et viticole.

DCO initiales en effluent

vinicole (mg.L-1)

Concentrations initiales

en pesticides (mg.L-1)

164 5

328 10

656 20

984 30

1312 40

III.2.3.1. Evolution de la DCO

L’évolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO) est visualisée sur la Figure

III.20.


101

Lorsque les concentrations initiales de l’effluent sont inférieures ou égales à 650 mg.L-1

en DCO, l’épuration semble similaire pour les deux liqueurs mixtes qu’elles soient

alimentées avec un effluent vinicole ou viti-vinicole. La biomasse n’est pas affectée par

l’ajout de pesticides. De plus, la DCO diminue progressivement dès les premières heures

pour se stabiliser à des valeurs inférieures ou égales à 300 g.L-1 après 10 h.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8 10 12

Temps (h)

DCO (mg/l) S0 = 164 mg/l

S0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/l

S0 = 1312 mg/l

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)


S0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/l

S0 = 1312 mg/l

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)


S0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/l

S0 = 1312 mg/l

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)


S0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/l

S0 = 1312 mg/l

Figure III.20. Evolution de la DCO dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte.

Liqueurs mixtes vinicoles. A : Témoin (S0 vin) ; B : Essai (S0 mélange vin + pesticides)

Liqueurs mixtes viti-vinicoles. A’ : Témoin (S0 vin) ; B’ : Essai (S0 mélange vin + pesticides)

Pour les concentrations en DCO supérieures à 1 g.L-1, le comportement de la biomasse

est différent suivant la présence ou non de produits phytosanitaires. Dans le témoin, une

phase de latence de quelques heures est observée avant que l’épuration ne commence.

La réduction de DCO est ensuite très rapide.

Pour l’effluent contenant les produits phytosanitaires (S0 > 656 mg/L de DCO), il est

observé une augmentation initiale de la DCO qui reste importante pendant les 10 h

d’expérimentations : >1000 mg.L-1. Ceci montre qu’il existe une concentration maximale

admissible en produits phytosanitaires pour qu’une biomasse ne soit pas affectée par la

présence de toxiques. Bouhabila (1999) a observé ce phénomène dans un bioréacteur à

membranes immergées.

A A’

B B’


102

III.2.3.2. Etude des liqueurs mixtes

III.2.3.2.1. Evolution des matières en suspension (MES) et de la

turbidité

Nous avons observé précédemment que la présence d’un nouveau substrat à dégrader

affecte la biomasse active dégradant la matière organique et influe sur la floculation des

boues et la qualité du surnageant. Celle–ci est mesurée par la teneur en Matières en

Suspension (MES) (Figure III.21) et la turbidité (Figure III.22).

Figure III.21. Evolution des Matières en Suspension dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte.



Dans les liqueurs mixtes issues du traitement des effluents vinicoles, de 0 à 8 h de

contact du substrat, dans le témoin et dans les essais, il n’est observé aucune différence

significative de comportement des Matières En Suspension (MES). A 2 h de contact, dans

le témoin et dans l’essai, un pic de turbidité apparaît pour les différentes concentrations

en substrat. Les turbidités chutent rapidement dans le témoin contrairement à l’essai qui

contient des produits phytosanitaires dont les valeurs restent quasi-stationnaires jusqu’à

8 h pour les concentrations les plus élevées (Figure III.22 : A et B). Il en est de même

A

B

A’

B’

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

MES (g/l) S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12Te mps (h)

M ES (g/l) S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

MES (mg/L) S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

MES (mg/L) S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l


103

pour les liqueurs mixtes issues du traitement des effluents viti-vinicoles. Ainsi, dans les

trois essais (A’, B et B’) alimentés avec des toxiques, nous observons une nette

dégradation de la qualité du surnageant.

Les fortes turbidités et les MES montrent une défloculation des boues en présence des

molécules phytosanitaires. Celle-ci est due à l’effet toxique des pesticides. De plus, le

stress subi par les cellules induit le relargage de composés biodégradables par les micro-

organismes en présence de pesticides. Ainsi, Il semblerait que les fortes teneurs de DCO

observées dans les essais proviennent de l’influence des pesticides sur l’activité des

micro-organismes en favorisant la défloculation et la lyse de certaines cellules libérant

leurs métabolites dans le surnageant ; ce qui ne représente pas la pollution engendrée

par l’apport direct des produits phytosanitaires et de l’effluent vinicole.

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

Turbidité (NTU)S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

Turbidité (NTU) S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

Figure III.22. Evolution des turbidités dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte.



B

A A’

B’

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

Turbidité (NTU)

S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

Turbidité (NTU)

S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

B’


104

III.2.3.2.2. Les Matières Volatiles (MVS)

L’évolution des Matières Volatiles (MVS) est représentée dans la Figure III.23.

Figure III.23. Evolution des Matières Volatiles dans les essais en jar-test utilisant une liqueur mixte.

Effluents vinicoles. A : Témoin (S0 vin) ; B : Essai (S0 mélange vin + pesticides)

Effluents viti-vinicoles. A’ : Témoin (S0 vin) ; B’ : Essai (S0 mélange vin + pesticides)

Dans les deux expérimentations, les concentrations restent stables au cours du temps

quelles que soient les conditions expérimentales et les concentrations testées. La liqueur

mixte provenant du traitement des effluents viti-vinicoles a une concentration initiale en

biomasse plus faible que la liqueur mixte vinicole. Ces résultats montrent que les micro-

organismes, vus au travers des MVS, ne semblent pas affectés par un substrat toxique.

Ces observations sont en accord avec les observations de la viabilité des levures qui ne

sont pas lysées par la présence de molécules toxiques (Chapitre III. Partie 3).

III.2.3.3. Comparaison des paramètres après 24 h

A la fin des 4 expérimentations, les mêmes paramètres (DCO, MES,…) sont mesurés et

représentés dans le Tableau III.19.

B

A A’

B’

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12

Temps (h)

MVS (g/l)

S0 = 164 mg/l

S0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/l

S0 = 1312 mg/l

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12Temps (h)

MVS (g/l)

S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/l

S0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12

Temps (h)

MVS (g/l)S0 = 164 mg/l

S0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/l

S0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

0 2 4 6 8 10 12

Temps (h)

MVS (g/l)S0 = 164 mg/lS0 = 328 mg/lS0 = 656 mg/lS0 = 984 mg/lS0 = 1312 mg/l


105

Tableau III. 19. Paramètres à 24 h du traitement biologique.



Essais Valeurs S0

(mg.L-1 de DCO)

DCO

(mg.L-1)

MES

(mg.L-1)

Turbidité

(NTU)

164 86 450 2,44

656 286 125 8,95 A

1312 493 400 12,8

164 120 150 4,47

656 346 300 31,4 B

1312 1133 700 93,4

164 200 250 24,9

656 212 225 40,4 A’

1312 500 400 56,9

164 223 150 41

656 272 250 44,45 B’

1312 1120 250 56,8

Lorsque la concentration en substrat augmente, l’efficacité d’épuration diminue en ce qui

concerne les MES, la turbidité et la DCO dans les 4 conditions expérimentales. Des

tendances peuvent être observées : les 2 témoins A et A’ alimentés avec un effluent

vinicole se comportent de façon similaire quelle que soit la concentration en substrat

sauf pour la turbidité qui est plus importante dans le cas de la liqueur mixte initiale viti-

vinicole (A’). L’épuration semble fortement affectée pour la concentration en substrat

viti-vinicole la plus élevée (1312 mg DCO.L-1). Les turbidités et les MES sont beaucoup

plus élevées lorsque la liqueur mixte initiale (vinicole – B) n’a pas été adaptée aux

produits phytosanitaires : par exemple, pour une concentration en substrat de 1312 mg

DCO.L-1, les MES sont de 700 mg.L-1 alors que dans le cas d’un effluent viti-vinicole sur

une biomasse adaptée, elles sont de 250 mg.L-1. Ceci montre bien l’effet toxique des

pesticides sur la liqueur mixte qui, comme nous l’avons vu précédemment, se traduit par

une défloculation des boues avec une possible libération d’exopolymères dans le milieu.

Nsabimana et al. (1996) ont observé l'acclimatation d’une biomasse et montrent aussi

cet effet toxique de l'Atrazine (herbicide) sur des boues activées.

III.2.3.4. Comparaison des paramètres cinétiques

Pour évaluer les différents paramètres cinétiques de croissance des micro-

organismes, nous avons utilisé le modèle de Monod. Monod (1942), analysant la

courbe de croissance bactérienne d'une culture pure, a proposé d'exprimer µ (Taux

spécifique de croissance) en fonction de S (Concentration en substrat à l'instant t)


106

par une relation empirique déduite de l'équation établie par Michaelis et Menten

pour les enzymes :

Où :

µ Taux de croissance (h-1)

µm Taux de croissance maximale (h-1)

St Concentration en substrat à l'instant t (mg DCO.L-1)

Ks Concentration seuil-valeur de S pour laquelle µ=µm/2 (mg DCO.L-1)

Le taux de croissance µ de la biomasse est obtenu en relevant la pente de la droite

représentant ln(Xt/X0) = f(t) à chaque concentration S0.

Cette méthode permet également de calculer le rendement de la croissance microbienne

en batch Y. Si on note VX la vitesse de croissance des micro-organismes et VS la vitesse

d’épuisement du substrat alors :

avec VX= (Xt-X0)/t et VS = (St-S0)/t

Y Rendement ou taux de conversion

Xt Concentration en biomasse à l’instant t (g MVS.L-1)

X0 Concentration en biomasse au temps initial (g MVS.L-1)

St Concentration en substrat à l'instant t (mg DCO.L-1)

S0 Concentration en substrat au temps initial (mg DCO.L-1)

A partir des courbes, on obtient les taux de dégradation du substrat par une liqueur

mixte vinicole et viti-vinicole (Tableau III.20). Les vitesses de dégradation par les micro-

organismes des boues sont fonction de la concentration en substrat.

µm St

Ks +St µ =

VX

VS Y = -

µ S X

Ks +S VX =


107

Tableau III.20. Détermination des taux de croissance µ (h-1) des 2 expérimentations.

Les taux de croissance diminuent avec l’augmentation de la concentration en substrat

quelles que soient les conditions testées. La figure III.24 nous permet d’apprécier plus

facilement les tendances d’évolution du taux de croissance en fonction des liqueurs

mixtes et du substrat utilisé. Il apparaît que les taux de croissance sont globalement plus

importants pour les liqueurs mixtes vinicoles et que le substrat contenant des produits

phytosanitaires provoque une légère diminution de ceux-ci. Sahinkaya et al. (2005)

trouve une diminution du taux de croissance d’une boue activée avec une augmentation

de la concentration en 4-chlorophénol : Les taux de croissance varie de 0,002 à 0,367 h-1

selon que les boues soient acclimatées ou non au substrat.

Figure III.24. Evolution du taux de croissance (µ) en fonction de la concentration S0 en substrat.

Les formes de courbes observées sur la Figure III.24 nous font penser au modèle de

HALDANE correspondant au modèle de MONOD en intégrant une constante d’inhibition.

La forme de la courbe qui devrait nous permettre de déterminer le taux de croissance

maximum sans inhibiteur correspond à la série A (liqueur mixte vinicole alimentée par

effluent vinicole). Cependant, lorsque la concentration en substrat augmente le taux de

Taux de croissance µ (h-1)

Substrat S0 (mg/L de DCO) 164 328 656 984 1312

Vin (A) 0.0622 0.0826 0.0218 0.0394 0.0204 Expérimentation

1 : liqueurs mixtes

vinicoles

Vin + pesticides

(B) 0.0874 0.0471 0.0235 0.0353 0.0198

Vin (A’) 0.051 0.0534 0.0286 - 0.0143 Expérimentation

2 : liqueurs mixtes

viti-vinicoles

Vin + pesticides

(B’) 0.0501 0.0496 0.0224 0.0061 0.0144

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

S0 (mg DCO/L)

µ (1/h) A

B

A'

B'

MONOD

HALDANE


108

croissance diminue à partir de 328 mg DCO.L-1 et la forme de la courbe suit l’équation

d’Haldane (Rozich et al., 1985). La courbe théorique qui aurait dû être obtenue avec le

substrat considéré comme non inhibiteur (vin) est représenté en pointillé sur la Figure

III.24. D’après ces résultats, il nous est impossible de déterminer les taux de croissance

maximum car le vin apparaît aussi comme un inhibiteur de la croissance de la biomasse.

Le contenu polyphénolique du vin est sans doute la cause essentielle de l’observation de

ce phénomène (Ye et al., 2003). Gaudy et al. (1974) suggèrent que la valeur maximale

du taux de croissance soit prise comme étant le taux de croissance spécifique µ* dans le

modèle d’Haldane. Ceci permet de déterminer le coefficient d’inhibition Ki pour l’effluent

vinicole (µ*≈ 0.08 h-1 ; Ki ≈ 300 mg DCO. L-1) et pour l’effluent phytosanitaire (µ*≈

0.055 h-1; Ki ≈ 200 mg DCO. L-1). Les taux de croissance spécifiques sont faibles et il est

reconnu que les effluents vinicoles sont moins facilement biodégradés que les effluents

urbains.


Dans les liqueurs mixtes issues du traitement des effluents viti-vinicoles, les

résultats montrent l’adaptation rapide de la biomasse à un substrat. Les variations

des teneurs en matières en suspension montrent l’influence des pesticides sur la

structure des flocs en induisant une défloculation à court terme qui n’est cependant

pas observée dans les liqueurs mixtes viti-vinicoles adaptées aux substrats. Ces

résultats confirment ceux obtenus dans le Chapitre III.partie 1.

Les matières volatiles n’évoluent pas au cours du temps considéré. Il semble y avoir une

tolérance des micro-organismes aux produits toxiques. Même si la dégradation de la DCO

semble s’effectuer normalement en présence de produits phytosanitaires, les taux de

croissance estimés de la biomasse sont faibles dans les conditions expérimentales qui ont

été testées.

Le suivi en parallèle des différentes modalités auxquelles nous avons apporté une

quantité de substrat croissante nous a permis de comparer le comportement des

différentes liqueurs mixtes. La vitesse de dégradation du substrat vinicole est plus

rapide que celle de l'effluent viti-vinicole. Les liqueurs mixtes viti-vinicoles

dégradent moins rapidement l'effluent vinicole que les liqueurs mixtes vinicoles.

Ainsi, une biomasse acclimatée aux effluents phytosanitaires dégradera plus

rapidement le substrat viti-vinicole.


109

III.2.4. Conclusion

En traitement biologique aéré, les effluents vinicoles sont épurés même en présence

de produits phytosanitaires. Cependant, le mélange de pesticides affecte l’activité

métabolique (ATP) de la biomasse épuratrice. Les matières volatiles restent stables

au cours du traitement contrairement à ce qui est observé lors de l’épuration des

effluents urbains (Praderie, 1996). Ceci montre l’effet de l’inhibition de la croissance

des micro-organismes en présence de toxiques. Liwarska-bizukojc et al. (2007),

indiquent qu’avec de fortes concentrations en substances inhibitrices (surfactants

non-ioniques), les rendements Y peuvent chuter à des valeurs de l’ordre de 0,13 ;

ce qui est très faible par rapport aux valeurs usuelles rencontrées (Y = 0,70). Il faut

aussi noter que les matières commerciales phytosanitaires peuvent contenir des

tensio-actifs, des dispersants, des mouillants,… qui peuvent contribuer à la toxicité

de l’effluent.

Le traitement des effluents vivi-vinicoles par une biomasse adaptée à ces effluents

permet d’obtenir un surnageant de meilleure qualité (DCO-Turbidité). Ceci semble

essentiellement dû à une meilleure structuration des flocs ne libérant pas de

bactéries contrairement à l’épuration de pesticides par une liqueur mixte adaptée à

un effluent vinicole. Ce résultat est important pour la gestion du rejet des produits

phytosanitaires dans les unités de traitement biologique des effluents vinicoles. En

effet, deux solutions sont possibles : le rejet collecté est introduit lorsque l’unité de

traitement vinicole reçoit peu d’effluents (période de juin à août) ou l’effluent

phytosanitaire est envoyé toute l’année sur l’unité de traitement biologique vinicole.

A la vue de nos résultats, la deuxième solution serait plutôt à privilégier. Dans le

cas de nos expérimentations, il semble y avoir une concentration seuil à ne pas

dépasser que nous avons déterminé à 650 mg DCO.L-1 et 20 mg.L-1 de pesticides.

Dans la réalité, ces valeurs vont dépendre de nombreux paramètres comme par

exemple les matières actives constituant le mélange, la concentration initiale en

biomasse active, le temps de séjour hydraulique et l’âge des boues.

Dans ce chapitre, nous avons vu que la microfaune était inhibée par la présence de

produits phytosanitaires qui sont considérés comme des toxiques. Il est difficile de

suivre quantitativement au cours du temps toutes les concentrations en matières

actives du mélange. C’est pourquoi, afin de mieux comprendre les mécanismes de

dégradation des molécules et de quantifier la toxicité, nous nous sommes intéressés

au developpement d’un test d’autocontrôle rapide et fiable basé sur l’inhibition

métabolique de la synthèse d’ATP de Saccharomyces cereviseae.


110


Saccharomyces cerevisiae, bio-marqueur de la pollution phytosanitaire

L'Arrêté du 12 septembre 2006 du Ministère de l’écologie et du développement durable

réglemente l’utilisation et le rejet des produits phytopharmaceutiques. La dernière partie de

l’arrêté décrit les dispositions relatives aux procédés de traitement des effluents

phytosanitaires et les modalités pour qu’un procédé puisse être autorisé. Pour répondre à

cette autorisation, des tests de toxicité sont exigés.

III.3.1. Rappel bibliographique

L’objectif de cette étude est de développer un test d’autocontrôle simple, rapide et peu

coûteux, permettant de définir l’efficacité des procédés de dégradation des résidus

phytosanitaires. L’étude évalue l'effet des pesticides sur l'activité, la croissance et la viabilité

métabolique (Adénosine-5-triphosphate (ATP)) des levures Saccharomyces cerevisiae

(S.C.).

Les résultats obtenus permettent la mise en place d’un nouveau test de toxicité aigu qui

mesure l’effet inhibiteur des pesticides sur l’activité métabolique de S.C.. Ce test est mis en

parallèle avec les tests écotoxicologiques normés demandés par l’Arrêté en comparant les

EC50 obtenus de trois matières actives sélectionnées : L’Azoxystrobine (fongicide d’origine

naturel), le Cymoxanil (fongicide) et le Diuron (herbicide). Ces trois molécules sont choisies

pour leurs natures chimiques différentes. De plus, leurs trois EC50 Daphnia magna (48 h)

sont représentatifs de l’ensemble des molécules (0,26 à 27 mg.L-1 d’EC50).

Les essais biologiques sont basés sur des micro-organismes aquatiques eucaryotes :

Daphnia magna et Pseudokirchneriella subcapitata. Ils sont employés pour détecter et

prévoir les effets néfastes des polluants chimiques sur les populations et les écosystèmes.

Les bioessais classiques, demandés par l’Arrêté, se fondent sur des organismes qui ont un

temps d'acclimatation important, les rendant difficile à mettre en oeuvre et coûteux (Farre

et Barcelo, 2003). Des bioessais microbiens peu coûteux existent avec des cycles de vie

courts répondant rapidement aux changements environnementaux (Bitton et al., 1984).

Cependant, la majorité des essais microbiens existant ne sont pas assez sensibles pour

détecter de faibles concentrations en toxiques (Schmitt et al., 2004). Une des alternatives


111

est l’utilisation d’organismes stables, de croissance rapide et de faible pouvoir mutagène tels

que les levures (Soares et Calow, 1993).

L'inhibition de Saccharomyces cerevisiae par des pesticides a déjà été démontrée par

plusieurs auteurs. Par exemple, la présence de résidus de fongicides (cyprodinil, fludioxinil

et pyriméthanil) pendant la fermentation alcoolique affecte le métabolisme de S.C.

entraînant une modification de la composition aromatique des vins blancs Vitis vinifera

causant une diminution de qualité sensorielle (Hatzidimitriou et al., 1997).

En outre, l'analyse de l’expression des gènes de S.C. en réponse au lindane a indiqué un

dysfonctionnement mitochondrial (Parveen et al., 2003). Ribiero et al. (2000) ont également

observé que les taux respiratoires spécifiques de S.C. ont été inhibés par des pesticides

(penconazole, cymoxanil et dichlofluanide).

Ainsi la levure, en particulier S.C., semble être un bon modèle pour évaluer la toxicité des

micropolluants, comme Bitton et al. (1984) l’ont démontré en étudiant la toxicité de métaux

lourds sur la levure. Malgré ces travaux, seulement quelques chercheurs ont employé S.C.

comme bioindicateur de la toxicité (Kungolos et Aoyama, 1992; Kungolos et al., 1999).

III.3.2. Protocole Opératoire

III.3.2.1. Souche de levure

La souche de levure utilisée dans cette étude est Saccharomyces cerevisiae var. Bayanus

(AWRI 350) et est commercialisée par AB MAURY Wine. Ces levures sèches actives sont

utilisées au moment des vinifications pour le développement de vins rouges jeunes

aromatiques de qualité. Elle a été sélectionnée pour cette étude car sa phase de latence est

courte, qu’elle a une bonne floculation et produit peu de mousse.

III.3.2.2. Conditions de culture

La souche de levure est conservée à 10 °C. 10 g de levures sèches actives avec 10 g D-

glucose, dissous dans 100 mL d’eau minérale sont incubées. Pendant 30 min, dans un bain

marie à 30 °C, sous agitation mécanique, les levures sèches sont régénérées. L’hydratation

de la suspension de levures (levain) est observée sous microscope optique à un

grossissement (X 400) (Figure III.25).


112

Figure III.25. Photo de levures au microscope optique Grossissement X400.

a. levures en cours de régénération ; b. levures régénérées.


1 mL de la suspension de levain est cultivé en absence et en présence de 4 mL de solution

de molécules phytosanitaires. Le protocole opératoire est représenté par la Figure III.26.

Les échantillons, maintenus à 20 °C, sont utilisés pour déterminer la production

d’adénosine-5-triphosphate (ATP), la production de la biomasse et l’activité de la levure.

Figure III.26. Protocole expérimental du test ATPyeast

Levain régénéré 30 min., 30°C (Souche Saccharomyces cerevisiae AWRI 350)SC))

10 g de souche + 10 g de glucose dans

100 mL d’eau

1ml de levain

4 ml

TEMOIN (Eau minérale)

4 ml

ESSAI

(Produits phytosanitaires)

a. b.

• Croissance des colonies de levures • Viabilité des levures par test Live Dead • Mesure des concentrations en ATP

a.


113

III.3.2.4. Dénombrement des levures

Pour estimer les effets des pesticides sur la production de biomasse, il est effectué des

dénombrements sur un milieu gélosé spécifique levure. Seules les levures viables cultivables

donnent après incubation des colonies. Pour l'ensemencement, le milieu est constitué de la

manière suivante: 5 mL de milieu nutritif (10 g d'extrait de levure, 10 g d'acide aminé ou

peptone bactérienne et 20 g de D-glucose, dissous dans 1 litre d'eau distillée et pH ajusté à

4), 5 mL de milieu gélosé ( 20 g d'agar dissous dans 1 litre d'eau distillée) et 0,1 mL de

pénicilline (12.5 mg/10 mL d'eau distillée stérile) pour inhiber la croissance des bactéries

lactiques, 0,2mL de diphényle (75 mg/10 mL d'éthanol à 95 %) pour inhiber la croissance

des moisissures, 0,2mL de chloramphénicol (50 mg/10 mL d'éthanol à 95 %) pour inhiber la

croissance des bactéries acétiques.

Les géloses sont ensemencées en surface par la méthode des billes avec 0,1 mL

d’échantillon. L’échantillon est dilué jusqu’à 10-10 afin d’obtenir un nombre de colonies

compris entre 30 et 300 par boite. Les boites sont ensuite mises à incuber 48 h à 25°C.

III.3.2.5. Test de viabilité

Afin de définir si la présence de pesticides dans l’échantillon est liée à la mort des levures,

un kit Live-Dead Yeast Viability L-7009 est utilisé. Ce kit permet de différencier les levures

viables (cultivable ou non) des levures mortes. Il est composé d'un réactif appelé Fun 1 qui

contient un fluorochrome le DMSO (diméthyl sulfoxide anhydre) à 10 mM transporté de

façon active à l'intérieur de la levure.

Après 30 minutes de contact de 1mL de levain avec 4 mL d’échantillon (témoin et essai), 1

mL prélevé est centrifugé pendant 5 minutes à 10 000 G. Le surnageant est éliminé et le

culot contenant les levures est dilué dans 1 mL de tampon HEPES. La solution est incubée

avec 1 µl de FUN 1 à 30 °C pendant 30 minutes à l'obscurité. 5 µL de suspension sont

observés sous un microscope à fluorescence (excitation = 480 nm; émission 530 nm).

Les cellules métaboliquement actives sont identifiées par une structure vacuolaire

fluorescente de couleur rouge extrêmement lumineuse, alors que les levures n’ayant pas

d'activité métabolique ont une fluorescence diffuse vert-jaune (Figure III.27).


114

Figure III.27. Protocole experimental de détermination de la viabilité des levures.

III.3.2.6. Dosage de l’ATP

L'Adénosine-5-triphosphate (ATP) est un intermédiaire énergétique universel de la cellule

vivante. Cette molécule est en relation directe avec l'activité de la cellule ; toute cellule

vivante produit et consomme de l'ATP qui est produit majoritairement par respiration dans

le cas de la levure.

Figure III.28. Représentation simplifiée du métabolisme cellulaire.

1 mL de levain +

4 mL d’échantillon

30 min

1 mL mélange

5 min 10000 G

Élimination du surnageant

1ml tampon glucose -hepès +

1 µL Fun 1 (PROBES Science )

30 min. 30°C Obscurité

5 µL sur une lame Observation

microscopique épifluorescence

λext= 480 nm λém= 530 nm

Levure rouge (viable) Levure verte/bleu (non viable)

Source de carbone

Source d’azote

O2

Substances de réserves

Matériaux cellulaires

Métabolites, enzymes

Produits d’excrétion

CO2 + H2O ATP

Membrane cellulaire

Mitochondrie

Noyau cellulaire

Barrière de diffusion


115

Diverses méthodes existent pour doser l'ATP mais la technique la plus rapide, d’une grande

sensibilité et relativement précise est la bioluminescence. Cette technique utilise la capacité

qu'ont certains organismes vivants (poissons, méduses, lucioles, vers luisants,

photobactéries) à émettre de la lumière de diverses couleurs, mettant en jeu une réaction

enzymatique différente.

La technique de mesure de l’ATP utilisée repose sur la capacité du coléoptère Photinus

pyralis d'émettre de la lumière par une réaction enzymatique bioluminescente. La

bioluminométrie (technique de mesure de la lumière émise par une réaction) possède

plusieurs avantages car elle concilie: une bonne sensibilité, des instruments de mesure et

des réactifs très peu chers, un protocole expérimental très simple et un bruit de fond très

réduit ou nul.

Pour effectuer ce dosage, la lumière émise par réaction enzymatique est mesurée. En

présence de l’ion Mg2+, d'ATP et de dioxygène, la luciférine est oxydée sous l'action de la

luciférase en oxyluciférine avec production de lumière. La vitesse de réaction est maximale à

une température de 24°C et est très peu modifiée entre 18 et 28 °C. Un bâton AQUAtrace,

placé en contact avec la solution expérimentale, contient les réactifs et les composés qui

détruisent les enveloppes de la cellule et inhibent les ATPases ainsi que toutes les enzymes

extracellulaires. La lumière émise est mesurée et exprimée en Unité Relative de Lumière

(URL) par un luminomètre Uni-Lite NG (BIOTRACE) à une longueur d’onde λ de 562 nm.

Le luminomètre (BIOTRACE®) est constitué d'une chambre qui réceptionne l'échantillon en

le plaçant le plus près possible du tube photomultiplicateur. La chambre doit être isolée de

la lumière ambiante afin de minimiser les interférences potentielles. Le tube

photomultiplicateur permet d'amplifier le passage des photons et de le transformer en une

cascade d'électrons dont l'intensité est mesurée.

Le mécanisme de la réaction peut être décomposé en deux étapes:

- L'activation de la luciférine LH2 avec formation de luciféryl-adénylate et la libération de

pyrophosphate.

Luciférase + Mg2+

ATP + LH2 LH2-AMP + PP


116

- L'oxydation de ce complexe en présence d'oxygène qui donne l'oxyluciférine dans un état

excité, avec décarboxylation. Le retour à l'état électronique stable de l'oxyluciférine

s'accompagne d'une émission de lumière.

LH2-AMP + O2 oxyluciférine + CO2 + AMP + Photons

Soit une équation bilan :

Luciférase + Mg2+ + Photons

Luciférine + ATP + O2 Oxyluciférine + CO2 + AMP + PP

III.3.3. Incidence des pesticides sur la levure Saccharomyces cerevisiae

Les expérimentations évaluent l'effet des pesticides sur l'activité métabolique (ATP), la

viabilité et la croissance des levures Saccharomyces cerevisiae (S.C.).

III.3.3.1. Molécules phytosanitaires

Les 14 pesticides issus des produits commerciaux sont utilisés en mélange pour les

expériences. Les concentrations en matières actives correspondent à celles retrouvées dans

un effluent viticole après lavage du matériel de pulvérisation (Tableau III.21).

Tableau III.21. Les produits phytosanitaires sélectionnés

Produits commerciaux Substances

actives

Concentrations substances

actives (mg.L-1)

Concentrations produits

commerciaux (mg.L-1)

Cymoxanil 30 ANTEOR

Folpel 254 380

BOUILLIE BORDELAISE Sulfate de cuivre 40 200


Mancozèbe 7 680 EPERON PEPITE

Méfénoxam 466 12000

FLUDIOSOUFRE Soufre 693 700


Diquat 67 GRAMOXONE

Paraquat 22 89


SCALA Pyriméthanil 50 50


Fludioxonil 243 970

MELANGE environ 1 g/L Environ 1,5 g/L

Lumière λ = 562 nm


117

Une solution d’un litre de chacun des pesticides a été préparée et 100 mL de chaque

solution ont été mélangés pour former une « solution mélange » qui contient 1 000 mg.L-1

de matières actives phytosanitaires.

III.3.3.2. Evolution des teneurs en ATP au cours du temps

L’évolution en ATP (URL) en présence et en absence de pesticides est représentée Figure

III.29. Les mesures sont effectuées toutes les 30 minutes pendant 3 heures et au premier

quart d'heure.

Figure III.29. Evolution des teneurs en ATP (URL) de la levure : Témoin (�), Mélange phytosanitaire (�).

De 0 à 15 min de contact, les valeurs d’ATP dans le témoin chutent en raison de

l’acclimatation des levures à un nouveau milieu (2,6 105 à 1,7 105 URL pour le témoin). Les

levures reprennent une activité métabolique (2,9 105 ± 0,4 105 URL) qui diminue

rapidement et progressivement en raison de l’absence de substrat.

En présence du mélange de pesticides, la courbe évolue de manière différente. Lors de la

mise en contact, les levures subissent un stress qui se visualise par une décroissance en ATP

suivie d’une phase quasi-stationnaire jusqu’à 90 min à 0,4 105 URL. Les écarts initiaux

observés au cours de la phase d’acclimatation entre le Témoin et l’Essai sont considérés

comme négligeable vis-à-vis des valeurs d’écart type. Après 90 minutes de contact, le

contenu d’ATP dans l’essai augmente, atteignant 1,5 105 ± 0,2 105 URL à 120 minutes.

Temps (min)

ATP (URL)

ATP (URL)

0

0,5.10-5

1,0.10-5

1,5.10-5

2,0.10-5.

2,5.10-5.

3,0.10-5

3,5.10-5

0 30 60 90 120 150 180

ATP (URL)

Temps (Min.)


118

La différence maximale entre le Témoin et l’Essai est observée à 30 min de contact des

levures avec le milieu. Ce temps sera employé pour comparer les résultats avec le test de

viabilité et de production de biomasse.

III.3.3.3. Effet des pesticides sur la viabilité de la levure et la production de

biomasse

Après un contact de 30 minutes, l'effet des pesticides sur la viabilité et la production de

biomasse de levures sont mesurées.

La production de biomasse a été évaluée par culture sur milieu gélosé spécifique. Les

colonies de levures ont été dénombrées mais aucune différence n’a été observée entre le

témoin (1011-1012) et l’essai (1011). Par conséquent, les pesticides n'ont pas affecté la

croissance des levures.

Figure III.30. Viabilité des levures : photo a (Témoin) et photo b (Mélange phytosanitaire)

Observation sous un microscope à fluorescence : excitation 480 nm ; émission 530 nm.

De même, la viabilité des levures dans le témoin et dans l’essai est évaluée en utilisant le kit

commercial L-7009 LIVE/DEAD (Molecular probes) (Figure III.30). Les comptages montrent

peu de différence : à titre d’exemple, sur les photos de la Figure III.30, le pourcentage de

levures viables est de 80 % pour le témoin et de 70 % pour l’essai. Ainsi, nous

considérerons que les pesticides n'ont pas d’effet sur la viabilité de S.C..


Cette expérimentation démontre que les pesticides ont affecté la synthèse d’ATP de S.C.

pendant une période courte (90 minutes). L'effet n’est pas continu, car à 120 minutes de

contact avec le mélange de pesticides les teneurs en ATP augmentent. En parallèle, l'activité

et la croissance de levures sont mesurées en présence des pesticides et un faible effet est

observé.

a. b.


119

Les pesticides ont affecté le métabolisme énergétique des levures en empêchant la

biosynthèse de métabolites, tels que l’ATP. Ces résultats ont confirmé des études

précédentes qui démontrent l'effet de ces produits chimiques sur le métabolisme de la

levure. Ainsi, l'étude de Jawich et al. (2006) a évalué l’effet inhibiteur du penconazole sur la

cinétique de croissance de S.C.. De plus, Ribiero et al. (2000) ont montré l'effet des

fongicides (penconazole, cymoxanil, dichlofluanide) sur le taux de croissance spécifique

(µO2) de S.C.. Quand les levures se développent en présence de cymoxanil, il y a une

diminution significative du taux de croissance et de la production de biomasse qui peut

atteindre 80 % signe de l'effet des fongicides sur l'activité métabolique des levures mesurée

par respirométrie.

En parallèle, le travail de Parveen et al. (2003) sur l'analyse fonctionnelle de 6000 gènes a

démontré l'effet génétique des pesticides sur S.C. En présence de lindane, S.C. induit un

dysfonctionnement mitochondrial, une diminution de la synthèse des métabolites ainsi qu’un

stress oxydatif. Razmovsky et Pucarevic (2002) ont observé des résultats semblables. A une

concentration de flutriafol de 9 mg.L-1 la concentration en protéines a diminué de 8 %, en

acide ribonucléique total de 43 % et en activité enzymatique de 38 % chez S.C.. De plus, la

chaîne respiratoire (cytochrome aa3, b, c) est affectée ; ce qui empêche le bon

fonctionnement du métabolisme de la levure.

Selon Xiang et al. (2005), le métabolisme de S.C. serait inhibé par les pesticides et non sa

croissance et sa reproduction à long terme. D’après plusieurs publications, les pesticides

(cuivre ; glyphosate ; benzimidazole-2-yl-carbamate ; lindane ; flutriafol) auraient un effet

génotoxique sur les gènes mitochondriaux codant pour la chaîne respiratoire (Parveen et al.,

2003 ; Razmovsky et Pucarevic, 2002).

Ainsi, ce nouveau test de toxicité aiguë rapide et peu coûteux comparé aux tests

écotoxicologiques traditionnels (tels que Daphnia magna, Pseudokirchneriella

subcapitata,...) pourrait être utilisé pour déterminer la pollution de l’eau ou l’efficacité de

procédés de traitement d’effluents contaminés par des produits phytosanitaires.

III.3.4. Validation du test d’écotoxicité aiguë (ATPyeast test)

Le test ATPyeast détermine l'effet des trois pesticides sur la synthèse d’ATP de la levure

Sacharomyces cerevisiae (AWRI 350) et compare la toxicité aiguë des molécules actives

phytosanitaires (EC50) avec les tests de toxicité traditionnels : l’inhibition de la mobilité de

Daphnia magna et l’inhibition de la bioluminescence de Vibrio fisheri.


120


Les trois pesticides sélectionnés sont : l’Azoxystrobine, le Cymoxanil et le Diuron. ils

ont chacun un rôle et des structures chimiques différentes (Figure III.31).

Azoxystrobine Cymoxanil Diuron

Figure III.31. Structure des matières actives phytosanitaires sélectionnées

L'Azoxystrobine dérive d’un groupe de fongicide naturel dérivé de l'acide b-

méthoxyacrylique. Son activité fongique permet d'inhiber l’activité respiratoire

mitochondriale des moisissures et d’interrompre le cycle d'énergie et donc la

production d’ATP (Bartlett et al., 2002). Le Cymoxanil, petite molécule aliphatique,

appartient à la famille des amides substitués. Il est utilisé pour le contrôle des

maladies de type moisissure en inhibant la germination des spores et la biosynthèse

des acides aminés (Leroux, 1994). Le Diuron appartient à la famille des urées

substituées. il est utilisé comme désherbant et pénètre dans la plante par la racine et

bloque le transfert des électrons mitochondriaux du cycle de Krebs et arrête la

photosynthèse (Tixier et al., 2000).

III.3.4.2. Réponse des pesticides sur la synthèse d’ATP de Saccharomyces

Cerevisiae

La Figure III.32 représente les histogrammes « dose-réponse » des différents

pesticides selectionnés : Azoxystrobine (a), cymoxanil (b) et Diuron (c). Le graphique

représente la concentration en ATP en fonction de la concentration en pesticides. Pour

les trois histogrammes, la diminution des teneurs en ATP de Saccharomyces cerevisiae

est plus importante lorsque la concentration en molécule phytosanitaire augmente.

L’effet des pesticides sur la synthèse d’ATP, après 30 minutes de contact, peut être

ainsi mise en relation avec leurs teneurs effectives. Les incertitudes de mesures ont

été réalisées à partir de trois expérimentations distinctes.


121

Figure III.32. Effet de l’Azoxystrobine, du Cymoxanil et du Diuron sur la synthèse d’ATP de S.C.

y = 295826e-0,2297x

R2 = 0,9385

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

Contrôle 0,1 1 10 100 1000

Concentration en Azoxystrobine (mg.L-1)

Concentration en ATP (URL)

y = 316312e-0,1969x

R2 = 0,913

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

Contrôle 0,1 1 10 100 1000

Concentration en cymoxanil (mg.L-1)

Concetration en ATP(URL)

y = 160153e-0,1885x

R2 = 0,9621

0

25000

50000

75000

100000

125000

150000

175000

200000

Control 0,1 1 10 100 1000

Concentration en Diuron (mg.L-1)

Concentration en ATP(URL)


122

Pour déterminer précisément les différences d’inhibition de la levure entre les

molécules testées, il est nécessaire de calculer les valeurs d’EC50 (concentration qui

affecte 50 % de la population) en utilisant la methode PROBIT (Chen et al., 2004).

III.3.4.3. Détermination de l’EC50

La détermination des valeurs de EC50 est obtenue à partir du calcul du pourcentage

d’inhibition. L’effet toxique est déterminé en comparant le témoin (eau) avec

différentes concentrations en solutions phytosanitaires (0,1 à 1000 mg.L-1). Le

pourcentage d’inhibition est calculé de la manière suivante :

([ATP]contrôle-[ATP]essai/[ATP]contrôle)*100

Les valeurs obtenues en pourcentage d’inhibition déterminent la valeur d’EC50. La

courbe présentant les valeurs d’inhibition en fonction des concentrations en pesticides

est de type logarithmique ne permettant pas le calcul de l’EC50. les valeurs d’EC50 sont

alors déterminées par analyse PROBIT, qui constite à tracer la droite log (concentration

en pesticides) en fonction du pourcentage d’inhibition (Figure III.33).

L’analyse PROBIT permet d’obtenir une droite de régression pouvant déterminer les

valeurs d’EC50. Cette méthode simple et rapide a été utilisée par Barata et al. (2004)

pour quantifier la toxicité des pesticides organochlorés et carbamates sur les micro-

organismes aquatiques Daphnia magna. L’analyse PROBIT est adaptée aux courbes

dose-réponse des toxiques. Le modèle PROBIT indique que la capacité de tolérance des

micro-organismes en réponse à un toxique dans une population donnée est une

distribution Log-normale (Chen et al., 2004).


123

Figure III.33. Graphique PROBIT pour déterminer les valeurs d’EC50 d’Azoxystrobine, du Cymoxanil et du Diuron.

III.3.4.4. Validation du biotest

Le Tableau III.22 présente les valeurs d’EC50 déterminées par analyse PROBIT pour le

biotest dévellopé. Les valeurs d’EC50 obtenues expérimentalement sont comparées avec

les valeurs de deux tests écotoxicologiques normés (test de mobilité Daphnia magna et

bioluminescence de Vibrio fisheri).

Tableau III.22. Comparaison des valeurs de toxicité aiguë de l’Azoxystrobine, du Cymoxanil et du Diuron avec les

différents biotests (ATPyeast-test, test Vibrio fisheri et test Daphnia magna).

Azoxystrobine Cymoxanil Diuron

Biotest mg L-1

Levures: Saccharomyces cerevisae

EC50 30 min 1,7 37,4 14,4

Bactéries: Vibrio fisheri

EC50 30 min - 39,1 (a) 58 (b)

Invertebrés aquatiques : Daphnia magna

EC50 48 h 0,3 (c) 27 (c) 5,7 (c)

Coefficient de Partage octanol / eau (Log P) 2,5 0,66 2,8

(a) source Oller and al., 2006 ; (b) Source Tixier and al., 2000 ; (c) Source “Footprint”.

y = 8,2483x + 48,21

R2 = 0,9097

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Log (Azoxyxtrobine mg.L- 1)

% d’inhibition

y = 9,2826x + 35,429 R2 = 0,9202

0

10

20

30

40

50

60

70

80

-2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Log (cymoxanil mg.L- 1)

% d’inhibition

y = 8,0185x + 40,702

R2 = 0,9788

0

10

20

30

40

50

60

70

-2,0 -1,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Log (Diuron mg.L-1)

% d’inhibition


124

On peut remarquer que les biotests ont une durée très variable; ainsi le test de

mobilité Daphnia magna est de 48 heures alors que les biotests utilisant des bactéries

comme Vibrio fisheri et le test proposé avec S.C. ont un temps de contact de

seulement 30 minutes. L'effet des pesticides sur S.C. est variable en fonction de la

nature du pesticide :

EC50 Cymoxanil < EC50 Diuron < EC50 Azoxystrobine.

Il en est de même pour le test d’inhibition de Vibrio fisheri (EC50 Diuron< EC50

cymoxanil) et du test d'inhibition de Daphnia magna (EC50 Cymoxanil< EC50 Diuron<

EC50 Azoxystrobine).

En comparant la sensibilité du biotest, on remarque que les valeurs obtenues en EC50

par Vibrio fisheri sont trois fois plus élevées pour le diuron et similaires en ce qui

concerne le cymoxanil. Ce test est donc peu sensible pour les produits phytosanitaires.

De même, Kay et al. (2007), remarquent que le test avec Vibrio Fisheri n’est pas assez

sensible pour l’estimation de la toxicité dans l’eau.

Le test Daphnia magna est plus sensible que le nouveau Biotest avec S.C.. En effet, le

test normé est cinq fois plus sensible pour l’Azoxystrobine, trois fois plus sensible pour

le Diuron et similaire pour le Cymoxanil.


L’effet des pesticides observé sur la synthèse d'ATP de Saccharomyces cerevisiae n’est

pas linéaire mais de forme exponentielle. Cette observation a été démontrée par

Ribeiro et al.(2000). En effet, ils ont montré que l’effet du cymoxanil sur la croissance,

la production de biomasse et la consommation d’oxygène de Saccharomyces cerevisiae

IGC 3507 était de forme logarithmique à des concentrations en pesticides de 0 à 100

mg.L-1.

Pour déterminer les valeurs d’EC50 des différentes molécules phytosanitaires testées à

partir des valeurs d’inhibition obtenues, la méthode PROBIT a été utilisée. Pour chacun

des trois pesticides sélectionnés, les EC50 obtenus expérimentalement avec le biotest

proposé sont comparés avec des tests toxicologiques normés (test de Mobilité Daphnia

magna et test de bioluminescence Vibrio fisheri).


125

Les valeurs d’EC50 obtenues ont démontré que l'effet des pesticides sur Saccharomyces

cerevisiae est fonction de la nature du pesticide. Il est remarqué que pour les micro-

organismes Daphnia magna et S.C. le pesticide Cymoxanil est moins toxique que le

Diuron et l’Azoxystrobine. Ce résultat suit les valeurs de Log P (Coefficient de partage

eau/éthanol) qui traduit la nature hydrophobe des molécules phytosanitaires. En effet,

le Cymoxanil, molécule aliphatique, à un Log P très faible 0,66 contrairement aux 2

autres pesticides testés (≈ 2,5). La toxicité des pesticides sur ces micro-organismes

eucaryotes est fortement influencée par la nature même de la molécule (Bartlett et al.,

2002). En comparant l’effet de différentes strobilurines sur des organismes aquatiques

(Daphnia magna 48 h, algues vertes 72 h, poissons 96 h) les auteurs démontrent

qu’une augmentation de Log P amène une augmentation de la toxicité.

Ce nouveau biotest développé est plus sensible que le test de bioluminescence avec

Vibrio fisheri. Cette constatation a été observée par Tixier et al. (2000) qui ont montré

que pour évaluer la toxicité du diuron, l'organisme eucaryote Tetrahymena pyriformis

(EC50 = 6,33 µg.mL-1) est 10 fois plus sensible que la bactérie Vibrio fisheri (EC50 = 58

µg.mL-1).

Le test de mobilité Daphnia magna est plus sensible que le test ATPyeast mais

nécessite un temps de contact beaucoup plus long : 48 heures. Malgré cette différence,

les valeurs obtenues d’EC50 sont de l'ordre du mg.L-1, ce qui est assez sensible pour

évaluer l'efficacité d'un procédé de traitement d'effluents phytosanitaires. En effet,

pour un effluent d’entrée moyen à 1500 mg.L-1 de pesticides, correspondant à un

rinçage à la parcelle, avec un rendement épuratoire de 99 %, l’effluent de sortie

contiendra 15 mg.L-1 de molécules phytosanitaires (résultats développés dans le

chapitre III.4.).

III.3.5. Conclusion

Les tests traditionnels (Daphnia magna, Vibrio fisheri) sont lourds à mettre en oeuvre

et coûteux (Radix et al., 2000). Pour le suivi d’une unité d’épuration de traitement de

produits phytosanitaires, il nous a semblé utile de développer un test fiable, facile à

réaliser, rapide et peu coûteux. Ainsi, après une recherche bibliographique et les

nombreuses études menées à la Faculté d’Oenologie, nous avons choisi de travailler

sur la modification de la synthèse d’ATP de Saccharomyces cereviseae en présence de

molécules toxiques.


126

Les pesticides affectent la synthèse d’ATP de Saccharomyces Cerevisiae pendant une

période courte (90 minutes). L'effet n’est pas continu, car à 120 minutes de contact avec le

mélange de pesticides, la synthèse d’ATP débute. En parallèle, l'activité et la croissance de

levures ont été mesurées en présence des pesticides et peu d’effet a été observé.

Les pesticides affectent le métabolisme énergétique des levures en inhibant les gènes

mitochondriaux qui commandent la chaîne respiratoire empêchant la biosynthèse des

métabolites tels que l’ATP. Ces résultats ont confirmé des études précédentes, démontrant

l'effet de ces produits chimiques sur le métabolisme de la levure ; comme celle de Ribiero et

al. (2000) qui a montré une diminution significative des taux respiratoires de S.C. et le

travail de Razmovsky et Pucarevic (2002) qui ont observé la diminution du contenu en

protéines, en ARN et de l'activité enzymatique chez S.C. par le flutriafol.

La validation du biotest proposé a été effectuée sur trois molécules phytosanitaires de

nature et de structure chimique différente. A partir des pourcentage d’inhibition de la

synthèse d’ATP de Saccharomyces cerevisiae, les valeurs d’EC50 furent obtenues par

analyse PROBIT. Les résultats démontrent que l'effet des pesticides sur la levure est

variable suivant la nature de celui-ci. La toxicité sur ces micro-organismes eucaryotes

est fortement influencée par la nature même de la molécule (log P). De plus, le

nouveau biotest est plus sensible que le test microtox® actuellement commercialisé.

Par contre, le test de mobilité Daphnia magna, largement utilisé en écotoxicologie, est

plus sensible mais nécessite un temps d’analyse plus long. Malgré cette différence de

sensibilité les valeurs obtenues d’EC50 sont de l'ordre du mg.L-1 ; ce qui est assez

sensible pour évaluer l'efficacité d'un procédé de traitement d'effluents phytosanitaires

ou assurer le suivi de l’épuration dans le temps.

Ainsi, ce nouveau test de toxicité est employé pour l'évaluation en continu de l’efficacité

d’élimination de la toxicité des résidus de produits phytosanitaires au cours du traitement

biologique aérobie par boues activées.


127


Etude du procédé de bio-élimination combiné des effluents viti-vinicoles

La mise en place de différents procédés d’épuration des effluents viticoles (eau de lavage

des pulvérisateurs) et vinicoles (eau de lavage du matériel vinaire) s’est imposée au

secteur viticole. Actuellement, plusieurs systèmes d’épuration sont proposés aux

viticulteurs. Différents procédés physico-chimiques peuvent éliminer les pesticides : la

coagulation–floculation; l’osmose inverse ; la photocatalyse, permettant de dégrader des

matières actives organiques (Mietton-Peuchot, 2003). Une des alternatives à ces

procédés est l’utilisation de réacteurs biologiques (Biobed, boues activées,…).

Le nouveau procédé d’épuration de ces effluents, en développement, utilise les liqueurs

mixtes du traitement biologique vinicole comme biomasse épuratrice. Cette technique

permettrait de traiter conjointement les effluents vinicoles issus de l’élaboration du vin et

des effluents viticoles issus de la production du raisin.

Kipopoulou et al. (2004) ont étudié la dégradation des pesticides par différents micro-

organismes comme Speudomonas sp.. Ces travaux montrent que la biodégradation d'un

pesticide est un processus complexe. Le résultat dépend de l'interaction de nombreux

facteurs : la structure chimique, la concentration des composés et des conditions

environnementales.

Après avoir travaillé sur des liqueurs mixtes adaptées au laboratoire, le but de

l’expérimentation est d'évaluer le potentiel épuratoire d’un mélange de pesticides par une

liqueur mixte vinicole réelle. Le test d’autocontrôle développé dans le chapitre précédent,

différentes analyses physico-chimiques et des observations microscopiques permettent

de déterminer la capacité de la biomasse à éliminer cette pollution toxique.

Par ailleurs, nous avons vu que les surnageants des effluents viticoles (chapitre III.2.)

avaient des turbidités élevées que nous avons attribuées à une défloculation.

Conjointement, la libération des exopolymères (EPS) peut augmenter lors de la phase de

stress des micro-organismes en présence de toxiques. Ces composés seront suivis tout

au long de l’épuration.


128

III.4.1. Mode opératoire


Le Tableau III.23 représente les produits phytosanitaires constituant le mélange qui

alimente le bioréacteur de laboratoire (30 L).

Tableau III.23. Produits phytosanitaires composant l’alimentation des boues activées.

14 matières actives correspondant à 10 produits commerciaux sont utilisées pour les

expériences. Les concentrations sélectionnées correspondent aux résidus de

pesticides retrouvés après lavage et rinçage du matériel de pulvérisation. Pour cette

expérience, un litre de solution de chaque pesticide a été préparée et 100 mL de

chaque solution a été mélangée pour former une solution qui contient 14 pesticides

à 1000 mg.L-1.

III.4.1.2. Caractéristiques physico-chimiques et biologiques des boues

activées

Les boues activées sélectionnées pour les expériences sont collectées au mois de

juin dans le bassin d'aération traitant les effluents vinicoles des vignobles Mabille à

Saint Gervais, France. L’unité est constituée d’étapes physiques et biologiques

traitant en totalité des effluents issus de la transformation du raisin en vin. Ils

Produits commerciaux Substances

actives

Concentrations en

substances actives (mg.L-1)

Concentrations des produits

commerciaux (mg.L-1)

Cymoxanil 30 ANTEOR

Folpel 254 380

BOUILLIE BORDELAISE Sulfate de cuivre 40 200



Méfénoxam 466 12000

FLUDIOSOUFRE Soufre 693 700


Diquat 67 GRAMOXONE

Paraquat 22 89


SCALA Pyriméthanil 50 50


Fludioxonil 243 970

MELANGE environ 1 g/L Environ 1,5 g/L


129

proviennent principalement des opérations de nettoyage du matériel. La cave

produit des effluents majoritairement composés de sucres, d’alcools, d’esters, de

glycérol, d’acides organiques et de phénol auxquels s’ajoutent les détergents de

lavage des cuves.

Tableau III.24. Caractérisation initiale de la liqueur mixte issue de l’unité d’épuration

(vignobles MABILLE)

La liqueur mixte initiale contient approximativement 5 g MS.L-1. L’unité d’épuration

fonctionne à une charge massique moyenne de 0,2 kg BOD5.kg-1MS-1.Jour-1 et 0,8

kg BOD5.m-3.Jour-1 en charge volumique avec un pH d'approximativement 7. Les

charges sont considérées comme typique pour les unités de traitement d'eau par

boues activées des effluents vinicoles en France (Calner et al., 1998). Les valeurs

initiales des différents paramètres sont présentées dans le Tableau III.24.

En parallèle, l’observation des micro-organismes (Tableau III.25) montre qu’il y a

très peu de bactéries libres et qu’il n’y a pas de bactéries filamenteuses. De plus, la

présence de petits et grands flagellés, de sarcodines, de ciliés holotriches, de

rotifères et de nématodes démontre que la liqueur mixte correspond bien à une

unité fonctionnant en moyenne charge (Calner et al., 1998).

Analyses Valeurs initiales

Le substrat

DCO 507 ± 87 mg.L-1

COT 9 ± 2 mg.L-1

La biomasse

Volume de boue 710 ± 66 mL.L-1

Turbidité 16,5 ± 4 NTU

MES Surnageant 53 ± 5 mg.L-1

MS liqueur mixte 5,2 ± 0,75 g.L-1

MVS Liqueur mixte 2 ± 0,12 g.L-1


130

Tableau III.25. Observation des micro-organismes des boues activées des vignobles MABILLE.


bactéries libres XX

flocs

Observations bactéries filamenteuses X

petits flagellés XX

grands flagellés volvox aureus XX

euglypha X sarcodines-thécamébiens

arcella

paramecium XX

holophya XX

litonotus

chilodomela

ciliés holotriches

scintillans

vorticelle pédoncule court

opercularia ciliés péritriches

zoothammium

Protozoaires

ciliés spirotriches stentor

monogononta X rotifères

digononta

nématodes X Métazoaires

oligotèches alelosama


Au cours des expériences, la charge volumique est fixée à 0,9 kg.DCO m-3.jour-1 et

la biomasse est maintenue à X = 6 g.L-1 avec une charge massique fixée à 0,15 kg

DCO kg.MES-1.jour-1. Le volume de boues activées (liqueur mixte) est de 20 litres ;

les boues sont aérées en continu et maintenues en suspension par un agitateur.

Deux litres d’effluent sont soutirés chaque jour et un volume équivalent d’effluent

d’entrée constitué d’un mélange de pesticides à 1 g.L-1 (Tableau III.23) dilué dans

une solution à 50 mL.L-1 de vin rouge jeune est ajouté. Les boues sont recirculées

quotidiennement. Chaque jour, la liqueur mixte de sortie (2 L) est collectée pour les

analyses. Les échantillons sont séparés en trois aliquotes, tous analysés

indépendemment les uns des autres pour déterminer l'incertitude expérimentale.

Dans les expériences, des échantillons à plusieurs intervalles du temps sont

analysés. L’évolution qualitative et quantitative de la biomasse est déterminée en

mesurant les matières sèches (MS), les matières en suspension (MES), les matières

volatiles (MVS), la turbidité, les polysaccharides, les protéines et les substances

humiques. Pour évaluer la performance du pilote, plusieurs paramètres physico-


131

chimiques (DCO, COT) sont mesurés dans l'effluent. Les concentrations en matières

actives phytosanitaires sont analysées dans le surnageant et dans les boues. Pour

compléter l’expérimentation, un suivi de l’évolution des micro-organismes ainsi que

de la toxicité est effectué.

III.4.2. La dégradation des effuents viti-vinicoles

Tous les deux jours, des analyses physico-chimiques sont réalisées sur le surnageant afin

de suivre l’évolution de la dégradation des matières actives phytosanitaires.

III.4.2.1. Evolution de la DCO et du COT

Toute biomasse en présence d’un nouveau substrat subit une phase d’acclimatation

qui est visualisée sur la Figure III.34.

Figure III.34. Evolution de la Demande Chimique en Oxygène (DCO)(�) et du Carbone Organique Total

(COT)(□) au cours du traitement biologique.

Dans le cas des molécules phytosanitaires, l’effet toxique sur une population de micro-

organismes sensibles se traduit par une augmentation importante de la Demande

Chimique en Oxygène (DCO) et du Carbone Organique Total (COT).

La biomasse résistante s’adapte et permet ensuite la réduction de la DCO et du COT. Le

temps d’adaptation est de l’ordre de 7 à 8 jours avec un pic de DCO de 6480 ± 1100

mg.L-1 et de COT de 1420 ± 240 mg.L-1. Quand la nutrition en pesticides est arrêtée au

21ème jour, la DCO est de 336 ± 58 mg.L-1 et est conforme à la législation du décret du

15 mars 1999 (valeurs limites du rejet des effluents vinicoles). Ainsi, les fluctuations de

la DCO observées correspondent au temps d'adaptation de la biomasse. Bouhabila

0200400

600

8001000

1200

1400 1600

1800

0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 26 27 28 29Temps (jours)

COT (mg.L -1)

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000 DCO (mg.L -1)


132

(1999) a observé ce phénomène dans un bioréacteur à membranes immergées, ce qui

tend à énoncer que la variation de la DCO peut être considérée comme due à

l’acclimatation des micro-organismes.

III.4.2.2. Evolution des teneurs en pesticides

Tout au long du traitement, les micro-organismes présents dans la liqueur mixte peuvent

dégrader les résidus de pesticides, mais il est possible que certains ne soient pas

dégradés et s’accumulent dans les boues. Les mesures des concentrations se sont

effectuées dans l’effluent initial, dans l’effluent épuré et dans les boues après 30 jours.

Un bilan matière de chaque substance active est effectué sur 20 jours en tenant compte

de la réintroduction quotidienne des boues et des quantités résiduelles dans la liqueur

mixte du bioréacteur en fin de traitement.

Tableau III.26. Concentrations résiduelles en sulfates, cuivre et soufre total après traitement.

EFFLUENTS BOUES

composés Avant traitement

(µg/L)

Après traitement

(µg/L)

Efficacité d’élimination

(%)

Après traitement (g.g de MS)

Efficacité globale (%)

Sulfates (SO4)

46 000 24 000 47,82 554 18

Cuivre (Cu) 6 000 27 99,55 895 -

Soufre total (S)

91 000 9 600 89,95 12 600 - 330

Le cuivre et le soufre total se retrouvent en faible concentration dans l’effluent de sortie

(Tableau III.26). Les sulfates se retrouvent en grande partie dans l’effluent épuré (48

%). En effet, il est reconnu que les métaux lourds comme le cuivre, le zinc et

l’aluminium sont piégés par les boues comme le démontrent Pruksathorn et Duverneuil

(1999). Cependant, nos résultats ne concordent pas avec une accumulation du cuivre

dans les boues. Les méthodes d’analyses et d’extraction sont délicates à mettre en

oeuvre. Le cuivre devrait se retrouver intégralement dans les boues alors que nous

trouvons une efficacité globale de 55 %. Les résultats sur le soufre peuvent paraître

surprenants mais les vins sont sulfités à de nombreuses reprises lors de leur

élaboration ; ce qui explique une quantité de soufre retrouvée plus importante que celle

apportée lors de l’expérimentation. Les sulfates sont peu éliminés par traitement

biologique.


133

Tableau III.27. Concentrations résiduelles en pesticides organiques après traitement.

EFFLUENTS BOUES

MATIERES ACTIVES Avant traitement

(µg/L)

Après traitement

(µg/L)

Efficacité dégradation

(%)

Après traitement

(µg/kg de MS)

Efficacité globale (%)

Diquat 266 0,23 99,91 - 99,87 Paraquat 474 0,29 99,94 - 99.91

Dithiocarbamates 801 0,2 99,97 15800 94.04

Glyphosate 103 0,2 99,80 ≤ 1 99.77

AMPA (métabolite) 1,8 0,7 61,11 116 20.33 Cymoxanil 739 ≤ 0,1 99,98 ≤ 50 95.94 Cyprodinil 1121 0,74 99,93 728338 0

Dimétomorphe 440 7,9 98,20 ≤ 50 97.27 Fludioxonil 9452 223 97,64 269168 87.92

Folpel 208 ≤ 0,020 99,99 ≤ 50 99.91 Pyriméthanil 8,9 0,08 99,10 31667 0

Les matières organiques sont toutes éliminées de l’effluent avec des efficacités de plus de

97 % sauf pour le métabolite du glyphosate (AMPA) dont l’épuration n’est que de 61 %

(Tableau III.27). Les mesures de concentrations résiduelles dans les boues montrent que

certaines matières actives sont plus ou moins concentrées. Ainsi, le Cyprodinil et le

Pyriméthanil se retrouvent entièrement concentrés dans les boues. L'accumulation de

résidus de pesticides observée dans ces dernières, après traitement biologique, a été

démontrée dans plusieurs revues scientifiques ; Harrison et al. (2006) ont inventorié les

différentes recherches.

Selon la littérature, les cyclohexanes, organochlorés et les phénoxy-substitués ne sont

pas dégradés par les boues activées. Les problèmes d’accumulation des pesticides dans

les boues impliquent leur propagation dans la terre s’il y a épandage et représentent un

risque pour la faune microbienne du sol qui les accumule (Chaney et al., 1996 ; Fries,

1996). Le cyprodinil et le pyriméthanil sont les deux seules molécules testées qui sont de

la famille des anilinopyrimidines. Il semblerait qu’elles agissent en inhibant la

biosynthèse de la méthionine. Les molécules biodégradées agissent sur la chaîne

respiratoire (folpel) ou la synthèse des stérols (cymoxanil).

Après 30 jours de traitement biologique, les pesticides sont dégradés à plus de 97 %. Ce

résultat a montré que les pesticides sont biodégradables par procédé de boues activées.

La biodégradation des différents pesticides par les micro-organismes a été étudiée par

différents auteurs. Ainsi, des pesticides comme le mécoprop (Zipper et al. ,1999 ;

Nitshke et al., 1999), le dichlorprop, le 2,4-D (Zipper et al. ,1999), le Terbuthylazine et

le lindane (Kipopoulou et al., 2004) sont dégradés par les microfaunes bactériennes.


134

Zipper et al. (1999) ont étudié le devenir de 3 herbicides (mécoprop, dichlorprop et 2,4-

D) dans des boues activées. L'étude de la dégradation d'un mélange de mécoprop et

dichlorprop a démontré que les boues activées pouvaient dégrader rapidement des

pesticides en moins de sept jours. Les trois pesticides sont métabolisés à 86-98% dans

les conditions expérimentales. Des résultats similaires ont été obtenus avec un mélange

d'atrazine, de bentazone et d’isoproturon. Ces pesticides sont éliminés à plus de 87 %

dans l'effluent par des boues activées. Mais un herbicide toxique comme le lindane est

difficilement biodégradable et s’élimine au maximum à 61 % dans l'effluent par des

boues activées conventionnelles (Kipopoulou et al., 2004).

Nitshke et al. (1999) ont démontré que les boues activées pouvaient dégrader environ

100 % de mecoprop mais des pesticides comme le terbuthylazine et l’isoproturon sont

absorbés à 80 % par les micro-organismes des boues activées. La structure chimique des

différents pesticides influence la dégradation par boues activées, comme le montrent les

résultats. Les résidus de pesticides retrouvés dans les boues ont des concentrations plus

ou moins importantes. L'accumulation de ces résidus de pesticides après traitement

biologique est un phénomène connu puisque l'étude d’Harrison et al. (2006) a clairement

démontré que les composés organochlorés (DTT) et les herbicides phénoxy-urées (2,4-D)

ne peuvent pas être totalement dégradés par boues activées.

Par leur nature hydrophobe, les pesticides sont particulièrement persistants et

s'accumulent dans l'environnement (Petrasek et al., 1983). Mais, certaines catégories de

micro-organismes comme les cyanobacterium utilisent les pesticides comme source de

carbone et d'azote et les dégradent complètement (Hirooka, 2006). Un effluent viticole

sera toujours constitué de plus d’une dizaine de matières actives de nature différente.

Les biodégradabilités seront donc fonction du choix par les viticulteurs des produits de

traitement ; ceux-ci pouvant varier aussi d’une année sur l’autre.

III.4.3. Comportement des boues activées face aux produits phytosanitaires

Tous les deux jours, des observations macroscopiques et microscopiques, ainsi que des

analyses physico-chimiques sont effectuées sur la liqueur mixte afin de suivre l’évolution

des micro-organismes.


135

III.4.3.1. Evolution des Matières Sèches (MS), des Matières Volatiles (MVS)

et du volume de boues

Nous avons vu dans le chapitre précédent que la présence de pesticides affecte la

biomasse active. Celle–ci est mesurée par la teneur en matières sèches (MS), en

matières volatiles (MVS) et le taux de boues. Les résultats montrent que les

concentrations en MS et en MVS tendent à augmenter pendant l’alimentation du

bioréacteur avec l’effluent viti-vinicole. A partir du 20ème jour, les concentrations en MS

et MVS diminuent progressivement (Figure III.35). Les variations sont similaires à celles

observées en Figure III.12 lors de l’alimentation avec un effluent viti-vinicole à 5 g/L

(effluent concentré). La chute à partir du 20ème jour est certainement due à une

accumulation du cyprodinil et du pyriméthanil dans les boues. Il faut remarquer que

l’alimentation en produits phytosanitaires a été continue sur 20 jours. Ce qui représente

un volume d’effluents apporté équivalent au volume du bioréacteur. Dans le cas d’une

unité de traitement d’effluent réel, le volume annuel d’effluent phytosanitaire produit par

un viticulteur correspond à environ 1/10ème du volume de la station d’épuration vinicole.

La quantité apportée en 20 jours sur le bioréacteur correspond donc à 10 ans de

fonctionnement du procédé.

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 26 27 28 29

Temps (jours)

MS (g/L)

0

1

2

3

4

5

6

7

8MVS (g/L)

Figure III.35. Evolution des Matières Sèches (MS) (�) et Matières Volatiles en suspension (MVS) (�) au cours

du traitement biologique.

La Figure III.36 montre une augmentation du volume de boues (Vb). Ainsi, au temps

initial, le Vb est d'environ 700 mL.L-1. Dès le premier jour de traitement biologique,

celui-ci augmente pour atteindre une valeur maximale de 990 mL.L-1. Ce phénomène

très rapide ne peut pas provenir de l’augmentation de la concentration biomasse. Il

correspond à la floculation des boues provoquée par les matières toxiques qui agissent


136

sur les micro-organismes constituant le flocs. A partir du 21ème jour de traitement, l'ajout

d'un floculant a permis d'agglomérer les différents micro-organismes entre eux et de

former à nouveau des flocs. Par contre, on remarque que la valeur du Vb est encore

relativement importante puisqu'elle est supérieure à 800 mL.L-1.

Figure III.36. Evolution du volume de boues (Vb) au cours du traitement biologique.

D'après les résultats obtenus, cette valeur maximale du Vb en fin de traitement est

importante et peut provenir de l'augmentation de la concentration en biomasse tout au

long du traitement (jusqu’à 7,5 g/L) (Figure III.35) conjointe à d’une défloculation et un

développement de bactéries dans la liqueur mixte.

III.4.3.2. Evolution des MES et de la turbidité

La mesure de la qualité des surnageants des effluents traités montre des turbidités et

des matières en suspension (MES) élevées (Figure III.37).

Figure III.37. Evolution des matières en suspension (MES) (□) et de la turbidité (●) au cours du

traitement biologique.

500

600

700

800

900

1000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Temps (Jours )

Vb (mL.L -1)

0

10 20 30 40 50 60 70 80

0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 26 27 28 29 Temps (jours)

MES (mg.L -1)

0

100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Turbidité (NTU)


137

Ces valeurs sont corrélées avec des observations microscopiques qui révèlent la

présence importante de bactéries libres dans le surnageant (Tableau III.28). Les

pesticides provoquent une défloculation des boues qui est parfois visible. Dès l’arrêt de

l’alimentation en pesticides, les turbidités et les teneurs en MES chutent. La floculation

effectuée au 21ème jour permet d’agglomérer les bactéries libres.

III.4.3.3. Evolution des micro-organismes

Les observations microscopiques montrent une évolution des micro-organismes tout

au long du traitement biologique. Les micro-organismes présents dans le milieu en

début et fin de traitement sont quantifiés dans le Tableau III.28.

Tableau III.28. Évolution des micro-organismes présents dans la liqueur mixte avant, pendant et après traitement.

Certains micro-organismes, présents dans les boues en début de traitement,

disparaissent comme les Volvox aureus et les Vorticella à pédoncule court. Leur

disparition est le signe d’une charge massique élevée, typique des fortes charges

organiques des effluents vinicoles. Conjointement, il y a apparition de nouveaux micro-

organismes comme les Paramecium, signe d’une épuration de bonne qualité en phase

transitoire. Des Zoothamnium, des Rotifères Monogononta et Digononta se développent

en fin d’épuration. Le nombre d’espèces diminue au cours du temps, sigue d’un

appauvrissement de la microfaune de la liqueur mixte.

0 Début

2 5 7 9 12 14 19 21 26 27 28 29 Fin

batéries libres X X X XX XXX XX XX XXX XXX XXX XXX XXX XX

flocs XXX XX XX XX XX XX XX X X X X XX XX observations

microscopiques bactéries filamenteuses X X X XX

flagellés petits XX XX X X X XX XX XXX XXX XXX XXX XX XX

flagellés grands volvox aureus XX XX XX XX X XX XX XX XX X X X

euglypha X XX sarcodines thécamébiens arcella X X X X

paramecium XX XX XX XXX XX XXX XX XXX X X X X

holophya XX XX X

litonotus X

chilodomela XX X

ciliés holotriches

scintillans X XX

vorticelle pédoncule court X X X X X X

opercularia X XX X ciliés péritriches

zoothammium X XX XXX XXX

protozoaires

ciliés spirotriches stentor X X X

monogononta X XX X X X rotifères

digononta X XX X

nématodes X métazoaires


138

III.4.3.3. Evolution des substances sécrétées par les micro-organismes

En traitement biologique des effluents, les bactéries sont agglomérées sous forme

de flocs. Une grande part de la structure des flocs est composée de polymères

exocellulaires. La composition des exopolymères solubles est dépendante de

l’effluent fourni à la biomasse. Ainsi, dans notre cas (Figure III.38), l’effet toxique

des pesticides favorisant la lyse de certains micro-organismes, induit le relargage

des produits microbiens solubles tels que les polysaccharides, les protéines et des

substances humiques.

Figure III.38. Evolution des teneurs en exopolymères (EPS) (protéines (◊), substances humiques (�),

polysaccharides (●), EPS totaux (▲)).

Le premier pic d'EPS à 7 jours de traitement est dû aux lyses cellulaires en raison de la

présence des pesticides ; ce qui cause le relargage d'EPS comme le montre Sponza

(2003). Dans la Figure III.39, le deuxième pic d'EPS observé au même moment que le

pic de DCO est essentiellement lié à l'augmentation en polysaccharides et correspond à

l'adaptation de la biomasse aux composés à épurer (Massé, 2004). Il apparaît clairement

que les pics de DCO et de COT proviennent du relargage de produits microbiens et ne

représentent pas la pollution engendrée par l’apport direct des produits phytosanitaires

et de l’effluent vinicole.

0

50

100

150

200

250,

300

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Temps (jours )

EPS mg.L-1


139

Figure III.39. Evolution des teneurs en EPS (◊) et en DCO (�).

Puisque les EPS sont les composants majoritaires des flocs et qu’ils ont des groupes

fonctionnels chargés, Raszka et al. (2007) pensent qu’ils contribuent aux propriétés de

surface des flocs et donc aux mécanismes de floculation. Ils jouent ainsi un rôle

déterminant sur la résistance du floc et sa décantabilité. L’augmentation des EPS libérés

par les flocs dans le surnageant au contact du mélange de pesticides explique les très

mauvaises décantabilités observées dans nos essais. De plus, les lyses des cellules ou la

sécrétion des polymères par les micro-organismes en présence de pesticides peuvent

affecter la biomasse active dont les concentrations restent cependant normales et

tendent à être plutôt élevées pour une liqueur mixte de boues activées (6,5 g.L-1)

(Figure III.35).

En parallèle, des mesures d’activité de la biomasse sont quantifiées dans l’effluent par

dosage de l’adénosine 5-triphosphate (ATP) (Figure III.40).

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

0 5 10 15 20 25 30Temps (jours)

ATP (URL)

Figure III.40. Evolution de l’adénosine 5-triphosphate (ATP) au cours du traitement biologique.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

0 2 5 7 9 12 14 16 19 21 29

COT (mg/L)

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00EPS (mg/L)


140

La biomasse en présence des pesticides subit une phase d’acclimatation et l’effet toxique

sur la population de micro-organismes se traduit par de faibles teneurs en ATP. A partir

du septième jour, la biomasse résistante s’adapte et dégrade l’effluent viti-vinicole en

produisant de l’énergie sous forme d’ATP. Les fluctuations d’ATP observées

correspondent à l’activité de la biomasse résistante aux pesticides et suit les variations

en matières volatiles. Ces résultats confirment les résultats obtenus précédemment dans

le chapitre III.2.

III.4.4. Mesure de la toxicité

La mesure de la toxicité est réalisée avec le nouveau biotest développé au sein du

laboratoire (Chapitre III.partie 3.). Ce test utilise l'inhibition de la synthèse d'ATP de

la levure Saccharomyces cerevisiae en présence de molécules phytosanitaires. Il

servira à mesurer la toxicité de l'effluent d'entrée et de sortie ainsi qu’à évaluer le

suivi de la biodégradation des molécules phytosanitaires par boues activées.

III.4.4.1. Toxicité de l’effluent d’entrée

• Impact de la nature de l'effluent d'entrée sur la toxicité

L’effluent d’entrée est un mélange de 14 molécules actives ayant des toxicités

initiales différentes. Les pourcentages d’inhibition ont été déterminées sur chaque

matière commerciale et sur le mélange. Après 30 minutes de contact avec les

molécules phytosanitaires, l'ATP de la levure est mesurée. Le pourcentage

d'inhibition est déterminé en comparant le contrôle (eau minérale) et les différents

essais. Les résultats d'inhibition de l'ATP de Saccharomyces cereviseae sont

présentés dans le Tableau III.29.


141

Tableau III.29. Pourcentage d'inhibition de l'ATP de Saccharomyces cervisieae en contact avec

différentes molécules phytosanitaires contenues dans le mélange phytosanitaire formant l'effluent

d'entrée. (pi : pas d’inhibition)

Matières

commerciales Matières actives

Concentrations

matières

actives mg/L

Concentrations

matières

commerciales mg/L

Inhibition de l’ATP de

Saccharomyces

cerevisiae (%)

Cymoxanil 30 ANTEOR

Folpel 254 380 42 ± 5,8

BOUILLIE

BORDELAISE Sulfate de cuivre 40 200 72 ± 8,2

CASCADE Flufénoxuron 10 10 pi


Méfénoxam 466 12000 95 ± 0,8

FLUDIOSOUFRE Soufre 693 700 34 ± 14,8

FORUM Dimétomorphe 43 43 48 ± 2

Diquat 67 GRAMOXONE

Paraquat 22 89 28 ± 14,8

ROUNDUP Glyphosate acide 105 105 11 ± 4,2

SCALA Pyriméthanil 50 50 6 ± 2,5


Fludioxonil 243 970 47 ± 6,2

MELANGE

PHYTOSANITAIRE

100 mL de chacun des

produits commerciaux environ 1 g/L Environ 1,5 g/L 75 ± 4

Les solutions de matières actives phytosanitaires sont préparées à la même

concentration que celle du mélange de pesticides utilisé pour étudier la dégradation.

La variation des différentes concentrations correspond aux concentrations

retrouvées après nettoyage et lavage du matériel de pulvérisation. Pour des

concentrations en molécules actives similaires, les pourcentages d’inhibition sont

complètement différents. A une concentration d'approximativement 50 mg.L-1, la

capacité d'inhibition du dimétomorphe (48 ± 2 %) sur la levure est 8 fois plus

importante que celle observée pour le pyriméthanil (6 ± 2,5 %). Le même

phénomène a été observé pour les pesticides dimétomorphe et pyriméthanil à des

concentrations faibles d’environ 50 mg.L-1. Le dimétomorphe a un impact sur le

métabolisme de la levure 5 fois plus important que le pyriméthanil dont la toxicité

n’affecte pas son métabolisme.

Les pesticides ayant des pourcentages d'inhibition semblables ne sont pas forcément

à la même concentration. Pour une inhibition d'approximativement 45 %, les

concentrations en pesticides varient de 43 mg.L-1, dans le cas du dimétomorphe à

380 mg.L-1 pour le mélange cymoxanil/folpel jusqu’à 970 mg.L-1 pour le mélange

fludioxonil/cyprodinil. De même, à une valeur d'inhibition d'approximativement 30

% dans le cas du diquat/paraquat (89 mg.L-1), la concentration du pesticide peut


142

être jusqu'à 7 fois plus importante comparée au soufre (700 mg.L-1). Des résultats

semblables ont été observés par Ribeiro et al. (2000) dans une étude sur l'impact

des molécules phytosanitaires sur le taux de respiration spécifique de la levure

Saccharomyces cereviseae. Aux mêmes concentrations de cymoxanil, penconazole

et dichlorofluanide, les taux de respiration spécifiques (µO2) sont différents:

µO2 dichlofluanide > µO2 cymoxanil > µO2 penconazole.

Les deux pesticides avec la plus forte capacité d’inhibition (70 à 95 %) sont le

mélange méfénoxam/mancozèbe et le sulfate de cuivre, mais les concentrations

méfénoxam/mancozèbe sont approximativement 6 fois plus élevées que pour le

sulfate de cuivre. Les pesticides de concentrations élevées (≈1 g.L-1) sont le

mélange méfénoxam/mancozèbe et cyprodinil/fludioxinil. La concentration du

mélange cyprodinil/fludioxinil inhibe la levure à des valeurs proches de son EC50. En

revanche, le mélange méfénoxam/mancozèbe est beaucoup plus toxique puisqu’il

inhibe totalement le métabolisme de la levure (inhibition à 95 ± 0,8 %).

D'après les résultats obtenus, la levure est sensible à la majorité des molécules

phytosanitaires qui ont été testées. Les molécules actives ayant un effet fortement

inhibiteur sur le métabolisme de la synthèse d'ATP de Saccharomyces cereviseae

sont : le sulfate de cuivre, mancozèbe/méfénoxam et le dimétomorphe. De plus, un

effet synergique est observé lorsque les molécules phytosanitaires sont mélangées

entre elles. En effet, le pourcentage d’inhibition de la solution réelle est de 75 ± 4

% alors que la moyenne des pourcentages d’inhibition des différentes molécules

phytosanitaires testées est de 42 %. Cedergreen et al. (2006) ont observé le même

phénomène en utilisant quatre tests écotoxicologiques différents : luminescence de

Vibrio fisheri, mobilité de Daphnia magna, croissance de la lentille d'eau, mortalité

des algues. Ils ont démontré l'effet synergique d'inhibition de plusieurs mélanges

(diquat/prochloraz, azoxystrobine/prochloraz,…) par rapport à l'inhibition retrouvée

lorsque les molécules sont seules. Cet effet synergique ou additif des molécules

phytosanitaires entre elles a été étudié par Koutsaftis et al. (2006). Cette étude sur

l'inhibition chronique de l'algue Chaetoceros gracilis montre qu'en présence de

métaux tels que le cuivre ou le zinc, il y a un effet synergique des molécules

phytosanitaires organiques (ex : Diuron) avec des pesticides organométalliques.


143

• Évolution de la toxicité en fonction de la concentration en matières actives

phytosanitaires

Pour déterminer si le test écotoxicologique « ATPyeast » est sensible à l'effluent

d'entrée phytosanitaire, des mesures sont effectuées pour des concentrations

comprises entre 0 à 1500 mg.L-1 de pesticides. Les expérimentations sont triplées

pour obtenir un résultat fiable. L'influence de ces concentrations sur la synthèse

d'ATP de la levure est présentée dans la Figure III.41.

Figure III.41. Influence de la concentration en pesticides sur la synthèse d'ATP

de Saccharomyces cereviseae.

A de faibles concentrations en mélange phytosanitaire (1,5 mg.L-1), les valeurs

d'ATP obtenues dans le contrôle et dans l'échantillon sont similaires. À partir de 7,5

mg.L-1 de matières actives phytosanitaires, un effet des pesticides croissant est

observé sur l’inhibition du métabolisme énergétique de la levure.

• Détermination de l’EC50 de l’effluent d’entrée

L'EC50 est déterminé par la méthode PROBIT. La droite de régression est

représentée par la Figure III.42.

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

Contrôle 1,5 7,5 37,5 75 150 300 750

ATP (URL)


144

Figure III.42. détermination de l’EC50 de l’effluent d’entrée.

L’EC50 obtenue expérimentalement est de 71 mg.L-1 de matières actives

phytosanitaires.

III.4.4.2. Toxicité de l'effluent de sortie

La toxicité de l'effluent de sortie prend en compte l’ajout du floculant dont la dose n'a

pas été optimisée.

• Détermination de l’EC50 de l’effluent de sortie

La droite de régression est représentée par la Figure III.43.

Figure III.43. Détermination de l’EC50 de l’effluent de sortie.

L’analyse PROBIT permet de déterminer l'EC50 de l’effluent de sortie après

traitement biologique. L’EC50 obtenue expérimentalement est de 33 mg.L-1 de

matières actives phytosanitaires.

y = 27,281x - 0,5296R

2 = 0,8872

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Log pesticides (mg.L- 1)

Inhbition de SC (%)

R 2 = 0,9621

0

10

20

30

40

50

60

70

-2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3Log (concentration en pesticides)

% d'inhibition d'ATP de SC

y = 7,8862x + 38,028


145

III.4.4.3. Évolution de la toxicité au cours de la dégradation

• Etude de la toxicité de l’effluent au cours de la dégradation

Des mesures de toxicité de l’effluent au cours du temps permettent de visualiser la

phase d’adaptation de la biomasse pendant laquelle la toxicité augmente (Figure

III.44).

20

30

40

50

60

70

80

90

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30Temps (jours)

% inhibition

Figure III.44. Toxicité de l’effluent de sortie au cours du traitement biologique.

Cette phase d'augmentation est suivie par une décroissance continue de la toxicité, ce

qui confirme les résultats de dégradation des pesticides et permet de s’assurer que des

métabolites éventuels ne sont pas plus toxiques que les matières initiales.

L’augmentation de la toxicité entre les 26ème jour et le 30ème jour est dû à l’ajout de

floculant non optimisé.

• Comparaison des valeurs de toxicité par différents tests écotoxicologiques

Tableau III.30. Valeurs de toxicité aiguë de l’effluent avant et après traitement par différents biotests.

Effluent d’entrée

(produit phytosanitaire)

1, 5 g.L-1

Effluent de sortie

(fin traitement)

38 mg.L-1

Biotest %

Levures

Saccharomyces cerevisae

EC50 30 min

4,7 87

* Invertebrés aquatiques

Algae (NF EN ISO 8692)

EC10 72 h

0,71 84


Algae (NF EN ISO 8692)

EC50 72 h

1,52 > 98 %


Daphnia magna (NF EN 6341)

EC50 24 h

37 > 90 %

* Détermination effectuée par le laboratoire CARSO, Lyon – laboratoire agréé pour les analyses d’eaux par le Ministère de la santé.


146

Le pourcentage exprimé dans le Tableau III.30 correspond à la dilution à laquelle

est immobilisé 50 % de Daphnia magna. Pour les algues, la mesure d’inhibition de la

croissance est déterminée pour 10 % et 50 % de la population. Ainsi, un

pourcentage de 1,52 % signifie qu’il a fallu mettre, par exemple, 1,52 mL d’effluent

dans 100 mL d’eau pour arrêter la croissance de 50 % des algues. Ceci démontre

que l’effluent initial est très toxique. Inversement, l’effluent de sortie du bioréacteur

ne présente plus de toxicité puisque le pourcentage est élevé.

Les valeurs obtenues d’EC50 pour l’effluent d’entrée sont proches pour les biotests

algues et Saccharomyces cereviseae. Dans le cas de Daphnia magna, la valeur sur

24 h est plus élevée, ce qui tend à montrer que ce test normé demandé par l’Arrêté

n’est pas aussi sensible que les deux autres biotests. Le test algues est un peu plus

précis mais son temps de contact est de 72 h comparé à 30 min pour le test que

nous avons développé.

Pour les effluents de sortie, tous les biotests montrent qu’il n’y a pas de toxicité

résiduelle. Ce résultat est surprenant car la concentration totale résiduelle en

produits phytosanitaires est de 38 mg.L-1 alors que le tableau II.3 montre des

valeurs d’EC50 en Daphnia magna de l’ordre de quelques milligrammes-litres pour

les molécules résiduelles de l’effluent de sortie. Ceci peut être dû à un temps de

contact de Daphnia magna deux fois plus long dans la base de données Footprint.

III.4.5. Conclusion

Le travail effectué a eu pour objectif de définir les conditions de rejet des effluents

viticoles dans le système de traitement aérobie des effluents vinicoles en conditions

réelles dans un bioréacteur pilote, afin que les deux types d’effluents puissent être traités

à partir d’un même système. Cette étude passe par un suivi de la liqueur mixte vinicole

d’une propriété viticole en contact avec un mélange de produits phytosanitaires

commerciaux aux concentrations réelles.

Les expérimentations montrent le potentiel épuratoire du traitement biologique par boues

activées de différents pesticides. A partir d’un mélange de 14 produits phytosanitaires,

représentatifs de l’activité viticole, les essais prouvent une adaptation rapide de la

biomasse dégradant les différents produits toxiques testés. Si presque toutes les

substances sont éliminées à plus de 99 % dans les effluents traités, certaines sont plus

difficilement biodégradables et peuvent s’accumuler dans les boues (anilinopyrimidines).


147

Ce phénomène peut être dû à un temps de demi-vie supérieur à un an pour le cyprodinil

et le pyriméthanil.

En parallèle, des mesures de toxicité de l’effluent de sortie effectuées avec le test basé

sur l’inhibition métabolique de la synthèse d’ATP de S. cerevisiae (Biotest), développé

dans le cadre de ce travail a permis de visualiser la phase d’adaptation de la biomasse

pendant laquelle la toxicité augmente. Cette phase est suivie par une décroissance

continue de la toxicité, ce qui confirme les résultats de dégradation des pesticides et

permet de s’assurer que des métabolites éventuels ne sont pas plus toxiques que les

matières initiales.

Ces travaux ont montré que l’épuration biologique par boues activées est réalisable en

respectant un temps d’adaptation de la biomasse d’environ 8 jours. Les pesticides sont

dégradés dans le cas du traitement continu pratiqué lors des expérimentations. La

stabilité de l’épuration en DCO intervient à partir d’un temps de 20 à 30 jours ; ce qui,

dans ce cas, correspond au temps de renouvellement de la totalité du volume du

bioréacteur. La biomasse se déflocule et il est nécessaire d’ajouter une étape de filtration

pour permettre d’éliminer les micro-organismes libres présents dans l’effluent traité.

Une des difficultés majeures concerne le contrôle de l’épuration. Les mesures,

préconisées par l’Arrêté du 12 septembre 2006, sont basées sur des tests d’écotoxicité

classiques (daphnies, algues,…) mais sont coûteux et difficiles à mettre en œuvre. Ces

tests ne sont pas envisageables en contrôle continu, le biotest mesurant l’inhibition de la

synthèse d’ATP de Saccharomyces cereviseae est sensible et serait un bon compromis

pour déterminer l’efficacité des procédés de traitement des effluents toxiques tels que les

pesticides.

CONCLUSION GENERALE

Conclusion Générale

148

CONCLUSION GENERALE

L’Arrêté du 12 septembre 2006 relatif à la mise sur le marché et à l’utilisation des

produits visés à l’article L.253-1 du code rural, fixe une réglementation sur l’utilisation et

le rejet des pesticides. La dernière partie décrit les dispositions relatives aux procédés de

traitement des effluents phytosanitaires et en particulier les modalités pour qu’un

procédé puisse être inscrit dans la liste des systèmes autorisés (B.O du Ministère de

l’écologie et du développement durable). Les procédés biologiques sont aujourd’hui

répandus pour traiter les effluents vinicoles. L’utilisation en traitement par boues activées

des produits phytosanitaires provient d’une constatation : les pesticides actuellement

homologués sont considérés comme biodégradables.

Dans ce contexte, l’objectif global de ce travail a été de développer un procédé

d’épuration des effluents phytosanitaires en utilisant les liqueurs mixtes du système

de traitement biologique par boues activées des effluents vinicoles comme biomasse

épuratrice. Cette étude permet de définir les conditions de rejet des effluents

phytosanitaires dans les systèmes de traitement aérobie des effluents vinicoles pour

que les deux types d’effluents puissent être traités conjointement ou

successivement.

En premier lieu, nous avons mis en évidence le rôle de divers paramètres liés à la

nature de chacune des familles chimiques de pesticides. Les expérimentations

montrent que les matières actives phytosanitaires organiques peuvent être

dégradées biologiquement. La biomasse s’adapte et les teneurs en pesticides

diminuent dans l’effluent au cours du traitement biologique en fonction de la nature

des micro-organismes présents dans les boues activées. Cette expérimentation

démontre que le procédé par boues activées du traitement des effluents vinicoles

peut être utilisé pour épurer les effluents phytosanitaires. De plus, en fonction de la

nature de la microfaune présente dans les boues activées, la dégradation des

molécules phytosanitaires est différente. D'après ces expérimentations, une

biomasse acclimatée à un effluent de soutirage semble plus facilement dégrader les

pesticides qu'une biomasse issue du traitement d’un effluent de type filtration. Mais

cette biomasse, subissant un stress dû à l’ajout de molécules toxiques, se déflocule

rapidement. La défloculation est un problème majeur dans le traitement biologique

par boues activées puisqu’elle empêche une bonne décantation de l'effluent.


149

En second lieu, cette étude a déterminé l’influence des concentrations en produits

phytosanitaires sur deux types de liqueur mixte : la première dégradant un effluent

vinicole, la deuxième acclimatée à un effluent viti-vinicole. Les efficacités épuratoires

sont fonction de l’adaptation de la boue et de la concentration en substrat. Il existe une

concentration seuil à ne pas dépasser de l’ordre de 650 mg DCO.L-1 et 20 mg.L-1 de

pesticides pour des temps de séjour hydraulique de 10 jours et une concentration en

biomasse d’environ 2 g MVS.L-1. Grâce à ces essais, l’influence des produits

phytosanitaires sur le métabolisme de la biomasse a été précisée. Le traitement des

effluents vivi-vinicoles par une biomasse adaptée à ces effluents permet d’obtenir un

surnageant de meilleure qualité (DCO-Turbidité). Ceci semble essentiellement dû à une

meilleure structuration des flocs ne libérant pas de bactéries contrairement à l’épuration

de pesticides par une liqueur mixte adaptée à un effluent vinicole. Ce résultat est

important pour la gestion du rejet des produits phytosanitaires dans les unités de

traitement biologique des effluents vinicoles. En effet, deux solutions sont possibles : Le

rejet collecté est introduit lorsque l’unité de traitement vinicole reçoit peu d’effluent

(période de juin à août) ou l’effluent phytosanitaire est envoyé toute l’année sur l’unité

de traitement biologique vinicole. A la vue de nos résultats, la deuxième solution semble

plutôt être privilégiée. Nous avons pu observer que la concentration en biomasse reste

relativement constante tout au cours de l’épuration. La non production de biomasse ou

même sa diminution dans certaines conditions est intéressante pour la gestion des boues

en excès du traitement vinicole.

Pour valider l’épuration, il est nécessaire de vérifier la toxicité de l’effluent rejeté. Un test

écotoxicologique simple et rapide a été développé. Ce test « ATPyeast » est basé sur

l’inhibition par les pesticides du métabolisme énergétique des levures en inhibant les

gènes mitochondriaux qui commandent la chaîne respiratoire empêchant la biosynthèse

des métabolites. Le test a été validé sur trois molécules phytosanitaires de nature et de

structure chimique différente. A partir des pourcentages d’inhibition de la synthèse d’ATP

de Saccharomyces cerevisiae des valeurs d’EC50 furent obtenues. Les résultats

démontrent que l'effet des pesticides sur la levure est variable en fonction de la nature

de celui-ci. La toxicité sur ces micro-organismes eucaryotes est fortement influencée par

la structure chimique de la molécule considérée (log P). Le nouveau biotest (30 min) est

plus sensible que le test microtox® actuellement commercialisé. Par contre, Le test de

mobilité Daphnia magna, largement utilisé en écotoxicologie est relativement plus

sensible mais nécessite un temps d’analyse plus long (48 h) : « L’ATPyeast test » est 96

fois plus rapide. Malgré cette faible différence de sensibilité, les valeurs obtenues d’EC50

sont de l'ordre du mg.L-1 ; ce qui est suffisant pour évaluer l'efficacité d'un procédé de

traitement d'effluents phytosanitaires. Ainsi, ce nouveau test de toxicité (ATPyeast test)


150

a été employé pour l'évaluation en continu du procédé de traitement biologique aérobie

des résidus de produits phytosanitaires par boues activées. Ce test est rapide, fiable et

peu coûteux comparé aux essais biologiques traditionnels de toxicité (Daphnia magna,

Pseudokirchneriella subcapitata...) et pourrait être ainsi employé pour d’autres

applications comme l’évaluation de la pollution des cours d'eau.

Enfin, la dernière expérimentation a eu pour objectif de définir les conditions réelles de

rejet des effluents viticoles dans le système de traitement aérobie des effluents vinicoles,

afin que les deux types d’effluents puissent être traités à partir d’un même système. Les

expérimentations confirment le potentiel épuratoire du traitement biologique par boues

activées de différents pesticides. A partir du mélange de 14 produits phytosanitaires,

représentatifs de l’activité viticole, les essais montrent une adaptation rapide de la

biomasse dégradant les différents produits toxiques testés. Si toutes les substances sont

éliminées à plus de 99 % dans les effluents traités, certaines sont plus difficilement

biodégradables et peuvent s’accumuler dans les boues. En parallèle, des mesures de

toxicité de l’effluent de sortie effectués avec le test basé sur l’inhibition métabolique de la

synthèse d’ATP de Saccharomyces cerevisiae (ATPyeast test), ont permis de visualiser la

phase d’adaptation de la biomasse pendant laquelle la toxicité augmente. Cette phase est

suivie par une décroissance continue de la toxicité, ce qui appuie les résultats de

dégradation des pesticides et permet de s’assurer que des métabolites éventuels ne sont

pas plus toxiques que les matières initiales.

En conclusion, cette étude confirme dans une large mesure l’intérêt du procédé par

boues activées pour le traitement des effluents phytosanitaires. Afin, d’améliorer la

biodégradabilité des pesticides et de diminuer le temps de traitement, il serait

souhaitable d’évaluer le potentiel des procédés d’oxydation avancée en amont ou en post

traitement. En parallèle, le développement du test d’autocontrôle permet d’évaluer

rapidement l’efficacité des différents traitements de dégradation des molécules

phytosanitaires. En perspective, il est prévu d’améliorer, de valider et de proposer un kit

commercial.

Ces recherches ont contribué à la validation de deux procédés de traitement biologique

des effluents vinicoles actuellement commercialisés : boues activées et stockage aéré

pour deux équipementiers. L’homologation accepte le rejet des effluents viticoles dans

l’unité sans mélange avec les effluents vinicoles (période juin-août). Ce travail devrait

permettre à terme d’autoriser le rejet simultané des deux types d’effluent dans la même

unité.

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ANNEXES

Annexe 1

160

Annexe 1

161

Annexe 1

162

Annexe 1

163

Annexe 1

164

Annexe 1

165

Annexe 1

166

Annexe 2

167

Annexe 2

NORMES FRANCAISES POUR LES EAUX USEES

1. EXIGENCES EPURATOIRES MINIMALES (Arrêté du 22/12/94) :

NK = Azote keldahl = azote organique + azote ammoniacal.

NGL = Azote global = azote organique + Azote ammoniacal + azote nitreux + azote nitrique.

PT = phosphore total.

Eqh = equivalent (1 equ = 60 g DBO5.j-1)

Concentration

maximale

Rendement

minimal

Charge de

pollution reçue Règles de coformité

Paramètre

mg/L % Nbre d’equ Dépassements

autorisés Val. rédhibitiores

Zones

normales

Pollution

carbonée

DBO5 (1)

DBO5 (1)

DCO (1)

MES

25

25

125

35

70

80

75

90

2000-10000

> 10000

Toutes charges

Toutes charges

Voir

paragraphe 3

(3)

DBO5 = 50 (4)

DCO = 250 (4)

MES = 85 (4)

Zones

sensibles

Azotes et/ou

phosphore

NGL

NGL

PT

PT

15

10

2

1

70

70

80

80

10000-100000

> 100000

10000-100000

> 100000

Valeurs à respecter en moyennes

annuelle (5)

(1) Pour lagunage : analyses réalisées sur échantillon filtré.

(2) Pour lagunage : cette valeur est fixée à 150 mg/L.

(3) Un échantillon moyen journalier est déclaré conforme, si l’une au moins des deux valeurs

(concentrations au rejet- rendement épuratoire) figurant dans l’autorisation de rejet est

respectée.

(4) Parmi les échantillons moyens journaliers déclarés conformes, aucun d’entre eux ne doit

dépasser les valeurs rédhibitoires.

(5) La station est déclarée conforme sur l’année considérée pour N et/ou P, si l’une au moins

des deux valeurs (concentration moyenne annuelle au rejet – rendement épuratoire moyen

annuel) figurant dans l’autorisation de rejet, est respectée.

Annexe 2

168

2. EXEMPLES D’EXIGENCES EPURATOIRES PLUS FORTES (cas des milieux

récepteurs particulièrement fragiles à certains facteurs de pollution) :

Concentration

maximale

Rendement

minimal Règles de conformité

Niveau

d’épuration Paramètre

mg.L % Dépassements

autorisés

Val.

Rédhibitoires

(mg/L)

Poussée

DBO5

DCO

MES

25

90

30 Pollution

carbonée

Très poussée

DBO5

DCO

MES

15

50

20

Calculé au point

près, par arrondi

inférieur, à partir

de la

concentration

moyenne

d’entrée

Voir paragraphe

3 (3)

DBO5 = 50 (2)

DCO = 250 (2)

MES = 85 (2)

Nitrification

classique NTK 15

Nitrification

très poussée NTK 5

Nit. Dénit.

classique NTL 15

Pollution

azotée

Nit. Dénit. très

poussée NTL 10

PT 2 Pollution

phosphorée

1er niveau

2ème niveau PT 1

Calculé à 5 point

près, par arrondi

inférieur, à partir

de la

concentration

moyenne

d’entrée

Valeurs à respecter en moyenne

annuelle (3)

(1) Un échantillon moyen journalier est déclaré conforme, si l’une au moins des deux valeurs

(concentrations au rejet- rendement épuratoire) figurant dans l’autorisation de rejet est

respectée.

(2) Parmi les échantillons moyens journaliers déclarés conformes, aucun d’entre eux ne doit

dépasser les valeurs rédhibitoires.

(3) La station est déclarée conforme sur l’année considérée pour N et/ou P, si l’une au moins

des deux valeurs (concentration moyenne annuelle au rejet – rendement épuratoire moyen

annuel) figurant dans l’autorisation de rejet, est respectée.

Annexe 2

169

3. NOMBRE DE DEPASSEMENTS AUTORISES (dans des conditions normales

d’exploitation) :

Nombre d’échantillons prélevés au cours d’une année

déterminée

Nombre maximal d’échantillons pouvant ne pas être

conforme

4 à 6

8 à 16

17 à 28

29 à 40

41 à 53

54 à 67

68 à 81

82 à 95

96 à 110

111 à 125

126 à 140

141 à 155

156 à 171

172 à 187

188 à 203

204 à 219

220 à 235

236 à 251

252 à 268

269 à 284

285 à 300

301 à 317

318 à 334

335 à 350

351 à 365

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

Annexe 2

170

4. FREQUENCE DES MESURES A LA STATION (Nombre de jours par an) :

DBO5 Kg/L

(1) 120-600 601-1800 1801-3000 3001-6000 6001-12000 12001-18000 > 18000

Nb d’eqh > 2000 > 10000 > 30000 > 50000 > 100000 > 200000 > 300000

CAS GENERAL

Débit

MES

DBO5

DCO

NTK

NH4

NO2

NO3

PT

Boues (2)

365

12

4

12

-

-

-

-

-

4

365

24

12

24

6

6

6

6

6

24

365

52

24

52

12

12

12

12

12

52

365

104

52

104

24

24

24

24

24

104

365

156

104

156

52

52

52

52

52

208

365

260

156

260

104

104

104

104

104

260

365

365

365

365

208

208

208

208

208

365

ZONES SENSIBLES A L’AZOTE

NTK (3)

NH4

NO2

NO3

-

-

-

-

12

12

12

12

24

24

24

24

52

52

52

52

104

104

104

104

208

208

208

208

365

365

365

365

ZONES SENSIBLES AU PHOSPHORE

PT - 12 24 52 104 208 365

(1) charge brute de pollution organique reçue par la station exprimée en Kg de DBO5 par jour.

(2) Quantité de matières sèches.

(3) Sauf cas particulier, les mesures amont des différentes formes de l’azote peuvent être

assimilées à la mesure de NTK.

5. QUALITE BACTERIOLOGIQUE DES EAUX DE BAIGNADE :

Paramètres Unité Valeur guide Valeur imperative Nombre minimal de

mesure par an

Coliformes totaux

Coliformes fécaux

Streptocoques fécaux

Salmonelles

Entérovirus

Saturation en O2 dissous

pH

phénols

transparence

résidus goudron

Matières flottantes

Nb/100 ml

Nb/100 ml

Nb/100 ml

Nb/L

PFU/10 L

%

Unité pH

mg C6H5OH / L

mètres

visuel

visuel

< 500

< 100

< 100

-

-

80 à 120

-

< 0,005

2

-

-

< 10000

< 2000

-

0

0

-

6 à 9

< 0,05

1

Absence

Absence

24

24

-

-

-

-

-

-

24

24

24

Eau de catégorie A (Eau de bonne qualité pour la baignade) :

80 % des résultats des analyses sont inférieurs ou égaux aux nombres guides relatifs aux

coliformes thermotolérants et au coliformes fécaux.

Annexe 2

171


coliformes totaux.


streptocoques fécaux.

Eau de catégorie B (Eau de qualité moyenne pour la baignade) :

Entre 5 et 33 % des résultats des analyses sont inférieurs ou égaux aux nombres guides relatifs

aux coliformes thermotolérants et coliformes fécaux.

Eau de catégorie C (Eau de mauvaise qualité pour la baignade) :

Plus de 33 % des résultats des analyses sont inférieurs ou égaux aux nombres guides relatifs aux

coliformes thermotolérants et coliformes fécaux.

6. UTILISATION, APRES EPURATION, DES EAUX RESIDUARES URBAINES

POUR L’IRRIGATION DES CULTURES ET DES ESPACES VERTS :

Contraintes de type C : Irrigation souterraine ou localisée, cultures industrielles.

Pas de contraintes microbiologiques

Contraintes de type B : Irrigation gravitaire, cultures de végétaux consommables après cuisson.

Œufs d’helminthes intestinaux < 1/L.

Contraintes de type A : cultures de végétaux consommables crus, espaces verts ouverts au public.

Œufs d’helminthes intestinaux < 1/L et coliformes fécaux <10/ml.

Annexe 3

172

Dégré significatif Sous embranchement classes Ordre genre Taille

(µm) abondance presence qualité de traitement

Charge massique

Type d’effluent

Phase de traitement oxygénation

Euglena 30-70 + - Indépendant faible Euglenida

Peranema 20-100 + - Très bonne faible Peu concentré transitoire

Dinobryon 35 - + Normal industries animales suffisante

chrysomonadida Monas 5-20 + + Normal faible Industries

animales démarage

Eudorina

Phytomastigophorea

volvocida volvox

100-250 - + Faible élevée insuffisante

Hexamita Tetramitus diplomonadida

trepomonas 10-20 +++ +++ Faible insuffisante

Mastigophorea (Flagellées)

Zoomastigophorea

kinetoplastida bodo 10-20 +++ ++ Faible forte riche Démarage faible

Actinopodes Actinophryida Actinophrys 40-200 - + Indépendant industriel

s toxiques

Amoeba 40-100 + + Bonne transistoire suffisante hartamanella

mayorella Amoebidae (Amibes)

Vahlkampfia <40 +++ ++ médiocre

industriels

toxiques anomalies

arcella 30-250 + + Bonne faible industries animales Suffisante

prolongée chlamydophr

ys cochliopodiu

m

10-45 +++ ++ Indépendant Tout au long du traitement

difflugia 60-200 ++ + Bonne Fin (20 -30 j) Suffisante prolongée

sarcodines

rhizopodes

Testacea (thécamébiens)

euglypha 50-150 +++ ++ Bonne faible Suffisante prolongée

Spathidium 80-200 ++ + Très bonne Chaenea 150 ++ + Bonne stable Holophria Prorodon

100-200 + + Correcte

trachelophyllum 40-50 +++ + Indépendant moyenne transitoire

coleps 55-65 ++ + Bonne faible suffisante didinum 80-180 - + Bonne important

Amphileptus 120-150 + - Indépendant forte Suffisante prolongée

Litonotus 50-200 ++ - Indépendant moyenne transitoire

Hemiophrys 200-300 - + Très bonne

Chilodonella 40-300 ++ + Bonne indifférent

Gymnostomatida

Trochilia 50 - - Très bonne Uronema 20-35 +++ +++ Moyen

Tetrahymna 25-90 +++ + Faible forte suffisante Glaucoma 40-80 - + Faible forte transitoire Colpidum 50-120 +++ ++ Faible élevée transitoire

Hymenostomatida

Paramecium 130 ++ + Très bonne Moyenne à forte transitoire sufisante

pro

toz

oa

ire

s

Ciliés holotriches

Trichostomatida Colpoda 40-120 +++ ++ Faible elevée transitoire

Annexe 3

173

Annexe 3

174

Dégré significatif Sous embranche

ment classes Ordre genre

Taille (µ m) abond

ance presen

ce

qualité de traitement

Charge massique

Type d’effluent

Phase de traitement

oxygénation

vorticella 30-120 +++ + Correct élevée

zoothamnium

80 ++ ++ Très

bonne faible stable suffisante

carchesium

80-140 + + Très

bonne stable suffisante

Opercularia

40-120 +++ + Faible elevée industriels toxiques

insuffisante

Epistylis 70-160 + +++ Bonne

elevéé insuffisante

Peritrichida

(péritriche

s)

Vaginicola 55-120 +++ ++ Bonne faible suffisante

aspidisca 25-45 ++ - Indépenda

nt forte stable

histriculus Oxytricha Stylonylch

ia tachysoma

> 100 Très

bonne Sous

charge fin

Hypotriches

(spirotriches)

Euplotes 50-200 ++ + Bonne faible stable suffisant

Stentor 250-1000

- +++ Très

bonne

Hétérotriches

(spirotriches)

spirostomum

150-400

++ + Bonne

Tokophrya 50-70 - + Indépenda

nt

acineta 30-300 - ++ Très

bonne

podophrya 10-60

pro

toz

oa

ire

s

Cil iés

Suctorina (suctorien

s) sphaeroph

rya 25-50

- + Moyenne

Cephalodella

lecane colurella

Monogononta

lepadella

50-300 +++ ++ Indépenda

nt faible fin

philodina

rotifères

Digononta rotaria

100-250 ++ ++

Indépendant faible fin

nématodes < 150 ++ - Indépenda

nt

gastrotriches

chaetonot

us 400-1000

- +++ Bonne faible

annélides oligochète

s Aelosoma < 500 ++ - Bonne faible fin Tros importante

me

tazo

air

es

tardigrades

500-1000

++ ++ Très

bonne faible fin

Annexe 4

175

Annexe 4 Soit X, concentration en produit en g/L.

Masse de matière active dans le pulvérisateur avant traitement : X g/ha d’où 2 X g pour 2

ha. Donc dans 300 L (volume de la cuve du pulvérisateur pour traiter 2 ha) on a 2 X g de

matière active, soit (2 X/300) g ou : ( X / 150) g

Masse de matière active dans le fond de cuve après traitement : On a (X / 150 ) g/L dans 10

Litres, soit (10 X / 150) g ou : (XY / 15) g

Rinçage à la parcelle : On ajoute 30 Litres aux 10 litres du fond de cuve, soit un volume total

de 40 litres. On a (X / 15) g dans 40 litres, soit une masse de [X / (40 ∗ 15)] g/L ou : (X /

600) g

Concentration du fond de cuve après rinçage : On a ( X / 600) g dans 10 litres soit (10X /

600)g ou : (X / 60) g

Concentration de l’effluent à traiter :On lave la cuve avec 15 Litres d’eau claire qui s’ajoutent

aux 10 Litres du fond de cuve, soit un volume total de 25 Litres. On a (X / 60) g dans 25

Litres, soit une concentration de [X / (25 ∗ 60)] g/L ou :

(X / 1500) g/L

Formule à appliquer pour connaître la concentration en matière active de l’effluent obtenu après un rinçage à la parcelle.

Annexe 5

175

Annexe 5

Métabolites

Azoxystrobine (E-2-(2-(6-cyanophenoxy)-pyrimidine-4-xyloxyl)-phénoxyl-

phenyl-3-méthoxyacrylic) acide

Cyprodinil 6-(cyclopropyl-2-phényl-aminopyrimidine-4-yl) méthanol

3-(4-cyclopryl-6 methyl-pyrimidine-amino) phénol

Difénoconazole 1,2,4-triazole

1-(2-(2-chloro-(4-chloro-phénoxy)phenyl)-2-1H-(1,2,4) triazol-yl)-ethanol

Diuron DCPUM DCPU

Folpel Phthalimide

Phthalique acide Phtalhamique acide

Glyphosate AMPA

Hexaconazole 1,2,4-triazole

Mancozèbe Ethylène thiourée

Ethylène urée EBIS

Pyriméthanil 2-amino-4,6-diméthyl pyrimidine

Quinoxyfène 3-hydroxy-quinoxyphène

Annexe 6

176

Annexe 6

Suivi de la dégradation de la DCO par une liqueur mixte issue du traitement d’un effluent vinicole : Liqueur Mixte de SOUTIRAGE

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

azosxystr obine

Val .l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Diur on

Val.l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Folpel


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Dimethomor phe

Val.l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Cymoxani l


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Hexaconazole


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Fosetyl aluminium

Val.l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Chlor pyr iphos ethyl


Annexe 6

177

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Mancozebe


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 1 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Glyphosate

Val.l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Quinxyf en

Val.l imi te r ejet

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Or yzal in


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 2 3 6 8

t emps ( j our s)

Témoin

Vinchlozol ine


0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1800,0

2000,0

0 2 3 6 8

t e mps ( j our s)

Témoin

Fludioxini l


Annexe 6

178

Liqueur Mixte de FILTRATION

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Azoxystrobine

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Fludioxinil

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Mancozèbe

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Difénoconazole

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Cyprodinil

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Folpel

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Chloropyriphos

0,00500,00

1000,001500,002000,002500,003000,003500,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Cymoxanil

Annexe 6

179

0,00500,00

1000,001500,00

2000,002500,003000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)Témoin

Diméthomorphe

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Diuron

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

3000,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Fosetyl Al

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Glyphosate

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 2 4 6 8 10

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Hexaconazole

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Quinoxyphene

0,00

500,00

1000,00

1500,00

2000,00

2500,00

0 2 4 6 8

Temps (jours)

DC

O (

mg/

L)

Témoin

Vinchlozoline

Annexe 7

180

Annexe 7

Tableau III.9. Evolution du phosphate (mg.L-1) avant et après traitement biologique de chaque pesticide et son

pourcentage d’augmentation.

Expérimentation A Expérimentation B

Phosphate (PO 4)(final) Augmentation (%) Phosphate (PO 4) (final) Augmentation (%)

Témoin 181 ± 18 155 ± 38

Folpel 151 ± 15 -17 176 ± 48 12

Hexaconazole 196 ± 20 8 395 ± 108 61

Fosetyl aluminium 219 ± 22 21 464 ± 126 67

Cyprodini ND ND 121 ± 33 - 22

Oryzalin 196 ± 20 8 ND ND

Mancozèbe 136 ± 14 -25 183 ± 50 15

Glyphosate 129 ± 13 -29 434 ± 118 64

Azoxystrobine 188 ± 19 4 120 ± 33 - 23

Chlorpyriphos éthyl 179 ± 18 -1 275 ± 75 44

Cymoxanil 175 ± 17 -3 223 ± 61 30

Diméthomorphe 145 ± 14 -20 254 ± 69 39

Diuron 140 ± 14 -23 234 ± 64 34

Fludioxonil 94 ± 9 -48 120 ± 33 -22


Quinoxyfène 191 ± 19 6 387 ± 105 60

Vinchlozoline 195 ± 19 8 405 ± 110 62

Min - Max -48-21 -23-67

Moyennes - 4,5 27

Annexe 8

181

Annexe 8

Suivi de l’évolution de la biomasse (MS) de la liqueur mixte issue du traitement d’un effluent vinicole dégradant les molécules phytosanitaires :Liqueur Mixte de SOUTIRAGE

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

AZOXYSTROBINE

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

DIURON

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

CYMOXANIL

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

HEXACONAZOLE

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

FOLPEL

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION FOSETYL ALUMINIUM

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMION

MANCOZEBE

2, 5

2, 7

2, 9

3, 1

3, 3

3, 5

3, 7

3, 9

4, 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

T EM ION

DIM E T HOM ORP HE

Annexe 8

182

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

GLYPHOSATE

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

FLUDIOXINIL

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

VINCHLOZOLINE

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

ORYZALIN

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

ORYZALIN

2,5

2,7

2,9

3,1

3,3

3,5

3,7

3,9

4,1

4,3

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

jour

mg/

L de

bou

e ac

tivée

TEMION

QUINOXYFENE

Annexe 8

183

Liqueur Mixte de FILTRATION

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

AZOXYSTROBINE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

DIURON

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

CYMOXANIL

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

HEXACONAZOLE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

FOLPEL

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN FOSETYL ALUMINIUM

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

MANCOZEBE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

T EM OIN

DIM ET HOM ORPHE

Annexe 8

184

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

GLYPHOSATE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

QUINOXYFENE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

T E M OIN

VINCHLOZOLINE

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN

FLUDIOXINIL

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

T EM OIN

ORYZALIN

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN CHLORPYRIPHOS ETHYL

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

0 1 2 3 4 5 6 7 8

j our

TEMOIN DIFENOCONAZOLE

Annexe 9

185

Annexe 9

Tableau III.15. Evolution des microorganismes de chaque pesticide après traitement biologique (LM-soutirage).

+++++++++++++++++++++++++++monogonontarotifères

++++podophryasutoriens

++++++++++++++++euplotes

++aspidiscaspirotriches

++++vorticelleperitriches

+holophrya

++++++++colpidium

++chilodonella

+++++++++++++paramecium

holotriches

++++++++arcellathécamebiens

++++actinopodesamibes

+++++++volvox

+++++++petitflagellés

microfaune

++++++++++++++++++++++++++++++++++flocs

+++++++++++++++++++++++bactéries libresliquide interstiel

Oryzalin

Vinchlozoline

Fosetyl

aluminium

Hexaconazole

Fludioxinil

Quinoxyfène

Cym

oxanil

Dim

ethomorphe

Folpel

Glyphosate

Mancozèbe

Chlorpyriphos

ethyl

Diuron

Azoxystrobine

Tém

oin

+++++++++++++++++++++++++++monogonontarotifères

++++podophryasutoriens

++++++++++++++++euplotes

++aspidiscaspirotriches

++++vorticelleperitriches

+holophrya

++++++++colpidium

++chilodonella

+++++++++++++paramecium

holotriches

++++++++arcellathécamebiens

++++actinopodesamibes

+++++++volvox

+++++++petitflagellés

microfaune

++++++++++++++++++++++++++++++++++flocs

+++++++++++++++++++++++bactéries libresliquide interstiel

Oryzalin

Vinchlozoline

Fosetyl

aluminium

Hexaconazole

Fludioxinil

Quinoxyfène

Cym

oxanil

Dim

ethomorphe

Folpel

Glyphosate

Mancozèbe

Chlorpyriphos

ethyl

Diuron

Azoxystrobine

Tém

oin

Tableau III.16. Evolution des microorganismes de chaque pesticide après traitement biologique (LM-Filtration).

+

++

+

+

+

+++

++

Difénoconazole

++++Epistylis

+++++++++++++++++++++++++++++++Digononta

+++++++++++++++++++++++Euglypha

+++++++++++monogonontarotifères

++++++aspidiscaspirotriches

++++++vorticelleperitriches

+colpidium

++++chaena

+++++Trachelophyllum

holotriches

+++++++++++++++++++++++++++++++arcellathécamebiens

+Mayorellaamibes

+++++++++++++++++++++++Euglenaflagellés

microfaune

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++flocs

+++++++++++++++++++++++++bactéries

libresliquide interstiel

Cyprodinil

Vinchlozoline

Fosetyl

aluminium

Hexaconazole

Fludioxinil

Quinoxyfène

Cym

oxanil

Dim

ethomorphe

Folpel

Glyphosate

Mancozèbe

Chlorpyriphos

ethyl

Diuron

Azoxystrobine

Tém

oin

+

++

+

+

+

+++

++

Difénoconazole

++++Epistylis

+++++++++++++++++++++++++++++++Digononta

+++++++++++++++++++++++Euglypha

+++++++++++monogonontarotifères

++++++aspidiscaspirotriches

++++++vorticelleperitriches

+colpidium

++++chaena

+++++Trachelophyllum

holotriches

+++++++++++++++++++++++++++++++arcellathécamebiens

+Mayorellaamibes

+++++++++++++++++++++++Euglenaflagellés

microfaune

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++flocs

+++++++++++++++++++++++++bactéries

libresliquide interstiel

Cyprodinil

Vinchlozoline

Fosetyl

aluminium

Hexaconazole

Fludioxinil

Quinoxyfène

Cym

oxanil

Dim

ethomorphe

Folpel

Glyphosate

Mancozèbe

Chlorpyriphos

ethyl

Diuron

Azoxystrobine

Tém

oin

Annexe 10

186

Annexe 10

Cinétiques de dégradation en bioréacteur 2L

L’expérimentation consiste en un suivi sur sept jours de l’évolution d’une biomasse

épuratrice en fonction de sa capacité à dégrader différents substrats. Il s’agit en réalité

de confirmer l’hypothèse selon laquelle une boue acclimatée à un effluent viticole réagira

plus favorablement à l’introduction de pesticides qu’une boue non acclimatée. Quatre

échantillons de deux litres de liqueur mixte sont placés des récipients de 2 litres, soumis

à une agitation (150 rpm) et à une oxygénation constante pendant toute la durée de

l’expérimentation.

L’expérimentation permet de suivre simultanément l’évolution de la biomasse entre les

témoins et les essais. Cette évolution est quantifiée par des mesures de matières en

suspension (MES), de demande chimique en oxygène (DCO),de matière sèche (MS), de

matières volatiles sèche (MVS) et de production d’ATP. Le mélange de produits

phytosanitaires (Tableau III.19) est utilisé.

Les quatre conditions expérimentales sont:

- Témoin A : 2 litres de liqueur mixte acclimatée à un effluent vinicole (étape 1) + 500

mL de vin jeune (DCO à 175 g.L-1).

- Essai A : 2 litres de liqueur mixte acclimatée à un effluent vinicole (étape 1) + 500 mL

de solution vitivinicole (5 g.l-1 Matières actives phytosanitaires).

- Témoin B : 2 litres de liqueur mixte acclimatée à un effluent viti-vinicole (étape 2) +

500 mL de vin jeune (DCO à 175 g.L-1).

- Essai B : 2 litres de liqueur mixte acclimatée à un effluent viti-vinicole (étape 2) + 500

mL de solution vitivinicole (5 g.l-1 Matières actives phytosanitaires).

Annexe 10

187

La description du dispositif expérimental est représentée dans la figure ci-dessous.

Descriptif du procédé expérimental

- La dégradation des effuents vitivinicoles : évolution de la DCO

La Figure ci-dessous représente l’évolution de la DCO au cours des expérimentations. On

remarque que la dégradation de la DCO a lieu quel que soit l’effluent d’entrée.

Cependant, la présence de pesticide dans une boue a pour effet de ralentir cette

dégradation. En effet, l’évolution de la DCO dans à 3 jours de traitement biologique est le

suivant : Témoin (Exp A) < essai (Exp A) < essai (Exp B) < Témoin (Exp B) / traitement

biologique 3 jours.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

-1 0 1 2 3 4 5 6Temps (jour)

DCO (mg.L-1)

Evolution des teneurs en DCO (mg.L-1) au cours du traitement biologique.

Expérimentation A : Témoin (�) et essai (�) ; Expérimentation B : Témoin (♦) et essai (�)

La dégradation la plus rapide à lieu dans le Batch contenant la boue acclimatée à un

effluent vinicole dans lequel on a introduit du vin. Ceci confirme donc ce qui a été

observé précédemment, la présence de pesticides dans une boue n’empêche pas

l’épuration d’avoir lieue mais leur toxicité ralentie le processus.

A B

Témoin Témoin Essai Essai

2L de Liqueur mixte issues de Br1 (vinicoles)

2L de Liqueur mixte issues de Br2 (vitivinicoles)

500 ml vin 500 ml vin 500 ml solution viti-vinicole 500 ml solution viti-vinicole

Annexe 10

188

- Evolution des Matières sèches (MS), des matières Volatiles (MVS)

Les Figures ci-après représentent l’évolution des taux de Matières Sèches et de Matières

Volatiles Sèches au cours de l’expérience.

2

2,5

3

3,5

4

4,5

5

5,5

6

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jour)

MS (g.L-1)

Evolution des teneurs en matières sèches (g.L-1) au cours du traitement biologique.


Les teneurs en matières sèches en matières volatiles sèches au début du traitement

(t0 àt3) fluctue entre les différents essais. Cette fluctuation correspond à la phase

d'acclimatation de la biomasse au substrat mais aussi à une phase de stress lors du

changement des conditions opératoires.

À partir de trois jours de traitement, on observe nettement une différence entre les

teneurs en matières sèches et en matières volatiles sèches :

[MS] Essai (Exp A) ≈ [MS] essai (Exp B) < [MS] Témoin(Exp A) ≈ [MS] Témoin (Exp

B)

[MVS] Essai (Exp A) < [MVS] essai (Exp B) ≈ [MVS] Témoin(Exp A) ≈ [MVS] Témoin

(Exp B)

Les teneurs en matières sèches et en matières volatiles sèches sont donc liés à la

nature même de l'effluent a dégradé. Lorsque la biomasse est en contact avec les

nouveaux substrats dégradés, ces teneurs diminuent progressivement jusqu'à

stabilisation. Les teneurs en biomasse seront plus faibles lorsqu'elle est en contact

avec un nouveau substrat. Lorsque la biomasse est en contact avec un substrat

connu elles s'adaptent rapidement et ces teneurs restent stables tout au long du

traitement. Ce phénomène est remarqué aussi bien avec une biomasse acclimatée à

Annexe 10

189

un effluent vinicole qu'avec une biomasse acclimatée à un effluent Vitivinicoles

contenant des pesticides.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jour)

MVS (g.L-1)

Evolution des teneurs en matières volatiles sèches (g.L-1) au cours du traitement biologique.


- Evolution des Matières en suspension (MES)

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

0 1 2 3 4 5 6 7

Temps (jour)

MES (g.L-1)

Evolution des teneurs en matières en suspension (mg.L-1) au cours du traitement biologique.


La Figure représente l’évolution des taux de matières en suspension au cours de

l’expérience. A l’instar de l’expérience précédente, on observe une augmentation

importante du taux de Matières en Suspension dans la liqueur mixte vinicole nourrie avec

un effluent vitivinicole. Ce phénomène est dû à une défloculation et à un développement

de microorganismes libres dans le surnageant en présence d'un nouveau toxique a

dégradé.

Les liqueurs mixtes viticoles (Témoin + essai) subissent une légère défloculation

due à la relative importance de la charge initiale des effluents d’entrée et se stabilisent

Annexe 10

190

ensuite très rapidement. De plus, la boue acclimatée à l’effluent phytosanitaire supporte

très bien l’introduction de pesticides supplémentaires malgré leur charge importante.

- Evolution de l’ATP total : subsance secrétée par les microorganismes

La Figure représente l'évolution de l’ATP de molécules synthétisées par les micro-

organismes lorsqu'ils sont en phase active. On observe en premier lieu une augmentation

globale de la production d’ATP, ce qui peut être expliqué par un apport très important de

DCO à dégrader.

0

50000

100000

150000

200000

250000

-1 0 1 2 3 4 5 6

Temps (jours)

ATP Total (URL)

Evolution des teneurs en ATP (URL) au cours du traitement biologique.


Cependant, toutes les biomasses ne réagissent pas de la même manière en fonction du

substrat qui leur a été apporté. En effet, on remarque une chute importante de la

production d’ATP dans la liqueur mixte vinicole dans laquelle on a ajouté des pesticides.

Cela met en évidence le caractère toxique et inhibiteur des pesticides sur une biomasse

non acclimatée.

Cette chute de la production d’ATP est également visible sur les boues acclimatées aux

effluents phytosanitaires mais elle est moindre. Elle peut être expliquée par une charge

polluante et donc une toxicité supérieure à celle de l’effluent habituel.

On remarque tout de même qu’au bout de sept jours, toutes les boues semblent avoir

résisté à la charge polluante ce qui permet de penser qu’il existe une adaptabilité des

microorganismes épurateurs.

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