LAMP 技術專刊 - 波仕特生物科技股份有限公司 · 2017-11-08 · 由於 lamp...

LAMP 技術專刊梁成芝撰

快速快速快速! ! ! 恆溫恆溫恆溫! ! ! 核酸檢測技術核酸檢測技術核酸檢測技術

For For 進階使用者進階使用者交叉污染防治 & 排除方法

輔助判定的好幫手 — 螢光染劑

LAMP 專用即時偵測儀 — LA-500

For For 入門使用者入門使用者比 PCR 更快更簡便的核酸檢測技術

原理介紹、簡明操作流程、primer 設計導覽

近年發表狀況 & 台灣相關發表整理

LA-500

電子版連結

免付費專線北部 0800-231-530 中部 0800-555-650 南部 0800-268-266 波仕特網頁 www.bio-protech.com.tw 客服信箱 [email protected] 1

特殊的 Polymerase 特殊的 primer 設計可肉眼觀測 (濁度測定)

Bst Polymerase 特性：

65 度恆溫增幅

可打開雙股 DNA

(無須高溫 denaturing)

LAMP 的 DNA 產

物為 PCR 的 1000 倍，隨

之產生的大量焦磷酸根

與鎂離子形成白色的沉

澱物，可用肉眼直接觀

察，或加入螢光染劑幫助

觀察。

酵素與 primer 在 65 度恆溫反應下，形成環型 DNA 構造，最後形成長鏈狀產物

4 條 primer 針對 6 個區域

Table 1. LAMP 原理說明簡表

LAMP 簡介

LAMP 全名為 Loop-Mediated Isothermal Amplification，是日本榮研公司 (Eiken Genome Site; http://

loopamp.eiken.co.jp/e/index.html) 在 2000 年研發出的核酸檢測技術，商品於 2002 年正式上市至今。

LAMP 使用 4~6 條 primer，在 65 度恆溫環境下，1 小時內即可完成 DNA 或 RNA 增幅反應。由於反應時間短，且專

一性與靈敏度都比傳統 PCR 高出許多，又可直接以肉眼辨識反應結果， LAMP 常被用於病原檢測及其他基因檢測項目

如性別判定、中草藥成分判定、基因改造食品檢測等等。

LAMP 特點

＊專利核酸 (DNA 或 RNA) 檢測技術

＊恆溫反應，無須複雜控溫設備

＊快速，1 小時內可完成

＊ RNA 反應同步完成

＊肉眼檢測，無須電泳

＊可自行設計 primer 搭配原廠試劑使用

日本榮研 (EIKEN) 株式會社

loopamp.eiken.co.jp/e/

波仕特生物科技 (股) 公司

www.bio-protech.com.tw


LAMP 基本原理

LAMP 的增幅流程如下圖 (Fig. 1)。LAMP 的原理主要可分為三點做說明 (Table 1)：特殊的 Polymerase、特殊的

primer 設計、及偵測原理。首先，LAMP 的酵素為 Bst DNA Polymerase，可在 65 度恆溫增幅，且在增幅的時候可以解

開 template DNA 的雙股構造 (Strand displacement ability)，使 LAMP 無須經過 95 度 denature 步驟，即可把 template

DNA 雙股打開；除此之外，LAMP 的 primer 經過特殊設計，共 4 條，分別為下圖中的 F3、FIP、B3 及 BIP primer。FIP 和

BIP primer 分別由 F1c 和 F2 區域及 B1c 和 B2 區域組合而成，可形成環型構造，讓 DNA 增幅成長鏈狀產物。最後，伴

隨 DNA 增幅反應產生白濁色焦磷酸鎂，直接用肉眼即可觀測。

LAMP 除了基本的 4 條 primer，還可以加入 loop primer 來加速反應進行。依據基本的 4 條 primer 的位置，可以設

計出 0 ~ 2 條 loop primer，因此 LAMP 使用的 primer 數量最多為 6 條。

最終長鏈狀產物

關鍵環型中間產物

Fig. 1. LAMP 增幅流程圖。

經過步驟 1~8 形成「關鍵環型中間產

物」後，除了新的 primer，也可從產物

3’端不斷延長形成「最終長鏈狀產物」

～ LAMP 增幅流程動畫，請上原廠網站觀看～

http://loopamp.eiken.co.jp/e/lamp/anim.html


LAMP 偵測原理與 real-time LAMP

LAMP 若成功增幅 DNA 時，會釋放出焦磷酸根。焦磷酸根會和反應溶液中的鎂離子形成不溶於水的焦磷酸鎂，

產生肉眼可見的白濁色。因此 LAMP 可直接用肉眼判斷 DNA 是否增幅。除了直接用肉眼觀測外，LAMP 也可搭配原

廠販售的螢光試劑使用，若成功增幅 DNA 時，反應溶液會在 UV 光下發出綠色螢光，可幫助判斷反應結果。或者，

可也在 LAMP 反應結束後直接加入 EtBr 及甲基藍，在 UV 光下觀察，各種螢光染色方法請見 LAMP 操作流程。

由於白濁色產生的情況和 template DNA 的量在一定範圍內 (0.01 pg/tube-100 ng/tube) 有相關性，因此，只

要搭配儀器 (LA-500) 進行即時濁度測定，即可進行 real-time LAMP 法，並利用和 real-time PCR 相似的原理，定量

template DNA。但也因為白濁色的產生是由於焦磷酸鎂的累積，並沒有序列上的特異性，因此 LAMP 法無法像 real

-time PCR 一般，搭配不同螢光標定的探針 (Probe) 進行 Multiplex 反應。

LAMP 污染防止方法

由於 LAMP 的靈敏度比 PCR 要高出許多，發生交叉汙染的可能性，自然也遠比 PCR 來的高。因此，在操作時必

須注意以下重點，以防止污染的發生。

LAMP 主要的汙染源是增幅後的反應溶液。由於 LAMP 可將目標片段 DNA 增幅達 1010 倍，因此增幅後的 LAMP

反應溶液中含有大量的目標片段 DNA。一旦操作環境、使用器具或是 LAMP 試劑被此 DNA 汙染，會使原本應該為

陰性反應的對照組 (negative control) 也出現陽性反應，嚴重影響檢測結果。因此，LAMP 增幅後，請勿隨意將反應

小管的蓋子打開，以避免污染操作環境。如需在反應後加入螢光染劑幫助判定結果，或要用電泳檢測 DNA 增幅結果

時，請避免和增幅反應前的操作步驟在同一地點進行，以預防污染的發生。除此之外，更要避免使用 Autoclave 的方

式來處理含目標片段 DNA 的反應溶液，以免汙染整台滅菌釜之外，目標片段 DNA 還有可能隨著蒸氣汙染整個實驗

環境。

萬一不幸發生污染，建議使用 0.55% 次氯酸鈉溶液 (約為市售漂白水稀釋 10 倍的濃度) 用擦拭或浸泡隔夜的方

式清理操作環境及使用器具，並更換新的試劑。此外，也可搭配市售去除 DNA 的產品來排除污染。

延伸閱讀：

1. Japan Microbiology Society, Bio Safety Committee. Revision on Guideline of Bio Hazard Prevention by Japan Microbi-

ology Society. Japan Microbiology Magazine Vol. 54 No. 3:667-715 (1999)

2. Brief Review: Preventing PCR Amplification Carryover Contamination in a Clinical Laboratory. Annals of Clinical La-

boratory Science. 34. No4:389－ 396.(2004) Aslanzadeh J.

3. How to kill Unwanted DNA. Biotechniques. 12. No3:358－ 360.(1992) Prince AM. et al.

4. An effort to appropriate Medical Waste disposal as a new Theme.1. Special issue on Clinic pathology review/ Amplified

Gene Waste vol.112「A Manual on Proper disposal of Medical Waste – featuring Infectious waste - : P. 98－ 103.

(2000)Tadayori Hoshina. X.


LAMP 使用流程

2x Master Mix 成份

Tris-HCl (pH8.8) 40 mM

KCl 20 mM

MgSO4 16 mM

(NH4)2SO4 20 mM

Tween20 0.2 %

Betaine 1.6 M

dNTPs 2.8 mM each

Component 體積 (µL)

2x Master Mix 12.5

Sterile H2O 10.5-X

Primer Mix X

Template DNA 1

Bst Polymerase 1

總體積 25 µL

Primer Mix 成份

將所有 primer 回溶成適當濃度後，混

合成 Primer Mix 使用。

FIP primer 40 pmole

BIP primer 40 pmole

F3 primer 5 pmole

B3 primer 5 pmole

*FL (loop) primer 20 pmole

*BL (loop) primer 20 pmole

* 加入 loop primer 可加速反應進行

LAMP 螢光染色方法

由左至右分別為三種常用的 LAMP 螢光

染色結果，螢光染色可以讓肉眼更容易

判定反應結果。

1. 反應前加入 1µL 原廠螢光試

劑 (LMP221)

2. 反應後加入 EtBr 0.5µg/mL +

甲基藍 20µmole/L

3. 反應後加入 1µL SYBR Green

(1000x)

* 反應後開蓋加入染劑請小心操作，以免

汙染後續實驗

配製反應液

65°C 1 hr

80°C 5 min

恆溫反應

判定結果

螢光輔助肉眼判定

LA-500

LA-500即時偵測濁度值，並自動判

定結果是否為陽性。

儀器判定

除了上述兩種常用判定方法，也可

使用 DNA 電泳、限制酶切、定序等

方法輔助判定。

原廠螢光試劑 (產品編號 LMP221)

包裝： 96 rxn (0.1 mL x 1 tube)

防止汙染必買

* 反應後無須開蓋!


LAMP & PCR 比較

LAMP 是由 PCR 改良而來，因此要了解 LAMP 的原理及優勢，最好的方法就是比較其與 PCR 的差異。如同在前面

的 LAMP 簡介及 LAMP 基本原理敘述中提到，LAMP 因為使用了特殊的酵素及 primer 設計，產生許多特點，例如：免去

PCR 高溫 denature 的步驟，使反應可以恆溫進行；縮短反應時間到 1 小時以內；可使用肉眼判讀，不用跑電泳等等。

LAMP 與 PCR 的詳細比較請見 Table 2。

榮研公司在醫療診斷方面已經有超過 60 年的經驗，其針對多種病原菌開發的專用檢測試劑 (Table 4)，有許多是已

被日本政府核可的臨床診斷試劑或環境檢測試劑，檢測效果值得信賴。若 table 4 中沒有您的檢測項目，也可以自行設

計 primer 搭配原廠試劑使用，primer 設計方法請見第 7 頁的介紹。

除此之外，LAMP 恆溫反應的特性，使其無需使用專門的儀器，只要簡單的加熱設備即可進行檢測。此特點十分

適合用於野外採樣等設備不足的環境。榮研公司積極與 FIND (Foundation for Innovative New Diagnostics; http://

www.finddiagnostics.org) 合作，開發 LAMP 用於設備不足的第三世界國家。目前已成功用於肺結核檢測，並已於日本

國內販售多年，除此之外，瘧疾、昏睡病 (非洲人類錐蟲病, HAT)、愛滋病 (HIV) 等合作案也持續進行中。

LAMP PCR

時間約 15 ~ 60 min 2 ~ 3 hr

溫度恆溫

* 僅需水浴槽或乾浴槽 ─ 設備費用低

需溫度循環

* 需要 PCR machine ─ 設備費用高

檢測方法可用肉眼觀測

* 產生白色沉澱物

需要跑電泳或用其他方式

* 約增加 30 分鐘

即時偵測

real-time LAMP * 需搭配即時偵測設備 LA-500

* 使用相同藥品

real-time PCR * 需 real-time PCR machine

* 需使用不同藥品

產物量約 1010 倍 (100 億倍) 約 107 倍 (1 千萬倍)

專一性專一性較高

* 4 條 primer 針對 6 個區域

專一性較低

* 2 條 primer 針對 2 個區域

RNA 檢測 1-step 反應

* 步驟和時間與 DNA 檢測相同

需另外進行 RT 步驟

* 約增加 30-60 分鐘

Table 2. LAMP & PCR 比較表


篇名期刊名稱年份檢測目標發表單位

Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection and differentiation of two genotypes of porcine circovirus type 2.

J Microbiol Immu-nol Infect.

2013 porcine circovirus type 2

(台灣豬第二型環狀病毒)

家畜所

台灣大學

Detection of viruses directly from the fresh leaves of a Phalaenopsis orchid using a microfluidic system.

Nanomedicine. 2013 Phalaenopsis orchid (蝴蝶蘭) 清華大學

Development of a sensitive and specific LAMP PCR assay for detection of fish pathogen Lactococcus garvieae.

Dis Aquat Organ. 2013 Lactococcus garvieae (乳酸球菌) 屏科大

Rapid and sensitive detection of Acinetobacter baumannii using loop-mediated isothermal amplification.

J Microbiol Meth-ods.

2012 Acinetobacter baumannii

(鮑曼不動桿菌) 慈濟大學

Application of loop-mediated isothermal amplification for malaria diagnosis during a follow-up study in São Tomé.

Malar J. 2012 malaria (瘧原蟲) 台灣瘧疾防治

顧問團

A novel loop-mediated isothermal amplification approach for sex identifica-tion of Columbidae birds.

Theriogenology. 2012 Columbidae birds

(鳥類性別鑑定) 嘉義大學

Rapid sex identification of papaya (Carica papaya) using multiplex loop-mediated isothermal amplification (mLAMP).

Planta. 2012 sex identification of papaya

(木瓜性別鑑定) 海洋大學

Loop-mediated isothermal amplification for rapid identification of biotypes B and Q of the globally invasive pest Bemisia tabaci, and studying population dynamics.

Pest Manag Sci. 2012 Bemisia tabaci (煙草粉蝨) 台灣大學

Rapid and sensitive detection of infectious bursal disease virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick.

J Virol Methods. 2012 infectious bursal disease virus

(傳染性華氏囊病毒) 中興大學

Detection of porcine circovirus type 1 in commercial porcine vaccines by loop-mediated isothermal amplification.

Folia Microbiol (Praha).

2011 porcine circovirus type 1

(豬第一型環狀病毒) 家畜所

Species and sex identification of Formosa landlocked salmon using loop-mediated isothermal amplification.

Mol Ecol Resour. 2011 Formosa landlocked salmon

(台灣鮭魚) 海洋大學

LAMP 研究發表現況

LAMP 從 2000 年發表至今超過 10 年，每年相關 paper 發表數量皆不斷成長 (Fig. 2)。相較之下，台灣相關 paper 發

表數量從 2009 年才開始增加，目前雖然已有顯著的成長，但無論是研究或是檢測方面，顯然都還有發展空間。由近

年台灣 LAMP 相關發表情況 (Table 3) 可知，目前 LAMP 在台灣，除了應用於病原的檢測 (病毒、細菌、或是寄生蟲)，

也開始用於性別鑑定等領域。其他如抗藥性檢測、物種鑑定、基因改良食品鑑定等範疇也都有應用 LAMP 的空間。

Table 3. 近年台灣 LAMP 相關發表。

J Microbiol Immunol Infect. 2013 Jul 8. pii: S1684-1182(13)00082-0. doi: 10.1016/j.jmii.2013.05.003. [Epub ahead of print]

2013 porcine circovirus type 2 (台灣豬第二型環狀病

毒) virus

家畜所

台灣大學

Nanomedicine. 2013 Jun 8. pii: S1549-9634(13)00267-0. doi: 10.1016/j.nano.2013.05.016. [Epub ahead of print]

2013 Phalaenopsis orchid (蝴蝶蘭) plant 清華大學

Dis Aquat Organ. 2013 Feb 28;102(3):225-35. doi: 10.3354/dao02546.

2013 Lactococcus garvieae (乳酸球菌) bacteria 屏科大

Fig. 2. LAMP 相關 paper 各年度發表數

量。

數據為 NCBI PubMed 網站搜尋結果，

2013 年篇數為預估數字，到 7 月 25 止，

實際發表篇數為 121 篇。台灣各年度相關

paper 發表數量如紅色數字所標示，無標

示表示當年度無發表。

1

7 3

10 7 3


LAMP primer 設計及免費設計軟體

Eiken 原廠提供免費的 LAMP primer 設計軟體 PrimerExplorer，目前最新版本為 4.0 版 (http://

primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)。PrimerExplorer 4.0 網頁操作請見下方說明。

選擇要設計的序列檔案 (2kb 以內)

點選 Primer Design 進入設計主畫面

依序點選 Generate 及 Display

點 Save List 儲存 Excel 檔

勾選 primer 並點 Confirm 查看詳細資料

點 Primer Information 儲存 primer 檔案

確認末端 dG 值 < -4

綠色底色部分為 primer 序列，

可複製保存

挑選 LAMP PRIMER 三原則

1. 空間位置

目的：避免 template DNA 二級結構影響反

應，因此建議挑選 3 ~ 5 組不同位置的

primer set 進行實測

2. 末端 dG 值 < -4

目的：讓末端容易和 template 結合，末端包

括 F1c 及 B1c 區域的 5’端、F3, B3, F2,

B2 區域的 3’端

3. Dimer dG 值較接近 0

目的：較不容易形成 primer dimer

PrimerExplorer 4.0

設計網頁連結


產品類別產品名稱 & 包裝產品編號

增幅試劑

Loopamp DNA Amplification Kit 48 rxns LMP204



Loopamp RNA Amplification Kit (RT-LAMP) 48 rxns LMP244



病原檢測試劑

Loopamp Norovirus G I Detection Kit 48 rxns LMP301

Loopamp Norovirus G II Detection Kit 48 rxns LMP302

Loopamp SARS Coronavirus Detection Kit 48 rxns LMP401

Loopamp H5 Subtype Influenza Virus Detection Kit* 48 rxns LMP461

Loopamp H1 pdm 2009 Influenza Detection Kit* 48 rxns LMP462

Loopamp FluA Influenza Detection Kit* 48 rxns LMP463

Loopamp Mycoplasma Pneumoniae Detection Kit* 48 rxns LMP481

Loopamp Legionella Detection Kit C* 48 rxns LMP501

48 rxns LMP520 Loopamp MTB Detection Kit*

96 rxns LMP521

Loopamp Herpes Simplex Virus Type1/2 Detection Kit* 48 rxns LMP531

Loopamp Bordetela pertussis Detection Kit 48 rxns LMP541

Loopamp Salmonella Detection Kit 48 rxns LMP601

Loopamp Verotoxin-producing Escherichia coli Detection Kit 48 rxns LMP621

Loopamp Escherichia coli O157 Detection Kit 48 rxns LMP631

Loopamp Verotoxin Typing Kit 24 rxns LMP641

Loopamp Legionella Detection Kit E 48 rxns LMP661

Loopamp Listeria monocytogenes Detection Kit 48 rxns LMP701

Loopamp Campylobacter Detection Kit 48 rxns LMP721

Loopamp Cryptosporidium Detection Kit* 48 rxns LMP741

Loopamp Giardia Detection Kit* 48 rxns LMP761

Loopamp Bacteria Multi 4 Detection Kit* 48 rxns LMP771

Loopamp Candida albicans Detection Kit* 48 rxns LMP772

性別判定試劑 Loopamp Bovine Embryo Sex Typing Kit 24 rxns LMP001

Primer Set

Loopamp Primer Set for West Nile Virus 48 rxns PM0001

Loopamp Primer Set for Koiherpes Virus 48 rxns PM0003

Loopamp Primer Set for Avian Flu H7 48 rxns PM0004

Loopamp Primer Set for Alicyclobacilus acidoterrestris 48 rxns PM0005

Loopamp Primer Set for Flavobacterium psychrophilum* 48 rxns PM0006

其他

Loopamp Fluorescence Detection Kit 96 rxns LMP221

Loopamp Influenza Extraction Reagent* 48 rxns LMP801

Loopamp Reaction Tube 12 * 8 strip LMP903

Loopamp Realtime Turbidimeter, LA-500 1 Unit LA-500

* 部分產品只有日文說明書或僅在日本販售，詳情請洽波仕特。

Table 4. Eiken 公司 LAMP 產品列表


LA-500 體積小重量輕，且無需使用電腦控制，直接分為 Control

Unit 及 Amplification Unit 兩部份，一台 Control Unit 可串聯 1 ~ 6 台

Amplification Unit 使用。兩者特點如下：

Control Unit

* 配備 7 吋全彩觸控式液晶螢幕

* 可自動判讀 LAMP 法檢測結果並以不同顏色顯示

* 一台 Control Unit 最多可串聯 6 台 Amplification Unit (96 個樣本)

* 無需外接電腦

* 操作方便且節省實驗室空間

* 內建印表機可直接列印數據

Amplification Unit

* 一台可偵測 16 個樣本

* 配備 2 個獨立控溫反應槽

* 16 channel 獨立光學偵測系統

* 光源採用紅光雷射二極體 (650nm)

* 外型輕巧不佔空間

§ 詳細規格請見下頁

「LAMP Real-time turbidimeter LA-500 儀器詳細規格表」

LA-500 data 輸出介面：

LA-500 Program 設定介面：

LA-500 data 顯示介面：

LAMP 即時濁度偵測儀 (LAMP Real-Time Turbidimeter) — LA-500

免付費專線北部 0800-231-530 中部 0800-555-650 南部 0800-268-266 波仕特網頁 www.bio-protech.com.tw 客服信箱 [email protected]

Loopamp Real-Time Turbidimeter LA-500 儀器詳細規格

Configuration

Control unit 包含操作介面、內建印表機，需與 Amplification Unit 連接

使用

Amplification unit 包含反應槽、上蓋加熱、溫度控制系統及光學偵測系統

* 一台 Control Unit 最多可連接 6 台 Amplification Unit

反應槽

Block 每台 Amplification Unit 包含 2 個可獨立控溫及偵測濁度

的 Block

一次可操作樣本數每台 Amplification Unit 最多一次 16 個樣本

Reaction tube Special 8 tubes Capacity 200 μ L

反應體積 25 μ L

上蓋加熱 2 blocks 共用

溫度控制系統

加熱系統 Aluminum block temperature control

控溫系統反應槽 2-block independence PID control

上蓋加熱 PID control

控溫精度反應槽 ± 0.5°C

上蓋加熱 ± 1.0°C

溫差最大 0.5°C

光學偵測系統

System

16-channel 獨立濁度偵測

濁度計算公式： Turbidity Abs = Ln (light intensity of

light source/light intensity of sample)

光源配備光強度監測系統的紅光雷射二極體 (波長 650 nm)

偵測系統光電二極體

量測範圍濁度值 0.01-1.00

量測精度濁度值 ± 0.05

量測間隔 6 秒

操作介面 7 吋全彩觸控式液晶螢幕

內建印表機熱感式印表機

外部連接 USB 介面

電源供應 100-240V～, 50/60 Hz

耗電量 Control unit: 最大 25 W

Amplification unit: 最大 90 VA

運行音量最大 75dB

操作環境要求溫度： 15-30°C ；濕度：相對濕度 30 ~ 80%

尺寸及重量 Control unit: 190 mm (W) x 230 mm (D) x 106 mm (H), 1.1 kg; Amplification unit: 150 mm

(W) x 275 mm (D) x 121 mm (H), 1.4 kg

儀器配件數量

電源線 1 條

6-pole 連接線 (連接 Amplification Unit) 1 條

熱感紙 (60 mm 寬 x 25 m/ 1 捲) 5 捲

英文操作手冊 1 本

可加購配備或耗材數量

Amplification unit 1 台

熱感紙 1 盒 5 捲

聯絡資訊

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地址：花蓮縣花蓮市 970 富裕七街 16 號 8 樓之 8

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