Laboratory Diagnosis of Viral y gMeningitis

M Parsania Ph DM Parsania, Ph.D.Tehran Medical Branch, Islamic Azad University

Central Nervous System InfectionsCentral Nervous System Infections• Meningitis

– Inflammation of the meninges  

– Infectious agents include:   b t i i f i dbacteria, viruses, fungi and protozoa.

• Encephalitis– Inflammation of the brain itself– Caused by many types of 

organisms• Myelitis

– Inflammation of the spinal cord (VZV, CMV, EBV)

Meningitis classifiedMeningitis classifiedAcute pyogenic meningitispy g gusually bacterial meningitis

Aseptic meningitisAseptic meningitis is a syndrome of multiple etiologies, but most cases are caused by a viral agent.

Chronic meningitisChronic meningitis is defined as persistence of meningealinflammation for over 4 weeks Mumps and lymphocyticinflammation for over 4 weeks.Mumps and lymphocytic choriomeningitis (LCM) virus infections occasionally persist for 3 to 4 weeks but true chronic viral meningitis is rare except in patients who are immunodeficient.

Meningitis Encephalitis

٥

Viral Meningitis (Aseptic Meningitis)Eti l i l A tEtiological Agents: 

Enteroviruses, most common (Coxsackie and Echovirus)H Si l iHerpes Simplex virusLymphocytic Choriomeningitis virus (LCM)M mpsMumpsVaricella Zoster virusMeasles virusMeasles virusArbovirusHIVHIV

Other less common causesinclude:include: EBV, CMV, and adenoviruses

Picornaviridae

• VIRON= naked , small (25‐30 nm) ( )icosahedral capsid enclosing  p gpositive sense single stranded gRNA

PicornaVirus‐ Characteristics• pico = small, rna =RNA  Viruses

• icosahedral 30 nm• naked nucleocapsid = Nonenveloped• plus strand(+) RNA m‐RNA

• single stranded and capped for infectivity and packaging

• this genome is infectious(should it be introduced into athis genome is infectious(should it be introduced into a cell)

• vertices of capsid creates canyon‐like depressions which contain the VAP’s, VAP ‐1, VAP ‐2, VAP ‐3

• most VAP bind to intracellular adhesion molecule ‐1 (ICAM‐1) expressed on epithelial cells fibroblasts and(ICAM 1) expressed on epithelial cells, fibroblasts, and endothelial cells

Virus Structure and AdsorptionVirus Structure and Adsorption

Fig. 57‐2 From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 57, published by Mosby Philadelphia, 

Picornavirus Capsid Structure

id i d i h d

Picornavirus Capsid Structure

Capsid is a pseudo T=3 icosahedron consisting of 60 identical asymmetric protomers arranged as y p g12 pentamers.

Each protomer is composed of a single copy of each of the four capsid proteins, VP1, VP2, VP3 and VP4.VP4.

VP4 is located on the inner surface of the protein shell formed by VP1, VP2 and VP3.

PicornaViruses – Virus Cycle

• Adsorption the susceptible cells• appropriate receptors determine host range• ICAM ‐ 1 or similar cellular receptors bind VAP’s

• Penetration• internalized by endocytosis• sometimes by viropexis thru small channels in the cytoplasmic membrane which removes the capsidcytoplasmic membrane which removes the capsid

• Uncoating• genome released by acidic conditions in the endosome

• capsid removed by passage thru channels in the membranemembrane

PicornaVirus – Replication

• Viruses replicate in the cytoplasm• genome binds directly to ribosomes where in g yfunctions as m‐RNA

• viral polyprotein is synthesized in  10 ‐15 minutes• polyprotein in cleaved into viral products

• cleavage proteases• viral RNA dependent RNA polymerase• viral RNA dependent RNA polymerase• proteins which inhibit cellular functions

• negative strand(+) template produced by viral RNA polymerase• these templates then generate new plus stranded RNA

Picornavirus – Virus Cycle

• Maturation/Assemblyl• structural proteins VP0, VP1, VP3 ect are 

cleaved from the polyprotein by the viral i d dinduced protease

• structural protein component assembly, then genome is inserted to complete maturation

• Release• virions are released by cell lysisvirions are released by cell lysis

Picornaviruses – Virus Cycle

ClassificationEnterovirus (enteroviruses)

•Poliovirus•Coxsackie virus •EchovirisE t i•EnterovirusRhinovirus (rhinoviruses)Hepatovirus (hepatitis A virus)Hepatovirus (hepatitis A virus)Parechovirus (parechoviruses)Aphthovirus (foot and mouth disease viruses)Aphthovirus (foot‐and‐mouth disease viruses)Cardiovirus (cardioviruses)

Polioviruses

• ENTEROVIRUSES• 3 Serotypes  1, 2 ,3• Major cause of paralytic 

poliomyelitis and now seeing post polioseeing post polio syndrome

• Global Eradication f OProgramme of WHO

P li i P h iPoliovirus ‐ Pathogenesis

• initial virus replication is in lymphoid tissues of tonsils and pharynx• virus is swallowed (resists acid) and replicates in the lymphoid cells 

of the Peyers patchesof the Peyers patches• primary viremia takes the viruses to CNS, anterior horn cells and brain motor cortex ‐ producing paralysis of the extremitiesextremities• virus may cross the blood brain barrier into CNS• or virus may move  via peripheral nerves to the CNS

• if virus spreads to other areas of the CNS like medulla and cranialif virus spreads to other areas of the CNS, like medulla and cranial nerve, then bulbar paralysis of respiration, pharynx, etc

• if virus is shed back to the blood from the CNS, this is secondary viremia

• pathogenically polio viruses are neurotrophic• humoral antibody is required for recovery and prevention

Clinical Presentations of Poliovirus Infection 

• Approx 90% of infections areApprox.  90% of infections are ASYMPTOMATIC

• Minor illness in 4‐8% of low‐grade fever, sore throat

• Aseptic Meningitis in 1‐5% • Asymmetrical acute flaccid paralysis with areflexia of limbs involved in 0.1%‐2% of infections (Respiratory Muscles may beinfections (Respiratory Muscles may be involved)

• Residual Paralytic Disease in 2/3 of these

Idealized Scheme of the Course of Infection with Poliovirus

Post‐polioSyndrome

90% ~5%90% ~5% 1‐2%

T /V iTreatment/VaccinesThe polio vaccine represents an important milestone in vaccine technology

1. Salk vaccine – killed, inactivated Since 2000 used exclusively in US2. Sabin vaccine – live attenuated (oral ‐OPV)

No longer used in US3. World‐wide eradication effort‐ OPV

Enterovirus ‐ Polio ControlEnterovirus Polio Control• control of polio has centered around stimulation artificial active 

immunity via vaccines h f h f bl /– to shift the ratio of susceptible/immunes.

• Two Polio Vaccines• Salk Vaccine ‐ three strains of inactive polio viruses(IPV)• Sabin Vaccine ‐three strain of active attenuated 

viruses(TVOPV)• attenuated viruses  are supposed to grow only in the oropharynx or intestinal tract but not in nerve cellsoropharynx or intestinal tract, but not in nerve cells.

• In absence of reversion, this is the case and system responds immunologically

• Polio will be the next communicable disease to be eradicated• Polio will be the next communicable disease to be eradicated• Changes in Polio immunization guidelines – 1998

• Use only inactive (Salk) vaccine• To reduce reversion of attenuated strains• To reduce reversion of attenuated strains

Enteroviral Meningitis

• Enterovirus infections account for most cases of viral meningitis.• Are a diverse group of RNA viruses including Coxsackie A & BAre a diverse group of RNA viruses including Coxsackie A & B, 

Echoviruses, and polioviruses.• Coxsackie A7, A9, B1‐6, echovirus 4, 6, 11, 14, 16, 25, 30, 31 are 

l i l dcommonly involved. • Transmitted primarily by fecal‐oral route, but can also be spread 

by contact with infected respiratory secretions. The incidence is y p yincreased in the summer months, but cases occur throughout the year.

• During outbreaks most cases occur in children under 5 years of• During outbreaks most cases occur in children under 5 years of age.

Enteroviral Meningitis

The human parechoviruses 1 and 2, formerly echovirus 22 and 23, are more commonly associated with diarrhea and respiratory illness than with CNS didisease.Cases of meningitis and encephalitis occasionally occur with these agentsoccur with these agents.

Picornaviruses ‐ Diagnosis• Enteroviruses

• Laboratory• Clinical Chemistry

• cerebrospinal fluid from CNS disease reveals• lymphocytic pleocytosis (25 ‐ 500 cell/ml)

• CSF glucose and protein• glucose normal or slightly depressed• protein normal or slightly  elevated

• Serology• detection of specific viral antibody in IgM fraction• four fold increase in IgG from acute to convelescence

– Culture performed only for epidemiological confirmation• polioviruses from pharynx or feces• coxsackie or echoviruses from throat or feces

• monkey kidney tissue culture• human  embryo kidney tissue culture

• culture virus is specifically identified with antibody assays

Enterovirus Lab Findings• CSF‐ findings typical of viral meningitis, with lymphocytic 

pleocytosis of generally <250 cells/mm3, with modest protein elevation generally <150 mg/dl, and normal glucose, viral cultures positive in 40‐80% of cases but it usually takes 4‐12 days to become positive, PCR is the most specific (close to 100%) and sensitive (97‐100%) test and is positive in more than 2/3 of culture negative CSF in patients with aseptic meningitis

• Can also culture throat and stool specimens but this typicallyCan also culture throat and stool specimens but this typically leads to a significant number of false positive results.

• Enterovirus IgM ELISA testing of serum may support adiagnosis of recent enteroviral infection.

ArenaviridaeVirus PropertiesName derived from “arenosus” (Latin “sandy”) describing 

f i i i i b l iappearance of virions on examination by electron microscopySpherical, 50–300 nm in diameter (mean, 110–130 nm). Genome: double‐segmented, negative‐sense, single‐stranded RNA,10–14 kb in overall size. Virion contains a transcriptase. Four major polypeptidesFour major polypeptides. Envelope. Replication: cytoplasm. Assembly: incorporate ribosomes and b d f l bbud from plasma membrane. 

Rodent ReservoirRodent Reservoir

• Mastomys species y pcomplex

• Taxonomy still unclear– M. huberti: more common incommon in peridomestic habitat

– M. erytholeucus: imore common in 

brush habitat– Others

TransmissionTransmission

• Rodent‐to‐human:• Rodent‐to‐human: 

– Inhalation of aerosolized virus

– Ingestion of food or materials contaminated b i f t d d t tby infected rodent excreta

– Catching and preparingMastomys as a foodCatching and preparing Mastomys as a food source

TransmissionTransmission

• Human‐to‐human:Human to human:

–Direct contact with blood, tissues, secretions or excretions of infected humans

–Needle stick or cut

– Inhalation of aerosolized virus

Lymphocytic ChoriomeningitisLCM virus is occasionally transmitted to humans, presumably via mouse droppings. LCM i h i di if d bLCM in humans is an acute disease manifested by aseptic meningitis or a mild systemic influenza‐likeillnessillness. mortality is less than 1%Many infections are subclinical.yThe incubation period is usually 1–2 weeks. There may be fever, chills, malaise, generalized muscle aches and pains, weakness, headache, and sore throat. The illness lasts 1 3 weeksThe illness lasts 1–3 weeks. 

Lymphocytic Choriomeningitis VirusLymphocytic Choriomeningitis Virus

• ssRNA virus of the arenavirus groupi d i h i d f f d• LCM is excreted in the urine and feces of rodents, 

including mice, rats, and hamsters. • It is transmitted to humans by either direct contact• It is transmitted to humans by either direct contact with infected animals or environmental surfaces. 

• Infection occurs more commonly in the winter ymonths.

• Symptoms generally include a influenza like illness.

Miscellaneous viruses• West Nile Virus,• St Louis Encephalitis• St Louis Encephalitis,• California Encephalitis,VZV• VZV,

• EBV,• CMV,• adenoviruses• Less common causes of meningitis, but they do occur.

• In most cases the course is self‐limited, and the treatment is supportive in nature.

Herpesviridae affecting CNSHerpesviridae affecting CNS

• Human viruses include:Human viruses include:– Herpes simplex 1– Herpes simplex 2Herpes simplex 2– Varicella‐zoster (covered in chickenpox talk later)Cytomegalovirus– Cytomegalovirus

– Epstein Barr virusHHV6– HHV6

HerpesviridaeHerpesviridaeStructure

• Large icosahedreal, double stranded DNA virusesDNA viruses

• Replicate in the nucleus of cells• Enveloped with numerous 

glycoprotein spikes.• Tendency to develop latent infections• Most primary (initial) infections areMost primary (initial) infections are 

asymptomatic (except for Varicella zoster)

CytomegalovirusCytomegalovirus

• Encephalitis, typically with periventricular lesions, occurs as p , yp y p ,part of the congenital CMV syndrome.

• In patients who are immunocompromised with AIDS it was til tl f th t f CNSuntil recently one of the most common causes of CNS 

disease (16%).• CMV encephalitis also occurs post‐transplantation but is p p p

believed to be uncommon.• CMV DNA has been described in 50% of brains from liver 

l i i h CNS ltransplant patients with CNS symptomatology. • Occasional cases are described in individuals who are  

immunocompromised.immunocompromised.

Diagnosis of CMV EncephalitisDiagnosis of  CMV Encephalitis

• CMV PCR on CSF is the best test for diagnosis, with sensitivity around 79% or higher.

• Supporting evidence can come from serum CMV IgM reactivity blood urine or throat swab CMV culture and PCRblood, urine, or throat swab CMV culture and PCR.

• However, only CSF CMV PCR or intrathecal CMV antibody production are diagnostic.Q i i f DNA i b h CSF d b i i i i l• Quantitation of DNA in both CSF and brain tissue sensitively diagnoses and monitors antiviral treatment, e.g.

– AIDS patients with HCMV‐related CNS disease have high quantities of HCMV DNA in their CSF

CMV Infection of the CNSCMV Infection of the CNS

Diagnosis of CMV related CNS disease is based uponDiagnosis of CMV‐related CNS disease is based upon clinical presentation, neuroradiological studies, CSF chemistries, serological testing, and culture and PCR of CSFCSF

• Clinical presentations of CMV‐related CNS disease    can be nonspecific

• CSF viral culture can be insensitive • Qualitative DNA PCR can detect both latent andQualitative DNA PCR can detect both latent and   replicating virus

Epstein‐Barr VirusEpstein Barr Virus

• Encephalitis and meningitis are recognized as uncommon p g gcomplications of glandular fever.

• Acute EBV accounts for 4 to 5% of infection‐related neurological disease, while reactivated EBV is reported to be an important cause of neurological complications in p g ppediatric patients.

Diagnosis of  EBV Encephalitis• EBV is rarely cultured from CSF during CNS infection.

• Detection of EBV DNA PCR on CSF is diagnostic for CNS disease.

• When quantitative PCR is done levels are relatively high in both q y gEBV CNS lymphoma and acute EBV encephalitis cases, and lower in post infectious EBV‐related syndromes such as Guillain‐Barresyndrome, acute demyelinating encephalitis and transverse 

li imyelitis.

• Antibody studies on serum may support a diagnosis of acute EBV encephalitis, for example when EBV VCA IgM is positive and anti‐EBNA negative. 

• Analysis by RT‐PCR of specific viral mRNA

Human Herpes Virus 6 (HHV6)Human Herpes Virus 6 (HHV6)

• HHV6 associates with febrile convulsions in children under 2 years of age.

• It is a cause of meningitis and encephalitis in immuno‐competent as well as immunocompromised patients.

• In the bone marrow transplant recipient, encephalitis presentation occurs between 10 days to 15 months (median 45 days) after transplantation.

Diagnosis of HHV6 EncephalitisDiagnosis of  HHV6 Encephalitis

• Positive anti‐HHV6 IgM serology in CSF.  A fourfold rise in g gyantibody in serum only reflects the reactivation of a virus. 

• Virus culture from CSF is insensitive• PCR from CSF is more appropriate.• Interpretation may require caution, given the reported high 

prevalence (over 30%) of latent virus in brain detectable byprevalence (over 30%) of latent virus in brain detectable by PCR, it is doubtful whether HHV6 DNA is detectable in CSF except in active CNS infection.

HHV‐6/‐7 Infection of the CNS

• Virus Isolation and Assay• Serological Assays• Genomic Detection by PCR

– Numerous PCR primer sets available for HHV‐6 

– Quantitative PCR assay ‐ persistence of a high HHV‐6 load in the absence of apparent diseaseapparent disease

– Multiplex PCR method ‐ simultaneous detection of HHV‐6 and HHV‐7

• CSF‐PCR is the technique of choice for the diagnosis of the CNS infection

Paramyxovirus structureParamyxovirus structure

Paramyxovirus electron micrograph

http://web.uct.ac.za/depts/mmi/stannard/paramyx.html

Paramyxoviridae structure

From Schaechter’s Mechanisms of Microbial Disease; 4th ed.; Engleberg, DiRita & Dermody; Lippincott, Williams & Wilkins; 2007; Fig.  34‐1

Measles virusMeasles virus

1 . It  has been classed as a paramyxovirus.p yit is spherical in appearance ,measuring about 100~150nm in diameter. 

It has an outer envelope composed of M‐protein, H‐protein, F‐protein, and internal core is RNA.

• 2 .Site of the measles virus existsmeasles can be detected from blood and  nasal,  pharyngeal , p y gsecretions.

Measles pathogenesis

Mechanisms of spread of the measles virus within the body and the pathogenesis ofand the pathogenesis of measles. CMI, Cell‐mediated immunity; CNS, central nervous system.  (From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig. 59‐3.)

Measles Pathogenesis and Clinical Featuresg• Respiratory transmission of virus• Replication in nasopharynx and regional lymph nodes• Primary viremia 2‐3 days after exposure• Secondary viremia 5‐7 days after exposure with spread to tissues• Incubation period 10 12 days• Incubation period 10‐12 days• Stepwise increase in fever to 103°F or higher• Cough, coryza, conjunctivitis• Koplik spots• 2‐4 days after prodrome, 14 days after exposure

M l l b fl t• Maculopapular, becomes confluent• Begins on face and head• Persists 5‐6 daysy• Fades in order of appearance

Measles time course

Time course of measles virus infection. Characteristic prodrome symptoms are cough, conjunctivitis, coryza, and photophobia (CCC and P), followed by the appearance of Koplik'sspots and rash. SSPE, Subacute sclerosingp gpanencephalitis. (From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig. 59‐4.)

Koplik’s spots

Koplik's spots in the mouth and exanthem. Koplik's spots usually precede the measles rash and may be seen for the first day or two afterbe seen for the first day or two after the rash appears. (Courtesy Dr. J.I. Pugh, St. Albans; from Emond RTD, Rowland HAK: A color atlas of infectious diseases, ed 3, London, 1995, Mosby.) (From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig. 59‐5.)

MeaslesMeasles• Measles causes three types of encephalitis:

1. Postinfectious encephalitis 5 to 14 days after the rash, it is an autoimmune response characterized by perivascularinflammation and demyelination.

2. Progressive infectious encephalitis 3 to 6 months after the initial infection It occurs in children who are immunoinitial infection. It occurs in children who are immuno‐deficient or immunosuppressed and is due to uncontrolled measles virus replication.

3. Subacute sclerosing pan encephalitis (SSPE) 5 to 10 years after the initial infection. Measles vaccine virus rarely causes SSPESSPE.

Diagnosis of Measles EncephalitisDiagnosis of  Measles Encephalitis

• Serology, particularly detection of IgM by ELISA is sensitive gy, p y g yand supports the diagnosis of measles encephalitis in the appropriate context.O l fl id b d f d t ti f l I M d f• Oral fluid can be used for detection of measles IgM and of virus by RT‐PCR with over 90% sensitivity, while virus can be detected by RT‐PCR in urine for some 5 weeks after infection. 

• SSPE is diagnosed by demonstrating intrathecal production of measles IgG antibodyof measles IgG antibody.

Mumps PathogenesisMumps Pathogenesis

• Respiratory transmission of virusRespiratory transmission of virus• Replication in nasopharynx and regional lymph nodeslymph nodes

• Viremia 12‐25 days after exposure with d ispread to tissues

• Multiple tissues infected during viremia

Mumps Clinical FeaturesMumps Clinical Features

• Incubation period 14‐18 daysIncubation period 14 18 days• Nonspecific prodrome of myalgia, malaise, headache low‐grade feverheadache, low grade fever 

• Parotitis in 30%‐40%U t 20% f i f ti t ti• Up to 20% of infections asymptomatic

Mumps symptoms

Child with parotitis.  (From Fields Vriology (2007) 5th edition, Knipe, DM & Howley, PM, eds, Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia Fig. 43.4

Mumps time course

Time course of mumps virus infection.  (From Medical Microbiology, 5th ed., Murray, Rosenthal & Pfaller, Mosby Inc., 2005, Fig. 59‐8.)

Mumps ComplicationsCNS involvement 15% of clinical cases

Mumps Complications

Orchitis 20%‐50% in post‐ pubertal males

Pancreatitis

D f

2%‐5%

/Deafness

D th

1/20,000 

A 1Death Average 1 per year

Mumps EpidemiologyMumps Epidemiology• Reservoir Human

A t ti i f tiAsymptomatic infections may transmit

• Transmission Respiratory drop nuclei• Transmission Respiratory drop nuclei

• Temporal pattern Peak in late winter and springTemporal pattern  Peak in late winter and spring

• Communicability Three days before to four days y y yafter onset of  active disease

Mumps VaccineMumps Vaccine• Composition Live virus (Jeryl Lynn strain)

• Efficacy 95% (Range, 90%‐97%)

• Duration ofImmunity Lifelong

• Schedule >1 Dose

• Should be administered with measles and rubella (MMR) or with measles, rubella and varicella (MMRV) 

Measles Mumps Rubella VaccineMeasles Mumps Rubella Vaccine

• 12 15 months is the recommended and• 12 ‐15 months is the recommended and minimum age (more effective at 15 months)MMR i b f 12 h h ld b• MMR given before 12 months should not be counted as a valid dose

• 2nd dose at 4‐6 years

Mumps DiagnosisMumps Diagnosis

• CSF‐ similar to other viral causes, but like LCM it can induce a lymphocytic pleocytosis with cell counts >1000/mm3 or a decreased glucose <50mg/dl, can isolate the virus from the CSFli i l l i i h l f l f h i• Clinical correlation is very helpful, ex. If the patient 

has parotitis or orchitis.

Mumps MeningitisMumps Meningitis

• Caused by paramyxovirus which is a ssRNA virus• Prior to the creation of the mumps vaccine in 1967, it accounted for 10‐20% of all cases of viral meningitis.

• Even now this virus causes a significant minority of i i t d d l t d d ltcases in unvaccinated adolescents and adults.

• In patients who do acquire mumps, CNS infection occurs rather frequently with CSF pleocytosisoccurs rather frequently, with CSF pleocytosisdetected in 40‐60% of patients, and 10‐30% of those have clinical signs and symptoms of meningitis.

RetroviridaeRetroviridae

• Retroviruses (family Retroviridae) areRetroviruses (family Retroviridae) are enveloped, single stranded (+) RNA viruses that replicate through a DNA intermediatethat replicate through a DNA intermediate using reverse transcriptase.

• This large and diverse family includes• This large and diverse family includes members that are oncogenic, are associated with a variety of immune system disorderswith a variety of immune system disorders, and cause degenerative and neurological syndromessyndromes.

HIV Structure

surface transmembrane

matrix protein

capsid protein

nucleocapsid protein

RTIntegraseprotease

CNS M if iCNS Manifestations••AIDS Dementia ComplexAIDS Dementia ComplexAIDS Dementia Complex AIDS Dementia Complex

(ADC)(ADC)h li ih li i•• EncephalitisEncephalitis

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS

Direct HIV infection of the CNS occurs in 10 to 50% ofDirect HIV infection of the CNS occurs in 10 to 50% of patients with AIDS, ultimately producing dementia. Multinucleated giant cells are the pathognomonicfeature in deep grey and central white matter. HIV encephalitis may be more common in drug users th i HIV i f t d h lthan in HIV‐infected homosexuals.

HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS

The incidence of HIV encephalitis, which had fallen with more effective therapy, has risen in recent yearswith more effective therapy, has risen in recent years perhaps due to longer survival and greater exposure of brain to HIV. HIV lymphocytic meningitis and HIV encephalitis can be found at various stages of HIV infection and tend to develop before opportunistic i f iinfections.

HIV Meningitis DiagnosisHIV Meningitis Diagnosis

• CSF‐might show a lymphocytic pleocytosisCSF might show a lymphocytic pleocytosis, elevated protein, and normal glucose.  

• CSF cultures are often positive, but are not availableCSF cultures are often positive, but are not availablein most centers.

• detection of HIV plasma viremia by nucleic acid p ytechniques can be used for diagnosis.

Laboratory DiagnosisLaboratory Diagnosis

R id iti f t i iti i it lRapid recognition of acute meningitis is vital, and the differentiation between bacterial, 

tl t t d b t i l d i l i iti ipartly treated bacterial and viral meningitis is critical to allow appropriate treatment of the i f t d i di id l d t finfected individual and management of contacts.

SAFETY CONSIDERATIONSSAFETY CONSIDERATIONSContainment Level 2 unless infection with a Hazard group 3 & 4 organism is suspected, in which case work should be performed in a pmicrobiological safety cabinet under containment level 3 conditions.

Biosafety LevelsBiosafety Levels• BSL‐1: agents not known to cause disease (in g (

healthy adults)• BSL‐2: agents associated with disease• BSL‐3: indigenous/exotic agents 

associated with human disease and with potential for aerosolwith potential for aerosol transmission

• BSL‐4: dangerous/exotic agents of life g / gthreatening nature

Bio‐safety ايمني زيستمختلفسطوح levels يح

.دارد وجود زيستي خطرناك مواد با كردن كار براي (BSLs) ايمني زيست سطح چھار:موضوعسهتركيبازعبارتستايمنزيستسطوحشالوده :موضوعسهتركيباز عبارتستايمنيزيستسطوحشالوده

آزمايشگاه در كار صحيح فني اصول و آزمايشگاھي كار نوع :الف

ايمنيتجھيزات:ب

آزمايشگاھي امكانات :ج

:دارد وجود عمده ھدف دو ايمني زيست سطوح از كدام ھر در و شده شناخته كامالً يا كه عفوني و بيماريزا عوامل از انواعي با كردن كار روش ترين ايمن - ١

ل لشگفششلطق ق و انتقال از پيشگيري :ھدف(.ندارندخاصيدرمانواندنشده شناساييكاملبطورياانددرمانقابل )بيماريزا عوامل انتشار

)آنمدتطوالنيارائهوكاركيفيتباالترين(باالكارآييباآزمايشگاھيكارارائه-٢ يرر ي ييبز رين(ب ر يب يروري )ن و

Bio‐safety( اول سطح ايمنی زيست level1 (BSL‐1

:استفاده موارد آنھا بالقوه زيان يا و نداشته محيط يا آزمايشگاه افراد براي اي شده شناخته خطر كه عواملي بررسي تحت ولي كنند نمي بيماري ايجاد انسان در معمول طور به كه ھايي ارگانيسم ميكرو از بسياري و است حداقلط ا ثاكطلفخاش اا ااا االكاف اف و مسن افراد و سال و سن كمافراددربيماريايجادباعثاست ممكنوبودهطلبفرصتخاص،شرايط

.شوند بوده ايمني ضعف دچار كه اشخاصي .ندارد خاصي ثانويه و اوليه سدھاي به نياز و بوده استوار شناسي ميكروب استاندارد روشھاي پايه بر.گيردميانجامآزمايشگاھيبازروبخشھايرويبرمعموالًكار- يرويبرور ھ زروب يب ي مز يريج را وابسته علوم ساير يا ميكروبيولوژي عمومي آموزش دوره كه متخصص يك زيرنظر آزمايشگاه در افراد -

.كنند مي كار اند گذرانده.باشد ساختمانھا ساير از دورتر مكاني در آزمايشگاه نيست الزم -

نه گانيازھاين ا تازطحايندكهھايك نزي اناي دكاآنھابات ك .كرد كار آنھاباتوانميايمنيزيستازسطح اين دركهھاميكروارگانيسمازھايينمونه

E.coli‐ K12Bacillus subtilis

مي بيولوژيك ايمني ھودھاي و ... ماسك عينك، دستكش، ، محافظ لباس پوشيدن : اوليه سدھاي از منظور.باشد

سيستمازتوانممثالعنوانبهاستآزمايشگاهداخلفضايساختاروطراح:ثانويهسدھايازمنظور سيستم از توان مي مثال عنوانبهاستآزمايشگاهداخلفضايساختاروطراحي:ثانويهسدھايازمنظور.برد نام باشد برقرار بايد آزمايشگاه داخل به خارج از كه ھوا جريان

Biosafety Level 1

Bio‐safety level 2 (BSL‐2(زيست ايمنی سطح دوم

:موارد استفاده.مي باشند مناسب استنسبتاً خطرناك و براي كار با عواملي كه براي افراد و محيط   BSL‐1مانند

BSL‐2  و ساير آزمايشگاھھايي كه با آن دسته باليني و آموزشي – آزمايشگاھھاي تشخيص طبي جھت.از عوامل بيماريزا و خطرساز خفيف كه باعث بيماري در انسان مي شوند، به كار مي رود

مي توان با اين دسته از عوامل خطرساز با رعايت روشھاي استاندارد ميكروبشناسي با استفاده و به كار بردن . اطمينان خاطر و امنيت كافي حتي بر روي سطوح ميزھاي باز آزمايشگاھي كار نمود

جھت شده توصيه معلقروشھاي ريز ذرات توليد از استجلوگيري ضروري ھوا در . در ھوا ضروري استجلوگيري از توليد ذرات ريز معلقروشھاي توصيه شده جھت

Hazard Group 2

Enteroviruses

Herpesviruses including Herpes Simplex virusHerpesviruses including Herpes Simplex virus, Varicella Zoster virus, Epstein Barr Virus, Cytomegalovirus

Mumps

Measles virus

Ad iAdenoviruses

Biosafety Level 2

ط ن ا f(ز l ( ‐ Bio(زيست ايمنی سطح سوم safety Level 3 ( BSL ‐ 3 

استفاده :موارد استفاده:مواردBSL‐3  شامل مسائل مربوط به تشخيص پزشكي ، آموزش ، تحقيقات يا امكانات توليد در مواردي

.مي شودبيماريھاي شديد كشنده داخلي يا خارجي موجب بروز استنشاق برخي از عوامل است كه . نمونه ھايي از ميكروارگانيسم ھا كه در اين سطح از زيست ايمني مي توان با آنھا كار كرد

Mycobacteriumtuberculosis ‐Francisella tularensis‐Brucella species‐Coxiella tularensisCoxiella tularensis‐Clamydia psittaci‐HIV‐Hanta virus‐Rabies‐Vesicular stomatitis virus‐Yellow Fever Virus‐St.Luis Encephalitis VirusSt.Luis Encephalitis Virus‐West‐nile virus

Biosafety Level 3

Biosafety Level 3Biosafety Level 3Working in High Containment

i f l ( )Biosafety Level‐3 (BSL‐3)• Indigenous or exotic agents• Aerosol transmission• Serious health effects• Treatment may or may not exist

Risk Group 3

Pathogenic, cause serious diseaseff i dEffective treatment and preventive measures usually availableLittle person‐to‐person spread

Laboratory in Lyon France

‐ Bio(زيست ايمنی سطح چھارم safety Level 4 ( BSL ‐ 4

:موارد استفادهو از طريق دستگاه تنفسي، مخاط يا ذرات ريز معلق در ھوا به صورت  BSL‐4عوامل خطرساز در

و شوند ا بي و حادثه ايجاد باعث تصادف يق تز علت به يا ديده يب آ ت نپو واك ھيچگونه واكسن پوست آسيب ديده يا به علت تزريق تصادفي باعث ايجاد حادثه و بيماري مي شوند و ھيچگونه.و درماني نيز براي آنھا وجود ندارد

. نمونه ھايي از ميكروارگانيسم ھا كه در اين سطح از زيست ايمني مي توان با آنھا كار كرد

-Small pox‐Ebola virus‐Arena virus(Lassa Machupo)‐Arena virus(Lassa,Machupo)‐Marburg Virus ‐Hantavirus‐Viral Hemorrhagic Fever Virus

Ebola virusEbola virus

Biosafety Level 4

Extreme biological hazardsExtreme biological hazards

Laboratory safety: BSL‐4Laboratory safety: BSL 4In contrast to patient‐care,high‐level protection required for:• Laboratory manipulation• Mechanical generation of aerosols

• Concentrated infectious material• Viral culture

Safety Cabinets of classes III

Biosafety Level‐4Working in High Containment

Biosafety Level‐4Biosafety Level 4• Builds on BSL‐3 practices• Maximum containment facilitiesMaximum containment facilities• Pressurized Containment Suite

– BSL‐3 + Class III Biosafety Cabinety• Chemical decontamination showers

Classification of viral agents of CNS diseaseHazard Group 2 Hazard Group 3 Hazard Group 4

Enteroviruses LCM Nipah

Herpesviruses including Herpes Simplex virus, Varicella Zoster virus, Epstein Barr Virus, Cytomegalovirus

Flaviruses including dengue,Japanese encephalitis, MurrayValley encephalitis, St Louisencephalitis, West Nile feverBarr Virus, Cytomegalovirus encephalitis, West Nile fever

Mumps Herpes simiae Russian Spring‐Summer encephalitis

Measles virus HIV Omsk haemorrhagicfever

Adenoviruses Rabies

Alphaviruses includingEastern equine encephalitis,Western equine encephalitis,V l h li iVenezuelan encephalitis

Tickborne encephalitis,louping ill

Types of specimen:

Cerebrospinal fluidserumserumplasmabrain biopsybrain biopsyswabsffecesurine

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT ANDSPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

OPTIMAL TIME OF COLLECTIONPreferably before antimicrobial therapy is started, but y py ,this must not be delayed unnecessarily pending lumbar puncture and CSF culture.Specimens should be transported and processed as soon as possible.

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

SPECIAL CONSIDERATIONS TO MINIMISE DETERIORATIONSPECIAL CONSIDERATIONS TO MINIMISE DETERIORATIONSpecimens should be cultured as soon as possible after receipt, ideally within 10 minutes and within a maximum of two hours.Cells disintegrate and a delay may produce a cell count th t d t fl t th li i l it ti f th ti tthat does not reflect the clinical situation of the patient.Do not refrigerate specimen until after microscopy and bacterial culture have been performedbacterial culture have been performed.The specimen should then be refrigerated pending further investigation.

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

CEREBROSPINAL FLUIDCEREBROSPINAL FLUIDCSF should be collected by lumbar tap into sterile containers It is essential that CSF is sent for cellcontainers. It is essential that CSF is sent for cell count, bacteriology, biochemistry and virology.CSF may be stored at +4°C if delays in processing y y p gfor virus culture or viral PCR will be less than 24 hours.If greater delays are likely CSF should be frozen at –80°C, while clotted blood samples should be separated and the serum stored at 20°Cseparated and the serum stored at –20 C.

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

SERUMSERUMClotted blood 7 to 10 mL, should be collected by venepuncture for serology, particularly IgM assays. Serum can also be used for enterovirus PCR.PLASMA

i l d bl d h ld b ll d iEDTA‐anticoagulated blood 5mL should be collected into sterile tubes by venepuncture.EDTA‐anticoagulatedwhole blood is suitable for PCR assays especiallywhole blood is suitable for PCR assays, especially herpesvirus assays, eg HSV in neonatal CNS disease, CMV and EBV in patients who are immunocompromised.p p

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

BRAIN BIOPSYBRAIN BIOPSYBrain specimens should be collected unfixed into a sterile container.Brain smears can be used for viral antigen detection by immunofluorescent antibody staining, and for electron microscopy with negative staining.Emulsified brain tissue is suitable for tissueEmulsified brain tissue is suitable for tissue culture and after proteinase K treatment for PCR.PCR.

SPECIMEN COLLECTION TRANSPORT AND STORAGE

SWABSSWABSSwabs when taken should be put into virus transport medium. Suitable swabs include throatpswabs for a range of virus cultures and PCR.FAECES

Faeces should be collected for enterovirus culture into clean containers.URINEURINE

Ten to 20 mL of urine should be collected into sterile containers (without preservatives) forsterile containers (without preservatives) for mumps virus culture and mumps PCR.

Examination of CSFxamination of CSF

The diagnosis of meningitis from the examination of CSF involves the following :

Complete cell countDiff i l l kDifferential leukocyte countExamination of Gram‐stained smearCultureCultureDetermination of glucose and protein concentrations PCR Antigen testing

SPECIMEN PROCESSING

TEST SELECTIONDivide specimen, if multiple samples are not taken after p , p pperforming microscopy and bacterial culture, for appropriate procedures An unopened sample, if available, is preferred for PCR.APPEARANCE

Describe turbidity and whether a clot is presentDescribe turbidity and whether a clot is present.Describe colour of supernatant after centrifugation. 

SPECIMEN PROCESSING

MICROSCOPYStandard total cell countStandard total cell count

Perform total WBC and RBC counts on the uncentrifuged specimen, preferably the last uncentrifuged specimen, preferably the lastspecimen taken, in a counting chamber.Cell counts should not be performed on specimens containing a clot (which would invalidate the result).Diff ti l l k t tDifferential leukocyte countCULTURE AND OTHER INVESTIGATION

Normal CSF valuesNeonates 1-4yr old

0 – 30 cells/mm3

0 - 20 cells/mm3

Leukocytes 5yr-pubertyAdults

0 - 10 cells/mm3

0 - 5 cells/mm3

ErythrocytesNewbornAdults

0 - 675 cells/mm3

0 - 10 cells/mm3

Neonates ≤6d 0.7 g/L (70 mg/dL)Protein Others

g ( g )0.2 - 0.4 g/L (20 - 40 mg/dL) (<1% of serum protein concentration)

Glucose≥60% of simultaneously determined plasmaconcentration (CSF: serum ratio (≥0.6)

CSF Cloudiness / TurbidityCSF Cloudiness / Turbidity

A simple test of CSF turbidity is to see if normal print can benormal print can be read easily through the sample – CSF sho ld be cr stalshould be crystal clear.

Cloudiness usuallyCloudiness usually appears at CSF WBC counts > 200 106 Wb L200x106 Wbc per L

CSF discoloration

Bedside assessment alone is very helpfulBedside assessment alone is very helpful.

75% of acute bacterial meningitis cases can be detected by examining for CSF cloudiness orfor CSF cloudiness or turbidity at the bedside.

CSF culture is great but if it is not available a i ill id l ll dmicroscope will provide nearly all you need to 

know.

82% of acute bacterial meningitis cases can be detected by either turbidity y yor a CSF white cell count and using a cut-off of >50 WBC per μL (>50 x 106WBC per μL. (>50 x 106

WBC per L)

CSF microscopy, blood and CSF glucose measures are highly sensitive. 

96% of acute bacterial meningitis cases can bemeningitis cases can be detected by turbidity, a CSF white cell count of >50 Wbc per μL (>50 x 106 Wbc per L) or a CSF glucose to Blood glucose ratio <0.1*glucose ratio 0.1

* Books suggest a ratio of ~0.6, this is much too high to be useful

CSF Findings in meningitis

CSF Findings in Infants and Children

Component Normal Children

Normal Newborn

Bacterial Meningitis

Viral Meningitis

WBC (cells/mm3)

0-6 0-30 100 to 10,000 20-500

Neutrophils 0 2 3 >80 < 50Neutrophils (%)

0 2-3 >80 < 50

Glucose ( /dL)

40-80 32-121 <40 >50(mg/dL) 0.6

CSF:serum<0.4

CSF:serumProtein 20-30 19-149 >50 50-100 (mg/dL)Erythrocytes/mcL

0-2 0-2 0 0-2

Viral CultureBecause viruses require cellularBecause viruses require cellular

machinery for replication, living systems must be usedmust be used. Isolation of viruses on tissue culture from CSF blood or urine is the gold standardCSF, blood or urine is the gold standard for diagnosing many viral pathogens causing meningitiscaus g e g t s

Viral CultureViral CultureAdvantages:

is an amplification method that increases the amount of the pathogen facilitatingamount of the pathogen, facilitatingdetection and characterization.

provides an isolate of viable virus that and can be stored for future studies.

Viral CultureDisadvantages:

i l di i t f i li d f iliti d

Viral Culture

including requirement for specialized facilities and expertise, expense, relatively prolonged time to detection and the relatively limited range of virusesdetection, and the relatively limited range of viruses that can be detected.Viral culture requires more attention to conditionsViral culture requires more attention to conditions of transport than specimens submitted for detection of viral antigens or nucleic acids, because the viability of the virus must be preserved.

I f dInfectedmonkey cellsmonkey cells

Non‐infectedk llmonkey cells

Syncytium and CPESyncytium and CPE

IF Test

Serologic Assays g y

C b i l Fl id S lCerebrospinal Fluid Serology:Serologic testing can be applied to CSF for the diagnosis of central nervous system (CNS) infection.

Serologic Assays g y

Cerebrospinal Fluid Serology:Cerebrospinal Fluid Serology:For the diagnosis of encephalitis caused by the

l h i b i fl i ialphaviruses, bunyaviruses, or flaviviruses, the presence of virus-specific antibodies in CSF i hi hl i i d th fCSF is highly suspicious and the presence of virus-specific IgM antibodies in CSF is di tidiagnostic.

C b i l Fl id S lCerebrospinal Fluid Serology

common viruses (e.g., herpesviruses) or respiratory viruses, the mere presence of virus-p y , pspecific antibodies in CSF is not diagnostic of CNS infection because antibodies produced in pthe blood are present in the CSF even in the absence of CNS infection.

Cerebrospinal Fluid Serologyp gy

Intrathecal synthesis of a specific antiviral antibody isIntrathecal synthesis of a specific antiviral antibody is evaluated by determining the quotient of two ratios:the ratio of specific antiviral antibody level in CSF tothe ratio of specific antiviral antibody level in CSF to the level in serum, the ratio of total IgG in CSF to total IgG in serumthe ratio of total IgG in CSF to total IgG in serumA quotient greater than 1.5 is evidence of intrathecalantibody synthesis of the specific antibody.antibody synthesis of the specific antibody.

Polymerase Chain Reaction

Multiplex PCRMultiplex PCR

I lti l PCR th t tIn multiplex PCR more than one target sequence can be amplified by including more than one pair of primers in the reactionof primers in the reaction.Design Primers Separately

Real-time PCRReal time PCR

advantagesadvantagesThe chance for contamination decreased, cause the systems are closed.yRapid cycling times (1 hour).Of great importance, quantitation of PCROf great importance, quantitation of PCR targets.Very sensitive Ve y se s ve

DNA-binding

agents

(SYBR Green )(SYBR Green )

Hydrolysis

probesprobes

(TaqMan)

Fluorescence MonitoringFluorescence Monitoring

Plateau:Qualitative end point read

Exponential:

end‐point read

Exponential:Quantitative real‐time read

125

Diagnostic assays for central nervous system viral infectionsviral infections

١٢٦

EnterovirusesEnteroviruses

Comparison of RT‐PCR vs Viral CultureComparison of RT PCR vs. Viral Culture59 inpatient CSF samples tested 

Result RT-PCR Culture

Pos 37 22

Neg 22 37

Sensitivity of CSF viral culture = 60%Culture time to detection = 3 – 5 daysRT‐PCR time to detection = 3 – 4 hours

127

Rapid diagnosis of viral meningitis by PCRRapid diagnosis of viral meningitis by PCR impacts clinical management:

Earlier hospital dischargeFewer additional diagnostic testsgDecreased antibiotic usageDecreased overall health care costs