UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

Facultad de Ingeniera Ambiental

LABORATORIO N5

Tema:Accin Bacteriosttica Selectiva del Cristal Violeta y Accin Oligodinmica de Metales PesadosCurso: Microbiologa Sanitaria IProfesor: Jorge Gilberto Tello CebrerosAlumno: Vaca Vasquez, Jhonatan

Accin Bacteriosttica Selectiva del Cristal Violeta y Accin Oligodinmica de Metales Pesados

I. OBJETIVOS:

Conocer la accin bacteriosttica en el crecimiento del Escherichia coli y Bacillus subtilis en muestras preparadas con diferentes concentraciones de cristal violeta. Comprobar la propiedad, de accin oligodinmica, que ejercen sobre las bacterias los metales pesados. Determinar y clasificar mediante coloracin de bacterias el tipo de bacteria, en los cultivos, cultivados con inhibidor. Observar y comprender las diferentes zonas que se generan alrededor del metal.

II. FUNDAMENTO TERICO:Las condiciones de salud en una nacin estn determinadas, en gran parte, por la capacidad de sus habitantes para controlar eficazmente los problemas microbianos. La costumbre diaria de purificar el agua, pasteurizar la leche o la conservacin de alimentos, son mtodos para controlar las poblaciones microbianas. Los microorganismos son tambin capaces de destruir materiales valiosos como madera y fibras textiles, causando prdidas que necesitan evitarse con medidas eficaces.

1.- IMPORTANCIA DEL CONTROL MICROBIANO Las razones principales se resumen as:1. Prevenir la trasmisin de infecciones y enfermedades 2. Prevenir la contaminacin y la proliferacin de microorganismos perjudiciales.3. Prevenir el deterioro o destruccin de materiales por microorganismos.Los microorganismos se eliminan, inhiben o matan por medio de agentes fsicos, procedimientos fsicos o agentes qumicos. 1.1.- Control por agentes fsicosLos microorganismos son capaces de sobrevivir y desarrollarse en medio de condiciones fsicas adversas. Sin embargo, hay ciertas condiciones limitantes y especficas que los microorganismos pueden tolerar para sobrevivir. Bajo circunstancias naturales las fluctuaciones de las condiciones del ambiente tienen efectos inhibidores e incluso letales en cierta porcin de la flora microbiana. Todos los microorganismos se desarrollan en varios tipos de temperatura desde las muy bajas hasta las muy altas; todos los microorganismos tienen su ptima temperatura, mnima y mxima de desarrollo. Las radiaciones electromagnticas en especial las ultravioletas tienen gran poder potencial para reducir la flora microbiana del aire por medio de lmparas que emiten radiaciones en la regin de 250- 260 nm en lo que es la zona bacteriana ms efectiva, pero solo es efectiva al tener contacto directo con las partculas que transportan los microorganismos, la aplicacin prctica de los rayos ultravioletas para sanear el ambiente se puede hacer de tres maneras:

La radiacin directa es permisible en cuartos que estn desocupados u ocupados durante cortos lapsos, claro que debidamente protegidos en este ltimo caso. Estn incluidos las salas aspticas, los cuartos estriles.

Radiacin indirecta en los cuartos ocupados; los ocupantes debern ser protegidos de las radiaciones. Estos lugares estn incluyen salones de escuela, oficinas y enfermeras de hospitales.

Algunas veces el aire se trata aparte o espacio al que se deber entrar como en los sistemas de ventilacin, en los cuales las lmparas ultravioletas se instalan en los conductos.

Otros agentes fsicos en el control de microorganismos son la electricidad, la tencin superficial, los filtros bacteriolgicos entre otros.

1.2.- Control por agentes qumicosGran nmero de compuestos qumicos en concentraciones apropiadas son capaces de matar o inhibir los microorganismos. Estos productos tienen muchas aplicaciones, algunos son usados para sencillos lavados bucales y otros para descontaminar un vehculo espacial. Debido a las grandes variaciones en el ambiente y a la magnitud y diversidad de organismos, no es posible prescribir un solo agente para eliminar o reducir la flora microbiana, por ello es importante conocer las sustancias qumicas con que contamos para cada propsito, sus caractersticas y eficacia como agentes antimicrobianos.

Caractersticas del desinfectante ideal:Ningn agente qumico antimicrobiano solo es el mejor o ideal para uno o todos los propsitos. Estos agentes microbianos deben reunir una serie de caractersticas:1. Actividad antimicrobiana: la sustancia qumica a baja concentracin deber tener un amplio espectro de actividad microbiana.2. Solubilidad: la sustancia deber ser soluble en agua y otros disolventes.3. Estabilidad: los cambios de estabilidad debern ser mnimos en la sustancia y no afectar la condicin germicida.4. No deber ser toxica al hombre u otros animales: la sustancia deber ser letal para los microorganismos y no para el hombre u otros animales.5. Homogeneidad: la preparacin deber ser uniforme en su composicin de manear que los ingredientes activos se encuentren en cada aplicacin.6. No deber reaccionar con material orgnicos extrao: cuando se usan estos desinfectantes en situaciones en las que adems de bacterias hay cantidades considerables de material orgnico, muy poco, si no es que nada del desinfectante, estar disponible para actuar contra los microorganismos.7. Toxicidad para los microorganismos a la temperatura ambiente y a la del cuerpo: para usar el compuesto, no ser necesario elevar la temperatura de la existente en el ambiente donde se usara.8. Capacidad de penetracin: a menos que la sustancia pueda penetrar a travs de las superficies, su accin germicida se limitara al sitio de aplicacin.9. No deber corroer ni teir: no deber producir rin u otras alteraciones en los metales o teir o daar las telas.10. Propiedad desodorante: lo ideal es que el desinfectante por s mismo tenga olor agradable o sea inodoro.11. Capacidad detergente: un desinfectante que a la vez sea detergente (agente limpiador) lograra dos objetivos pues la accin limpiadora aumentara la desinfeccin.12. Disponibilidad: el compuesto deber estar disponible en grandes cantidades y a precio razonables.

Seleccin de agentes qumicos antimicrobianos:Generalmente los factores que se deben considerar en la seleccin de agentes qumicos microbianos son:1. Naturaleza del material que ser tratado: La sustancia seleccionada deber ser compatible con el material sobre el que se aplicara.2. Tipos de microorganismos: Los agentes qumicos no son igualmente eficaz contra las bacterias, hongos, virus y oros microorganismos. Por lo tanto, debemos estar seguros que el agente seleccionado sea eficaz contra el tipo de microorganismo que queremos destruir.3. Condiciones ambientales: Los factores como temperatura, pH, tiempo, concentracin y presencia de material orgnico extrao, nos orienta a evaluar la eficacia de la destruccin microbiana. Para usar un agente antimicrobiano con xito se requiere saber la influencia que este ejercen estas condiciones sobre un agente en particular, de manera que pueda ser empleado en las circunstancias ms favorables.

Principales grupos de agentes qumicos microbianosSe han agrupado bajo los siguientes ttulos: Fenol y compuestos fenlicos. Alcoholes. Halgenos. Metales pesados y sus compuestos. Colorantes. Detergentes. Compuesto de amonio cuaternario. cidos y lcalis. Glutaraldehido. Quimio estabilizadores gaseosos (oxido de etilo, beta- propiolactona, formol).Para nuestro propsito, solo hablaremos de dos grupos de agentes qumicos antimicrobianos.

2.- METALES PESADOS Y SUS COMPUESTOS:La mayora de metales pesados, ya sean solos o en ciertos compuestos, causan dao a los microorganismos. Los ms efectivos son el mercurio, plata cobre.

Metales pesados (accin oligodinmica)La accin oligodinmica es la propiedad que tienen ciertos metales en cantidades sumamente pequeas, en particular la plata, de ejercer efectos letales sobre las bacterias; el trmino proviene de dos palabras griegas oligos, que significa pequeo, poco y dynamis, que significa, fuerza, poder.

Este fenmeno se demuestra fcilmente en el laboratorio poniendo un pedazo de metal limpio (plata o cobre) sobre una placa de cultivo. Despus de la incubacin, se ver una zona de inhibicin (sin desarrollo) rodeando al metal.La cantidad de metal involucrada en el efecto inhibidor se puede expresar en partes por milln.

Compuestos de metales pesadosMuchos compuestos de metales pesados son tiles como germicidas o agentes antispticos. Los compuestos de metales pesados que ms descuellan son los de mercurio, plata y cobre. Los metales pesados y sus compuestos actan contra los microbios al combinarse con las protenas celulares y desnaturalizarlas. En el caso del cloruro de mercurio la inhibicin es directamente sobre las enzimas que contienen grupos sulfhidrilos.Mecanismo de desinfeccin mediante ionizacin cobre- plataLos iones cargados positivamente (Cu2+) en el agua intentan buscar partculas con polaridad opuesta, como bacterias, virus y hongos. Los iones de cobre cargados positivamente forman compuestos electrostticos con clulas de microorganismos que estn cargados positivamente. Esto produce dao o interrupcin en la permeabilidad de la pared celular y por lo tanto evita la toma de nutrientes. Los iones de cobre penetran en la pared celular creando la entrada de iones de plata (Ag+). Estos penetran en el ncleo de los microorganismos, unindose a varias partes de la clula como el ADN y el ARN, protenas y encimas respiratorias impidiendo el funcionamiento normal de estos sistemas celulares. Como resultado no hay ms crecimiento celular o divisin celular, impidiendo la multiplicacin y desarrollo de los microorganismos y provocando su muerte. Los iones se mantienen activos hasta que son absorbidos por un microorganismo.

Propiedades antimicrobianas de la plataLa plata es un antimicrobiano de amplio espectro capaz de destruir bacterias, hongos, virus y protozoos.Neveras, pequeos electrodomsticos, mquinas de hielo, filtros de agua, envases alimentarios y papel para almacenamiento de alimentos, tablas de cortar, cuchillos e incluso una corteza plstica de queso, productos de limpieza, interruptores de luz, teclados de ordenador y mviles, ropa futurista y zapatos, sistemas de aire acondicionado, vidrio y materiales de construccin, tuberas y grifos, apsitos y material hospitalario. Todos estos productos tienen en comn la utilizacin de los iones de plata como sistema de tratamiento antimicrobiano.

Aunque pueda parecer un descubrimiento tecnolgico de lo ms innovador, lo cierto es que la plata se ha venido usando con fines protectores contra las infecciones desde hace miles de aos. Las civilizaciones ms antiguas como los egipcios o los fenicios ya construan las cisternas de almacenamiento de agua con plata para reducir las enfermedades causadas por el consumo de aguas contaminadas o para mantenerla en buenas condiciones durante sus largas travesas en barco. Los emperadores chinos utilizaban cubiertos de plata, igual que ms tarde lo hicieron las familias acomodadas europeas, como medida preventiva de las plagas. En el ao 1000 el Vaticano decret el uso de clices de plata para la comunin con el propsito de reducir las frecuentes indisposiciones entre sus sacerdotes y feligreses. Las referencias a la plata como protectora contra las infecciones son continuas a lo largo de la historia, aunque no fue hasta 1893 cuando Karl Wilhelm von Nageli, botnico suizo, hizo pblica la primera investigacin demostrando las caractersticas antimicrobianas de la plata. Es el caso de la introduccin de monedas de plata en los tanques de agua o leche para evitar su deterioro, as como su temprana utilizacin en la medicina: limaduras de plata para curar heridas, ungentos antibiticos y para quemaduras, gotitas en los ojos de los recin nacidos, amalgama dental, incluso la NASA utiliz iones de plata para proteger el agua durante los viajes espaciales.

Iones de plataLos antimicrobianos son sustancias naturales o sintticas, orgnicas o inorgnicas, que inhiben el crecimiento de los microorganismos (bacterias y hongos y levaduras, virus, protozoos). Su eficacia depende de parmetros como su concentracin, tipo de microorganismo y de sustrato adems de temperatura, pH, humedad y niveles de oxgeno. Para ser eficaces, los iones de plata deben interaccionar con el microorganismo y penetrar en l. La plata se introduce en el interior de la clula a travs de unos transportadores de metales presentes en su membrana compitiendo con ellos por los lugares de captacin. Los iones de plata actan interfiriendo en la permeabilidad gaseosa de la membrana (respiracin celular) y una vez en el interior de la clula, alteran su sistema enzimtico, inhibiendo su metabolismo y produccin de energa y modificando su material gentico. El resultado es que el microorganismo pierde rpidamente toda capacidad de crecer y reproducirse. De esta manera se evita el desarrollo de microorganismos patgenos como 'Salmonella', 'Legionella', 'Escherichia coli' y 'Staphylococcus aureus', entre otros.

Aplicacin En las aplicaciones y productos ms propensos al desarrollo microbiano, la incorporacin de agentes antimicrobianos como los iones de plata en el material matriz del producto o en el recubrimiento del mismo para inhibir la proliferacin de microbios supone una eficaz medida de precaucin complementaria a la limpieza peridica con desinfectantes qumicos. En el mbito alimentario, el tratamiento por iones de plata se est aplicando actualmente a neveras domsticas, mquinas de hielo, papeles y envases alimentarios, tablas y cuchillos, superficies, cintas transportadoras y maquinaria de la industria agroalimentaria, jabones lquidos para el lavado de manos a base de xido de plata, productos de limpieza profesional junto con el agua oxigenada.Todas estas aplicaciones estn relacionadas con los alimentos, e impiden que los microorganismos crezcan y se desarrollen, por lo que son un factor ms para tener en cuenta en el cada da ms exigente campo de la seguridad alimentaria.

MONEDA DE DIEZ CENTIMOSSon acuadas en latn, aleacin de cobre y zinc, de color amarillo.Zona de estimulacin: presenta un crecimiento abundante, hay cantidades abundantes de iones txicos.

Crecimiento normal

Zona despejadaZona oligodinmica

Colorantes: Hay dos clases de compuestos colorantes que tienen especial inters como agentes antimicrobianos y son los colorantes del trifenilmetano y algunos derivados de acridina.

Colorantes de trifenilmetanosEn esta categora se incluyen el verde de malaquita, el verde brillante y el cristal violeta. Como regla general, los microorganismos gram positivos son ms susceptibles a estos compuestos que los gram negativos. El cristal violeta inhibe cocos gram positivos a diluciones de 1:200 000 a 1:300000; se necesita diez veces esta concentracin para inhibir a Escherichia coli. El verde de malaquita inhibe a Staphylococcus aureus a concentraciones de 1:1000000; mientras que se necesitan concentraciones de 1:30000 para inhibir a E. Coli.

No obstante, esta correlacin general entre ala reaccin la gram y la susceptibilidad a los colorantes tiene gran nmero de aplicaciones prcticas. Se preparan medios selectivos a concentraciones bajas (alrededor de 1:100000) con colorantes con el cristal violeta, el verde brillante y el verde de malaquita; en este medio de cultivo solo crecern bacterias gram negativas. En este mtodo se utiliza la susceptibilidad a los colorantes para la identificacin de bacterias. Una concentracin de 1:10000 es letal para amonila y torula, pero es inhibidora en concentracin de 1:1000000.

ACCIONES DEL CRISTAL VIOLETA SOBRE LOS MICROORGANISMOS Interfieren en la sntesis de la pared celular. Bloquean la conversin del acido UDP- acetilmurmico en UDP-acetilmuramil- pptido. Inhiben las bacterias Gram positivas. El modo de accin no est claro pero se cree que intervienen en los procesos de oxidacin celular. Actualmente son de uso limitado. Antes usado como antisptico. Ahora principalmente como antifngico. Uso antisptico en animales. Verde de malaquita para peces en acuarios (txico para humanos).III. PROCEDIMIENTO:

Accin Bacteriosttica Selectiva del Cristal Violeta1. Mantener 4 tubos con agar nutritivo fundido en el bao mara a 45C.2. Transferir 1 ml de la solucin acuosa de cristal violeta de 1:1000 a uno de los tubos con 9 ml de agua. Esto da una dilucin de 1:10 000.3. Usando la misma pipeta, transferir 1 ml. de la dilucin 1:10 000 a una placa Petri y 1 ml al segundo tubo con 9 ml de agua. Esto da una dilucin de 1:100 000.4. Transferir 1 ml de la dilucin 1:100 000 a una placa de Petri y 1 ml a un tercer tubo con 9 ml de agua. Esto da una dilucin de 1:1 000 0005. Transferir 1 ml de la dilucin de 1:1 000 000 a una placa Petri.6. Verter el agar fundido en las tres placas Petri y mezclar bien el colorante con el agar rotando suavemente la placa, para obtener una distribucin uniforme del colorante.7. Verter el contenido del ltimo tubo de agar en la placa de Petri sin colorante para que sirva de control.8. Cuando ha solidificado el agar, invertir las placas y dividir cada una en dos partes iguales marcando la muestra A y B para diferenciar las colonias ha inocular.9. Rayar en estras cada mitad de las placas Petri con una colonia extrada del inoculador de una respectiva muestra. 10. Proceder de igual forma con las dems placas Petri.11. Invertir las placas e incubarlas a 37C por 48 horas.

Accin Oligodinmica de Metales Pesados1. Sumergir la moneda en una solucin al 10% de cido Ntrico.2. Lavar la moneda con agua destilada, con una pinza.3. Colocar la moneda en el centro de una placa petri.4. Inocular una o dos gotas de cultivo A en un tubo con agar nutritivo.5. Rotar el tubo para obtener una distribucin uniforme.6. Verter el agar inoculado dentro de la placa petri que contiene la moneda.7. Dejar que solidifique.8. Inocular la placa a 37C por 48 hr.

IV. RESULTADOS:CRECIMIENTO BACTERIANO

GRUPO N01GRUPO N02GRUPO N03GRUPO N04GRUPO N05

DilucionesCultivo ACultivo BCultivo ACultivo BCultivo ACultivo BCultivo ACultivo BCultivo ACultivo B

1 : 10,000++++++++

1 : 100,000++++++++++

1: 1'000,000++++++++++

Sin colorante++--

(+) Hay Crecimiento (-) No hay CrecimientoAccin bacteriosttica del cristal violeta.ColoranteConcentracinEscherichia ColiBacillus Subtilis

Gram NegativaGram Positiva

CRISTAL1 : 10,000-+

1 : 100,000-+

VIOLETA1: 1'000,000-+

Sin colorante

COLORACION GRAM

COLONIA ACOLONIA B

GRUPO N01Gram (+) Estreptobacilos Gram (+) Estreptobacilos

GRUPO N02Gram (+)EstafilococosGram (+) Cocos

GRUPO N03Gram (+)EstafilococosGram (+) Estreptococos

GRUPO N04Gram (-) EstafilococosGram (+) Cocobacilos

GRUPO N05Gram (-) CocosGram (-) Estreptococos

Accin Oligodinmica de Metales Pesados.OligodinmicaEstimulacinCrecimiento

Grupo 1NoNoPoco

Grupo 2SiSiNo

Grupo 3NoNoSi

Grupo 4Si (poco)SiSi

Grupo 5SiSiNo inocularon

Grupo 1 Grupo 2

Grupo 3 Grupo 4

Grupo 5

V. DISCUSIN:

Los resultados de la coloracin Gram no fueron los esperados, esto debido a muchos factores, como la mala manipulacin de los materiales durante el experimento.

Los resultados de los grupos N2 y N3 para coloracin GRAM fueron errneos.

Se debi hacer de nuevo el experimento para obtener los resultados correctos.

Se supone que si la moneda es ms antigua, entonces debera tener mayor concentracin.

Lo ms importante para accin oligodinmica es rotar bien el tubo para una mejor distribucin.

VI. CONCLUSIONES:

En una mala distribucin en las placas del agar no se puede observar bien el experimento.

De la observacin en las placas, el cristal violeta inhibe el crecimiento de las bacterias Gram (+) en mayor proporcin que las Gram (-).

Se nota en las placas que mayor dilucin el efecto bacteriosttico del cristal violeta sobre las bacterias Gram (+) disminuye.

De la observacin de la accin Oligodinmica de los metales pesados se puede afirmar que el metal usado (moneda de zinc) inhibe el crecimiento de microorganismos en sus alrededores.

VII. RECOMENDACIONES:

Realizar un correcto rapado sobre el agar para la formacin de colonias en este.

Esterilizar el inoculador antes de extraer la colonia de la muestra y despus de inocularla.

Realizar rpido la maniobra enfriamiento de los tubos con agar y vertimiento del agar en las placas para as evitar que se solidifique en los tubos.

Hay que tener cuidado en el manejo del cido ntrico, para la limpieza de la moneda, tratando de no tener contacto directo y utilizar pinzas para manipular la moneda con el cido.

VIII. CUESTIONARIO:

1. Qu es un agente bacteriosttico y qu quiere decir una accin bacteriosttica selectiva? Indique algunas aplicaciones prcticas de este fenmeno.Agente bacteriosttico:La accin bacteriosttica se fundamenta en la inhibicin del desarrollo microbiano mediante el bloqueo de diferentes factores de reproduccin. No las mata directamente, pues una poblacin de bacterias sin capacidad de reproduccin o con capacidad disminuida para la misma es una poblacin condenada a su desaparicin. En cambio un agente bactericida es aquel capaz de matar a las bacterias.

Accin bacteriosttica selectiva:Es aquel efecto que slo inhibe el crecimiento o reproduccin de cierto grupo de microorganismos, mientras que no afecta o afecta en menos proporcin a otro grupo de microorganismos. Es por ello que se agregan a medios de cultivos agentes bacteriostticos para que stos tengan carcter selectivo. Aplicaciones:

El NaOH se utiliza en la industria del vino para limpiar las cubas de madera.

El ozono es utilizado desde antes para tratamiento de agua, ahora se ha extendido su utilizacin y se aplica para tratar ambientes e incluso podemos tratar directamente sobre el organismo con fines teraputicos (concentraciones de 0.01 ppm a menos).

Los antibiticos son usados para preservar los alimentos, as tenemos las tetraciclinas.

Agentes bacteriostticos se utilizan en la industria textil como proteccin de materiales. En la industria del maquillaje para las cremas, lociones para despus de afeitar, en perfumes.

2. A qu se debe la accin oligodinmica y qu aplicaciones puede tener?Ciertos metales pesados o sus combinaciones qumicas ejercen efecto antimicrobiano a concentraciones muy bajas (1 parte en 20 millones), esta accin recibe el nombre de accin oligodinmica; los ms activos son el mercurio, la plata y el cobre. Los mercuriales poseen propiedad antisptica y desinfectante. Su actividad antibacteriana se reduce fuertemente en presencia de suero y de protenas tisulares. Los organomercuriales son menos txicos y custicos que las sales inorgnicas.

Aplicaciones:

Se estn haciendo estudios sobre un cepillo de dientes con una parte del cepillo que presenta un portacerdas y unas cerdas es el mismo, con la particularidad de que la parte del cepillo est provista de componentes a base de un material de accin oligodinmica (capa plateada).

El nitrato de plata en solucin 1% es utilizado para prevenir infecciones gonoccicas.

Sulfato de cobre, zinc son fungicidas.IX. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

MICROBIOLOGIA. Autor: Michael J Pelczar. 2da Edicin 1982.

http://www.elergonomista.com/microbiologia/esteri.htm

http://bc.inter.edu/facultad/yserrano/factoresfisicosqui.htm

http://microral.wikispaces.com/7.+Control+de+los+microorganismos.

Biologa de los microorganismos, Brock (EFECTO DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS SOBRE EL CRECIMIENTO)

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/19_micro.html

http://enfermerograleducastillo.blogspot.com/2011/09/bactericida-y-bacteriostatico.html

http://www.bcrp.gob.pe/docs/Proyeccion-Institucional/Museo/Museo-Numismatico-del-Peru.pdf

Propiedades antimicrobianas de algunos metales (PDF), International Copper Association Latin America.

X. ANEXOS:

CocoBacilosLa palabraCocobacilose refiere a microorganismos que combinan: forma debacilo(bastn), y forma decoco(esfrica).Dos ejemplos son lasbacteriasHaemophilus influenzaeyChlamydia trachomatis.

Los cocobacilos estn relacionados con la zona vaginal.