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LA 1 Screening Reagent / LA 2 Conrmation ReagentLA 1 [REAGENT] / LA 2 [REAGENT]Simplied Dilute Russell’s Viper Venom Test (DRVVT) for detection of LupusAnticoagulants

Intended UseLA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent are simplied DRVVT reagents for detec-tion of Lupus Anticoagulants (LA) in one-stage clotting tests.

LA 1 Screening ReagentSimplied DRVV reagent to screen for the presence of Lupus Anticoagulants.

LA 2 Conrmation ReagentPhospholipid-rich DRVV reagent for the specic correction of Lupus Anticoagulants.

Summary and ExplanationLAs are autoantibodies against negatively charged phospholipids or complexes of phospholipidswith either beta-2-glycoprotein 1 or clotting factors such as prothrombin. They occur in variousclinical conditions, especially autoimmune diseases1 and are now considered to be a signicantrisk factor in patients with otherwise unexplained thrombosis and are often present in women whohave recurrent fetal loss5. LA have traditionally been detected using phospholipid responsive clot-ting tests, such as the activated partial thromboplastin time (APTT), kaolin clotting time (KCT) andDRVVT2 where they have an anticoagulant effect.The DRVV time rst became popular following the publication by Thiagarajan et al. in 19866. Thismethod has been standardized and simplied7. According to Petri8 et al., thrombosis in SLE patientsis more closely linked with LA detectable by DRVVT than with anticardiolipin antibodies detectedby enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) 5. This observation was recently extended byGalli and Bevers9  who showed that the LA subtype with most effect on DRVVT tests is beta-2-glycoprotein 1 dependent and different to the prothrombin-requiring LA subtype having moreprolonging effect on KCT tests.

Test Principle1. Russell’s viper venom present in LA 1 Screening Reagent initiate plasma clotting by directlyactivating factor X. LA antibodies prolong the LA 1 Screening Reagent clotting time.

2. LA 2 Conrmation Reagent is similar to LA 1 Screening Reagent but contains a high phospholi-pid concentration. The extra phospholipid counteracts the LA antibody and largely corrects theclot time3.

3. DRVV test ”bypass” factor VII of the extrinsic pathway and the contact and antihemophilic fac-tors of the intrinsic pathway. Therefore LA 1 Screening Reagent is more specic for LA thanAPTTs as they are not affected by contact factor abnormalities or by factor VIII deciencies orantibodies6. There have been a number of tests developed based on phospholipid correction4 however none have been as convenient to use as LA 2 Conrmation Reagent subsequent to LA 1Screening Reagent.

4. Mixing tests may be useful to exclude factor II, V and X deciencies, which may prolong LA 1Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent results. Mixing normal plasma with testplasma replenishes any factors decient in the test plasma. If the mixing test is still prolonged,it indicates that an inhibitor (such as LA) is present in the test plasma. A circulating inhibitoris usually indicated by a prolonged clotting time result that is not corrected by mixing patientplasma with normal plasma3,10.

ReagentCompositionLA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent contain Russell’s viper venom, phospholi-pids, antiheparin agents, calcium, buffers, stabilizers, sodium azide and dyes.

Warnings and precautions

Forin-vitro

diagnostic use only.When disposing of azide, always ush with large volumes of water to avoid the possibility of anexplosive residue forming in metal plumbing.

Preparation for useReconstitute with the volume of distilled water stated on the vial. Mix well by inversion to ensurecomplete re-suspension of the lyophilized material.

Storage instructionsThe lyophilized reagents are stable at least until the expiry date stated on the vial label when storedat +2 to +8 °C.Following reconstitution reagents can be stored for 8 hours at +37 °C, 24 hours at +20 to +25 °C,48 hrs at +2 to +8 °C and 1 month at -20 °C.

Indications of instability / deteriorationIf there is no evidence of vacuum when the v ial is opened and/or the reagent does not appear dryit should be returned to Siemens Healthcare Diagnostics.

Specimen Collection and PreparationCollect and process blood in accordance with NCCLS Standard H21-A3: Collection, Transport andProcessing of Blood Specimens for Coagulation Testing and General Performance of CoagulationAssays; Approved Guideline - 3rd Edition (1998). Separated plasma should be stored at +2 to +8 °Cand tested within 4 hours of collection.If the samples are to be frozen before testing, the plasma must double spun to remove platelets(to below 10 x 109 /L)10  prior to freezing as these can shorten the LA 1 Screening Reagent clottingtime.

Test Procedure1. Pre-warm a slight excess of LA 1 Screening Reagent or LA 2 Conrmation Reagent at 37 ± 1 °C

in a reagent reservoir, allowing for 200 µL per test.2. Dispense 200 µL of test plasma into a glass test tube and warm for 1 minute at +37 °C.3. Add 200 µL of pre-warmed reagent to the plasma and time from the moment of reagent addition

to a clotting end point.4. Repeat for duplicate test values and report the average of these as the result.Automated methodProtocols for Siemens analyzers are available on request.LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should be carried out using equalvolumes of test plasma and reagent as in most thrombin time protocols. However, observation oracquisition times should be extended to 120 seconds.Materials provided

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP with

10 xl 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Screening Reagent

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR with

10 xl 1 mL LA 2 [REAGENT], LA 2 Conrmation Reagent

Materials required but not provided

10 mm x 75 mm glass test tubesPipette to deliver 200 µL, 1 mL, 2 mL or 5 mLWater bath, stop watch

Puried water, USP or equivalentLA Control High ([REF] OQWD)

LA Control Low ([REF] OQWE)

Quality Control

Each laboratory should determine its own acceptable control values and normal range.

LA Control High ([REF] OQWD) and LA Control Low ([REF] OQWE) are distributed by Siemens foruse in quality control of LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent assays. Qualitycontrol plasma must be tested at the same time as patient samples.

ResultsIf the LA 1 Screening Reagent clotting time is within the normal range, no further testing for LAmay be necessary. If the LA 1 Screening Reagent clotting time result is more than 2 SD longerthan the mean of normal plasma (ideally n ≥ 20), the result should be considered abnormal andinvestigated further. (See gure 1)The nal result is best expressed as a ratio of the clotting times of LA 1 Screening Reagent dividedby LA 2 Conrmation Reagent.  LA 1 Screening Reagent clotting timeLA Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––––

 LA 2 Conrmation Reagent clotting time

Figure 1

1

Mixing testsIf results are borderline, mixing studies may be used to correct for hidden defects in the sampleand clarify the presence of LA. These tests should be carried out on a 50:50 mixture of test plasmaand normal plasma (Siemens Control Plasma N should not be used for mixing studies) using thestandard test procedure.

TABLE 1: Combination of mixing and conrmatory tests

LA 1 LA 2 Diagnosis

Patient Plasma Mix-Patient + Normal

Patient Plasma Mix-Patient + Normal

N N N N LA not detected

ABN ABN N N LA present

ABN N ABN N Factor decient/OAT

ABN ABN ABN N LA + Factor decient

ABN ABN ABN ABN Other inhibitor

Calculating a normalized ratio may be useful to correct for differences in instrument/reagent com-binations. Normalization uses the mean clot times of normal plasma tested with LA 1 ScreeningReagent and LA 2 Conrmation Reagent in the users own laboratory. This may improve discrimina-tion between normal and low positive LA samples.

  patient LA 1 Screening Reagent mean normal LA 2 Conrmation ReagentNormalized Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––– x ––––––––––––––––––––––––––––––––– 

mean normal LA 1 Screening Reagent patient LA 2 Conrmation Reagent

The ow chart in gure 1 can also be used to interpret normalized ratios.

Limitations of the ProcedureSamples containing clots and those with abnormal hematocrits should be discarded. Jaundiced,lipemic and hemolysed specimens should be tested by manual techniques as some photo-electricinstruments give false results.Commercially available normal quality control plasmas with unspecied levels of citrate and plate -lets are not recommended for use in mixing studies.For comparative studies LA 1 Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent tests should beperformed at the same time.At least 2 screening tests based on different assay principles should be performed. Additionally amixing study for the verication of the presence of a coagulation inhibitor and a conrmation test forthe documentation of phospholipid dependency should be performed10.Heparin levels up to 1 unit/mL have no effect due to the presence of a neutralizing agent in both LA 1Screening Reagent and LA 2 Conrmation Reagent.Results of this test should always be interpreted in conjunction with the patient’s medical history,clinical presentation and other ndings.

Expected ValuesNormal ranges for LA 1 Screening Reagent of 31 - 44 seconds and for LA 2 Conrmation Reagentof 30 - 38 seconds were obtained using a manual tilt-tube method with samples coll ected from 26healthy individuals aged 18 to 55 years. The ratio of LA 1 / LA 2 was in the range 0.8 - 1.2. Theseresults should be used as a guide only.  LA 1 ScreeningIf ratio ––––––––––––– is greater than 2.0, LA is strongly present,  LA 2 Conrm

  LA 1 ScreeningIf ratio ––––––––––––– is between 1.5 and 2.0, LA is moderately present,  LA 2 Conrm

  LA 1 ScreeningIf ratio ––––––––––––– is between 1.2 and 1.5, LA is weakly present,  LA 2 Conrm

Each laboratory should determine its own normal range for both manual and automated methodsto overcome differences in sample collection and instrumentation.

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Specic Performance CharacteristicsIntra-laboratory and inter-laboratory precision studies were performed using both manual tilt-tubeand automated methods. These studies gave coefcient of variation less than 3.5 % on normalplasmas and less than 5 % for abnormal samples.Specicity Studies were performed on known plasma samples.A positive ratio for LA 1 Screening Reagent/LA 2 Conrmation Reagent of greater than 1.2 wasfound in known*:LA plasma- 90 % (26/29)Heparinized plasma- 12 % (1/8)OAT patient plasma- 0 % (0/7)Factor decient plasma- 0 % (0/5)Normal plasma- 2 % (1/60)

* N.B. “known” LA identication with APTT + KCT mixing studies.

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  5. Love PE, Santoro SA. Antiphospholipid antibodies: Anticardiolipin and the lupus anticoagulantin systemic lupus erythematosis (SLE) and in non-SLE disorders. Ann. Intern. Med. 1990, 112,682-698

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  9. Galli M., Finazzi G, Bevers EM, Barbui T. Kaolin clotting time and dilute Russel’s viper venomtime distinguish between prothrombin dependent and beta-2-glycoprotein 1 dependent an-tiphospholipid antibodies. Blood. 1995, 86, 617-623

10. Brandt JT, Triplett DA, Alving B, Scharrer I, Criteria for the Diagnosis of Lupus Anticoagulants:

An Update. Thromb. Haemostas. 1995, 74 (4), 1185-90

  Edition October 2008

Screening-Reagenz LA 1 /Bestätigungsreagenz LA 2LA 1 [REAGENT] /LA 2 [REAGENT]Vereinfachtes “Dilute Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, Schlangengiftaktivator)-Reagenz zum Nachweis von Lupus Anticoagulans

AnwendungsbereichScreening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sind vereinfachte DRVVT-Reagenzienzum Nachweis von Lupus Anticoagulans (LA) in einstugen Gerinnungstests.

Screening-Reagenz LA 1Vereinfachtes DRVV-Reagenz zum Screening auf Lupus Anticoagulans.

Bestätigungsreagenz LA 2Phospholipidreiches DRVV-Reagenz für die spezische Korrektur von Lupus Anticoagulans.

Diagnostische BedeutungBei Lupus Anticoagulans (LA) handelt es sich um Auto-Antikörper gegen negativ geladene Phos-pholipide oder Komplexe von Phospholipiden mit entweder Beta-2-Glykoprotein 1 oder Gerinnungs-faktoren wie Prothrombin. Sie treten bei verschiedenen klinischen Zuständen, insbesondere jedochbei Autoimmunerkrankungen auf1. Darüber hinaus wird LA heute als signikanter Risikofaktor fürPatienten mit anderweitig nicht zu erklärenden Thrombosen angesehen und ist häug bei Frauenmit wiederholten Fehlgeburten nachzuweisen5. LA wird üblicherweise mit phospholipid-empnd-lichen Gerinnungstests wie APTT (activated partial thromboplastin time), KCT (kaolin clotting time),und DRVVT2 nachgewiesen, bei denen es gerinnungshemmend wirkt.Die DRVV-Zeit begann sich nach der Publikation von Thiagarajan et al. im Jahre 1986 durchzuset-zen6. Diese Methode wurde vereinfacht und standardisiert7. Nach Petri8 et al. ist bei Thrombose-Patienten mit systemischem Lupus erythematodes die Wahrscheinlichkeit höher, LA mit DRVVTnachzuweisen mit einem Enzymimmunoassay (ELISA)5  für Antikardiolipin-Antikörper  . Diese

Beobachtung wurde kürzlich durch Galli und Bevers9

 erweitert, die gezeigt haben, dass der LA-Subtypus mit der größten Wirkung auf DRVVT-Tests auf Beta-2-Glykoprotein 1 angewiesen istund sich vom Prothrombin-abhängigen LA-Subtypus unterscheidet, der sich eher verlängernd aufKCT-Tests auswirkt.

Prinzip der Methode1. Das im Screening-Reagenz LA 1 enthaltene Gift der Russel Viper löst die Plasmagerinnung

durch direkte Aktivierung des Faktor X aus. Die LA-Antikörper verlängern die Gerinnungszeitdes Screening-Reagenz’ LA 1.

2. Das Bestätigungsreagenz LA 2 ähnelt dem Screening-Reagenz LA1, enthält aber eine höhereKonzentration an Phospholipiden. Diese zusätzlichen Phospholipide wirken dem LA-Antikörperentgegen und korrigieren so weitestgehend die Gerinnungszeit3.

3. Der DRVVT-Test umgeht Faktor VII des extrinsischen Systems der Blutgerinnung sowie dieKontakt- und antihämophilen Faktoren des intrinsischen Systems. Deshalb ist das Screening-Reagenz LA 1 für den spezischen Nachweis von LA besser geeignet als APTT-Tests, dennes wird weder durch Kontaktfaktor-Anomalien noch durch einen Faktor-VIII-Mangel oder An-tikörper beeinusst6. Es wurden eine Reihe von Tests auf Basis der Phospholipid-Korrektur4 entwickelt, es hat sich allerdings keiner als annähernd so geeignet erwiesen, wie der Einsatzdes Bestätigungs-Reagenz‘ LA 2 im Anschluss an das Screening-Reagenz LA 1.

4. Um einen Mangel an den Faktoren II, V und X auszuschließen, der das Testergebnis mit demScreening-Reagenz LA 1 und dem Bestätigungsreagenz LA 2 verlängern würde, können auchPlasmatauschversuche nützlich sein. Durch Mischen von normalem Plasma mit Testplasma wer-den die im Testplasma fehlenden Faktoren wieder zugeführt. Wenn der Plasmatauschversuchnoch immer zu verlängerten Testzeiten führt, ist dies ein Hinweis darauf, dass sich im Testplas -

ma ein Inhibitor (wie LA) bendet. Normalerweise weist eine verlängerte Gerinnungszeit, dieauch durch Mischen von Patientenplasma mit normalem Plasma nicht korrigiert wird, auf einenzirkulierenden Inhibitor hin3, 10.

ReagenzienZusammensetzungScreening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten das Gift der Russell Viper,Phospholipide, Antiheparin-Wirkstoffe, Calcium, Pufferlösung, Stabilisatoren, Natriumazid und Farb-stoffe.

Warnungen und VorsichtsmaßnahmenNur zur in-vitro  diagnostischen Anwendung.Bei Entsorgung ins Abwasser mit viel Wasser nachspülen, um die Bildung explosiver Stoffe inMetall-Abussrohren zu verhindern.

Vorbereitung der Reagenzien Den Inhalt des Fläschchens mit der auf dem Etikett angegebenen Menge destilliertem Wasserauösen. Den Inhalt durch Umschütteln sorgfältig mischen, um vollständige Resuspendierung deslyophilisierten Materials zu gewährleisten.

Haltbarkeit und Lagerungsbedingungen

Wenn die gefriergetrockneten Reagenzien bei +2 bis +8 °C aufbewahrt werden, sind sie mindes -tens bis zu dem auf dem Flaschenetikett aufgedruckten Datum haltbar.Nach Rekonstitution können die Reagenzien bei +37 °C 8 Stunden, bei +20 bis +25 °C 24 Stunden,bei +2 bis +8 °C 48 Stunden und bei -20 °C einen Monat lang gelagert werden.

Anzeichen für Instabilität und VerfallWenn beim Öffnen des Fläschchens keine deutlichen Anzeichen von Vakuum festzustellen sindund/oder wenn das Reagenz nicht trocken wirkt, sollte dieses an Siemens Healthcare Diagnostics zurückgesendet werden.

Probenabnahme und -vorbereitungDas Blut ist gemäß dem NCCLS-Standard H21-A3 über Abnahme, Transport und Verarbeitung vonBlutproben für Gerinnungstests und die Allgemeine Durchführung von Gerinnungsassays - aner-kannte Richtlinie - 3.Ausgabe (1998), abzunehmen und zu verarbeiten. Abgetrenntes Plasma ist bei+2 bis +8 °C zu lagern und innerhalb von 4 Stunden nach Entnahme zur Testung einzusetzen.Wenn die Proben vor der Austestung eingefroren werden sollen, muss das Plasma vor dem Einfrie-ren zweimal zentrifugiert werden, um Blutplättchen (auf weniger als 10 x 109 /l)10 zu entfernen, denndiese können sonst die Gerinnungszeit des Screening Reagenz‘ LA 1 verkürzen.

Testdurchführung1. In einem Reagenzglas, das mindestens 200 µl pro Test aufnehmen kann, etwas mehr als die

benötigte Menge Screening-Reagenz LA 1 und/oder Bestätigungsreagenz LA 2 bei +37 °C ± 1 °Cvorwärmen.

2. 200 µl Patientenplasma in ein Glasgefäß geben und 1 Minute bei +37 °C inkubieren.3. 200 µl vorgewärmtes Screening-Reagenz LA 1 oder Bestätigungsreagenz LA 2 zum Plasmageben und die Zeit von der Zugabe des Reagenzes bis zum Abschluss der Gerinnungsreaktionmessen.

4. Test für Doppelbestimmung wiederholen und Mittelwert der Testresultate bilden.

Automatisierte MethodeTestvorschriften für Siemens-Analysatoren stehen auf Anfrage zur Verfügung.Die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 sollten, wie auch in denmeisten Thrombin-Zeit-Protokollen, unter Verwendung gleicher Volumina an Testplasma und Rea-genz ausgeführt werden. Die Messwertaufnahme- bzw. Auswertezeit sollte jedoch auf 120 Sekun-den ausgedehnt werden.

Inhalt der Handelspackung

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP mit10 xl 2 ml LA 1 [REAGENT], Screening-Reagenz LA 1

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR mit10 xl 1 ml LA 2 [REAGENT], Bestätigungsreagenz LA 2

Zusätzlich benötigte Materialien10 mm x 75 mm Reagenzgefäße,Pipette für 200 µl, 1 ml, 2 ml oder 5 mlWasserbad, Stoppuhrdestilliertes Wasser (USP oder vergleichbare Reinheit)LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD)LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE)

QualitätskontrolleJedes Labor sollte seine eigenen Vertrauensbereiche der Kontrollen und einen Normalbereichfestlegen.LA Kontrolle Hoch ([REF] OQWD) und LA Kontrolle Niedrig ([REF] OQWE) werden von Siemens zurQualitätskontrolle von Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2 geliefert. Die Bestim-mungen der Kontrollplasmen und Patientenproben müssen gleichzeitig durchgeführt werden.

ErgebnisseWenn die LA 1-Gerinnungszeit im Normalbereich liegt, ist möglicherweise keine weitere Testungauf LA notwendig. Wenn die LA 1-Gerinnungszeit über 2 SD oder etwa 20 % länger als der Mittel-wert des Normalplasmas (idealerweise n ≥ 20) ist, sollte das Ergebnis als nicht normal betrachtetwerden und weiter untersucht werden (siehe Abbildung 1).Das Endergebnis lässt sich am besten als Verhältnis (Ratio) zwischen der Gerinnungszeit desScreening-Reagenz LA 1 und der Gerinnungszeit des Bestätigungsreagenz LA 2 ausdrücken.

  Gerinnungszeit Screening-Reagenz LA 1LA Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Gerinnungszeit Bestätigungsreagenz LA 2

Abbildung 1

1

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PlasmatauschversuchUm versteckte Fehlergebisse der Probe zu korrigieren und um die Präsenz von LA zu klären,können bei grenzwertigen Ergebnissen Plasmatauschversuche durchgeführt werden. Bei diesenTests, die wie der normale Standardtest durchzuführen sind, sollte das Verhältnis zwischen derPlasmaprobe und dem normalen Plasma 50:50 betragen (für Plasmatauschversuche sollte nichtSiemens Control Plasma N verwendet werden).

Tabelle 1: Kombination von Plasmatauschversuchen und Bestätigungstests

LA 1 LA 2 Diagnose

Patienten-

plasmaMischung Patient + Normal

Patienten-

plasmaMischung Patient + Normal

N N N N Kein Nachweisvon LA

ABN ABN N N Nachweis von LA

ABN N ABN N Faktormangel/OATABN ABN ABN N LA + Faktormangel

ABN ABN ABN ABN Sonstiger Inhibitor

Zum Ausgleich der Abweichungen bei verschiedenen Kombinationen von Reagenzien bzw. Gerä-ten kann die Berechnung einer normalisierten Verhältniszahl sinnvoll sein. Bei der Normalisierungwerden die mittleren Gerinnungszeiten des im Labor des Anwenders mit Screening-Reagenz LA 1und Bestätigungsreagenz LA 2 getesteten Normalplasmas verwendet. Das kann die Unterschei -dung zwischen normalen und schwach positiven LA-Proben erleichtern.

Screening-Reagenz LA 1 Patient mittlere Normalzeit Bestätigungsreagenz LA2Normalisierte Ratio = ––––––––––––––––––––––––––––––– x –––––––––––––––––––––––––––––––––– 

mittlere Normalzeit Screening Reagenz LA 1 Bestätigungsreagenz LA 2 Patient

Zur Interpretation normalisierter Verhältniszahlen kann das Flussdiagramm in Abbildung 1 eben -falls herangezogen werden.

Einschränkungen der TestdurchführungProben mit bereits vorhandenen Gerinnseln und abnormen Hämatokritwerten sollten verworfenwerden. Hepatische, lipämische und hämolytische Proben sollten mit manuellen Verfahren getestetwerden, da einige photometrische Instrumente falsche Resultate liefern.Die Verwendung von kommerziell erhältlichen Kontrollplasmen, die keine Angabe zu Citrat- undPlättchenkonzentrationen machen, ist nicht zu empfehlen.Bei Vergleichsprüfungen sollten die Tests mit Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz

LA 2 jeweils zur gleichen Zeit durchgeführt werden.Es sollten mindestens 2 auf unterschiedlichen Testprinzipien basierende Screening-Tests durchge-führt werden. Darüber hinaus sollte ein Plasmatauschversuch zur Verikation des Vorhandenseinseines Gerinnungshemmers und ein Bestätigungstest zur Dokumentation der Phospholipid-Abhän-gigkeit durchgeführt werden10.Heparin-Konzentrationen bis 1 Einheit/ml haben keine Auswirkungen, denn sowohl Screening- Reagenz LA 1 als auch Bestätigungsreagenz LA 2 enthalten entsprechende Neutralisatoren.Resultate dieses Tests sollten stets in Verbindung mit der Vorgeschichte des Patienten, dem kli -nischen Bild und anderen Untersuchungsergebnissen interpretiert werden.

Erwartete WerteMit Proben von 26 gesunden Personen im Alter zwischen 18 und 55 Jahren wurden bei Anwendungeiner manuellen Methode für das Screening-Reagenz LA 1 ein Normalbereich von 31 - 44 Sekunden und für das Bestätigungsreagenz LA 2 ein Normalbereich von 30 - 38 Sekunden gefunden. DieRatio von LA 1 : LA 2 bewegte sich im Bereich zwischen 0,8 und 1,2. Diese Ergebnisse bietenlediglich einen Anhaltspunkt.

Screening LA 1Ist das Verhältnis –––––––––––––– größer als 2,0, dann ist LA stark ausgeprägt.  Bestätigung LA 2

  Screening LA 1Ist das Verhältnis –––––––––––––– zwischen 1,5 und 2,0, dann ist LA mäßig ausgeprägt.  Bestätigung LA 2

  Screening LA 1Ist das Verhältnis –––––––––––––– zwischen 1,2 und 1,5, dann ist LA schwach ausgeprägt.  Bestätigung LA 2

Jedes Labor sollte seinen eigenen Normalbereich sowohl für manuelle als auch automatisierteTestmethoden bestimmen, um Unterschiede bei Probennahme und Geräten auszugleichen.

Leistungsmerkmale des TestsIntra- und Interlaboratoriumsstudien zur Präzision wurden sowohl mit manuellen (tilt tube) als auchautomatisierten Methoden durchgeführt. Diese Prüfungen ergaben Variationskoefzienten von we-niger als 3,5 % bei normalen Plasmen und weniger als 5 % bei abnormen Proben.Untersuchungen zur Spezität wurden an bekannten Plasmaproben durchgeführt.Bei folgenden Plasmen* wurde zwischen Screening-Reagenz LA 1 und Bestätigungsreagenz LA 2eine positive Ratio von größer als 1,2 gefunden:

LA-Plasma 90 % (26/29)heparinisiertes Plasma 12 % (1/8)Plasma von OAT-Patienten 0 % (0/7)Plasma mit Faktormangel 0 % (0/5)Normalplasma 2 % (1/60)

* Bei diesen Plasmen wurde LA in APTT+KCT-Plasmatauschversuchen nachgewiesen.

LiteraturSiehe englische Packungsbeilage.

  Ausgabe Oktober 2008

LA 1 Réactif de dépistage / LA 2 Réactif de conrmationLA 1 [REAGENT] /LA 2 [REAGENT]Test simplié de mesure du Temps de Venin de Vipère Russell dilué (dRVVT, activateur devenin de serpent), pour le dépistage des anticoagulants lupiques

Domaine d’utilisationLes réactifs LA 1 de dépistage et LA 2 de conrmation sont des réactifs dRVVT simpliés, quipermettent la mise en évidence d’anticoagulants lupiques (LA) dans des tests de coagulation enune étape.

LA 1 Réactif de dépistageRéactif dRVV simplié pour le dépistage des anticoagulants lupiques.

LA 2 Réactif de conrmationRéactif dRVV riche en phospholipides, pour la correction spécique des anticoagulants lupiques.

Intérêt diagnostiqueLes anticoagulants lupiques (LA) sont des auto-anticorps dirigés contre des phospholipides char-gés négativement ou des complexes de phospholipides contenant soit de la beta-2-glycoprotéine 1, soit un facteur de la coagulation comme la prothrombine. Ils apparaissent dans différents ta-bleaux cliniques, et plus particulièrement dans les maladies auto-immunes1. Par ailleurs, les LAsont aujourd’hui considérés comme un facteur de risque signicatif chez les patients souffrant dethromboses inexpliquées, et sont fréquemment mis en évidence chez les femmes ayant eu desavortements répétés5. Les LA sont généralement mis en évidence à l’aide de tests de coagulationsensibles aux phospholipides où ils agissent en tant qu’inhibiteur de la coagulation, comme le TCA(Temps de Céphaline avec Activateur), le TCK (Temps de Céphaline Kaolin), ou le dRVVT2.

Le dRVVT a commencé à être utilisé après la publication de Thiagarajan et al. en 19866. Cetteméthode a été standardisée et simpliée7. Selon Petri8 et al., la probabilité, chez les patients throm-botiques souffrant d’un Lupus érythémateux systémique, est plus élevée de révéler des LA avecle dRVVT que des anticorps anti-cardiolipine avec un test immunoenzymatique (ELISA)5. Cetteobservation a récemment été élargie par Galli et Bevers 9, qui ont montré que le sous-type des LAayant le plus d’effet sur le dRVVT est beta-2-glycoprotéine 1 dépendant, et différent du sous-typeLA prothrombine dépendant qui a un effet d’allongement plus marqué sur le TCA.

Principe de la méthode1. Le venin de vipère Russell contenu dans le Réactif de dépistage LA 1 déclenche la coagulation

du plasma par activation directe du Facteur X. Les anticorps anti-LA allongent le temps decoagulation du Réactif de dépistage LA 1.

2. Le Réactif de conrmation LA 2 ressemble au Réactif de dépistage LA 1, mais sa concentrationen phospholipides est augmentée. Ces phospholipides supplémentaires contrecarrent l’actiondes anticorps anti-LA et corrigent ainsi largement le temps de coagulation3.

3. Le dRVVT contourne le Facteur VII de la voie extrinsèque de la coagulation ainsi que les fac-teurs de la phase contact et les facteurs anti-hémophiliques de la voie intrinsèque. Aussi leRéactif de dépistage LA 1 est-il plus adapté pour la mise en évidence spécique des LA quele TCA, car il n’est inuencé ni par des anomalies des facteurs de la phase contact, ni par undécit en Facteur VIII, ni par des anticorps6. Une série de tests basés sur la correction par lesphospholipides4 ont été mis au point. Aucun ne s’est cependant révélé aussi simple d’utilisationque le Réactif de dépistage LA 1, suivi du Réactif de conrmation LA 2.

4. Pour exclure un décit en Facteur II, V ou X , qui pourrait allonger le résultat obtenu avec leRéactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2, il peut être util e d’effectuer un test

de mélange. Pour cela, mélanger le plasma testé avec un plasma témoin, de façon à réintroduireles facteurs manquants dans le plasma testé. Si le mélange donne toujours un temps allongé,cela signie que le plasma testé contient un inhibiteur de la coagulation (par ex. des LA). Nor -malement, un temps de coagulation allongé qui ne se corrige pas par le test de mélange prouvela présence d’un inhibiteur circulant3, 10.

RéactifsCompositionLe Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 contiennent du venin de vipèreRussell, des phospholipides, des agents anti-hépariniques, du calcium, une solution tampon, desstabilisateurs, de l’azide de sodium, et des colorants.

Mises en garde et précautions d’emploiLes réactifs sont réservés à un usage de diagnostic in-vitro .En cas d’évacuation dans l’évier, rincer avec un grand volume d’eau pour éviter tout mélangeexplosif dans les canalisations métalliques.

Préparation des réactifsReconstituer le contenu d’un acon avec le volume d’eau distillée indiqué sur l’étiquette. Bien mé -langer en agitant avec précaution an d’assurer une parfaite reconstitution du lyophilisat.

Stabilité et conditions de conservationLes réactifs lyophilisés conservés à +2/+8 °C peuvent être utilisés jusqu’à la date indiquée surl’étiquette du acon.Une fois reconstitués, ils se conservent 8 heures à +37 °C, 24 heures à +20/+25 °C, 48 heures à

+2/+8 °C et un mois à -20 °C.Signes d’instabilité et de détériorationSi, à l’ouverture du acon, on observe une absence de v ide, et/ou si le réactif ne paraît pas l yophi-lisé, le retourner à Siemens Healthcare Diagnostics.

Prélèvement et préparation des échantillonsPrélever et préparer les échantillons selon le NCCLS H21-A3 « Prélèvement, transport et prépara-tion des échantillons sanguins pour tests de coagulation », ainsi que selon la procédure généralepour tests de coagulation, directive validée, 3ème édition (1998). Conserver le plasma séparé à+2/+8 °C, et le tester dans les 4 heures qui suivent le prélèvement.Si les plasmas doivent être congelés avant leur utilisation dans le test, les centrifuger deux foispour éliminer les plaquettes sanguines (le taux doit être inférieur à 10 x 109 /l)10 car celles-ci peuventraccourcir le temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1.

Réalisation du test1. Dans un acon pour réactif pouvant contenir au moins 200 µl par test, préchauffer à +37 ± 1 °C

un peu plus que la quantité nécessaire de Réactif de dépistage LA 1 et/ou de Réactif de conr-mation LA 2.

2. Distribuer 200 µl de plasma de patient dans un tube à essai en verre, et laisser incuber 1 minuteà +37 °C.

3. Ajouter au plasma 200 µl de Réactif de dépistage LA 1 ou de Réactif de conrmation LA 2préchauffé, et mesurer le temps écoulé depuis l’addition du Réactif jusqu’à l a n de la réactionde coagulation.

4. Répéter la mesure pour un dosage en double, et calculer la moyenne des résultats obtenus.Méthode automatiséeLes protocoles de test sur les automates Siemens sont disponibles sur demande.Les tests utilisant le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2 doivent, commela plupart des tests de mesure du temps de thrombine, être effectués avec un volume égal deplasma de patient et de réactif. Cependant, le temps de lecture ou d’exploitation doit être porté à120 secondes.

Conditionnements

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP contenant

10 xl 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Réactif de dépistage

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR contenant

10 xl 1 ml LA 2 [REAGENT], LA 2 Réactif de conrmation

Matériel nécessaireTubes à essai en verre de 10 mm x 75 mmPipette pour distribuer 200 µl, 1 ml, 2 ml ou 5 mlBain-marie, chronomètreEau distillée (USP ou de pureté équivalente)LA Contrôle Elevé ([REF] OQWD)LA Contrôle Bas ([REF] OQWE)

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Contrôle de qualitéIl est recommandé à chaque laboratoire de déterminer ses propres domaines de conance pour lescontrôles et son propre domaine normal.Le LA Contrôle Elevé ([REF] OQWD) et le LA Contrôle Bas ([REF] OQWE) sont proposés par Sie -mens pour le contrôle de qualité du Réactif de dépistage LA 1 et du Réactif de conrmation LA 2.

RésultatsSi le temps de coagulation de LA 1 est trouvé à l’intérieur du domaine normal, il n’est éventuel -lement pas nécessaire d’effectuer un autre test de LA. Si le temps de coagulation de LA 1 estsupérieur à 2 DS ou allongé d’environ 20 % par rapport à la valeur moyenne d’un plasma normal(idéalement n ≥ 20), le résultat doit être considéré comme anormal, et des tests complémentairesdoivent être effectués (cf. Schéma 1).Le mieux est d’exprimer le résultat nal en ratio : temps de coagulation du Réactif de dépistageLA 1/temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2.

Temps de coagulation du Réactif de dépistage LA 1Ratio LA = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––  Temps de coagulation du Réactif de conrmation LA 2

Schéma 1

1

Test de mélangeEn cas de résultat douteux, effectuer un test de mélange pour corriger l’éventuel faux résultat ob-tenu et clarier la présence de LA. Pour cela, mélanger à parts égales le plasma du malade avec unplasma normal dit plasma témoin, et tester le mélange selon la procédure normale du test (commeplasma témoin, ne pas utiliser le Siemens Plasma de contrôle N).

Tableau 1 : Combinaisons des tests de mélange et des tests de conrmation

LA 1 LA 2 Diagnostic

Plasma dumalade

Mélange malade + témoin

Plasma dumalade

Mélange malade + témoin

N N N N Pas de mise enévidence de LA

ABN ABN N N Mise en évidencede LA

ABN N ABN N Facteur décient/  AVK

ABN ABN ABN N LA + facteurdécient

ABN ABN ABN ABN Autre inhibiteur

An de corriger les variations de résultats obtenus selon les réactifs et l’appareil utilisés, il estrecommandé de calculer un ratio normalisé. Pour cela, utiliser les temps de coagulation moyensobtenus dans le laboratoire avec le Réactif de dépistage LA 1 et le Réactif de conrmation LA 2sur un plasma normal. Ceci peut faciliter la différenciation entre des échantillons normaux et deséchantillons faiblement positifs en LA.

  Temps du malade avec Réactif de dépistage LA 1Ratio normalisé = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 

Temps moyen du témoin avec Réactif de dépistage LA 1

X

  Temps moyen du témoin avec Réactif de conrmation LA 2  ––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Temps du malade avec Réactif de de conrmation LA 2

Pour l’interprétation du ratio normalisé ont peut également suivre le diagramme représenté selon le schéma1.

Limites de réalisation du testNe pas utiliser d’échantillons ayant déjà coagulés ou avec un hématocrite anormal. Les échan -tillons hépatiques, lipémiques ou hémolytiques doivent être testés en méthode manuelle, car cer-tains appareils photométriques fournissent des résultats erronés.Il n’est pas recommandé d’utiliser des plasmas de contrôle du commerce dont les concentrations

en citrate et en plaquettes ne sont pas précisées.Les tests effectués dans le cadre d’études comparatives avec les Réactifs de dépistage LA 1 et deconrmation LA 2 doivent être effectués simultanément.Effectuer au moins 2 tests de dépistage basés sur des principes de test différents. Par ailleurs,effectuer un test de mélange pour vérier la présence d’un inhibiteur de la coagulation, et un testde conrmation pour vérier la sensibilité aux phospholipides10.Les concentrations d’héparine jusqu’à 1 unité/ml n’ont pas d’inuence sur les tests, car aussi bienle Réactif de dépistage LA 1 que le Réactif de conrmation LA 2 contiennent un neutralisateurcorrespondant.Les résultats de ce test doivent toujours être interprétés en rapport avec les antécédents médicauxdu patient, les signes cliniques et autres constatations.

Valeurs attenduesLes échantillons de 26 sujets sains âgés de 18 à 55 ans testés en méthode manuelle ont donné undomaine normal compris entre 31 et 44 secondes avec le Réactif de dépistage LA 1, et un domainenormal compris entre 30 et 38 secondes avec le Réactif de conrmation LA 2. Le ratio LA 1/LA 2s’étend sur un domaine compris entre 0,8 et 1,2. Ces valeurs ne sont données qu’à titre indicatif.

  Dépistage LA1Si le ratio –––––––––––––– est supérieur à 2,0, la présence de LA est fortement marquée 

Conrmation LA 2

  Dépistage LA1Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,5 et 2,0, la présence de LA est moyenne

Conrmation LA 2

  Dépistage LA1Si le ratio –––––––––––––– est compris entre 1,2 et 1,5, la présence de LA est faible 

Conrmation LA 2

Chaque laboratoire doit déterminer son propre domaine normal, aussi bien pour la méthode ma-nuelle que pour les méthodes avec automates, pour corriger les variations dues au prélèvementdes échantillons et à l’automate utilisé.

Caractéristiques du testDes études de précision intra et inter-laboratoires ont été effectuées, en méthode manuelle (retour-nement du tube) et sur automates. Les coefcients de variation obtenus étaient inférieurs à 3,5 %pour les plasmas normaux, et inférieurs à 5 % pour les échantillons anormaux.Des études de spécicité ont été effectuées sur des échantillons plasmatiques connus.Un ratio positif entre Réactif de dépistage LA 1 et Réactif de conrmation LA 2 supérieur à 1,2 aété trouvé sur les plasmas connus suivants :Plasmas LA positifs 90 % (26/29)Plasmas héparinés 12 % (1/8)Plasmas de patients sous AVK 0 % (0/7)Plasmas avec facteur décient 0 % (0/5)Plasmas normaux 2 % (1/60)* l’identication des LA s’est faite par TCA + TCK sur plasma mélangé

LittératureCf. texte anglais.

  Edition Octobre 2008

LA 1 Reagente di screening /LA 2 Reagente di confermaLA 1 [REAGENT] /

LA 2 [REAGENT]Reagente semplicato per il tempo di Veleno di Vipera Russell Diluito (DRVVT) perl’identicazione degli Anticoagulanti Lupus

Uso previstoIl Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 sono reagenti DRVVT per l’identi-cazione degli anticoagulanti lupici (LA) nei test di coagulazione ad una fase.

LA 1 Reagente di screeningReagente DRVV semplicato per lo screening degli anticoagulanti lupici.

LA2 Reagente di ConfermaReagente DRVV ricco di fosfolipidi per la correzione specica degli anticoagulanti lupici.

Signicato diagnosticoGli anticoagulanti lupici (LA) sono degli autoanticorpi diretti contro i fosfolipidi con carica negativa oi complessi di fosfolipidi con beta-2-glicoproteina 1 o fattori della coagulazione, quali la protrombina.Essi si riscontrano in varie condizioni cliniche, specialmente nelle malattie autoimmuni 1. Inoltre gliLA sono da considerarsi come un fattore di rischio signicativo nei pazienti con inspiegabili trombosie sono spesso presenti in donne con aborti ricorrenti5. Normalmente gli LA vengono individuatiattraverso test coagulativi sensibili ai fosfolipidi, come l’aPTT (Tempo di Tromboplastina Parziale at -tivato), tempo di coagulazione con caolino (KCT) e DRVVT 2, dove hanno un effetto anticoagulante.Il tempo di DRVV divenne popolare in seguito alla pubblicazione di Thiagarajan et al. nel 19866.

Questo metodo è stato standardizzato e semplicato7. Secondo Petri8 et al., la trombosi nei pazientiSLE è maggiormente collegata agli LA identicabili con DRVVT che con gli anticorpi anti-cardioli -pina identicati da test immunoenzimatico (ELISA)5. Questa osservazione è stata recentementespiegata da Gall e Bevers9, i quali hanno dimostrato che il sottotipo LA con maggiore effetto sui testDRVVT è dipendente dalla beta-2-glicoproteina, e diverso dal sottotipo LA richiedente protrombina,che ha un effetto prolungato sui test KCT.

Principio del metodo1. Il veleno di vipera Russell, presente nel Reagente di screening LA 1 attiva direttamente il fattore

X, provocando la coagulazione del plasma. Gli anticorpi LA allungano il tempo di coagulazionedel Reagente di screening LA 1.

2. Il Reagente di conferma LA 2 è simile al Reagente di screening LA 1, ma contiene un’altaconcentrazione di fosfolipidi. Questi fosfolipidi aggiuntivi agiscono conto gli anticorpi LA e cor -reggono ampiamente il tempo di coagulazione 3.

3. Il test DRVV “aggira” il fattore VII del sistema estrinseco della coagulazione così come i fattoriantiemolici e di contatto del sistema intrinseco. Pertanto, il Reagente di screening LA 1 è moltopiù specico per gli LA del test aPTT, poiché non è inuenzato né da anomalie del fattore dicontatto, né da decit del fattore VIII o anticorpi 6. Sono stati sviluppati una serie di test sullabase della correzione con fosfolipidi4, ma nessuno è risultato così appropriato come l’impiegodel Reagente di conferma LA 2 dopo il Reagente di screening LA 1.

4. E’ possibile utilizzare un test di miscelazione del plasma per escludere un decit di fattore II,V e X che provocherebbero un allungamento dei risultati del Reagente di screening LA 1 e delReagente di conferma LA 2. Miscelando il plasma normale con il plasma in esame, si ripristinanoi fattori mancanti nel plasma in esame. Se il risultato del test di miscelazione risulta ancora

allungato, signica che un inibitore (come LA) è presente nel plasma in esame. Un tempodi coagulazione allungato, che non può essere corretto miscelando il plasma di paziente conplasma normale, indica la presenza di un inibitore circolante3,10.

ReagentiComposizioneIl Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2 contengono veleno di vipera Russell,fosfolipidi, agenti anti-eparina, calcio, tamponi, stabilizzanti, sodio azide e colorante.

Avvertenze e precauzioniSolo per uso diagnostico in-vitro .Nell’eliminare il reagente attraverso lo scarico, far scorrere molta acqua per prevenire la formazionedi residui esplosivi nelle tubature di metallo.

Preparazione del reagenteRicostituire con la quantità d’acqua distillata indicata sull’etichetta. Mescolare bene mediante capo-volgimento per assicurare una completa risospensione del materiale liolizzato.

Conservazione e stabilitàI reagenti liolizzati, conservati a +2/+8 °C, sono stabili no alla data di scadenza indicata sull’eti -chetta.I reagenti ricostituiti possono essere conservati per 8 ore a +37 °C, 24 ore a +20/+25 °C, 48 ore a+2/+8 °C e 1 mese a -20 °C.

Indice di instabilità / deterioramentoSe, aprendo il acone, non si osserva presenza di vuoto e/o il reagente non appare secco, deveessere restituito a Siemens Healthcare Diagnostics.

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Raccolta e preparazione dei campioniIl sangue deve essere prelevato e lavorato secondo lo standard NCCLS H21-A3: raccolta, trasportoe lavorazione dei campioni di sangue per test coagulativi e esecuzione generale dei metodi coa -gulativi, linee guida approvate - 3a edizione (1998). Il plasma separato deve essere conservato a+2/+8 °C e analizzato entro 4 ore dal prelievo.Se il campione va congelato, il plasma deve essere centrifugato una seconda volta per rimuoverele piastrine (inferiori a 10 x 109 /l)10, in quanto potrebbero accorciare il tempo di coagulazione delReagente di screening LA 1.

Esecuzione del test1. Preriscaldare a +37 ± 1 °C poco più della quantità necessaria di Reagente di screening LA 1 e/o

Reagente di conferma LA 2, calcolando 200 µl per test2. Dispensare 200 µl del plasma in esame in una provetta di vetro e riscaldare per 1 minuto a +37 °C.3. Aggiungere 200 µl del reagente di screening preriscaldato al plasma e cronometrare il tempo,

dal momento dell’aggiunta del reagente no alla conclusione della reazione di coagulazione.

4. Ripetere il test per una determinazione in doppio e riportare il valore medio dei risultati deltest.

Metodo automaticoSono disponibili, su richiesta, i protocolli per gli analizzatori Siemens.I test con il Reagente di screening LA 1 ed il Reagente di conferma LA 2 devono essere eseguiti conla stessa quantità di plasma e reagente, come in molti protocolli per il tempo di trombina. Tuttavia,i tempi di lettura e interpretazione dei dati devono essere portati a 120 secondi.

Materiali forniti

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con

10 xl 2 mL LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con

10 xl 1 mL LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma

Materiale necessario ma non fornitoProvette di vetro 10 mm x 75 mmPipette da 200 µl, 1 ml, 2 ml o 5 mlBagnomaria, cronometroAcqua depurata, USP o equivalenteLA Controllo Alto ([REF] OQWD)LA Controllo Basso ([REF] OQWE)

Controllo qualità

Ogni laboratorio dovrebbe stabilire i propri valori di accettabilità dei controlli ed un proprio intervallonormale.LA Controllo Alto ([REF] OQWD) e LA Controllo Basso ([REF] OQWE) sono distribuiti da Siemens eservono per il controllo qualità del Reagente di screening LA 1 e del Reagente di conferma LA 2.Il plasma di controllo e i campioni dei pazienti devono essere analizzati simultaneamente.

RisultatiSe il tempo di coagulazione con LA 1 rientra nell’intervallo normale, non è necessario eseguire altritest. Se il tempo di coagulazione con LA 1 è superiore a 2 DS o ca. il 20 % più lungo del valoremedio del plasma normale (n ≥ 20), il risultato deve essere considerato anomalo e sottoposto aulteriori indagini (vedere gura 1).Il risultato nale può essere espresso meglio come rapporto (ratio) tra il tempo di coagulazione delReagente di screening LA 1 e il tempo di coagulazione del Reagente di conferma LA 2.

  Tempo di coagulazione Reagente di screening LA 1Ratio LA = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Tempo di coagulazione Reagente di conferma LA 2

Figura 1

1

 

Test di miscelazioneSe i risultati si trovano ai limiti, è possibile eseguire prove di miscelazione del plasma per corregge-re i difetti nascosti del campione e chiarir e la presenza degli LA. In questo test, da eseguire come unnormale test standard, il rapporto tra campione di plasma e plasma normale dovrebbe essere 50:50(non utilizzare il Plasma di controllo della Siemens per le prove di miscelazione del plasma).

Tabella 1: Combinazione di test di miscelazione e di conferma

LA 1 LA 2 Diagnosi

Plasma dipaziente

Miscela paziente +Normale

Plasma dipaziente

Miscela paziente +Normale

N N N N LA non identicati

ABN ABN N N LA identicati

ABN N ABN N Decit fattore/TAO

ABN ABN ABN N LA + Decit fattore

ABN ABN ABN ABN Altro inibitore

Il calcolo di una ratio normalizzata può essere utile per correggere le differenze delle varie combinazio-ni reagenti/strumenti. Nella normalità, si usano i tempi di coagulazione medi del plasma normale ana -

lizzato con il Reagente di screening LA 1 e Reagente di conferma LA 2 nel laboratorio dell’utilizzatore.Ciò può facilitare la differenziazione tra i campioni LA normali e quelli leggermente positivi.

  Reagente di screening LA 1 del pazienteRatio normalizzata = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Tempo normale medio Reagente di screening LA 1

X

  Tempo normale medio Reagente di conferma LA 2  ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Reagente di conferma LA 2 del paziente

Il diagramma della gura 1 può essere utilizzato anche per interpretare le ratio normalizzate.

Limitazioni della esecuzione del testCampioni che contengono coaguli e quelli con valori di ematocrito anormali devono essere elimi-nati. I campioni itterici, lipemici e emolitici dovrebbero essere analizzati con tecniche manuali, inquanto alcuni strumenti fotometrici danno falsi risultati.Si raccomanda di non utilizzare i plasmi di controllo commercializzati senza indicazione della con -centrazione di citrato e piastrine.Per gli studi comparativi, i test con il Reagente di screening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2dovrebbero essere eseguiti in simultanea.Eseguire almeno 2 test di screening basati su principi analitici differenti. Eseguire, inoltre, una provadi miscelazione del plasma per vericare la presenza di inibitore della coagulazione, e un test diconferma per documentare la dipendenza dei fosfolipidi10.Concentrazioni di eparina no a 1 unità/ml non hanno alcun effetto, per la presenza di un agenteneutralizzante sia nel Reagente di screening LA 1 che nel Reagente di conferma LA 2.I risultati di questo test devono essere sempre interpretati alla luce della anamnesi del paziente,della presentazione clinica e valutando contestualmente l’esito di altri accertamenti.

Valori attesiCon campioni di 26 individui sani di età compresa tra 18 e 55 anni e utilizzando un metodo manua-le in provetta (tilt-tube), sono stati ottenuti intervalli normali di 31 - 44 secondi per il Reagente discreening LA1 e di 30 - 38 secondi per il Reagente di conferma LA 2. La ratio LA1/LA2 oscillavatra 0,8 e 1,2. Questi risultati devono intendersi solo come riferimento

  Screening LA 1Se la ratio ––––––––––––– è maggiore di 2,0: forte presenza di LA 

Conferma LA2

Screening LA 1Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,5 e 2,0: moderata presenza di LA 

Conferma LA 2

  Screening LA 1Se la ratio ––––––––––––– è compresa tra 1,2 e 1,5: debole presenza di LA 

Conferma LA 2

Ogni laboratorio dovrebbe stabile il proprio intervallo normale, sia per il metodo manuale che perquello automatico, per poter bilanciare le differenze nel prelievo dei campioni e nella strumenta -

zione.

Caratteristiche speciche del testStudi di precisione intra- ed inter-laboratori sono stati realizzati tanto con il metodo manuale inprovetta (tilt-tube) quanto con il metodo automatico. Questi studi hanno dato un coefciente di

variazione inferiore al 3,5 % su plasma normale e inferiore al 5 % per i campioni anormali.Studi di specicità sono stati effettuati su campioni di plasma noti.Per i seguenti plasmi* e stata riscontrata una ratio positiva maggiore di 1,2, tra il Reagente discreening LA 1 e il Reagente di conferma LA 2:Plasma LA 90 % (26/29)Plasma eparinato 12 % (1/8)Plasma di paziente TAO 0 % (0/7)Plasma carente di fattore 0 % (0/5)Plasma normale 2 % (1/60)* Per questi plasmi gli LA sono stati identicati con APTT + prove di miscelazione KCT.

BibliograaVedi testo Inglese.

Edizione Ottobre 2008

Reactivo de screening LA 1/Reactivo de conrmación LA 2LA 1 [REAGENT] /LA 2 [REAGENT]Reactivo para el tiempo de veneno de víbora de Russell diluido, ("Dilute Russell’s ViperVenom Time" reagent), simplicado, para la detección del anticoagulante lúpico.

Campos de aplicaciónEl reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2 son reactivos simplicados, delreactivo DRVVT para la detección del anticoagulante lúpico (LA), en un test de coagulación deuna etapa.

Reactivo de screening LA 1Reactivo DRVV simplicado para el screening del anticoagulante lúpico.

Reactivo de conrmación LA 2Reactivo DRVV rico en fosfolípidos para la corrección especíca del anticoagulante lúpico.

Signicado diagnósticoLos anticoagulantes lúpicos (LA) son autoanticuerpos, los cuales están dirigido contra fosfolípidoscargados negativamente o contra los complejos de fosfolípidos, ya sea con beta-2-glicoproteína 1o con factores de la coagulación como la protrombina. Ellos aparecen en diferentes estadios clí -nicos, especialmente en enfermedades autoinmunes1. Además, el LA es visto hoy como un factorde riesgo signicante para pacientes con diferentes trombosis inexplicables y se puede reconocerfrecuentemente en mujeres con abortos repetidos5. El LA se detecta normalmente por medio deensayos de coagulación sensibles a los fosfolípidos, tales como, APTT (tiempo de tromboplastinaparcial activado), KCT (tiempo de coagulación con caolín) y el DRVVT2, en los cuales actúa comoinhibidor de la coagulación.El test DRVVT comenzó a conocerse después de la publicación de Thiagarajan et al. en el año19866. Este método ha sido estandarizado y simplicado7. Según Petri et al8. en trombosis de pa-cientes con lupus eritematoso sistémico, es mucho mayor la posibilidad de detectar LA con DRVVTque el anticuerpo anticardiolipina con un ensayo inmunoenzimático (ELISA)5. Estas observacionesfueron extendidas recientemente por Galli y Bevers 9, quienes demostraron que el subtipo de LAcon más efecto sobre el test DRVVT es el dependiente de la beta-2-glicoproteína 1 y se diferenciadel subtipo de LA dependiente de la protrombina, el cual tiene un fuerte efecto en la prolongacióndel test KCT.

Principio del método1. El veneno de víbora de Russell contenido en el reactivo de screening LA 1 desencadena la

coagulación del plasma mediante la activación directa del factor X. El anticuerpo LA prolongael tiempo de coagulación del reactivo de screening LA 1.

2. El reactivo de conrmación LA 2 es similar al reactivo de screening LA 1, pero contiene unamayor concentración de fosfolípidos. Estos fosfolípidos adicionales actúan en contra de el an -ticuerpo LA y de esta manera corrigen casi completamente el tiempo de coagulación3.

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3. El test DRVVT evita (bypass) el factor VII del sistema extrínseco de la coagulación y los factoresde contacto y antihemofílicos del sistema intrínseco. Por esta razón, el reactivo de screening LA 1es más apropiado para el reconocimiento especíco de LA, que el test del TTPA, ya que no va aestar inuenciado ni por anomalías de los factores de contacto ni por deciencia en el factor VIIIo anticuerpos6. Se han desarrollado una gran serie de ensayos basados en la corrección de losfosfolípidos4, sin embargo ninguno de ellos ha sido tan apropiado para usar como el reactivo deconrmación LA 2 a continuación del reactivo de screening LA 1.

4. Para descartar una deciencia en los factores II, V o X, la cual podría prolongar los resultadosdel ensayo con el reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2, puede ser deutilidad realizar ensayos con mezclas de plasmas. Mediante la mezcla de un plasma normalcon un plasma test, se van a agregar al plasma test los factores faltantes. Si el test mezcladotodavía produce tiempos prolongado, esto está indicando, que en el plasma test se encuentraun inhibidor (como LA). Normalmente un tiempo de coagulación prolongado, el cual tampocose pueda corregir mediante la mezcla de plasmas de pacientes con plasmas normales, indicaun inhibidor circular 3, 10.

ReactivosComposiciónEl reactivo de screening LA 1 y el reactivo de conrmación LA 2 contienen veneno de víborade Russell, fosfolípidos, agentes anti-heparínicos, calcio, solución tampón, estabilizadores, azidasódica y colorantes.

Advertencias y medidas de seguridad:Sólo para ser utilizado en diagnósticos in-vitro .Cuando se retira la azida sódica, se debe purgar la cañería con suciente cantidad de agua, paraevitar la posibilidad de formación de materiales explosivos en la tubería metálica.

Preparación de los reactivosDisolver el contenido de los frascos en la cantidad de agua dest. indicada en las etiquetas. Mezclarbien por inversión para asegurar la completa resuspensión del material liolizado.

Estabilidad y almacenajeLos reactivos liolizados almacenados a una temperatura entre +2 y +8 °C pueden ser usados, porlo menos, hasta la fecha indicada en la etiqueta.Después de la reconstitución los reactivos pueden ser almacenados 8 horas a +37 °C, 24 horasentre +20 y +25 °C, 48 horas entre +2 y +8 °C y 1 mes a -20 °C.

Indicaciones de inestabilidad y deterioraciónSi al abrir el frasco no es evidente la existencia de vacío y/o el reactivo no parece seco, éste sedebe devolver a Siemens Healthcare Diagnostics.

Toma de las muestras y preparaciónLa sangre se debe tomar y procesar de acuerdo con el NCCLS-Standard H 21 - A3: Toma, trans-porte y procesamiento de muestras de sangre para los test de coagulación y la ejecución generalde los ensayos de la coagulación- Normas aprobadas - 3a Edición (1998). El plasma separado debeser almacenado entre +2 y +8 °C y usado para el test dentro de las 4 horas siguientes a la toma.Si las muestras van a ser congeladas antes de usarlas, el plasma debe ser centrifugado 2 vecesantes de congelarse, para remover las plaquetas de sangre (por debajo de 10 x 109 /l)10, ya queestas pueden llega a acortar el tiempo de coagulación del reactivo de screening LA1.

Procedimiento1. Pre-calentar a 37 ± 1 °C, en un tubo de ensayo que pueda contener por lo menos 200 µl por

test, un poco más de la cantidad necesaria del reactivo de screening LA 1 y/o del reactivo deconrmación LA 2.

2. Agregar en un tubo de ensayo de vidrio 200 µl de plasma de paciente e incubar 1 minuto a +37 °C.3. Añadir al plasma 200 µl del reactivo de screening LA 1 o del reactivo de conrmación LA 2,

pre-calentados, y medir el tiempo desde la adición del reactivo hasta el nal de la reacción decoagulación.

4. Repetir por duplicado el test y reportar el promedio de estos como el resultado.

Método automáticoLos protocolos para los analizadores Siemens están disponibles a petición.Los test con el reactivo de screening LA 1 y con el reactivo de conrmación LA 2, como en lamayoría de los protocolos para el tiempo de trombina, deben efectuarse usando el mismo volumende plasma test y de reactivo. Sin embargo, el tiempo de la toma de la medida o de valoración debeser prolongado a 120 segundos.

Contenido del envase comercial:

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP con

10 xl 2 ml LA 1 [REAGENT], LA 1 Reagente di screening

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR con

10 xl 1 ml LA 2 [REAGENT], LA2 Reagente di Conferma

Materiales adicionales necesariosTubos de ensayo 10 mm x 75 mm,Pipetas de 200 µl, 1 ml, 2 ml o 5 ml.Baño de agua, Cronómetro,Agua destilada (USP o de pureza equivalente),LA control alto ([REF] OQWD)LA control bajo ([REF] OQWE)

Control de calidadCada laboratorio debe establecer sus propios rango de conanza para los controles y su propiorango normal.El LA control alto ([REF] OQWD) y el LA control bajo ( [REF] OQWE) son suministrados por Sie-mens, para ser usados en el control de calidad del reactivo de screening LA 1 y del reactivo deconrmación LA 2. Las determinaciones de los plasmas de control y de las muestras de pacientesdeben efectuarse al mismo tiempo.

ResultadosSi el tiempo de coagulación con LA 1 se encuentra en el rango normal, no es necesario realizar otrotest para LA. Si el tiempo de coagulación con LA 1 está por encima de 2 SD o es aproximadamente20 % más largo que el valor promedio del plasma normal (de manera ideal n ≥ 20), el resultado sedebe considerar como anormal y se debe continuar investigando (ver Fig. 1).El resultado se puede expresar mejor como la relación (radio) entre el tiempo de coagulación conLA 1 y el tiempo de coagulación con LA 2.

  Tiempo de coagulación del reactivo de screening LA1Radio LA = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Tiempo de coagulación del reactivo de conrmación LA 2

Figura 1

1

Test de mezclasPara corregir errores escondidos en la muestra y para aclarar l a presencia de LA en muestras conresultados limítrofe, se pueden realizar estudios de mezclas de plasmas. En estos test, los cualesvan a ser realizados como los test estándar, la relación entre la muestra de plasma y el plasmanormal debe ser de 50:50 (para estos estudios de mezclas de plasmas no se debe utilizar el plasmacontrol N de Siemens)

Tabla 1: Combinación del test de mezclas y de conrmación

LA 1 LA 2 Diagnóstico

Plasma depaciente

Mezcla Paciente + normal

Plasma depaciente

Mezcla Paciente + normal

N N N N LA no detectado

ABN ABN N N LA presente

ABN N ABN N Factor deciente/OATABN ABN ABN N LA + factor deciente

ABN ABN ABN ABN Otro inhibidor

Para corregir las desviaciones en diferentes combinaciones de reactivos o de aparatos puede serde gran utilidad calcular un radio normalizado. Para la normalización se van a tomar los valorespromedios del tiempo de coagulación de plasmas normales chequeados en el laboratorio del usua-rio con los reactivos de screening LA 1 y de conrmación LA 2. Esto puede facilitar la diferenciaciónentre muestras normales y muestras con LA positivo bajo.

  Paciente reactivo de screening LA 1Radio normalizado = ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 

Tiempo promedio normal reactivo de screening LA 1

  x

  Tiempo promedio normal reactivo de conrmación LA 2–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 Paciente reactivo de conrmación LA 2

Para la interpretación de los radios normalizados se puede usar también el diagrama de ujos de laFig. 1

Limitaciones del ProcedimientoMuestras que ya se encuentran coaguladas y con valores de hematócrito anormales deben serdescartadas. Muestras hepáticas, lipémicas y hemóliticas deben medirse por un método manual,

ya que algunos instrumentos fotométricos producen resultados falsos.No se recomienda el uso de plasmas de control comerciales disponibles, que no presenten datossobre la concentración de citrato y de plaquetas.Para estudios comparativos, los test con el reactivo de screening LA 1 y con el de conrmación LA 2deben ser efectuados al mismo tiempo.Se deben realizar por lo menos 2 test de screening basados en principios diferentes. Además, sedebe realizar un test de mezclas para vericar la existencia de un inhibidor de la coagulación y untest de conrmación para documentar la dependencia de fosfolípidos10.Concentraciones de heparina hasta de 1 unidad/ml no tiene ninguna inuencia, ya que tanto elreactivo de screening LA 1 como el de conrmación LA 2 contienen los correspondientes neu -tralizadores.Los resultados de esta prueba deberán interpretarse siempre de acuerdo con la historia clínica delpaciente, la sintomatologia clínica y otras observaciones.

Valores esperadosCon muestras de 26 personas sanas, en edades entre 18 y 55 años y utilizando un método manualse encontró un rango normal para el reactivo de screening LA 1 de 31 - 44 segundos y para elreactivo de conrmación LA 2 de 30 - 38 segundos. El radio LA 1/LA 2 se encontró en un rangoentre 0,8 y 1,2. Estos resultados deben ser tomados solamente como una guía.

Screening LA1Si el radio ––––––––––––––– es más grande que 2,0, la presencia del LA es fuerte

Conrmación LA2

  Screening LA1

Si el radio ––––––––––––––– está entre 1,5 y 2,0, la presencia del LA es moderadaConrmación LA2

  Screening LA1Si el radio ––––––––––––––– está entre 1,2 y 1,5, la presencia del LA es débil

Conrmación LA2

Cada laboratorio debe determinar su propio rango normal, tanto para el test manual como paralos test automáticos, con el n de compensar las diferencias por la toma de muestra y por losaparatos.

Características del testEstudios de precisión inter e intra laboratorios fueron realizados tanto manualmente (tubo tilt),como con métodos automáticos. Estos estudios dieron coecientes de variación menores al 3,5 %para plasmas normales y menores del 5 % para plasmas anormales.Los estudios de especicidad fueron realizados con muestras de plasmas conocidos.Para los siguientes plasmas conocidos* se encontró entre el reactivo de screening LA 1 y el deconrmación LA 2 un radio positivo mayor de 1,2:Plasma LA 90 % (26/29)Plasma heparinizado 12 % (1/8)Plasma de pacientes OAT 0 % (0/7)Plasma con factor deciente 0 % (0/5)Plasma normal 2 % (1/60)* Para estos plasmas la identicación del LA se hizo con estudios mixtos APTT + KCT

LiteraturaVer boletín informativo en Inglés

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Edición Octubre 2008

Reagente de rastreio LA 1 / Reagente de conrmação LA 2LA 1 [REAGENT] /LA 2 [REAGENT]Reagente simplicado ”Dilute Russell’s Viper Venom Time” (DRVVT, activador de venenode víbora) para detecção do anticoagulante lúpico

Campo de aplicaçãoO reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 são reagentes DRVVT simplicadospara detecção do anticoagulante lúpico (LA) em testes de coagulação de um só estágio.

Reagente de rastreio LA 1Reagente simplicado DRVV para o rastreio de anticoagulante lúpico.

Reagente de conrmação LA 2Reagente DRVV rico em fosfolípidos para a correcção especíca do anticoagulante lúpico.

Signicado diagnósticoO anticoagulante lúpico (LA) é constituído por autoanticorpos contra os fosfolípidos carregados nega-tivamente ou complexos de fosfolípidos com beta-2-glicoproteína 1 ou factores de coagulação como aprotrombina. Ocorre em várias situações clínicas, especialmente nas doenças autoimunes1. Além dis-so, o LA é considerado actualmente um factor de risco signicativo para os pacientes com trombo -

ses de etiologia desconhecida e é detectado, frequen temente, em mulheres com aborto recorrente5. O LA é detectado, habitualmente, com testes de coagulação sensíveis aos fosfolípidos, como o

APTT (tempo de tromboplastina parcial activado), o KCT (kaolin clotting time), e o DRVVT2

, ondepossui um efeito inibidor da coagulação.O tempo DRVV tornou-se popular após a publicação de Thiagarajan et al. no ano de 19866. Estemétodo foi simplicado e padronizado7. Segundo Petri8 et al., nos pacientes com trombose com lúpuseritematoso sistémico a probabilidade de detectar LA com DRVVT é maior com um ensaio imuno-enzimático (ELISA)5  para os anticorpos anticardiolipina. Esta observação foi alargada recentementepor Galli e Bevers9 que mostraram que o subtipo de LA com o maior efeito sobre os testes DRVVTprecisa da beta-2-glicoproteína 1 e se distingue do subtipo LA dependente da protrombina, que possuium efeito mais prolongado sobre os testes KCT.

Princípio metodológico1. O veneno da víbora de Russel presente no reagente de rastreio LA 1 provoca a coagulação

do plasma através da activação directa do factor X. Os anticorpos LA prolongam o tempo decoagulação do reagente de rastreio LA 1.

2. O reagente de conrmação LA 2 é semelhante ao reagente de rastreio LA 1, mas contém umaconcentração de fosfolípidos superior. Estes fosfolípidos adicionais reagem contra o anticorpoLA corrigindo, assim, largamente, o tempo de coagulação3.

3. O teste DRVVT ilude o factor VII do sistema extrínseco da coagulação do sangue e os factoresde contacto e antihemofílicos do sistema intrínseco. Por isso, o reagente de rastreio LA 1 é maisadequado para a detecção especíca de LA do que os testes APTT, uma vez que não é afec-tado pelas anomalias do factor de contacto, nem pela deciência de factor VII ou anticorpos 6.Foi desenvolvida uma série de testes com base na correcção de fosfolípidos4, mas nenhum semostrou, de longe, tão adequado como a utilização do reagente de conrmação LA 2, a seguirao reagente de rastreio LA 1.

4. Para excluir a deciência de factores II, V e X que prolongaria o resultado do teste com oreagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2, também podem ser úteis testesde reposição de plasma. Misturando o plasma normal com o plasma de teste, os factores emfalta são novamente aportados. Se o teste de reposição de plasma continuar a originar temposde teste prolongados, isso indica a presença de um inibidor (como o LA) no plasma de teste.Normalmente, um tempo de coagulação prolongado que também não foi corrigido misturandoo plasma do paciente com o plasma normal, indicia um inibidor circulante 3, 10.

ReagentesComposiçãoO reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 contêm o veneno da víbora deRussell, fosfolípidos, agentes antiheparínicos, cálcio, solução tamponada, estabilizadores, azidade sódio e corantes.

Advertências e medidas de precauçãoSó para uso diagnóstico in-vitro .Em caso de eliminação no esgoto, lavar com água abundante para evitar a formação de substân-cias explosivas nos canos de esgoto metálicos.

Preparação dos reagentesDissolver o conteúdo do frasquinho com a quantidade de água destilada indicada no rótulo. Mis -turar o conteúdo agitando cuidadosamente, para garantir a ressuspensão integral do materialliolizado.

Estabilidade e condições de conservação

Se os reagentes liolizados forem conservados entre + 2 e + 8 °C, são estáveis, no mínimo, até àdata impressa no rótulo do frasco.Após reconstituição, os reagentes podem ser conservados durante 8 horas à temperatura de + 37 °C,24 horas entre + 20 e + 25 °C, 48 horas entre + 2 e + 8 °C e um mês a -20 °C.

Indícios de instabilidade e caducidadeSe, ao abrir o frasquinho, não se constatarem sinais claros de vácuo e/ou se o reagente não tivero aspecto de seco, deverá ser devolvido à Siemens Healthcare Diagnostics.

Colheita e preparação da amostraO sangue deverá ser colhido e processado em conformidade com a norma H21-A3 NCCLS sobrea colheita, o transporte e o processamento de amostras de sangue para testes de coagulação e adirectiva geral aprovada para a realização de ensaios de coagulação - 3ª edição (1998). O plasmaseparado deverá ser conservado entre + 2 e + 8 °C e utilizado no teste num período de tempo de4 horas após a colheita.Se as amostras tiverem de ser congeladas antes da realização do teste, antes de ser congelado,o plasma tem de ser centrifugado duas vezes, para remover as plaquetas sanguíneas (inferioresa 10 x 109 /l)10, já que estas, caso contrário, podem encurtar o tempo de coagulação do reagentede rastreio LA 1.

Procedimento1. Aquecer, previamente, num tubo de ensaio com uma capacidade mínima de 200 µl por teste,

um pouco mais do que a quantidade necessária de reagente de rastreio LA 1 e/ou reagente deconrmação LA 2, à temperatura de +37 °C ± 1 °C .

2. Introduzir 200 µl de plasma do paciente num tubo de ensaio de vidro e incubar durante 1 minutoa +37 °C.3. Adicionar ao plasma os 200 µl de reagente de rastreio LA 1 ou reagente de conrmação LA 2

pré-aquecidos e medir o tempo desde a adição do reagente, até à conclusão da reacção decoagulação.

4. Repetir o teste para determinações duplas e formar o valor médio dos resultados do teste.

Método automatizadoA pedido, são disponibilizadas os protocolos de teste para os analisadores da Siemens.Tal como para a maioria dos protocolos para o tempo de trombina, os testes com o reagente derastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2 deverão ser executados utilizando os mesmosvolumes de plasma de teste e reagente. Contudo, o tempo de registo e de interpretação do valormedido deverá ser ampliado em aprox. 120 segundos.

Conteúdo da embalagem comercial

LA 1 [REAGENT], [REF] OQGP com

10 xl 2 ml LA 1 [REAGENT], Reagente de rastreio LA 1

LA 2 [REAGENT], [REF] OQGR com

10 xl 1 ml LA 2 [REAGENT], Reagente de conrmação LA 2

Outros materiais necessáriosTubos de ensaio com 10 mm x 75 mm,Pipeta para 200 µl, 1 ml, 2 ml ou 5 mlBanho-maria, cronógrafoÁgua destilada (pureza USP ou similar)Controlo LA elevado ([REF] OQWD)Controlo LA baixo ([REF] OQWE)

Controlo de qualidadeCada laboratório deverá determinar os intervalos de conança próprios dos seus controlos e umintervalo normal.O controlo LA elevado ([REF] OQWD) e o controlo LA baixo ( [REF] OQWE) são fornecidos pelaSiemens para o controlo de qualidade do reagente de rastreio LA 1 e do reagente de conrmação LA 2.  As determinações dos plasmas de controlo e das amostras do paciente têm de ser executadasem simultâneo.

ResultadosSe o tempo de coagulação LA 1 se situar no intervalo normal, eventualmente não serão neces-sários mais testes de LA. Se o tempo de coagulação de LA 1 for superior a 2 SD ou aprox. 20 %mais prolongado que o valor médio do plasma normal (idealmente n ≥ 20), o resultado deverá serconsiderado como anormal e a análise deverá continuar (veja a gura 1).A melhor forma de exprimir o resultado nal é a relação (ratio) entre o tempo de coagulação doreagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2.

tempo de coagulação do reagente de rastreio LA 1Ratio LA = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 tempo de coagulação do reagente de conrmação LA 2

Figura 1

1

Teste de reposição de plasmaPara corrigir os resultados incorrectos da amostra e claricar a presença de LA, nos casos emque os resultados são duvidosos, podem ser executados testes de reposição de plasma. Nestestestes, que deverão ser executados como o teste standard normal, a relação entre a amostra deplasma e o plasma normal deverá ser de 50:50 ( para os testes de reposição de plasma não deveser utilizado o plasma de controlo N da Siemens).

Tabela 1: Combinação dos testes de reposição de plasma com os testes de conrmação

LA 1 LA 2 Diagnóstico

Plasmado paciente

Mistura patiente + normal

Plasma do paciente

Mistura patiente + normal

N N N N Sem detecçãode LA

ABN ABN N N Detecção de LA

ABN N ABN N Deciência defactor/OAT

ABN ABN ABN N LA + deciência defactor

ABN ABN ABN ABN Outro inibidor

Para compensar os desvios das diferentes combinações de reagentes ou aparelhos, pode ser útilcalcular um ratio normalizado. Para a normalização são usados os tempos médios de coagulaçãodo plasma normal testado no laboratório do utilizador com o reagente de rastreio LA 1 e o rea -gente de conrmação LA 2. Isso pode facilitar a diferenciação entre as amostras LA normais e asamostras fraco-positivas.

reagente de rastreio LA 1 pacienteRatio normalizado = –––––––––––––––––––––––––––––––––––––––– 

tempo médio normal do reagente de rastreio LA 1

x

  tempo médio normal do reagente de conrmação LA 2  ––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––

 reagente de conrmação LA 2 do paciente

Para a interpretação dos ratios, também pode ser usado o uxograma na gura 1.

Limites de execução do testeAs amostras com coágulos já existentes e valores de hematócritos anormais devem ser rejeitadas.As amostras hepáticas, lipémicas e hemolíticas devem ser testadas com métodos manuais, já quealguns instrumentos fotométricos fornecem resultados errados.

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A utilização de plasmas de controlo adquiríveis no comércio, sem indicação da concentração decitrato e de plaquetas, não é aconselhável.Em caso de análises comparativas, os testes com o reagente de rastreio LA 1 e o reagente deconrmação LA 2 devem ser executados ao mesmo tempo.Deverão ser realizados, no mínimo, 2 testes de rastreio, baseados em 2 princípios de teste dife-rentes. Além disso, deverá ser executado um teste de reposição de plasma para a vericação daexistência de um inibidor de coagulação e um teste de conrmação para documentar a depen-dência fosfolípida10.As concentrações de heparina até 1 unidade/ml não têm quaisquer efeitos, já que tanto o reagentede rastreio LA 1, como o reagente de conrmação LA 2 contêm neutralizadores adequados.Os resultados deste teste devem sempre ser interpretados em conjunto com o histórico médico dodoente, estado clínico e outros dados de interesse.

Valores expectáveisCom amostras de 26 pessoas saudáveis com a idade entre 18 e 55 anos, obteve-se um intervalo

normal de 31 - 44 segundos para o reagente de rastreio LA 1 e um intervalo normal de 30 - 48segundos para o reagente de conrmação LA 2, utilizando um método manual. O ratio LA 1 : LA2 andou no intervalo entre 0,8 e 1,2. Estes resultados constituem apenas um ponto de referência.

  rastreio LA 1Se a relação –––––––––––––– for superior a 2,0, a presença de LA é forte 

conrmação LA 2

  rastreio LA 1Se a relação –––––––––––––– se situar entre 1,5 e 2,0, a presença de LA é moderada 

conrmação LA 2

  rastreio LA 1Se a relação –––––––––––––– se situar entre 1,2 e 1,5, a presença de LA é fraca 

conrmação LA 2

Cada laboratório deverá determinar o seu intervalo normal próprio para os métodos de teste auto-máticos e manuais, para compensar as diferenças da colheita de amostras e dos aparelhos.

Características de performance do testeEstudos de precisão intra e inter-laboratoriais foram executados com o método manual (tilt tube) ecom o método automatizado. Estas análises forneceram coecientes de variação inferiores a 3,5 %nos plasmas normais e inferiores a 5 % nas amostras anormais.Os estudos de especicidade foram executados com amostras de plasma conhecido.Nos plasmas* seguintes, entre o reagente de rastreio LA 1 e o reagente de conrmação LA 2obteve-se um ratio positivo superior a 1,2:

Plasma LA 90 % (26/29)Plasma heparinizado 12 % (1/8)Plasma de pacientes OAT 0 % (0/7)Plasma com deciência de factor 0 % (0/5)Plasma normal 2 % (1/60)

* Nestes plasmas, o LA foi detectado com os testes de reposição de plasma APTT+KCT.

BibliograaVeja o prospecto da embalagem em inglês.

Edição Outubro 2008