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La structure des protéines Hervé Darbon [email protected] Support de cours: http://master.afmb.univ-mrs.fr/ Rubrique: supports de cours/BIO71
identifiant: etudiant_2012-2013 passwd: BBSG2012
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L2 BIO71
Structure et fonction des protéines • Organisation de l’enseignement:
• Acides aminés et leurs modifications • La liaison peptidique, géométrie et chimie • Les interactions non-covalentes et les structures secondaires • Le repliement tridimensionnel et l’organisation quaternaire • Relations structure/fonction: les protéases • Les protéines non structurées, la chute d’un dogme? • Approches méthodologiques
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Les protéines peuvent avoir plusieurs fonctions -Catalytique (enzyme) -Reconnaissance moléculaire (anticorps) -Transport (hémoglobine) -Structurale (collagène)
En raison de leur implication dans le vivant, leur étude est importante en médecine (médicament).
Par leurs activités: reconnaissance moléculaire, enzyme, nanotechnologie … Elles ont de très nombreux intérêt en biotechnologie.
De plus par leurs structures, elles livrent des informations cruciales sur l'évolution du monde vivant et sur les mécanismes du vivant
L'étude des protéines est à la fois utile en recherche appliquée et en recherche fondamentale
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La structure des protéines se décompose en 4 parties
La structure primaire. La structure primaire est la séquence en acide aminé. Elle est codée par le génome. La structure secondaire La chaine polypeptidique adopte des repliements préférentiels. Hélice ou feuillet. La structure tertiaire La chaine polypeptidique se replie en domaines plus ou moins globulaires La structure quaternaire Plusieurs chaines polypeptidiques (différentes ou non) s'associent. Oligomères, homo-oligomère
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Parfois, il faut aussi l'ajout d'autres groupes chimiques (Cofacteurs, métaux,…). Pour garder l'intégrité de la fonction, il faut que le repliement soit correct. Dogmatisme: La séquence primaire code pour la structure spatiale Au-dela du dogme: Protéines naturellement non-structurées
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La structure primaire est l’enchainement des acides aminés (liaison peptidique) C’est la séquence primaire.
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Les acides aminés
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Introduction Structure générale Conformation Propriétés des chaînes latérales Ionisation Méthodes de séparation
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Introduction
Protéines : combinaison de 20 acides aminés (aa) (peptide=fragment de protéine)
1 aa ~ 110 Da (1 Da=1/12 masse mole12C, eq 1g)
-Acides aminés rares (citruline, ornithine, acide pyroglutamique, acide gamma-aminobutyrique…)
-Modifications des chaines latérales -groupements réactionnels
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Introduction Structure générale Conformation Propriétés des chaînes latérales Ionisation Méthodes de séparation
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Structure des acides aminés
20 groupements R donc 20 acides aminés
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• Fonctions -COOH et -NH2 ionisables
• Propriétés essentielles pour fonction et séparation des aa
• Fonction acide : R-COOH + H2O <=> R -COO- + H3O+ pKa ~ 3
(AH) (A-)
• Fonction amine : R-NH3
+ + H2O <=> R -NH2 + H3O+ pKa ~ 8
(BH+) (B)
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Ionisation
• Calcul du degré d'ionisation en fonction du pH :
→ Charge nette d'un aa
Acide : COOH
COO log pKa pH - + =
Acide conjugué d'une base :
+ + = BH B log pKa pH
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Acides faibles / Acides forts
• Acide fort : [H+] = [Acide]
Ex. : HCl 0,1 M => pH = 1
AH = acide
• Acide faible (acides aminés, base) : ionisation partielle
AH A- + H+
A- = base conjuguée
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Acides faibles
• Acide acétique : Ka = 1,76 . 10-5 M
soit pKa = 4,75 car pKa = - log Ka
• On obtient : Ka = [A-] [H+]
[AH]
CH3COOH CH3COO- + H+
Si [CH3COOH] = [CH3COO-], Ka = [H+] D’où pH = pKa
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Bases faibles
• Acide conjugué (BH+) d'une base faible B :
BH+ B + H+
Ka = [B] [H+]
[BH+] On obtient :
• Pour l'ammoniaque, pKa = 9,25
NH4+ NH3 + H+
Si [NH4+] = [NH3], pH = pKa = 9,25
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• Formes ioniques en fonction du pH :
C COOH
NH3+
R H C
R H N H 2
COO-
C COO-
R H NH3
+
3 6 10 8
pKa1 ~ 3 pKa2 ~ 8
charge + 1 0 - 1
A un pH donné, certains aa sont sous la forme zwitterion (charge nette = 0)
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Courbes de titrage
• Relation d'Henderson-Hasselbalch :
log Ka = log [A-] [H+] [AH]
pH = pKa + log [A-] [AH]
• Pour une base faible :
pH = pKa + log [B] [BH+]
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• Tracé rapide des courbes de titrage,
3 points particuliers :
[A-] = [AH] pH = pKa [A-] = 10 [AH] pH = pKa + 1
[A-] = 1/10 [AH] pH = pKa - 1
Courbes de titrage
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Cas de la Lysine
• Point isoélectrique (pHi)
9,4 2
10,8 8 pHi soit 2
pKa1 + pKa2 pHi = +
= =
C H N H 3 + C O O H
C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 N H 3 +
C H N H 3 + C O O -
C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 N H 3 +
C H N H
+
C O O -
C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 N H 3
C H C O O -
C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 N H 2
N H 2
pKa = 3,1 pKa = 8 pKa = 10,8
Charge + 2 + 1 0 - 1
2
pH 1
14
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Stéréochimie des acides aminés
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Le Cα est en général asymétrique
Ex : l'alanine C +H 3 N H COO-
C H 3 C COO-
C H 3 N H + 3 H
L - Ala D - Ala
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Nomenclature :
On utilise un code soit à 3 lettres soit à 1 lettre
Exemple : Alanine = Ala = A
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Leucine Leu, L Lysine Lys, K Méthionine Met, M Phénylalanine Phe, F Proline Pro, P Sérine Ser, S Thréonine Thr, T Tryptophane Trp, W Tyrosine Tyr, Y Valine Val, V
Alanine Ala, A Arginine Arg, R Asparagine Asn, N Acide aspartique Asp, D Cystéine Cys, C Glutamine Gln, Q Acide glutamique Glu, E Glycine Gly, G Histidine His, H Isoleucine Ile, I
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• 20 aa codés. • acides aminés
générés post-traductionel.
Les acides aminés dans la chaîne peptidique
Généralités:
http://www.geniebio.ac-aix-marseille.fr/biomol/docs/tradu.html
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Propriétés physicochimiques des chaines latérales
• -Fondamentales dans la fonction des protéines – Acides aminés
hydrophyles/hydrophobes acides/basiques aromatiques souffrés encombrement stérique
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Les chaînes latérales sont importantes pour la structure mais confèrent aussi une fonctionnalité Les chaînes chargées et polaires peuvent former des liaisons hydrogène spécifiques à l'origine de la spécificité des interactions protéine-ligand ou protéine-protéine Les chaînes non-polaires sont importantes dans le support de l'architecture des protéines, le repliement et les interactions protéine-protéine
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Conformation de la Chaine Latérale
Les chaines latérales différent: - en longueur -dans le nombre de degrés de
liberté conformationnelle
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Glycine (Gly, G)
§ Acide aminé avec la plus grande flexibilité conformationnelle. § C’est l’acide aminé le moins encombrant.
Mw: 75 Pka R::
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Alanine (Ala, A)
l Chaîne latérale courte l Pas de réactivité chimique l Tendance hydrophobe l Intéraction avec d’autres groupes hydrophobes
Mw: 89 Pka R::
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Proline (Pro, P)
l Chaîne latérale cyclisée (Importance conformationnelle)
l Pas de réactivité chimique l Tendance hydrophobe l Deux conformations: trans (90% et cis (10%)
Mw: 115 Pka R::
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Valine (Val, V)
l Hydrophobe l Intéraction avec d’autres groupes hydrophobes l Pas de réactivité chimique
Mw: 117 Pka R::
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Leucine (Leu, L)
l Hydrophobe l Intéraction avec d’autres groupes hydrophobes l Pas de réactivité chimique
Mw: 131 Pka R::
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Isoleucine (Ile, I)
l Hydrophobe l Intéraction avec d’autres groupes hydrophobes l Pas de réactivité chimique l Isomère de la Leucine (même formule brute)
Mw: 131 Pka R::
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Serine (Ser, S)
l Hydrophile, polaire l Partenaire de liaisons hydrogènes l Réactif (trouvés dans les centres actifs
d’enzymes) l Phosphorylation post-traductionnelle (kinase)
Mw: 105 Pka R::
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Thréonine (Thr, T)
l Hydrophile l polaire l Partenaire de liaisons hydrogènes l Réactif (moins que Ser), centres actifs
l Phosphorylation post-traductionnelle (kinase)
Mw: 119 Pka R::
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Ser/Thr (O-Glycosylation) • Modification des résidus de
Sérine (Ser) et/ou de Thréonine (Thr)
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Méthionine (Met, M)
l Hydrophile mais peu réactif l Partenaire de liaisons hydrogènes l chaîne latérale très mobile, “solubilisateur” de
protéines globulaires l Fréquemment exposés au solvant et participant
à des ponts salins l trouvés dans le centre actif de protéines
Mw: 149 Pka R::
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Cystéine (Cys, C)
l Hydrophile l Partenaire de liaisons hydrogènes
Mw: 121 Pka R: 8::
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Cystéine/cystine: Oxydation/réduction
-L'oxydation de 2 cystéines proches dans l’espace forme un pont disulfure (liaison covalente). -Le pont disulfure est hydrophobe -Peut être catalysé par la protéine disulfide isomérase -Peut servir à se protéger contre un stress oxydatif, de capteur d'oxydation. -La possibilité de faire une liaison covalente inter ou intra moléculaire augmente la stabilité de la molécule (protéine sécrétées, toxine)
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l Critères pour liaison:
l 2 Cys à 4-7.5 Å une de l'autre l conformation correcte
l Conformations Typiques
Spirale Gauche (vecteurs Cα-Cβ anti-parallèles)
Crochet vers la droite (vecteurs Cα-Cβ
“ parallèles ”)
Cystine (pont disulfure)
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Cystéine/cystine: Oxydation/réduction
SH lié (à un ligand)
l Différents métaux et groupes prosthétiques (Fe, Zn, Cu, l parfois dans des paires de Cys séparées par 1-2 résidus
S-S Pont disulfure
Résidu de Cystine oxydat
l Une des liaisons plus fortes pour stabiliser les protéines l Aucun rôle dans le repliement – Formation de la liaison une fois la protéine repliée
oxygène
R-SH
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Cystéine: carboxymethylation
Pour « bloquer » un pont disulfure en position ouverte!
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Phenylalanine (Phe, F)
l anneau aromatique (stacking pi)
l hydrophobe
l chaîne latérale très volumineuse
l Absorbance UV (tres faible, 254m)
Mw: 165 Pka R: ::
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Tyrosine (Tyr, Y)
l anneau aromatique (stacking pi)
l Hydrophobe
l Liaison hydrogène
l chaîne latérale très volumineuse
l Absorbance UV (277nm, x5)
Mw: 181 Pka R: 10::
Peut-etre iodée (125I) = marquage radioactif phosphorylable
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Tryptophane (Trp, W)
l anneau aromatique (staking pi)
l Hydrophobe
l Liaison hydrogène
l chaîne latérale très volumineuse
l Absorbance UV (282nm, x25)
Mw: 204 Pka R: ::
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Très utile pour la quantification des protéines en solution
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Histidine (His, H)
l Chaine latérale cyclique l Ionisable à pH physiologique l Nombreuses possibilités de modification
chimiques, mais peu spécifiques.
Mw: 155 Pka R: 6::
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Asparagine (Asn, N)
l Hydrophile, polaire non chargé à pH
physiologique l Partenaire de liaisons hydrogènes l Réactif
l Modifications post-traductionnelles
Mw: 132 Pka R: ::
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Asparagine (N-glycosylation)
ne fonctionne pas sur Gln (problèmes géométriques)
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Glutamine (Gln, Q)
l Hydrophile l Partenaire de liaisons hydrogènes l Réactif l Peut se cycliser en « pyroglu »
Mw: 146 Pka R: ::
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Aspartate (Asp, D)
l Hydrophile l Ionisable (chargé au pH physiologique, modifiable) l Partenaire de liaisons hydrogènes l Fréquemment exposés au solvant et participant à
des ponts salins l Souvent trouvés dans le centre actif de protéines
Mw: 133 Pka R: 4::
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Glutamate (Glu, E)
l Hydrophile l Ionisable (chargé au pH physiologique), modifiable l Partenaire de liaisons hydrogènes l Fréquemment exposés au solvant et participant à des
ponts salins l Souvent trouvés dans le centre actif de protéines
Mw: 147 Pka R: 4::
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Lysine (Lys, K)
l Hydrophile, ionisable (chargé à pH physiologique) l Partenaire de liaisons hydrogènes l chaîne latérale très mobile, “solubilisateur” de
protéines globulaires l Fréquemment exposés au solvant et participant à
des ponts salins l trouvés dans le centre actif de protéines
Mw: 146 Pka R: 10::
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Arginine (Arg, R)
l Hydrophile l Partenaire de liaisons hydrogènes, l chaîne latérale très mobile, “solubilisateur” de
protéines globulaires l Fréquemment exposés au solvant et participant
à des ponts salins l trouvés dans le centre actif de protéines
Mw: 174 Pka R: 12::
Guanidinium plan
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Résidu acide ou basique
chargé positivement N-term, Lys, Arg Chargé négativement C-term, Asp, Glu L'histidine et la cystéine sont les acides aminés dont les pKa sont les plus proches du pH physiologique.
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Les plus hydrophobes: Ile, Leu, Val, Ala, Cys, Met, Phe Les plus polaires : Arg, Lys, Asp, Asn, Glu, Gln, His
hydrophobicité
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
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ratio: %enfouie/ %surface
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
Ala Arg Asn Asp Cys Gln Glu Gly His Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Trp Tyr Val
Les plus enfouis: cys (oxydation), Ile, Leu, Val, Trp, Phe, Met, Ala (cœur hydrophobe) Les résidus en surface: Arg, Lys (Charge), Glu, Asp, Gln, Asn. La tyrosine est plutôt en surface
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Propension de réactivité pour chaque acide aminé
Les acides aminés les plus réactifs sont : His, Cys (Pka ~7), Asp (court et chargé) Les moins réactifs: hydrophobes aliphatiques (I, L, V, A)
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La notion d'hydrophobicité est plus compliquée car certains résidus sont à la fois hydrophobes et polaires. Ex Lys (chaine aliphatique+ amine), Thr (groupe méthyle + alcool), Tyr (groupe phényle+ alcool).
Il faut avoir la structure 3D pour comprendre le rôle du résidu
De plus, la solubilité change en fonction de l'état d'ionisation. Ex Cys (S-H, S-). La solubilité change aussi en fonction de l'état des cystéines . (le pont disulfure est beaucoup moins soluble que la cystéine libre) Les pKa sont dépendants de l’environnement
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Acides aminés hydrophobes
C O O - C H
+ H 3 N C H C H 3 C H 2 C H 3
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
ILE, I LEU, L
C H C H 3 3 H C
C O O - C H
+ H 3 N C H 2
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
ALA, A
C O O - C H
+ H 3 N C H 3
VAL, V
C O O - C H
+ H 3 N C H
C H 3 3 H C GLY, G
C O O - C H
+ H 3 N H
PRO, P
C H 2 +
2 H N
C H 2
C O O -
2 H C C H
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Acides aminés aromatiques règle de Hückel:
Une molécule chimique est aromatique s'il est plan et s'il possède 4n + 2 électrons délocalisables dans un système cyclique (où n est un entier naturel)
C O O - C H
+ H 3 N C H 2
PHE, F
NH
C H 2 + H 3 N
H C C O O -
TRP, W TYR, Y
C O O - C H
+ H 3 N C H 2
O H
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
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Acides aminés soufrés
COO- C
H +H3N
CH2
SH
CYS, C MET, M
S
CH3
COO- C
H +H3N
CH2
CH2
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Acides aminés hydrophiles neutres
THR, T
C O O - C H
+ H 3 N C C H 3
H O H C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N C O O - C
H + H 3 N
SER, S
C O O - C H
+ H 3 N C H 2 O H
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
GLN, Q
C O N H 2
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C H 2
ASN, N
C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C
O N H 2
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
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Acides aminés hydrophiles basiques
HIS, H
C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C C H
+ H N C H
N H
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
ARG, R
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C H 2 C H 2 N H C
2 H N N H 2 + LYS, K
C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C H 2 C H 2 C H 2 N H 3 +
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
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Acides aminés hydrophiles acides
ASP, D
C O O - C H
+ H 3 N C H 2 C
O O -
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
GLU, E
C O O - C H
+ H 3 N C H 2
O - O C C H 2
C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N C O O - C H
+ H 3 N
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aa essentiels (9) (non synthétisés par la cellule, donc
apport exogène)
His, H Ile, I
Leu, L Lys, K Met, M Phe, F Thr, T Trp, W Val, V
aa non essentiels (11)
Ala, A Arg, R Asn, N Asp, D Cys, C Glu, E Gln, Q Gly, G Pro, P Ser, S Tyr, Y
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Introduction Structure générale Conformation Propriétés des chaînes latérales Ionisation Méthodes de séparation
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• Fonctions -COOH et -NH2 ionisables
• Propriétés essentielles pour fonction et séparation des aa
• Fonction acide : -COOH + H2O <=> -COO- + H3O+ pKa ~ 3
(AH) (A-)
• Fonction amine : -NH3
+ + H2O <=> -NH2 + H3O+ pKa ~ 8
(BH+) (B)
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Ionisation des chaînes latérales
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