La regolazione secondo…

Biochimica classica o MCA?

Rohwer and Hofmeyr (2010) Kinetic and Thermodynamic Aspects of Enzyme Control and Regulation. J. Phys. Chem. B, 114:16280–16289.

http://web.campbell.edu/faculty/nemecz/323_lect/glycolysis/images/regulation1.jpg

Regulation of Glycolysis

What is the contribution of thermodynamics to the rate of a chemical reaction, whether catalyzed or uncatalyzed? Distinguishing between near-equilibrium and far-from-equilibrium reactions

Come descriviamo la regolazione (della velocità) dei singoli enzimi e dei flussi?

Basta sapere i ΔG/ΔG°'?

A B←→vf

vr

atto III(ovverosia la cinetica)

vf = Kf [A] vr = Kr [B]

All’equilibrio vf = vr e quindi Kf [A] = Kr [B] e cioè

Kf / Kr = ([B] / [A]) = Keq

Se non siamo all’equilibrio, allora vf ≠ vr .

Quanto differiscono? Quanto vale vr / vf ?

Facciamo un passo avanti richiamando alcune nozioni di cinetica

Vale la disequilibrium ratio!

A B←→vf

vr

→ →v v

eqf

r

K

Q

AK

BK

][

][

v

v

f

r

Q o Γ

Se questa reazione fuori dall’equilibrio è immersa in una via (pathway) il cui flusso è v (velocità netta), allora:

Keq

In una via allo ss, J = v = vf - vr

o anche vf = vr + v , per cui:

1vf

Se la reazione è vicina all’equilibrio (ρ 1), allora: v << vf vr

Se la reazione è lontana dall’equilibrio (ρ 0), allora: v vf e vr 0

f

f

f

r

v

-v

v

v v

Generalizzando la reazione:

To assess the contributions of kinetics and thermodynamics to reaction rate one could plot v against a in linear rate and concentration space

Il contributo dei due termini è difficile da interpretare perché i termini si moltiplicano

Ma usando ln(v)The rate is mainly determined by the forward rate (i.e., by kinetics)

When >0.9, then v is mainly determined by the distance from equilibrium.

The thermodynamic function dominates

Net rate of the chemical reaction as a function of the concentration of A

=0.9=0.1

Questo tipo di ragionamenti hanno convinto i biochimici di 50 anni fa che le reazioni vicine all’equilibrio sono catalizzate da enzimi presenti in eccesso e quindi questi enzimi non potranno essere limitanti per il flusso.

Al contrario, in una reazione lontana dall’equilibrio catalizzata da un enzima, la velocità della catalisi è poco più grande del flusso, per cui è potenzialmente limitante.

Se una reazione è già vicina all’equilibrio, e noi aggiungiamo enzima, la reazione si avvicinerà ancora un poco all’eq., ma non ci sarà un grande aumento di P per cui non ci sarà propagazione del segnale, al contrario di reazioni lontane dell’eq.

Quando la reazione è vicina all’equilibrio (ρ 1), allora: v << vf vr

Alla ricerca del Rate Limiting Step (RLS)

Tutti i ragionamenti sopra descritti hanno portato a postulare che in una via metabolica,

“quando un processo è dipendente, per quanto riguarda la sua velocità, da numerosi fattori separati, la velocità dell’intero processo sarà determinata dal più lento dei fattori” (Blackman, 1905)* (vedi anche Voet e Voet, p350)

Cosa vuole dire in realtà “dal più lento dei suoi fattori” se in una via metabolica tutte le reazioni vanno alla stessa velocità (che corrisponde al flusso J della via)?

Questo è verificato sperimentalmente nelle reazioni ed es. di decadimento, o anche in reazioni chimiche a molti stadi

Il RLS del flusso autostradale (ma descrive il metabolismo?)

Fuorviante per due motivi: v dipende da S e da P (e può anche tornare indietro!)

Il Rate Limiting Step significa:

Che la velocità di una via possa essere variata solamente cambiando l’attività di un particolare enzima.

5. Regulatory Enzyme

In metabolic pathway, there is at least one enzyme that set the rate of

overall sequence ……… Regulatory Enzyme

Example : Glycolysis pathway → Hexokinase, Pyruvate kinase ect.

There are two major classes of regulatory enzymes in metabolic pathway.

(1) Allosteric enzyme : function through reversible, noncovalent binding of

regulatory compounds → allosteric modulator

Allosteric modulator → small metabolites, cofactor…..

activator (positive), inhibitor (negative)

(2) Other enzyme : reversible covalent modification

Da Lehninger

…ma come identificarlo?

Un enzima potenzialmente regolatore è stato definito come:

* quello che catalizza una reazione lontana dall’equilibrio

* la cui attività è controllata da fattori diversi dai substrati

* l’enzima che risponde al primo segnale metabolico e che provoca i successivi cambiamenti nell’attività dei restanti enzimi

Per questo lo studio del controllo del metabolismo coincideva essenzialmente con l’identificare i RLS. Si è cercato prima di identificare gli enzimi potenzialmente regolatori e poi, tra questi, quello che fosse “il” RLS.

10-7

10-2

10-3

10-4

10-6

10-5

1

10-1

Pho Pgl Trn Hek Gpi Pfk Pgm Eno Pyk

Displacement of reaction in perfused Rat heart

ρNella glicolisi quali sono gli enzimi più lontani dall’equilibrio?

Nella glicolisi nel cuore di ratto presenta almeno quattro reazioni con un ρ più piccolo di 0.1 (valore indicativo) per cui non si può decidere quale sia il RLS

Proviamo a cercare un altro indicatore valido per identificare il RLS. Storicamente ne sono stati proposti diversi, come ad esempio il valore del rapporto tra massima attività catalitica e flusso nella via (VM / J); quanto più il rapporto è tendente a 1 tanto più l’enzima sarà limitante

1

102

10

Relative enzyme activities in perfused Rat heart

103

Pho Pgl Hek Gpi Pfk Ald Tim Gad Pgk Pgm Eno Pyk Lad

Nella glicolisi quali sono gli enzimi con maggiore VM ?

J

VMax

Nella glicolisi la Vmax di molti enzimi sembra in largo eccesso rispetto al flusso

Anche qui non possiamo definire con certezza quale sia il RLS

Questi metodi non arrivano a conclusioni univoche, per cui si ricorreva spesso a conferme con criteri diversi (cross-over, misure di flussi con isotopi, presenza di regolatori allosterici, mutanti metabolici, aggiunta di intermedi…)

La presenza di un RLS (anche detto Rate Determining Step) cosa comporta?

1) il flusso a questo step vari in risposta alla richiesta metabolica

2) la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via

Vedi trattazione sulla propagazione della variazione (V&V, p.470)

In una via allo ss, J = vf - vr

Se esistesse un RLS, questo comporterebbe:

1) che l’enzima sia il primo a cambiare attività (flusso)

2) e che la variazione di flusso sia trasmessa lungo la via attraverso un aumento del prodotto

Se il prodotto A passa da [A] ad ([A] + Δ[A]), il flusso varia

ΔJ = Δvf Come esprimiamo vf?

Come si propaga la variazione di flusso a partire da un RLS? (secondo Voet & Voet)

Se [A]<< KM allora:

that is, the fractional change in reaction rate is equal to the fractional change in sustrate conv.

Se [A]<< KM allora:

Inoltre l’assunzione per cui [A]<< KM rischia di essere irreale

C’è contraddizione tra le due espressioni: come posso descrivere una reazione reversibile con una MM irreversibile???

… spesso le [Si] sono ~KM (se non maggiori)

<<

THIS IS ALL CRAP! Gli enzimi sono reversibili

Non si può fare di necessità virtù nel caso degli enzimi*. Abbiamo bisogno di un modo di ragionare diverso e soprattutto quantitativo.

Tutti gli enzimi (vicini o lontani dall’equilibrio) influenzano il flusso (con meccanismi diversi)

Le vie metaboliche hanno variazioni incredibili di flusso con piccole variazioni di concentrazione degli intermedi:

nella glicolisi si verifica un aumento di flusso di 100-1000 volte ma la concentrazione degli intermedi aumenta di circa 10 volte.

The law of the flush (1)(legge dello sciacquone)

A

B

Δh

hA

hB

Flux (l/s) = πr4Δp/8ηΔx

Δp=kΔh

In metabolic terms ΔG is the driving force and Vmax the flux carrying capacity (amount of enzyme). When ΔG is large Vmax can be small.

F6P + ATP F1,6BP + ADP ΔG= -22 KJ/molReazioni lontane dall’eq.

r: raggio del tubo

Δp: differenza di pressione

η: viscosità del liquido

Δx: lunghezza del tubo

(Δp/Δx)= driving force

πr48η = Flux carrying capacity

The law of the flush (2)

G6P F6P ΔG= -1.4 KJ/molReazioni vicine all’eq.

When the driving force ΔG is small, Vmax (amount of enzyme) must be high

Flux (l/s) = πr4Δp/8ηΔx

v

S

P=0

P=1

P=3

P=5

Vmax=5 KS = 0.5Keq = 1KP = 1

S =5.05

PS

eqS

KPKS

KPSKVv

//1

)/()/( max

Velocità di un enzima MM reversibile in presenza di quantità crescenti di Prodotto

Mantenendo S costante e vicino al valore di equilibrio, la velocità, in presenza di quantità crescenti di P, crolla

P = 0, v = 4.56P = 1, v = 3.35P = 3, v = 1.45P = 5, v = 0.031

Che relazione tra v e Vmax?

Reazioni con ΔG ~0

S =5.05

vP = 0, v = 4.56P = 1, v = 3.35P = 3, v = 1.45P = 5, v = 0.031

S =5.05

P=3

P=5

(VP=0/VP=5) = 150 ≈ Vmax/Vin vivo

an enzyme ‘close to equilibrium’ has to be in large excess to keep the reaction close to equilibium

P=0

P=1

P=3

P=5

Vmax=5 KS = 0.5Keq = 1000KP = 1

S =5.05, P = 0, V = 4.55S =5.05, P = 1, V = 4.17S =5.05, P = 3, V = 3.57S =5.05, P = 5, V = 3.13

S =5.05

PS

eqS

f

KPKS

KPSK

V

v//1

)/(

Un enzima con Keq molto grande sente molto meno questo problema (a meno che P non sia più grande di S di vari ordini di grandezza )

È una reazione con ΔG°′ <<0

A systemic viewCombinando reazioni vicine o lontane rispetto all’equilibrio

Per le reazioni che sono lontane dall’equilibrio occorre avere dei limitatori del flusso, altrimenti il serbatoio a monte si svuota e quello a valle si riempie

Per le reazioni vicine all’equilibrio, il flusso si si riduce quanto più ci si avvicina all’equilibrio. Un flusso dignitoso richiede un tubo grosso, perchè la driving force è piccola.

La relazione tra ΔG e ΔG°'

Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Young’s Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp. 135-148 in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain. articolo disponibile a: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/harden.htm

Su questi aspetti: Morandini (2009) Plant Science 176:441-451.

Non sempre le reazioni con un ΔG°' grande presentano poi anche un ΔG grande. Qui si spiega il perché…

Table 1. Thermodynamic characteristics of the early reactions of fermentation

What happens at a physiologically realistic concentration(around 50 μM) for both [G3P] and [DHAP]?

the concentration of fructose 1,6-bisphosphate at equilibrium will be 37 μM

The use of ΔG0′ referred to above to predict which direction of reaction is favoured is worse than naive; it is wrong!

putting all three concentrations to 50 μM, we get:

una reazione può procedere in vivo in direzione opposta a quanto indicato dal ΔG0′. Ciò che conta è ΔG !

Due corollari importanti

• Le reazioni con un ΔG°'<<0 sono spesso obbligate in vivo ad avere un ΔG<<0 *

• Le reazioni che con un ΔG°'~0 sono spesso obbligate ad avere in vivo un ΔG~0 *

• Quello che conta comunque è il ΔG (ρ)

Le reazioni con ΔG<<0 devono essere regolate

Le reazioni con ΔG ~0 si regolano “da sole”

* Rischia di essere una semplificazione grossolana se non si considerano fattori come il n. di reagenti e substrati, la loro conc., il coinvolgimento di specie chimiche a conc. costante come H2O...)

Gli enzimi non possono fare di necessità [regolazione] virtù [capacità di controllo]

“From a physiological point of view the most surprising result was that the heavily regulated allosteric enzyme, glycogen synthase, does not control flux but is needed to maintain homeostasis during flux changes. This novel role for a phosphorylated allosteric enzyme is proposed to be a general phenomenon in metabolic and signaling pathways, which physiologically link different cellular activities.”

Shulman and Rothman (2001) 13C NMR of intermediary metabolism: implications for systemic physiology. Annual Review of Physiology. 63:15-48.

macap vΘv v

Effetto dell’enzima: PS

eqS

f

KPKS

KPSK

V

v//1

)/(

)/(//1

1eq

PSS

f KPSKPKSK

Vv

Rate constant

Mass action term

Saturation term

Come l’enzima regola?

enzymes bring two additional properties into the mix, i.e., binding and catalysis

macap vΘv v

macap vΘv lnlnln

ln

(v)

...usando il passaggio a ln(v)

Fig. from Rohwer & Hofmeyr (2010)

Fig. from Rohwer & Hofmeyr (2010)

eq

ps

s

f K

PS

KP

KS

1

K1

Vv

eq

ps

s

f

K

PS

K

P

K

S1

1

K

Vv

macap vΘv

maf vV Σ

The uni-uni reaction equation

can be recast in a slightly different form:

where (vcap)= k2 Et /Ks

This term was inglobated with Vf in the previous formulation, but was moved here

Decomposition according to Rohwer & Hofmeyr (Stellenbosch)

Decomposition according to P. Morandini (UniMi)

where (Vf)= k2 Et

$10 {̂-3}$

$10 {̂-2}$

$10 {̂-1}$

$10 {̂0}$

$10 {̂1}$

$10 {̂2}$

$10 {̂3}$

$10 {̂-1}$ $10 {̂0}$ $10 {̂1}$ $10 {̂2}$

-6

-4

-2

0

2

4

6

$v$

ln $

v$

$s$

v

10-1

100

103

102

10-2

10-3

101

10-1 100 101 102

s

-6

-4

-2

0

2

4

6

ln v

Vf

v

vma

Σ

vcap (no enzyme)

v approaches Vf at increasing sLa decomposizione evidenzia meglio il limite di Vf

All’aumentare della driving force l’ultimo termine diventa S, che, combinato con il secondo termine diventa uguale a 1.

rimane solo Vf

f

ps

sf

eq

ps

sf V

K

P

K

S1

K

S

VK

PS

K

P

K

S1

K

1

V

v

Se 0 S

Se 0

0 significa cheP<<Kp e S>>Ks

Decomposition according to R. Milo (Weizmann ist.)

1

K

P

K

S1

K

S

VK

S

P

1

K

P

K

S1

K

S

V

ps

sf

eq

ps

sfv

Se 0

0 significa cheP<<Kp e S>>Ks

1

K

P

K

S1

K

S

V

ps

sf

v

Se 1

f

ps

sf V 0

K

P

K

S1

K

S

V

v

Vf

v

vthe

Bin

v

ln v

10-1

100

103

102

10-2

10-3

101

10-1 100 102101

vcap (no enzyme)

s

Anche questa decomposizione evidenzia il limite di Vf

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

Referenze

Per la parte di cinetica chimica vedere:

* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 1.4.2 e 1.4.3

Per il concetto di RLS, vedi

* Fell “understanding the control of Metabolism”, 1997 cap. 4

Per la relazione tra ΔG°’ e ΔG°’ per le reazioni biochimiche, vedere:

Athel Cornish-Bowden (1997) Harden and Young’s Discovery of Fructose 1,6-Bisphosphate, pp. 135-148 in New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical Knowledge (ed. A. Cornish-Bowden), Universitat de València, Valencia, Spain.

Articolo disponibile a: http://bip.cnrs-mrs.fr/bip10/harden.htm