Screening of the most relevant parameters for method development in ultra-high performance hydrophilic

interaction chromatographyAurélie Periat, Benjamin Debrus, Serge Rudaz, Davy Guillarme∗

School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva, University of Lausanne, Boulevard d’Yvoy 20, 1211 Geneva 4, Switzerland

Parameter Screening yang Paling Relevan dalam Metode Pengembangan Kinerja Kromatografi Interaksi Hidrofilik Ultra-Tinggi

Abstrak

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan beberapa pedoman untuk pengembangan metode dalam kromatografi interaksi hidrofilik (HILIC). Untuk tujuan ini, training set 82 dari salah satu jenis senyawa farmasi yang memiliki beragam polaritas dan termasuk asam, sifat dasar dan kenetralannya telah dianalisis.Semua obat ini disuntikkan pada lima kolom HILIC pendek dikemas dengan partikel sub-2μm dan berfungsi untuk operasi UHPLC (kromatografi cair kinerja ultra-tinggi). Empat kondisi pH yang berbeda mulai dari pH 3 sampai 6 diuji pada dua kekuatan ionik (10 dan 50 mmol / L) dan pada bagian akhir, pengubah organik dalam HILIC, yaitu asetonitril telah dimodifikasi dengan sejumlah kecil metanol atau isopropanol. Dari eksperimen ini dan dengan menggunakan analisis data multivariat, jelas bahwa fase diam adalah parameter yang paling relevan untuk penyetelan selektivitas dalam HILIC, karena jenis interaksi (yaitu dipol-dipol, ikatan hidrogen dan pertukaran ion) dengan analit sangat bervariasi antara kolom. Di antara tahapan yang dipilih, fase diol lah yang tak kalah menarik, dalam hal selektivitas dan dan berpengaruh terhadap bentuk puncaknya. Tahap zwitterionik juga menarik, karena memungkinkan retensi yang lebih baik dari senyawa asam. Kemudian fase silika kosong (bare silica) adalah kolom HILIC paling serbaguna dikemas dengan partikel sub-2μm l dalam hal retensi, bentuk puncak dan selektivitas. PH fase gerak adalah parameter penting lainnya untuk mencapai selektivitas dan retensi yang tepat, walaupun selalu sulit untuk melakukan pengukuran, PH tahap bergerak, analit pKa dan silanols pKa, ketika bekerja dengan lebih 70% asetonitril. Akhirnya, penyangga kekuatan ionik dan pengubah organik bisa dianggap sebagai parameter sekunder untuk pengembangan metode HILIC. Sebagai kesimpulan, screening empat kolom berbeda yang dikemas dengan partikel sub−2 μm pada dua PH fase gerak, menggunakan gradien cepat tampaknya menjadi pendekatan generik yang baik untuk pengembangan metode HILIC awal. Total waktu untuk screening tersebut diperkirakan ~ 1 jam, termasuk reequilibration.

1. Pendahuluan

Dibandingkan dengan kromatografi cair fase normal (NPLC), kromatografi pertukaran ion (IEX) atau kromatografi pasangan ion, kromatografi interaksi hidrofilik (HILIC) memnrikan teknik kromatografi untuk analisis senyawa hidrofilik . Memang, HILIC memberikan performa kinetik yang sangat baik dan tidak memerlukan penggunaan pelarut beracun dan mahal seperti pada NPLC. Selain itu, HILIC sepenuhnya kompatibel dengan MS, dan kromatografi cair fase terbalik kedua (RPLC) dan HILIC dapat dilakukan pada instrumen yang sama. Manfaat-manfaat nyata, HILIC telah berhasil diterapkan untuk analisis berbagai senyawa hidrofilik, termasuk sakarida, nukleobasa, asam amino, neurotransmiter, metabolit dan amina biogenik . Selain kemungkinan untuk menganalisis senyawa

polar, McCalley menyatakan bahwa HILIC adalah alternatif untuk RPLC untuk analisis berbagai analit terionisasi . Kemungkinan untuk menganalisis senyawa tersebut telah digambarkan dalam salah satu studi terbaru kami, dengan menggunakan satu set 45 senyawa farmasi yang telah dianalisis menggunakan kedua RPLC dan HILIC, yang yang terakhir memberikan "ortogonal" selektivitas RPLC .

Seiring dengan meningkatnya popularitas HILIC, mekanisme retensi telah menerima banyak perhatian selama beberapa tahun terakhir. Yang tentunya lebih kompleks daripada di RPLC, karena HILIC dicapai dengan keragaman relatif penting fasa diam. Oleh karena itu, retensi adalah kombinasi dari adsorpsi, pertukaran ion, dan partisi hidrofilik antara fase gerak dan waterenriched lapisan pada permukaan fase diam Memberikan kontribusi yang berbeda dari interaksi tergantung pada kolom kimia, komposisi fase gerak dan pH. Dengan demikian, aturan untuk mengembangkan metode HILIC yang sangat berbeda dari yang bekerja di RPLC. Berbagai makalah baru pada metode pengembangan HILIC telah menunjukkan bahwa sifat fase diam, fase pH ponsel, jenis pengubah organik, penyangga kekuatan ion, suhu fase gerak dan isokratik / kondisi gradien merupakan parameter yang relevan untuk retensi penyetelan dan selektivitas . Khususnya, perilaku retensi berbagai Ffsa diam HILIC, adalah salah satu faktor kunci untuk metode pengembangan, dan telah diselidiki dengan menggunakan beberapa pendekatan. Kawachi et al. telah mengevaluasi 14 HILIC menggunakan plot radar, memperhitungkan derajat mereka hidrofilisitas, selektivitas untuk hidrofilik / hidrofobik substituen, regioselektivitas dan configurational perbedaan substituen hidrofilik, selektivitas bentuk molekul, evaluasi interaksi elektrostatik dan evaluasi sifat asam / dasar dari fase diam, menggunakan model nukleosida dan turunannya xanthines. Chirita et al. telah mempertimbangkan beberapa neurotransmiter sebagai model senyawa dan menganalisis data retensi yang tersedia secara komersial HILIC dengan analisis komponen utama (PCA). Lammerhofer et al. yang telah ditandai 19 kolom mode campuran di bawah ILIC dan RPLC modus. Mereka telah menggunakan beberapa xanthines, nukleosida dan vitamin sebagai model analit dan telah menggunakan PCA. Guo dan Wang telah mengevaluasi selektivitas dan retensi 11 fase stasioner kutub yang berbeda di HILIC, menggunakan campuran 6 netral dan satu lagi dari 6 senyawa asam. Dinh et al. Telah mengevaluasi interaksi (yaitu hidrofilik, hidrofobik, elektrostatik, ikatan hidrogen, dipol-dipol, interaksi π−π dan bentuk-selektivitas) antara satu set 21 probe hidrofilik dan 22 kutub fase stasioner. Guo dan Gaiki dan Jandera baru-baru ini meninjau fase stasioner yang tersedia untuk HILIC. Dalam semua studi yang berbeda, sebagian besar konvensional 150 atau 250 mm kolom dikemas dengan partikel 5 μm (dianggap hampir 3μm) dan kadang-kadang, juga diselidiki fase bare silika dikemas dengan 2,7μm partikel core-shell .

Menurut pendapat kami, keuntungan HILIC jelas berkaitan dengan viskositas rendah fase gerak ketika bekerja dengan proporsiasetonitril lebih tinggi dari 70%. Memang, viskositas, rata-rata,kondisi menurun 2-3 faktor antara RPLC reguler dan HILICi . Untuk mengambil keuntungan penuh dari tekanan balik rendah yang dihasilkan di bawah kondisi HILIC, maka diembangkan metode HILIC menggunakan kolom dikemas dengan sub-2μm, bahkan pada instrumentasi klasik, asalkan volume kolom tambahan dan volume diam yang dioptimalkan untuk dimensi kolom .Selain itu, efek pemanasan akibat gesekan bisa membahayakan ketika bekerja dengan partikel sub-2μm di bawah tekanan ultra-tinggi kondisi (sampai 1300 bar) tidak lagi menjadi masalah karena backpressure tetap selalu rendah di HILIC (2-3 kali lebih sedikit daripada di RPLC). Saat ini, ada berbagai kolom yang tersedia secara komersial dikemas dengan partikel sub-2μm, termasuk berbagai fase diam kimia seperti bare silika, silika hibrida, amida, siano, diol, zwitterionik atau amino.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan pedoman dalam pengembangan metode HILIC menggunakan kolom dikemas dengan partikel sub- 2μm. Untuk tujuan ini, training set 82 senyawa farmasi dengan sifat fisiko-kimia yang sangat beragam itu dipilih. Obat ini disuntikkan pada lima fase stasioner yang berbeda, menggunakan empat PH fase bergerak, dua penyangga kekuatan ionik dan tiga pengubah organik, sesuai dengan 120 eksperimental kondisi. Akhirnya, jumlah yang sangat besar (~ 10.000 nilai) yang dihasilkan oleh desain eksperimen faktorial lengkap yang kami selidiki menggunakan PCA, untuk mendirikan yang paling menghasilkan, efisien dan cara cepat untuk mengembangkan metode HILIC.

2. Percobaan

2.1. Reagen dan Kimia

Air diperoleh dari sistem pemurnian air Milli-Q dari Millipore (Bedford, MA, USA). Asetonitril (ACN), isopropanol (IPA), metanol (MeOH), asam format dan asam asetat adalah dari KLP-MS grade dan dibeli dari Biosolve (Valkenswaald, Belanda). Amonium hidroksida dari Sigma-Fluka (Buchs, Swiss).

Buffer format, 10 dan 50 mmol / L, siap dengan memadai volume asam format dan amonium hidroksida, 28% v / v (pH diatur pada 3,0 atau 4,0). Buffer asetat, 10 dan 50 mmol / L, siap dengan volume yang memadai asam asetat (pH disesuaikan dengan 5.0 atau 6.0).

2.2. Titik Percobaan dari Senyawa Farmasi 82

Senyawa training set 82, yang mencakup spektrum yang luas dari pKa dan log P, seperti ditunjukkan pada Gambar. 1, termasuk berikut: acebutolol (AA), acetaminophen (AB), asetilkolin (AC), asam asetilsalisilat (AD), adenosin (AE), alprazolam (AF), amiodaron (AG), atenolol (AH), atropin (AI), baclofen (AJ), bisoprolol (AK), bupropion (AL), butacaine (AM), carazolol (AN), cetirizine metil ester (AO), klorpromazin (AP), chlorthalidone (AQ), clonazepam (AR), kodein (AS), coumachlor (AT), d-amfetamin (AU), dekstrometorfan (AV), diazepam (AW), dibacaine (AX), diklofenak (AY), hydrocodeine (AZ), doksepin (BA), duloxetine (BB), ephedrine (BC), asam flufenamic (BD), flunitrazepam (BE), flurazepam (BF), flurbiprofen (BG), furosemide (BH), heroin (BI), hydrochorothiazide (BJ), hydromorphone (BK), imipramine (BL), indapamide (BM), isoleusin (BN), ketamin (BO), ketoprofen (BP), lidocaine (BQ), lorazepam (BR), lovastatine (BS), Maprotiline (BT), n-metil-1-(1,3-benzodioxol-5- yl)-2-butanamine (MBDB) (BU), 3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA) (BV), 3,4-methylenedioxyethamphetamine (MDEA) (BW), 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) (BX), mefenamat Asam (BY), mefloquine (BZ), metadon (CA), metamfetamin (CB), morfin (CC), nadolol (CD), naltrexone (CE), nitrazepam (CF), norcocaine (CG), norephedrine (CH), nortriptyline (CI), Noscapine (CJ), olanzapine (CK), oxazepam (CL), papaverin (CM), petidin (CN), fenilalanin (CO), pindolol (CP), prazepam (CQ), prilokaina (CR), prokain (CS), serin (CT), serotonin (CU), sotalol (CV), suprofen (CW), temazepam (CX), terfenadine (CY), tebain (CZ), teofilin (DA), triazolam (DB), urasil (DC) dan valin (DD).

Bahan tambahan yang berkaitan dengan artikel ini dapat ditemukan, di versi online, pada http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2013.01.037.

Semua senyawa yang dibeli dari Sigma-Aldrich (Steinheim, Jerman), dikecualikan untuk Maprotiline, klorpromazin, olanzapine dan duloxetine yang disediakan oleh E. Bachmann dari Departemen Kimia Klinik (Lausanne, Swiss).

Tersedianya solusi dari setiap sampel individu disiapkan di 1 mg / mL MeOH murni. Karena selektivitas tambahan dari perangkat MS, empat campuran senyawa disiapkan dan 5μ L masing-masing campuran disuntikkan menggunakan platform yang UHPLC-MS/MS . Campuran pertama berisi 32 obat-obatan termasuk indapamide, triazolam, bisoprolol, alprazolam, norcocaine, prokain, MBDB masing-masing pada 100 ng / mL, isoleusin pada 10μ G / mL, mefloquine, klorpromazin,sotalol, teofilin masing-masing pada 1μ g / mL, kodein, nadolol, hidromorfon,pindolol masing-masing pada 2μ g / mL, acetaminophen, baclofen setiap pada 4μ g / mL, asetilkolin, adenosin, dihydrocodeine, duloxetine, efedrin, lorazepam, Prilocaine masing-masing pada 500 ng / mL dan amiodarone, cetirizine, papaverin, flunitrazepam, nitrazepam, doksepin, bupropion masing-masing sebesar 50 ng / mL, yang dapat dianalisis dalam ESI + modus, menggunakan pemantauan beberapa reaksi (MRM) dalam eksperimen. Yang kedua, berisi 34 obat-obatan termasuk terfenadin, flurazepam, dibucaine, clonazepam, temazepam, oxazepam, maproptiline, nortriptyline, petidin, ketamin, MDEA masing-masing pada 100 ng / mL, lovastatin, naltrexone, acebutolol, masing-masing d-amfetamin pada 1μ g / mL, chlorthalidone, MDA, norephedrine masing-masing pada 2μ g / mL, heroin, tebain, carazolol, MDMA, methamphetamine masing-masing sebesar 500 ng / mL, Noscapine, prazepam, metadon, butacaine, atropin, diazepam, dimipramine, dekstrometorfan, lidokain masing-masing pada 50 ng / mL, dan fenilalanin, valin baik di 5μ g / mL, yang juga dianalisis dalam yang + modus ESI, menggunakan eksperimen MRM. Campuran ketiga berisi 11 analit asam, termasuk ketoprofen, flurbiprofen, suprofen masing-masing pada 3μ g / mL, coumachlor, furosemide, hidroklorotiazid, diklofenak, asam mefenamat masing-masing sebesar 500 ng / mL dan flufenamic asam, urasil, asam asetilsalisilat pada 100 ng / mL, 1μ g / mL dan 200 ng / mL, masing-masing dianalisis dalam ESI- modus menggunakan eksperimen MRM. Campuran terakhir berisi 5 senyawa, yaitu olanzapine dan morfin baik di 500 ng / mL, atenolol, serin dan serotonin pada 50, 10 dan 8μ? G / mL. Dengan campuran ini, percobaan dilakukan dalam modus ESI +, menggunakan Dipilih Ion Recording (SIR) eksperimen. Semua campuran tersebut disusun dengan menggunakan setidaknya 90-95% ACN dalam pengencer sampel, memiliki puncak yang wajar membentuk . Tidak ada masalah kelarutan terjadi karena rendahnya konsentrasi campuran sampel. Pemisahan dilakukan menggunakan gradien generik dengan terus isokratik awal pada 95% pengubah organik selama 1 menit, kemudian ke pengubah organik 65% 3 menit, kemudian 1 menit pada pengubah organik 65%, dan waktu reequilibration dari 3 menit pada pengubah organik 95% sebelum menjalankan berikutnya. Suhu oven ditetapkan pada 30 ◦ C. Waktu retensi dimonitor dan dianalisis lebih lanjut dengan menggunakan alat komputasi.

2.3. Instrumentasi dan Kolom

2.3.1 UHPLC-UV

Konfigurasi UHPLC-UV ditentukan untuk memperoleh kromatogram yang berbeda Pengukuran ini dilakukan menggunakan Acquity UPLCTM sistem I-Class dari Waters (Milford, MA, USA) yang dilengkapi dengan pelarut biner delivery pump, detektor autosampler dan UV-DAD. The Waters Acquity I-Class System mengalir melalui jarum (FTN) yang diinjeksikan kedalam sistem dengan jarum 15μ L, aliran-sel UV 0,5μ L. Volume kolom ekstra (VEXT), dan Volume diam (Vd) dalam percobaan

masing-masing diukur pada 8,5μ L dan 90μL. Akuisisi laju dan konstanta waktu dari detektor UV yang tetap pada 20 Hz dan 50 ms. Akuisisi data, penanganan data dan alat kontrol yangdilakukan dengan menggunakan Empower 2 (Waters).

2.3.2 UHPLC –MS

Percobaan kromatografi dilakukan dengan menggunakan kromatografi cair performa ultra (UPLCTM) Waters Acquity untuk sistem dari Waters. Instrumen ini dilengkapi dengan sebuah pelarut biner dengan laju alir pengiriman maksimum 2 mL / menit, autosampler dengan lingkaran 5μ L beroperasi penuh pada modus injeksi lingkaran, dan manajer kolom yang berada di kolom oven, ditetapkan pada 30 ◦ C. Sistem UHPLC ini ditulis dengan tanda penghubung Waters TQD (Triple Quadrupole Mass Spectrometer) dilengkapi dengan semprotan ionisasi Z elektrospray (ESI) yang berasal dari ESCi ® .Sumber ionisasi dioperasikan di ESI mode positif dan negatif dan SIR atau MRM dioperasikan. Nitrogen digunakan sebagai pengeringan gas. Kapiler tegangan dan sumber tegangan ekstraktor ditetapkan masing-masing sebesar +2,5 kV dan +3 V. Suhu sumber dipertahankan pada 120 ◦ C, suhu gas desolvation dan laju alir ditetapkan sebesar 350 ◦ C dan 600 L / jam, masing-masing, dan aliran gas kerucut pada 20 L / jam. Tegangan kerucut dan energi tumbukan yang dioptimalkan untuk masing-masing senyawa, dan nilai-nilai optimal yang tercantum dalam Tabel S1 tambahan material. Yang terakhir, penentuan waktu tinggal dan penundaan antar-channel yang ditetapkan untuk 5 ms untuk mendapatkan sejumlah titik data di puncak bahkan ketika lebih dari 30 transisi MRM. Akuisisi data, penanganan data dan alat kontrol yang dilakukan dengan Masslynx 4.1.

Bahan tambahan yang berkaitan dengan artikel ini ditemukan, diversi online, pada http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2013.01.037

2.3.3 Kolom

Kolom yang digunakan dalam penelitian ini adalah bare silika, yaitu Zorbax HILIC ditambah dengat rapid resolusi HD, RRHD (2.1 mm id × 50 mm, 1,8 m) dari teknologi Agilent (Waldbronn, Jerman);sebuah bare silika hibrid, yaitu Acquity BEH HILIC kolom (2.1 mm id × 50 mm, 1,7μm) dan Acquity BEH HILIC amida kolom (2.1 mm id × 50 mm, 1,7μm) baik dari Waters, sebuah Fortis HILIC diol (2.1 mm id × 50 mm, 1,7μm) dari Fortis Technologies (Neston, Inggris) dan fase zwitterionik, yaitu Thermo Syncronis HILIC (2.1 mm id × 50 mm, 1,7μm) dari ThermoFisher (Runcorn, Inggris). Kemudian kelima kolom yang berbeda diberi nama bare silika, hybrid silika, amida, diol dan zwiterionik, masing-masing.

2.3.4 Aplikasi untuk Analisa Data

Perhitungan chemometric (PCA, HCA dan korelasi peta) dilakukan dengan open source R 2.14.2 dengan bahasa pemrograman.

2.4 Prosedur untuk Menghasilkan Data

Analit 82 dielusi pada lima fasa diam yang berbeda (yaitu silika telanjang, silika hibrida, amida, diol dan zwitterionik) di empat pH fase bergerak (pH 3-6), menggunakan tiga pengubah organik (ACN murni, 80/20 ACN / MeOH atau 80/20 ACN / IPA) dan dua penyangga kekuatan ionik (10 dan 50 mmol / L), sesuai dengan 120 kondisi percobaan yang berbeda, seperti yang dilaporkan dalam Tabel 1. Untuk membatasi jumlah percobaan, 82 senyawa dikumpulkan dalam empat campuran yang

berbeda, dan kekuatan identifikasi MS dilakukan untuk mengenali masing-masing senyawa dan mengukur waktu retensi yang sesuai di bawah fase diam yang berbeda dan kondisi fase bergerak. Selain itu, karena senyawa memiliki sifat fisiko-kimia yang sangat berbea, seperti diilustrasikan pada Gambar. S1 dan S1 Tabel dari bahan tambahan, maka tidak mungkin untuk mengetahui komposisi generik isokratik yang memberikan retensi yang cukup untuk semua senyawa ini. Oleh karena itu, profil gradien yang sama (95% organik pengubah selama 1 menit, kemudian ke pengubah organik 65% dalam 3 menit, kemudian 1 menit pada pengubah organik 65%), digunakan untuk mengelusi semua obat, apapun kondisi eksperimental. Akhirnya, total 960 injeksi dilakukan untuk seluruh studi, sesuai dengan analisis empat campuran senyawa yang dianalisis dalam rangkap di bawah 120 kondisi percobaan yang berbeda.

2.5 Prosedur untuk Analisa Data

Dalam contoh pertama, volume dead kolom diukur untuk setiap kolom menggunakan acenaphtene sebagai penanda unretained. Volume void kolom diperkirakan mencapai masing-masing 130, 150, 135, 145 dan 135? L untuk Agilent Zorbax RRHD, Aqcuity BEH, Thermo Syncronis HILIC, Fortis HILIC diol, ACQUITY BEH amida. Kemudian, gradien faktor retensi (kapp) dihitung dengan menggunakan dead time kolom (t0) nilai dan waktu retensi (tr) dari masing-masing senyawa dengan persamaan: kapp = (tr - t0) / t0. Akhirnya nilai-nilai kapp yang tercantum dalam perangkat lunak R, berpusat dan ditingkatkan ke unit varians, dan sesuai skor plot PCA dan alur pembebanan, masing-masing menunjukkan distribusi kondisi eksperimental dan pola dari retensi senyawa yang digunakan untuk memnunjukkan variansi maksimal pada setiap PC, dihitung dan disajikan pada Gambar. 1.

Untuk mengevaluasi dampak berbagai kondisi eksperimental pada selektivitas, prosedur otomatis diberi kode dalam perangkat lunak R. Umumnya, selektivitas dihitung pada puncak yang berdekatan. Namun, ketika mempertimbangkan urutan perubahan elusi antara semua kondisi eksperimental yang diuji, selektivitas 81 tidak pernah sama pada kromatogram. Dengan demikian, semua kemungkinan selektivitas dihitung dan mewakili global selektivitas yang diamati pada setiap kondisi operasi. Dalam contoh pertama, rasio kapp = tr/t0 diasumsikan. Kemudian, semua kemungkinan dari selektivitas yang ada, ˛ app = kapp (i) / kapp (j) diaasumsi dengan i bervariasi 1-81 dan j bervariasi dari

i + 1-82, sesuai dengan nilai 3321 (yaitu∑i+1

81

82−i. Waktu komputasi untuk menghitung selektivitas

3321 selama 120 kondisi eksperimental, dan plot sesuai PCA kurang dari 10 s.

Akhirnya, untuk mengkonfirmasi pengamatan yang dilakukan pada PCA dan memperkirakan korelasi retensi antara kondisi eksperimental diuji, peta korelasi juga dihitung. Korelasi yang dihitung

menggunakan S=100 ×√1−r2dengan r sama dengan korelasi koefisien Pearson antara dua kondisi

yang diberikan. Jadi mengakibatkan S sebesar 100 untuk dua kondisi berkorelasi (yaitu sangat berbeda retensi dari senyawa 82) dan sama dengan 0 untuk dua identik pemisahan . Untuk setiap plot skor PCA, kepercayaan elips pada 80% ditarik pada tingkat faktor yang diberikan. Misalnya, sebagai ditunjukkan pada Gambar. 1A, faktor elips adalah fase diam dan dengan demikian satu elips yang ditampilkan untuk masing-masing dari lima fase stasioner. Tingkat confidence 80% dipilih untuk mendapatkan elips yang ukuran yang sesuai dengan nilai plot rentang.

3. Hasil dan Pembahasan

Keragaman obat model 82 telah diilustrasikan pada Gambar. S1, menunjukkan pKa vs log P nilai-nilai dari asam, basa, zwiterionik dan obat-obatan netral. Di antara dataset dipelajari, ada 70% dari basis, 17% asam, 7% dari Zwitterions dan 6% dari netral senyawa, memberikan pandangan yang mewakili senyawa farmasi komersial .

Faktor retens yang jelas (kapp) dan selektifitas yang jelas (α app) dari dataset diproses oleh PCA untuk menyoroti persamaan dan perbedaan antara kondisi analitis diuji dan variabel (yaitu faktor retensi atau selektivitas) digunakan untuk menyoroti perbedaan-perbedaan ini.

Sampai sekarang, hanya tiga studi telah melaporkan penggunaan PCA representasi di HILIC. Dalam karya-karya ini ,, tujuannya adalah untuk ciri fasa diam HILIC dan mengevaluasi kesamaan antara kolom yang diselidiki. Untuk tujuan ini, hanya terbatas sejumlah senyawa itu dipilih, kapp dari 12 neurotransmitter dievaluasi oleh Chirita et al. , kapp dari 22 senyawa hidrofilik diukur oleh Dinh et al. , sedangkan kapp dari 3 xanthines, 5 nukleosida dan 5 vitamin dipelajari oleh Lämmerhofer et al. .

3.1 Evaluasi dari Penyimpanan Sifat dari 5 Fase Stasioner

Dalam contoh pertama, faktor retensi jelas dari obat 82 digunakan untuk mengkarakterisasi masing-masing analit dalam setiap kondisi eksperimental.

Model PCA pertama, membangun tabel data secara keseluruhan dan dua komponen utama pertama (PC1 PC2 vs) menyumbang sekitar 70% dari varians awal. Seperti nilai signifikan yang memungkinkan menafsirkan hamburan data yang diperoleh dalam plot skor (lihat Gambar. 1A) dan dalam beban plot (lihat Gambar. 1B). Karena sebagian besar kondisi eksperimental diwakili dalam Gambar. 1A, sehinggaa representasi merupakan sesuatu yang sulit untuk ditafsirkan. Untuk meningkatkan pembacaan, confidence elips pada 80% juga diplot dan memungkinkan visualisasi yang lebih baik. Selain itu, tidak adanya tumpang tindih antara confidence elips memungkinkan untuk menyoroti perbedaan antara HILIC kolom. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 1A, beberapa kondisi eksperimental menggunakan kolom yang berbeda berkumpul bersama-sama, yang menunjukkan

retensi yang cukup sama. Misalnya, diol dan hibrida elips silika jelas tumpang tindih. Akibatnya, tidak ada keuntungan dalam melakukan pengembangan metode HILIC menggunakan dua kolom

secara bersa

bersamaan. Di sisi lain, fase stasioner paling berbeda adalah yang memiliki confodence elips yang jauh dari satu sama lain di PC1 PC2 vs plot skor. Contoh ini diilustrasikan untuk bare silika dan fase zwitterionik. Akhirnya, amida memberikan retensi cukup mirip dengan yang zwitterionik tapi sangat berbeda dari bare silika.

Seperti ditunjukkan dalam plot pemuatan (lihat Gambar. 1B), kontribusi analit bisa relatif baik sesuai dengan fundamental mereka sifat kimia, yaitu dasar, netral, asam, dan Zwitterion sehingga dapat diketahui pentingnya mekanisme interaksi dengan 5 fase stasioner yang berbeda. Kontribusi rata-rata setiap kelas kimia, diwakili oleh anak panah pada gambar. 1B, menjelaskan stasioner fase pengelompokan dalam skor plot (Gambar 1A).

Bahkan, situasi disajikan oleh Gambar. 1 dapat dijelaskan oleh beberapa tipe tertentu dari interaksi zat terlarut dengan dukungan-dukungan analisis yang berbeda. Untuk semua tahapan ini, ada kombinasi dari interaksi dipol-dipol, hidrogen ikatan, dan interaksi elektrostatik, tetapi pada tingkat

yang berbeda . Berdasarkan hasil yang disajikan, fase bare silika memiliki kemampuan menukar kation tertinggi karena memiliki banyak silanols bermuatan negatif yang berinteraksi dengan positif biaya obat dasar. Dengan demikian, fase ini adalah yang paling kuat satu untuk senyawa kationik. Di sisi lain, zwitterionik fase mampu mempertahankan senyawa asam karena ia memiliki gugus fungsional sulfonat (memungkinkan pertukaran kation) dan kuartener gugus amonium (memungkinkan pertukaran anion). Diantara 5 kolom, fase zwitterionik adalah yang paling kuat untuk asam. Akhirnya, kolom amida tidak banyak memiliki silanols (silika hibrida terikat dengan gugus amida) dari fase lain dan relatif posisi pada plot skor, diilustrasikan retensi yang lebih rendah dari dasar senyawa.

Seperti dijelaskan oleh McCalley , analisis asam bisa bermasalah di HILIC, karena tolakan elektrostatik antara senyawa anionik dan silanols sisa pada permukaan fase stasioner Berbagai solusi dapat dipertimbangkan untuk menghindari masalah ini . Pertama adalah, mungkin untuk menggunakan kondisi yang sangat asam (misalnya 0,1% TFA, pH <2) dengan sebagian besar bermuatan silanols dan netral senyawa anionik. Solusi lain adalah menggunakan ion positif yang dibebankan fase amina-berikat, tetapi kolom ini umumnya tidak stabil .

Berdasarkan data kami, solusi alternatif bisa untuk dilakukan pada fase zwitterionik. Untuk menggambarkan pernyataan ini, campuran 6 perwakilan obat asam dianalisis dengan fase stasioner yang berbeda menggunakan kondisi UHPLC-UV. Seperti ditunjukkan dalam contoh pada Gambar. 2, fase bare silika adalah salah satu yang kurang kuat (senyawa lalu dielusi pada 0.44 min) karena memiliki jumlah tertinggi dari silanols sisa menghasilkan beberapa tolakan elektrostatik dengan obat anionik. Keseluruhan retensi silika hibrida dan diol yang setara (terakhir puncak dielusi pada ~ 0.52 menit). Tahap amida adalah sedikit lebih kuat (terakhir puncak dielusi pada ~ 0,65 menit), mungkin karena silanols sisa kurang. Yang paling menarik adalah kolom untuk analisis dari 6 obat asam adalah fase zwitterionik, memungkinkan retensi yang cukup untuk 6 asam, dan analisis keseluruhan waktu kurang dari 1,5 menit.

Akhirnya, untuk mengkonfirmasi pengamatan yang dilakukan pada berbagai kondisi eksperimen , korelasi antara faktor retensi yang juga dihitung dan ditampilkan sebagai korelasi S peta (lihat Bagian 2.5). Dalam Gambar. S2, perbedaan antara kondisi mudah diidentifikasi dengan mencari nilai S tertinggi. Hal ini jelas bahwa kolom zwitterionic digunakan pada pH 3 dan 4 yang paling tersedia berkorelasi perilaku dengan semua kolom lainnya. Faktor retensi fase stasioner amida juga disediakan terutama yang memiliki korelasi dengan fase bare silika.

Bahan tambahan yang berkaitan dengan artikel ini ditemukan, di versi online, pada http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2013.01.037.

3.2 Bagaimana Menyesuaikan Selektivitas dari HILIC

Ketika berhadapan dengan pengembangan metode, tujuannya adalah untuk tidak mengetahui kondisi eksperimental yang hanya mengubah retensi, tetapi tetap memberikan kemungkinkan untuk selektivitas tuning. Untuk alasan ini, PCA juga dilakukan menggunakan dataset selektivitas, seperti yang ada dalam Bagian 2.5. Dengan menggunakan pendekatan ini, plot beban tidak bisa ditafsirkan lagi, karena jumlah beban terlalu tinggi karena nilai selektivitas lengkap 3321 yang dipertimbangkan.

3.2.1 Pengaruh Fase Stasioner Kimia

PCA pertama dilakukan pada matriks data yang dihasilkan dari 3321, nilai selektivitas diperoleh dengan 120 kondisi eksperimental (Lihat Gambar. 3A). Sekali lagi, varians dijelaskan oleh PC1 dan PC2 adalah sekitar 60% dan confidence elips pada 80% ditarik untuk setiap fase stasioner untuk membantu interpretasi data. Berdasarkan Gambar. 1 dan 3A, silika diol dan hibrida sangat dekat dalam hal retensi (Lihat Gambar. 1A) dan selektivitas (lihat Gambar. 3A), apapun pH, penyangga kekuatan ionik dan pengubah organik. Ini menegaskan , bahwa kedua kolom hadir retensi yang sama dan selektivitas dengan dianggap campuran uji senyawa farmasi. Karena kinerja kinetik (pelebaran puncak dan tailing) selalu lebih baik pada silika hybrid (data tidak ditampilkan), kolom ini mungkin lebih berguna dalam hal screening awal daripada diol. Ketika mempertimbangkan selektivitas, dua fase yang paling berbeda adalah bare silika dan fase amida, yang muncul menjadi dua cluster yang dipisahkan. Selain itu, kedua fase yang ditemukan cukup berbeda dari kolom silika hybrid. Oleh karena itu, adanya sifat saling melengkapi antara tiga fasa diam muncul sebagai keuntungan yang dapat dipertimbangkan untuk pengembangan metode. Akhirnya, fase zwitterionik berperilaku cukup berbeda dari fase lain (confidence elips belum searah dengan yang lain) tetapi merupakan tugas yang lebih rumit untuk memahami hal ini. Perbedaan karena plot pemuatan membuat kelebihan beban dan tidak mudah diterangkan. Namun demikian, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3A, ketika bekerja dengan fase zwitterionik dalam kondisi asam (pH 3 dan 4), senyawa kromatografi perilaku yang dekat dengan mereka diamati dengan fase amida pada pH yang sama. Sebaliknya, ketika bekerja pada pH 5 atau 6, perilaku kromatografi yang mirip dengan silika hibrida dan kolom diol. Mengingat bahwa kolom ini zwitterionik juga mampu mempertahankan obat anionik, hal itu dapat bermanfaat untuk screening awal.

Untuk lebih mengevaluasi informasi yang terkandung dalam PC yang lebih tinggi , dapat dilakukan dengan teknik pengelompokan lain, analisis cluster yaitu hirarkis (HCA) menggunakan jumlah komponen utama, yang menyumbang 95% dari varians dataset awal . HCA memungkinkan

pengelompokan pengamatan dataset menggunakan jarak multidimensi, sehingga pengamatan ( faktor retensi) terdapat pada cluster yang sama adalah sama satu sama lain ,tapi entah bagaimana berbeda dengan di cluster lain. Dalam bottom up prosedur HCA, cluster terbentuk secara berurutan, dimulai dengan pasangan yang paling mirip dengan variabel dan membentuk cluster yang lebih tinggi, sedikit demi sedikit. Hasil sebah clustering dendogram, dapat dipotong pada tingkat yang berbeda untuk menghasilkan cluster yang berbeda dari dataset asli. Dengan menggunakan jarak Euclidean sebagai perbedaan untuk mengukur dan metode agglomerative Ward, dendrogram dihitung dan disajikan pada Gambar. 3B. 17 . Komponen PCA pertama , sesuai dengan 95% dari varians dataset awal, yang digunakan untuk menghitung dendrogram ini. Dendrogram ini menunjukkan bahwa ketidaksamaan terbesar terjadi antara fase bare silika dan amida . Cluster sesuai dengan diol dan hybrid silika yang umumnya sangat dekat kesamaan dari dua fase stasioner. Akhirnya, HCA juga menegaskan bahwa perilaku fase zwitterionik yang tergantung pada PH fase bergerak. Hal ini juga menunjukkan bahwa fase bare silika dan fase zwitterionik yang sangat berbeda.

Pengamatan dilakukan pada PCA dan HCA yang dalam eksperimen menggunakan campuran dari 7 obat dasar. Kromatogram yang sesuai tunjukkan pada Gambar. 4. Menurut pengamatan sebelumnya, perubahan tertinggi dalam selektivitas dan retensi yang diamati antara tahap bare silika dan amida, dimana retensi berkurang secara drastis (1,9 menit untuk puncak terakhir) dibandingkan

dengan kolom lain (3,2 menit untuk puncak terakhir), karena interaksi ionik yang rendah antara obat dasar dan silanols sisa. Selain itu, selektivitas juga sangat berbeda antara dua fase, menunjukkan sifat yang saling melengkapi. Akhirnya, penting untuk melihat bahwa puncak turunan kodein (Puncak

5-7) yang mengejutkan pada luas dengan fase amida,sedangkan lebar puncak lain yang sesuai. Selama penelitian ini, itu juga mengamati bahwa fase amida sering terjadi bentuk puncak yang buruk pada pH 3 yang menggunakan penyangga dengan kekuatan ion rendah. Namun, pada pH 4 yang menggunakan kekuatan ionik dari 50 mmol / L, hanya turunan kodein yang bermasalah (tidak dapat dilihat bentuk puncak). Pada tahapan lain, retensi dan selektivitas menggunakan silika diol dan hibrida yang sangat mirip, kecuali untuk puncak heroin. Kedua fase yang menengah dalam hal retensi dan selektivitas antara silika telanjang dan amida fase. Sehingga urutan elusi yang diamati pada kolom zwitterionik mendekati dari kolom lain tetapi keseluruhan selektivitas berbeda.

Kecuali selektivitas dan retensi, kinerja kinetik dan bentuk puncak juga penting selama pengembangan metode. Berdasarkan pada pengukuran dilakukan pada 82 obat dalam semua analisis kondisi, kolom dapat peringkat dari segi bentuk puncak dalam urutan sebagai berikut dari yang memiliki lebar puncak terbaik hingga yang paling buruk yang asimetri: bare silika, silika hibrida, zwiterionik, diol dan amida.

Karena aplikasi farmasi kebanyakan tidak melakukan uji kompleks campuran, hal tersebut dapat berguna untuk mengevaluasi dalam contoh pertama hanya satu tunggal fase diam HILIC dikemas dengan partikel sub-2μm. Berdasarkan data bentuk, retensi dan selektivitas puncak yang diperoleh dari set senyawa farmasi, dipilih Agilent Zorbax RRHD yang cocok untuk mewakili fase diam untuk penentuan sederhana terkait senyawa.

3.2.2 Pengaruh PH terhadap Fase Bergerak

Untuk mengevaluasi relevansi dalam modifikasi pH selama langkah pertama dari metode pengembangan HILIC, sebuah PCA tambahan dilakukan untuk setiap kolom. Untuk setiap PCA baru, hanya data yang diasumsikan sesuai ke kolom yang diberikan. Jumlah kondisi eksperimental karena itu sama dengan 24 untuk masing-masing dari lima kolom. Namun, jumlah selektivitas tetap sama dengan 3321 (sesuai menjadi 82 senyawa).

Salah satu kesulitan dalam HILIC muncul dari pengukuran yang tepat atau estimasi PH fase bergerak, analit pKa dan silanols pKa, ketika sebagian besar pengubah organik digunakan dalam fase bergerak. Nilai pH dan pKa yang dipengaruhi oleh adanya pelarut organik dan ionisasi obat mungkin agak berbeda dengan apa yang diharapkan dalam medium berair murni. Seperti yanng disebutkan oleh McCalley, sebuah ACN / buffer amonium format 15/85 v / v dimana pH air buffer sama dengan 3, dan terdapat fakta pH sekitar 5,2 .

PCA diperoleh untuk lima fase stasioner ditunjukkan pada Gambar. 5, dan confidence elips pada 80% dimasukkan. Antara semua kolom ini, dampak dari pH terhadap selektivitas pada umumnya sama. Dan ternyata perubahan selektivitas antara pH 5 dan 6 hampir dapat diabaikan. Karena sebagian besar training set yang digunakan dalam percobaan merupakan obat dasar, perilaku ini dapat dijelaskan oleh fakta bahwa residu silanols , sebagian besar terdeprotonasi dan obat-obatan dasar juga pada pH 5 dan 6. Dengan demikian, daya tarik elektrostatik antara bermuatan positif obat dasar dan bermuatan negatif sisa silanols harus serupa dalam kisaran pH yang relatif kecil. Pada sisi lain, selama lima kolom diuji, pH 3 dan 4 disediakan berbeda selektivitas, dengan pH 3 menjadi yang

paling berbeda dari pH 5 atau 6. Pada fase bare silika, kelompok diamati pada PH3, PH4 dan ph5 / 6 dapat jelas dibedakan, mungkin karena kolom ini memiliki kemampuan pertukaran ion yang kuat, yang berhubungan dengan jumlah yang tinggi silanols sisa. Perbedaan kelompok-kelompok ini pada hybrid silika, juga cukup signifikan. Namun, dampak dari pH pada selektivitas kurang penting dalam kasus fase amida dan diol, mungkin karena jumlah silanols diakses berkurang, dan begitu juga kemampuan tukar ion. Akhirnya, perilaku dari fase zwitterionik cukup berbeda karena selektivitas pada pH 3 dan 4 yang sangat berbeda dari pH 5 dan 6, dibandingkan dengan fase stasioner lain. Hal ini dapat dikaitkan dengan permanen muatan negatif (kelompok sulfonat, asam kuat) di permukaan fase diam dan silanols sisa sedikit (asam lemah), keduanya memiliki kemampuan untuk berinteraksi dengan rmuatan positif obat dasar.

Dampak dari PH fase bergerak dalam pemisahan digambarkan pada Gambar. 6, menggunakan fase bare silika. Campuran y ang netral, salah satu asam dan lima obat dasar (nilai pKa dari 6,1 menjadi 9,5) dipilih untuk menggambarkan perilaku ini. Urutan elusi, tetap hampir identik antara pH 3 dan pH 4, kecuali untuk puncak 1 dan 2, yang coeluted pada pH 3 tapi muncul hasil yang baik pada pH 4. Ini sesuai dengan harapan kami karena senyawa 1 tidak dipengaruhi oleh pH fase bergerak (obat netral), sedangkan senyawa 2 adalah asam. Waktu retensi puncak 3 (lidokain) juga berubah drastis antara pH 3 dan pH 4. Yang paling penting adalah variasi selektivitas yang terjadi antara pH 4 dan pH 5 (mungkin indikasi pKa jelas silanols residual), sebagai puncak nomor 3 dielusi sebelum puncak 2 dan tatanan elusi dari gerak balik diamati antara puncak 4 dan 5. Akhirnya, hampir tidak ada perubahan selektivitas antara pH 5 dan 6, seperti yang diharapkan dari PCA skor plot pada Gambar. 5.

Berdasarkan pengukuran yang dilakukan pada senyawa 82 di bawah semua kondisi analitis, asimetri dan luasan puncak dapat diubah ketika mengubah pH. Dari penelitian ini, pH dapat diurutkan dari segi bentuk , puncak yang baik, dalam urutan sebagai berikut dari yang terbaik hingga terburuk yang asimetri: pH 6> ph5> pH 4> pH 3. Namun, pengaruh pH pada bentuk puncak kuat tergantung pada sifat fisiko-kimia dari analit yang diselidiki (yaitu apakah benar-benar terionisasi, bentuk terionisasi sebagian atau netral).

3.2.3 Pengaruh Pengubah Organik

Di HILIC, umumnya disarankan untuk menggunakan pelarut aprotik seperti sebagai asetonitril atau aseton , sebagai pengubah organik untuk mencapai retensi yang cukup . Namun, aseton memiliki sebuah UV dapat diterima cut-off dan tetap hampir digunakan. Itu juga menunjukkan bahwa HILIC dapat dilakukan dengan alkohol (MeOH, etanol atau IPA) sebagai eluen lemah . Namun, penggunaan alkohol, memiliki kemampuan ikatan hidrogen yang signifikan,sehingga bisa mengubah formasi dari lapisan air pada permukaan fase diam, membuat pengurangan pada interaksi hidrofilik . Pada saat, percobaan pendahuluan yang dilakukan dengan menggunakan MeOH murni atau IPA pada sejumlah fase diam dan pH, dengan 82 model senyawa. MeOH disebabkan ~ 90% dari zat terlarut menjadi dielusi tanpa retensi apapun. Dibandingkan dengan MeOH, IPA memiliki lebih rendah kemampuan ikatan hidrogen, yang memungkinkan zat terlarut dipertahankan. Namun, untuk sebagian besar senyawa dan kondisi eksperimental, retensi itu masih dapat diterima dengan IPA.

Berdasarkan pengamatan awal ini, MeOH dan IPA dievaluasi dalam kombinasi dengan ACN, untuk mencapai retensi yang wajar untuk sebagian besar senyawa kami. Dengan demikian, fase gerak terdiri di satu sisi buffer berair dan di sisi lain dari tiga pengubah organik yang berbeda , yaitu (i) murni ACN, (ii) 80/20 ACN / MeOH, v / v atau (iii)80/20 ACN / IPA, v / v

PCA dilakukan untuk dua fasa diam representatif, silika yaitu bare silica dan silika hibrida yang disajikan pada Gambar. 7, dengan menggunakan confidence elips pada 80%. Penting untuk dicatat bahwa Gambar. 5, 7 dan 9 sesuai dengan PCA representasi yang sama. Satu-satunya perbedaan antara angka-angka ini adalah perubahan dari faktor-faktor yang mempengaruhi (yaitu pH, pengubah organik dan kekuatan ion buffer) yang memiliki label di setiap tingkatan, agar lebih mudah dibaca. Kedua fase adalah kolom yang tertinggi dan terendah perbedaan antara pengubah organik diamati. Untuk tiga fase lain, PCA plot slor dan hamburan elips yang menengah antara dua kasus (data tidak ditampilkan). Dalam Gambar. 7, dampak pada selektivitas hampir diabaikan dengan fase bare silika, antara murni ACN, 80/20 ACN / MeOH dan 80/20 ACN / IPA. Di sisi lain, beberapa perbedaan signifikan yang diamati dengan fase silika hibrida dan kelompok "murni ACN" dan / 20 "80 ACN / MeOH "sepenuhnya dibedakan. Perilaku ini berbeda antara bare silika dan hybrid bisa dihubungkan dengan derajat adsorpsi, pertukaran ion, dan hidrofilik partisi fase stasioner .

Meskipun terjadi beberapa perbedaan selektivitas ketika mengubah sifat pengubah organik, namun efeknya kurang daripada mengubah sifat fase diam atau PH fase bergerak. Oleh karena itu,

pengubah organik harus dipertimbangkan sebagai sekunder parameter untuk prosedur screening awal. Selain itu, khusus perawatan harus dilakukan karena retensi dapat dikurangi secara drastis di hadapan sejumlah besar alkohol lemah.

Menurut hasil penelitian kami, ACN murni sering memberikan pemisahan optimum dalam hal retensi, selektivitas dan efisiensi dibandingkan dengan campuran dengan 20% MeOH atau IPA. Hal ini diilustrasikan pada Gambar. 8, menunjukkan pemisahan campuran asam, netral dan obat-obatan dasar pada fase bare silika, di bawah kondisi UHPLC-UV. Seperti yang diharapkan dari PCA (lihat Gambar. 7A), perubahan selektivitas hampir diabaikan dan urutan elusi tetap identik untuk semua kondisi eksperimental. Namun, retensi berkurang pada IPA (sekitar 10% lebih rendah) dan di atas semua dengan MeOH (~ 30%). Akhirnya, puncak yang sempit dan simetris menggunakan murni ACN, sementara itu terjadi perluasan signifikan s dan penurunan performa kinetik ketika diamati pada 20% IPA dan MeOH.

3.2.4 Pengaruh Kekuatan Ion Buffer

Karena retensi dalam HILIC melibatkan pertukaran ion, kekuatan ion penyangga berpotensi mempengaruhi retensi dan selektivitas, ketika berhadapan dengan senyawa terionisasi. Tentu saja, dampak kekuatan ion penyangga tergantung pada pentingnya pertukaran ion dalam mekanisme retensi HILIC, yang merupakan kombinasi adsorpsi, pertukaran ion, dan hidrofilik partisi. PCA

dilakukan untuk lima fasa diam dengan hanya dua skor plot disediakan pada Gambar. 9 demi. Untuk bare silika dan fase diol, PC1 PC2 vs petak menyumbang selama sekitar 67 dan 71% dari varian awal. Kedua kolom menunjukkan perbedaan tertinggi dan terendah antara dua ionik kondisi kekuatan. Ini sesuai dengan harapan kami, karena sebelumnya menunjukkan bahwa fase bare silika menyajikan jumlah tertinggi silanols sisa diakses dan dengan demikian mekanisme interaksi terkuat pertukaran kation. Di sisi lain, fase diol memiliki jumlah silanols yang rendah. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 9, efek kekuatan ion penyangga pada selektifitas sangat terbatas dan tidak boleh dianggap sebagai parameter utama dalam hal pengembangan metode HILIC. Namun, tergantung pada fase diam. Parameter tambahan dapat dipertimbangkan untuk selektivitas fine tuning. Dalam hal kinerja kinetik, ternyata bahwa lebar puncak sedikit lebih luas dengan 10 mmol / L vs 50 mmol / L penyangga ionik kekuatan. Ini pasti karena interaksi pertukaran ion yang kuat pada kekuatan ion rendah dan memperlambat kinetika interaksi.

4. Kesimpulan

Berdasarkan PCA, HCA dan analisis korelasi, dan penggunakan training set dari 82 senyawa farmasi, dalam percobaan kami, sifat fase diam dan PH fase bergerak muncul sebagai yang paling relevan parameter untuk tuning selektivitas dalam hal metode HILIC pengembangan obat farmasi.

Sebuah pernyataan pertama adalah bahwa saat ini, ada berbagai macamkolom HILIC yang dikemas dengan partikel sub-2μm, termasuk fase bare silika, silika hibrida, amida, diol dan zwitterionik. Hal tersebut merupakan fase stasioner yang menjanjikan dan memungkinkan pemisahan serta reequilibration hanya dalam beberapa menit. Berdasarkan 960 injeksi dilakukan selama penelitian ini, fase terbaik, dalam hal pelebaran puncak (kinerja kinetik), jelas Agilent Zorbax RRHD diikuti oleh Acquity BEH dan Thermo Syncronis HILIC, untuk analisis senyawa farmasi.

Di sisi lain,puncak yang diperoleh dengan Fortis HILIC diol yang lebih luas daripada Acquity BEH amida yang sering menghasilkan puncak terdistorsi (di bawah kondisi asam dan kekuatan ion rendah.

Kedua, bahkan jika hal tersebut merupakan sesuatu yang kompleks untuk mengukur dengan jelas pH fase bergerak, analit pKa dan silanols pKa, bila menggunakan lebih dari 70% ACN dalam fase gerak, PH fase bergerak memainkan peran utama untuk tuning selektivitas dalam HILIC. Hal ini memungkinkan adanya perubahan yang cepat dari lipophilicity obat dan jumlah silanols sisa (tukar kation mekanisme interaksi). Namun, pada pH 5 dan pH 6 memberikan selektivitas yang sama, dan puncak terdistorsi yang kadang-kadang diamati pada pH 3. Kesimpulan ini bisa relevan, namun kuat tergantung pada sifat fisiko-kimia diselidiki analit.

Buffer kekuatan ion juga bisa memberikan beberapa sedikit perubahan selektivitas, terutama ketika fase diam dipamerkan kemampuan tukar kation (misalnya Zorbax RRHD), tetapi tidak harus dipertimbangkan selama tahap pertama dari metode pembangunan.

Akhirnya, asetonitril tetap pengubah organik pilihan dalam HILIC. Bahkan jika beberapa upaya dilakukan dalam beberapa tahun terakhir menggunakan lemah alkohol seperti MeOH, EtOH atau IPA, retensi sering drastis berkurang dan puncak menjadi terdistorsi. Pada penelitian ini, sebuah kombinasi asetonitril dan MeOH atau IPA diuji, tetapi dampak selektivitasnya terbatas dan signifikan pelebaran puncak terjadi.

Dalam hal pengembangan metode HILIC menggunakan kolom dikemas dengan sub-2? partikel m, maka dengan demikian disarankan untuk melakukan hal berikut skrining generik awal kolom:

Agilent Zorbax RRHD ( bare silika)

Aqcuity BEH (silika hybrid)

Thermo Syncronis HILIC (fase zwitterionik)

Acquity BEH amida (silika hibrida terikat dengan gugus amida)

Dengan ACN sebagai pengubah organik, dua buffer harus diuji, yaitu amonium format 10 mmol / L pH 3 dan amonium asetat 10 mmol / L PH6. Keempat kolom dan dua buffer (delapan kondisi yang berbeda) dapat diputar di sekitar 1 jam, dengan menggunakan mengikuti gradien generik: isokratik awal sebesar 5% ACN untuk 1 menit, kemudian 65% ACN di 3 menit dan kemudian 1 menit. sebesar 65% dan ACN reequilibration selama 3 menit, pada 50 mm × 2.1 mm I.D. kolom pada 500? L / min. Tergantung pada hasil yang dicapai, pemisahan dapat lebih dioptimalkan dengan menyesuaikan parameter sekunder: penyangga kekuatan ion, profil gradien, sifat atau pengubah organik atau temperatur fase gerak.