Jurnal Perbandingan Penilaian Sitotoksisitas Dari Enam Tetes Mata Anti-Inflamasi
Transcript of Jurnal Perbandingan Penilaian Sitotoksisitas Dari Enam Tetes Mata Anti-Inflamasi
Perbandingan penilaian sitotoksisitas dari enam tetes mata
anti-inflamasi dalam empat kultur sel permukaan mata,
sebagaimana ditentukan oleh nilai viabilitas sel
Masahiko Ayaki1 Atsuo Iwasawa2 Yoshimi Niwano3
1Department of Ophthalmology, International University of Health and Welfare, Mita Hospital, Tokyo, 2Department of Bioengineering, Graduate School of Bioscience and Biotechnology, Tokyo Institute of Technology, Yokohama, 3Laboratory for Redox Regulation, Tohoku University Graduate School of Dentistry, Sendai, Japan
ABSTRAK
Tujuan: tetes mata anti-inflamasi sering digunakan dalam pengobatan gangguan korneal epitelial.
Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi toksisitas dari enam tetes mata anti-inflamasi dalam
empat kultur sel permukaan mata.
Metode: Toksisitas dari enam solusi optalmik anti-inflamasi yang tersedia secara komersial
(diclofenac, bromfenac, pranoprofen, betametason dan fluoromethason) telah dilakukan penilaian
pada tiga baris sel korneal dan sau baris sel konjungtival. Viabilitas sel ditentukan oleh 3 - (4,5-
dimetil-2 thiazoyl) -2,5-difenil-2H-tetrazolium bromide dan neutral red assays setelah mengekspos
sel untuk 10, 30, dan 60 menit dari satu kali lipat, ganda, dan sepuluh kali lipat pengenceran obat.
Sitotoksisitas dibandingkan dengan menggunakan cell viability score (CVS), parameter sitotoksik
terpadu yang mengambil berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan air mata atau konsentrasi
dengan penguapan, waktu paparan obat, dan jenis permukaan sel mata.
Hasil: Berdasarkan skor CVS, urutan anti-inflamasi tetes mata diuji dari rendah ke tinggi
sitotoksik, dengan % bahan aktif CVS50, dan CVS40/80% untuk setiap solusi yang diberikan dalam
kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon® (betametason, 100 %, 100%) >0.02% Flumethoron®
(fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron® (fluoromethorone, 76%, 22%) > Bronuck®
(0.1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod® (0.1% diklofenak, 44%, -15%) = Niflan® (pranoprofen,
50%, -19%). Rinderon® memperlihatkan toksisitas paling rendah dari semua tetes mata anti-
inflamasi yang diuji. Obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory
memperlihatkan sitotoksisitas yang lebih besar dari pada yang mengandung steroid dengan
benzalkonium pada konsentrasi sebanding. Konsentrasi adalah faktor paling signifikan yang
mempengaruhi kelangsungan hidup sel.
Kesimpulan: Sitotoksisitas tetes mata anti-inflamasi dievaluasi dalam penelitian ini tergantung
pada kedua komponen farmasi dan bahan pengawet. CVS adalah indikator singkat dari
sitotoksisitas obat.
1
Kata kunci: benzalkonium klorida, toksisitas, kornea, sel skor viabilitas, obat anti-inflamasi
PENDAHULUAN
Tetes mata anti-inflamasi secara rutin digunakan pasca operasi, serta untuk
mengobati penyakit peradangan pada mata. Sebuah studi sebelumnya memeriksa
sitotoksisitas setelah 48 jam paparan dari jalur sel mata untuk tetes mata anti-inflamasi di
hadapan media kultur menunjukkan bahwa obat tetes mata yang mengandung
benzalkonium klorida (BAK) menunjukan cukup sitotoksisitas.1
Namun, paparan obat tetes mata periode 48-jam bukanlah refleksi akurat dari
situasi aktual di mana obat tetes mata umumnya diterapkan beberapa kali sehari. Selain
itu, permukaan sel-sel mata pasien bersentuhan langsung dengan formulasi tetes mata.
Dengan demikian, untuk mencerminkan situasi yang sebenarnya, kami telah mencoba
untuk meningkatkan tes sitotoksisitas untuk sel-sel mata.2-6 Dalam studi ini, sel-sel
permukaan mata mengalami kontak langsung dengan formulasi obat tanpa adanya media
kultur. Berdasarkan penelitian kami, kami mengusulkan penggunaan cell viability
score(CVS) sebagai parameter sederhana untuk mengekspresikan potensi sitotoksik obat
tetes mata.
Awalnya, kita mendefinisikan CVS50 sebagai jumlah baris sel dengan viabilitas
% ≥ 50 di hadapan sepuluh kali lipat pengenceran obat (misalnya, ketika empat baris sel
yang digunakan, nilai harus 0, 1, 2, 3, atau 4 ) .1 Namun, dalam studi terbaru kami telah
meningkatkan CVS sehingga CVS50 kini didefinisikan sebagai jumlah pengukuran
menunjukkan viabilitas sel% ≥ 50 dan dinyatakan sebagai persentase atas kisaran 0% -
100% .2,3 Menggunakan metode yang ditingkatkan tersebut, jumlah pengukuran adalah
72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes) .2,3 Karena obat tetes
mata dapat dipengaruhi oleh berbagai faktor, seperti pengenceran oleh cairan lakrimal atau
konsentrasi oleh hilangnya kelembaban, dan karena dapat bersentuhan dengan jenis sel
yang berbeda (misalnya, sel-sel epitel kornea dan konjungtiva) pada permukaan kornea
untuk jumlah dan waktu yang bervariasi, sitotoksisitas obat tetes mata perlu dievaluasi
secara komprehensif. Dengan demikian, CVS telah dimodifikasi berdasarkan jumlah
pengukuran sitotoksisitas dalam segala situasi, dengan perhitungan konsentrasi, waktu
pemaparan, dan jenis sel.
2
Sitotoksisitas tetes mata merupakan isu kontroversial karena sekali tetes mata
yang diterapkan pada permukaan mata, konsentrasi dan penetrasi obat dapat berubah
sangat cepat. Oleh karena itu, dalam penelitian ini kami mengevaluasi ulang sitotoksisitas
tetes mata anti-inflamasi dengan melakukan penyelidikan komprehensif yang mencakup
berbagai konsentrasi dan waktu pengobatan berdasarkan sistem CVS yang dimodifikasi.
METODE DAN MATERI
Enam tetes mata anti-inflamasi tersedia secara komersial yang diuji dalam
penelitian ini. Nama dagang, komponen aktif, komponen inaktif (pengawet), dan produsen
tercantum dalam Tabel 1. Struktur kimia dari komponen aktif telah diterbitkan di mana
pun.4
Metode untuk kultur sel, alat tes sitotoksisitas, dan evaluasi data yang telah
dijelaskan secara rinci .2 Singkatnya, digunakan baris sel berikut yang tersedia secara
komersial: SIRC (epitel kornea kelinci, ATCC CCL-60, Koleksi Tipe Kultur Amerika
[ATCC] , Manassas, VA), BCE C/D-1b (sel epitel kornea bovine, JCRB-9129, Bank
Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya, Osaka, Jepang), RC-1 (epitel kornea kelinci,
JCRB-0246, Penelitian Ilmu Kesehatan dan Sumber Daya), dan Chang konjungtiva (sel
konjungtiva manusia, ATCC CCL-20.2, ATCC). Setelah sel telah mencapai titik temu,
media kultur diganti dengan larutan murni atau dua kali lipat dan sepuluh kali lipat
pengenceran larutan uji yang berbeda, dan sel monolayers diinkubasi dengan adanya
solusi ini untuk 10, 30 atau 60 menit.
Garam fisiologis steril digunakan sebagai pengencer untuk setiap tetes mata, dan
itu menegaskan bahwa paparan dari setiap baris sel untuk garam selama 60 menit tidak
berpengaruh signifikan terhadap kelangsungan hidup sel dibandingkan dengan kontrol
yang sesuai. Setelah 10, 30, atau 60 menit inkubasi, solusi oftalmik diganti dengan
medium kultur segar dan sel-sel diinkubasi selama 48 jam lebih. Viabilitas sel diukur
dengan menggunakan 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2-il) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide
(MTT, Sigma-Aldrich Co, St Louis, MO) dan neutral red assay(NR, Wako Pure Chemical
Industries , Osaka, Jepang). Viabilitas sel dalam larutan uji dihitung sebagai persentase
viabilitas kontrol sel dalam medium saja. Percobaan diulang delapan kali, dan hasilnya
disajikan sebagai mean ± SD.
3
Untuk mengevaluasi sitotoksisitas obat tetes mata anti-inflamasi, nilai mean
untuk 1/2 konsentrasi dibandingkan dengan yang lain untuk Rinderon ® (Shionogi dan
Co, Ltd, Osaka, Jepang), obat tetes mata yang mengandung betametason, dengan
menggunakan uji perbandingan ganda Dunnett, dengan P<0,05 ditetapkan sebagai tingkat
signifikansi. Selain itu, efek dari jenis tetes mata, garis sel, waktu pemaparan, konsentrasi,
dan metode uji pada viabilitas sel dievaluasi menggunakan analisis varians untuk
parameter bivalen, dengan P<0,05 diambil untuk menunjukkan signifikansi statistik.
CVS digunakan untuk membandingkan toksisitas larutan uji. CVS50 tersebut
dihitung sebagai jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas ≥50% dibandingkan dengan
kontrol. CVS40/80 tersebut dihitung sebagai: (jumlah pengukuran menunjukkan viabilitas
>80%) - (jumlah pengukuran menunjukkan <40% viabilitas). Jumlah pengukuran adalah
72 (tiga konsentrasi, tiga kali paparan, empat baris sel, dan dua tes). Hasil dinyatakan
sebagai persentase dari semua pengukuran (%CVS).
HASIL
Untuk semua baris sel yang telah diuji, viabilitas sel setelah terpapar Rinderon ®
adalah ≥ 80% (Gambar 1-4). Kelangsungan hidup sel setelah paparan dari sel ke tetes mata
lain yang telah diuji adalah tergantung konsentrasi.
CVS untuk tetes mata anti-inflamasi yang diuji dalam penelitian ini dirangkum
dalam Tabel 2. Berdasarkan CVS, urutan tetes mata anti-inflamasi diuji dari sitotoksik
rendah ke toksisitas tinggi, dengan bahan aktif, CVS50%, dan CVS40/80% untuk setiap solusi
yang diberikan dalam kurung, adalah sebagai berikut: Rinderon ® (betametason, 100 %,
4
100%) >0.02% Flumethoron ® (Santen Pharmaceutical Co, Ltd, Osaka, Jepang,
fluoromethorone, 68%, 22%) = 0,1% Flumethoron ® (Santen Pharmaceutical Co, Ltd,
fluoromethorone, 76%, 22%) >Bronuck ® (Senju Pharmaceutical Co Ltd, Osaka, Jepang,
0,1% bromfenac, 53%, -8%) = Diclod ® (Wakamoto Co, Ltd, Tokyo, Jepang, 0,1%
diklofenak, 44%, -15%) = Niflan ® (Senju Pharmaceutical Co, Ltd, pranoprofen, 50%, -
19%).
Rinderon ® menunjukan toksisitas paling dari semua tetes mata anti-inflamasi
yang diuji. Secara mikroskopis mengungkapkan bahwa morfologi dari semua baris sel
yang diobati Rinderon® adalah mirip dengan sel kontrol (data tidak ditampilkan). Secara
keseluruhan, obat tetes mata yang mengandung non-steroid anti-inflammatory drugs
menunjukan toksisitas yang lebih besar daripada yang mengandung steroid.
Gambar 5 menunjukkan viabilitas sel sesuai dengan obat, metode baris sel, waktu
pemaparan, konsentrasi obat, dan uji. Semua faktor ini memiliki pengaruh yang signifikan
terhadap kelangsungan hidup sel, sebagaimana ditentukan oleh analisis varians untuk
parameter bivalen. Konsentrasi obat, diikuti dengan waktu paparan, memiliki efek paling
signifikan pada viabilitas sel. Dari baris sel diuji, Chang konjungtiva dan RC-1 sel
tampaknya menjadi sedikit lebih sensitif terhadap paparan obat bila dibandingkan dengan
dua baris sel lainnya, dengan tes MTT muncul untuk menjadi sedikit lebih sensitif
dibandingkan dengan uji NR untuk mengevaluasi viabilitas sel. Jenis obat merupakan
faktor penting yang mempengaruhi kelangsungan hidup sel dan, dari solusi oftalmik
berbeda yang diuji, Rinderon ® (yang berisi betametason steroid sintetis sebagai bahan
aktif) adalah yang paling randah sitotoksiknya, diikuti oleh ® Flumethoron 0,02% dan
0,1% Flumethoron ®, baik yang mengandung steroid fluoromethorone sintetis sebagai
bahan aktif.
5
6
Viabilitas sel yang terekspos obat tetes mata lainnya, yang diklasifikasikan
sebagai non-steroid anti-inflammatory drugs, rendah. Observasi ini sesuai dengan temuan
% CVS yang dijelaskan di atas.
7
Karena viabilitas sel tampaknya menurun dengan waktu paparan meningkat
untuk semua obat tetes mata selain Rinderon ®, viabilitas sel dalam solusi oftalmik
diencerkan dua kali lipat dibandingkan dengan paparan berikut untuk Rinderon ®
menggunakan Dunnett’s multiple comparison test, seperti yang ditunjukkan pada Gambar
1-4.
DISKUSI
Tetes mata anti-inflamasi dianggap sebagai faktor penyebab utama gangguan
permukaan mata selama pengobatan radang mata, seperti pasca operasi atau untuk
penyakit mata inflamasi. Berdasarkan nilai-nilai CVS yang diperoleh dalam penelitian ini,
potensi sitotoksik tetes mata anti-inflamasi yang diuji adalah, Niflan ® = Diclod ® =
Bronuck ®> 0,02% Flumethoron ® = 0,1% Flumethoron ®> Rinderon ®. Dalam hal
bahan aktif dalam setiap tetes mata, hasil dari penelitian ini mengkonfirmasi temuan
sebelumnya, yaitu bahwa steroid kurang sitotoksik dibandingkan, non-steroids.1 4 Karena
beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa deksametason, suatu steroid sintetik, adalah
sitoprotektif,5-7 betametason mungkin telah diberikan efek sitoprotektif dalam penelitian
ini, menjelaskan mengapa Rinderon ® menunjukan sitotoksisitas terendah dari semua
solusi yang diuji. Alasan lain mengapa obat tetes mata yang mengandung nonsteroidal
anti-inflammatory drugs menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar mungkin karena
penggunaan BAK sebagai pengawet. Studi sebelumnya telah melaporkan hubungan
terbalik antara CVS berbagai obat tetes mata dan konsentrasi BAK yang mengandung
therein.1,2,8-10 Dalam penelitian kami terbaru di mana sitotoksisitas in vitro BAK-obat tetes
mata yang mengandung antiglaucoma dievaluasi, sitotoksisitas yang obat tetes mata diuji
adalah tergantung pada konsentrasi BAK.3 Dalam kasus Diclod ®, yang tidak mengandung
BAK, bahan aktif diklofenak telah digunakan untuk kontrol peradangan pasca operasi dan
nyeri tetapi menberi efek samping termasuk kerusakan kornea yang parah,11-14 yang
menunjukkan sitotoksisitas okular permukaan. Dari bahan-bahan aktif lainnya, polisorbat
adalah racun bagi mata,15 dan beberapa peringatan telah direkomendasikan ketika
mempertimbangkan suntikan intraokular obat yang mengandung asam borat polysorbate.15
Boric acid, metil paraoxybenzoate, dan chlorobutanol telah dilaporkan menunjukkan
toksisitas rendah hanya pada konsenrasi yang dianjurkan atau yg paling umum digunakan. 16-18
8
Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek dari berbagai konsentrasi obat dan
waktu paparan dalam empat baris sel yang tersedia secara komersial karena, dalam situasi
klinis, mata terekspos berbagai perawatan obat. Misalnya, obat mungkin terkonsentrasi
pada mata karena penguapan atau drainase menurun, obat dapat teradsorpsi pada mata
untuk jangka waktu lama, atau kerentanan terhadap obat tertentu mungkin berbeda antara
jenis sel (misalnya, konjungtiva dibandingkan kornea epitel sel). Memang, diagram pencar
yang ditampilkan pada Gambar 5 menunjukkan bahwa konsentrasi obat dan waktu
paparan secara signifikan mempengaruhi viabilitas sel.
Salah satu keterbatasan dari studi ini adalah bahwa kita hanya menggunakan
bioassay untuk mengevaluasi sitotoksisitas. Selain sistem kultur sel monolayer
konvensional, seperti yang digunakan dalam penelitian ini, mengevaluasi sitotoksisitas
menggunakan model okular yang sudah dibuktikan, seperti model tiga-dimensi (3D), akan
memberikan informasi yang berguna. Sebagai contoh, penelitian sebelumnya telah
menggunakan epitel model 3D yang dibudidayakan dari sel kornea manusia sebagai
alternatif tes mata Draize untuk menilai potensi bahan kimia yang menyebabkan irritasi
mata.19, 20 Dalam studi lain, respons dose-dependent BAK terungkap , dengan efek toksik
yang signifikan dicatat antara konsentrasi rendah 0,005% dalam model epitel kornea 3D.21
Dengan demikian, penelitian masa depan harus menggunakan salah satu dari model-model
9
baru, seperti model epitel kornea 3D, untuk mengkonfirmasi apakah korelasi signifikan
yang diperoleh dengan sistem CVS disajikan di sini dapat direplikasi dalam model
lainnya. Selain itu, studi masa depan perlu memeriksa korelasi antara sitotoksisitas in vitro
dan in vivo.
PENYINGKAPAN
Para penulis melaporkan tidak ada konflik kepentingan dalam pekerjaan ini.
10
JURNAL
PERBANDINGAN PENILAIAN SITOTOKSISITAS DARI
ENAM TETES MATA ANTI-INFLAMASI DALAM EMPAT
KULTUR SEL PERMUKAAN MATA, SEBAGAIMANA
DITENTUKAN OLEH NILAI VIABILITAS SEL
PEMBIMBING:
Dr. HELMI Sp.M
DISUSUN OLEH:
Eugenius (030.04.071)
KEPANITERAAN KLINIK ILMU KESEHATAN MATA RSUD CILEGON
PERIODE 18 DESEMBER 2012 - 19 JANUARI 2013
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS TRISAKTI
11