Joseph l. Melnick Manuel Ramos-Alvarez Section Of

8/14/2019 Joseph l. Melnick Manuel Ramos-Alvarez Section Of

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JOSEPH L . MELNICKMANUEL RAMOS-ALVAREZFRANCIS L . B L A C K ! S e c t i o n o f P r e v e n t i v e M e d i c i n e , Y a l eA N T H O N Y . ~ . G I R A R D I U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e d i c i n eANTHONY J . GIRARDIDAIZO NAGAKI'

POLIOMYELITIS VIRUSES I N T I S S U E CULTUREV I I . EXPERIENCES WITH VIRAL AND SEROLOGICALDIAGNOSTIC P R O C E D U R E S 5

T i s s u e c u l t u r e i n o c u l a t i o n h a s r e p l a c e d t h e p r o d u c t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a ld i s e a s e i n t h e m o n k e y a s t h e m e t h o d o f c h o i c e f o r t h e d i r e c t i s o l a t i o n a n da n t i g e n i c i d e n t i f i c a t i o n o f v i r u s f r o m m a t e r i a l s o b t a i n e d f r o m p o l i o m y e l i t i sp a t i e n t s . " " '2 , 1 6 , 1 8 I n a d d i t i o n , t i s s u e - c u l t u r e m e t h o d s h a v e now m a d e p r a c -t i c a l s e r o l o g i c t e s t s f o r a n t i b o d y d e v e l o p m e n t i n man a f t e r n a t u r a l p o l i o -m y e l i t i s i n f e c t i o n ' ' o r a f t e r a c t i v e i m m u n i z a t i o n . " ' H o w e v e r , t h e r e h a s b e e nn o s t a n d a r d i z a t i o n o f m e t h o d s a s y e t , w h i c h i s p e r h a p s d e s i r a b l e i n a f i e l ds o n e w .

T h e p r e s e n t r e p o r t i s c o n c e r n e d w i t h t h e f u r t h e r d e v e l o p m e n t o f t i s s u e -c u l t u r e t e c h n i q u e s , w i t h a v i e w t o t h e i r p o s s i b l e e f f e c t i v e n e s s i n a p o l i o -m y e l i t i s d i a g n o s t i c l a b o r a t o r y . T h r e e d i f f e r e n t l i n e s o f i n v e s t i g a t i o n h a v eb e e n p u r s u e d :

1 . A c o m p a r i s o n o f t h e s e n s i t i v i t y a n d p r a c t i c a l i t y o f d i f f e r e n t m e t h o d sf o r v i r u s i s o l a t i o n .2 . An i n t e g r a t i o n o f t h e d a t a o b t a i n a b l e f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n s b o t hb y v i r u s i s o l a t i o n a n d b y s e r o l o g i c a l t e s t s f o r c o m p l e m e n t - f i x i n g a n dn e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s .3 . An i n v e s t i g a t i o n o f p o s s i b l e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e t y p e o f d i s e a s e ,t h e t y p e o f v i r u s i n v o l v e d , a n d t h e i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s e .I n t h e e a r l y s t u d i e s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e , c u l t u r e s o f humant i s s u e s o r m o n k e y t e s t i s w e r e c h i e f l y e m p l o y e d . A n o t h e r m o n k e y t i s s u ew h i c h i s r e a d i l y r e s p o n s i v e t o p o l i o m y e l i t i s v i r u s i n f e c t i o n i s t h e k i d -

1 F e l l o w o f t h e B e h r i n g I n s t i t u t e , C e n t r o d e E s t u d i o s S o b r e P o l i o m i e l i t i s , M e x i c oC i t y , 1 9 5 3 .' F e l l o w o f t h e R o c k e f e l l e r F o u n d a t i o n , 1 9 5 3 - 5 4 , o n l e a v e f r o m T h e L a b o r a t o r y o fH y g i e n e , O t t a w a , O n t a r i o .' U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e F e l l o w , 1 9 5 2 - 5 3 , o n l e a v e f r o m t h e V i r u s L a b o r a t o r y ,D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , U n i v e r s i t y o f P e n n s y l v a n i a , P h i l a d e l p h i a .' F e l l o w o f t h e C h i n a M e d i c a l B o a r d , 1 9 5 3 , o n l e a v e f r o m K i t a s a t o I n s t i t u t e , T o k y o .' A i d e d b y a g r a n t f r o m t h e N a t i o n a l F o u n d a t i o n f o r I n f a n t i l e P a r a l y s i s .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n M a r c h 1 2 , 1 9 5 4 .

C o p y r i g h t 1 9 5 4 b y T HE YALE J O U R N A L O F B I O L O G Y AND M E D I C I N E , I N C .


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YA L E JOURNAL OF BIOLOGY AND MEDICINE

n e y , 3 ' 9 1 4 , 7 a n d i n t h e p r e s e n t s t u d y , c u l t u r e s o f t h i s t i s s u e h a v e b e e n c h i e f l yu s e d . N o t o n l y c a n c o n s i d e r a b l y m o r e t i s s u e b e o b t a i n e d f r o m a s i n g l e a n i -m a l t h a n i s t h e c a s e w i t h t e s t i s , b u t k i d n e y t i s s u e a n d t h e e p i t h e l i a l c e l l sw h i c h g r o w o u t f r o m i t a r e u s u a l l y m o r e r e s p o n s i v e t o p o l i o m y e l i t i s v i r u si n f e c t i o n t h a n t e s t i c u l a r t i s s u e a n d i t s o u t g r o w t h o f f i b r o b l a s t s . A f u r t h e ra d v a n t a g e i s t h e g r e a t e r r a p i d i t y o f t h e c y t o p a t h i c c h a n g e s i n k i d n e yc u l t u r e s , w h i c h h a s a l r e a d y b e e n n o t e d b y o t h e r s .COLLECTION OF S P E CI M E NS

I n o r d e r t o b r o a d e n t h e s t u d y , m a t e r i a l s f r o m p a t i e n t s w i t h i n t w o r e p r e -s e n t a t i v e a r e a s w e r e s t u d i e d : ( a ) New H a v e n , C o n n e c t i c u t , w h e r e i n 1 9 5 2t h e i n c i d e n c e o f p o l i o m y e l i t i s w a s l o w a n d ( b ) L o c k H a v e n , P e n n s y l v a n i a ,w h e r e a s e v e r e p o l i o m y e l i t i s o u t b r e a k o c c u r r e d i n t h e s a m e y e a r . I n a d d i -t i o n , t w o s e r i e s o f t e s t s f o r p o l i o m y e l i t i s v i r u s w e r e c a r r i e d o u t o n t h e f e c e so f c h i m p a n z e e s f e d t h e W-S T y p e I s t r a i n .

P o l i o m y e l i t i s i n New H a v e n , C o n n . , 1 9 5 2 . * I n 1 9 5 2 , o f 5 9 c a s e s i n NewH a v e n C o u n t y ( 1 1 p e r 1 0 0 , 0 0 0 ) , 3 7 w e r e r e p o r t e d a s p a r a l y t i c a n d 2 2 a sn o n p a r a l y t i c c a s e s . T h e m o s t r e c e n t o u t b r e a k o f s e v e r e p r o p o r t i o n s i n t h i sl o c a l i t y t o o k p l a c e i n 1 9 4 3 .P o l i o m y e l i t i s i n L o c k H a v e n , P a . , 1 9 5 2 . * T h i s w a s t h e f i r s t l a r g e e p i -d e m i c t o b e r e p o r t e d i n r e c e n t y e a r s i n t h i s t o w n a n d i t s s u r r o u n d i n g a r e a ,

C e n t r e a n d C l i n t o n c o u n t i e s ; 1 0 4 c a s e s w e r e r e p o r t e d , t h e m a j o r i t y b e i n gp a r a l y t i c . T h e o v e r - a l l c a s e r a t e f o r t h e t w o c o u n t i e s w a s 1 2 0 p e r 1 0 0 , 0 0 0 .T h e c a s e r a t e f o r t h o s e u n d e r 1 5 y e a r s o f a g e w a s 3 4 0 p e r 1 0 0 , 0 0 0 a n d f o rt h o s e 1 5 y e a r s a n d o v e r , 3 2 p e r 1 0 0 , 0 0 0 .E x p e r i m e n t a l l y i n f e c t e d c h i m p a n z e e s . I n a d d i t i o n t o t h e h u m a n s p e c i -

m e n s , f e c e s w e r e c o l l e c t e d f r o m e i g h t c h i m p a n z e e s f e d t h e W-S T y p e Ip o l i o m y e l i t i s v i r u s ; n o n e o f t h e a n i m a l s d e v e l o p e d s i g n s o f i l l n e s s . T h e f e c e sw e r e c o l l e c t e d a l m o s t d a i l y f o r a b o u t o n e m o n t h a f t e r t h e v i r u s f e e d i n g .S p e c i m e n s f r o m e a c h a n i m a l w e r e m a d e i n t o e i g h t t o t e n p o o l s , e a c h r e p r e -s e n t i n g a s a m p l e o f t w o t o t h r e e d a y s . T h e y w e r e t h e n t r e a t e d a s d e s c r i b e db e l o w i n t h e s a m e m a n n e r a s t h e h u m a n s p e c i m e n s .

S t o o l s w e r e c o l l e c t e d c h i e f l y d u r i n g t h e f i r s t w e e k f o l l o w i n g h o s p i t a l i z a -t i o n o f p a t i e n t s . O n e t o t h r e e s p e c i m e n s w e r e t a k e n f r o m e a c h p a t i e n t a n ds t o r e d a t - 2 0 C . I n s o m e i n s t a n c e s t h e y w e r e r e f r i g e r a t e d a t 4 C . , u n t i l*We a r e i n d e b t e d t o t h e m e d i c a l a n d p e d i a t r i c s t a f f s o f t h e G r a c e - N e w H a v e nC o m m u n i t y H o s p i t a l a n d t o D r s . G e r a l d M c D o n o u g h , E d w a r d R a b e , a n d M e r l C o l v i n ,f o r t h e i r a s s i s t a n c e i n t h e c o l l e c t i o n o f m a t e r i a l s f r o m t h e New H a v e n a n d L o c kH a v e n a r e a s , r e s p e c t i v e l y .

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V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


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P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e MELNICK e t a l .

s u s p e n s i o n o f t h e m a t e r i a l c o u l d b e p r e p a r e d , b u t i n n o c a s e w e r e t h e s a m -p l e s a l l o w e d t o r e m a i n a t t h i s t e m p e r a t u r e f o r m o r e t h a n 7 2 h o u r s . S u s p e n -s i o n s w e r e p r e p a r e d w i t h s i n g l e o r p o o l e d s a m p l e s , i n f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f2 0 % o , b y o v e r n i g h t s h a k i n g i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r a t 4 0 C . T h i s w a s d o n ei n 2 5 0 m l . c e n t r i f u g e b o t t l e s w h i c h c o u l d t h e n b e s p u n a t 2 , 5 0 0 r p m . f o r 2 0m i n u t e s t o r e m o v e g r o s s p a r t i c u l a t e m a t t e r . T h e s u p e r n a t a n t f l u i d s w e r es t o r e d a t -20 C . p r i o r t o v i r u s i s o l a t i o n s t u d i e s .

J u s t p r i o r t o t h e i n o c u l a t i o n o f t h e t i s s u e c u l t u r e s , t h e 2 0 % o s t o o l s u s p e n -s i o n w a s t h a w e d r a p i d l y , m i x e d , a n d c e n t r i f u g e d a t 3 , 0 0 0 r p m . f o r 3 0m i n u t e s . ( F o r s o m e e x p e r i m e n t s a n a l i q u o t w a s s p u n a t 1 8 , 0 0 0 r p m . f o r3 0 m i n u t e s ) . T h e s u p e r n a t a n t f l u i d w a s r e m o v e d a n d p e n i c i l l i n , p l u s s t r e p -t o m y c i n , a d d e d t o t h i s m a t e r i a l t o y i e l d f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 5 0 0 t o 2 , 0 0 0u n i t s a n d o f 0 . 5 t o 2 m g . p e r m l . , r e s p e c t i v e l y . T h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t os t a n d f o r 1 0 m i n u t e s b e f o r e i n o c u l a t i o n i n t o c u l t u r e s .

T h r o a t s w a b s w e r e c o l l e c t e d o n l y f r o m t h e New H a v e n p a t i e n t s , a l s od u r i n g t h e f i r s t f e w d a y s o f h o s p i t a l i z a t i o n . T h e y w e r e s t o r e d a t -20 C .i n 1 . 0 m l . o f b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n c o n t a i n i n g p e n i c i l l i n a n d s t r e p t o m y c i n .A f t e r t h a w i n g , t h e s w a b w a s s q u e e z e d a n d t h e e x p r e s s e d f l u i d w a s a d d e d t ot h e f l u i d i n w h i c h i t h a d b e e n f r o z e n .

S e r u m s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m many o f t h e p a t i e n t s who p r o v i d e ds t o o l s p e c i m e n s . An a t t e m p t w a s m a d e t o c o l l e c t t h e f i r s t s e r u m e a r l y a f t e ra d m i s s i o n t o t h e h o s p i t a l , a s e c o n d s a m p l e t w o t o t h r e e w e e k s l a t e r , a n d at h i r d s a m p l e a b o u t s i x w e e k s l a t e r . T h e y w e r e a l s o s t o r e d a t - 2 0 C .u n t i l u s e d .VIRUS ISOLATION METHODS

M e t h o d s f o r t h e i s o l a t i o n o f v i r u s u s i n g t w o t y p e s o f t i s s u e c u l t u r e ,s u s p e n d e d c e l l a n d o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s , h a v e b e e n c o m p a r e d . S u s p e n d e dc e l l c u l t u r e s c o n s i s t e d o f a b o u t 1 5 f r a g m e n t s o f m o n k e y k i d n e y ( 1 t o 2 mm.i n d i a m e t e r ) b a t h e d i n 1 m l . o f n u t r i e n t m e d i u m i n a 1 6 x 1 5 0 mm. t e s tt u b e . T h e s e c u l t u r e s w e r e u s u a l l y u s e d o n t h e d a y o f p r e p a r a t i o n . O u t -g r o w t h c e l l c u l t u r e s w e r e o b t a i n e d b y a t t a c h i n g f r a g m e n t s o f k i d n e y o rt e s t i s t i s s u e t o t h e w a l l o f t h e t e s t t u b e b y m e a n s o f a p l a s m a c l o t o r b y p r e -w a r m i n g t h e t u b e . 6 " 8 ' 9 O n e m l . o f m e d i u m w a s a d d e d t o e a c h t u b e a n d t h et u b e s w e r e i n c u b a t e d f o r a p e r i o d o f o n e o r t w o w e e k s , t o a l l o w a s h e e t o fc e l l s t o g r o w o u t f r o m t h e e x p l a n t s . T h e m e d i u m u s e d f o r b o t h t y p e s o fc u l t u r e w a s e i t h e r m i x t u r e # 1 9 9 , ' o r a m i x t u r e c o n t a i n i n g 0 . 5 % l a c t a l -b u m i n h y d r o l y s a t e , 2 0 % o b o v i n e s e r u m u l t r a f i l t r a t e , a n d 7 9 . 5 % o E a r l e ' sb a l a n c e d s a l t s o l u t i o n . 8 A l l t u b e s w e r e p l a c e d a t a s l i g h t l y i n c l i n e d p o s i t i o n

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Y A L E JOURNAL OF BIOLOGY AND MEDICINE

s o t h a t a t h i n l a y e r o f f l u i d w a s p r e s e n t o v e r t h e t i s s u e f r a g m e n t s , a n d h e l ds t a t i o n a r y d u r i n g i n c u b a t i o n a t 3 6 C . *I s o l a t i o n s f r o m t h r o a t s w a b s w e r e c a r r i e d o u t i n s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e si n t h e s a m e m a n n e r a s t h e s t o o l i s o l a t i o n s ( s e e b e l o w ) .

I s o l a t i o n o f v i r u s i n s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s . O n e - t e n t h m l . o f t h ep e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n - t r e a t e d s t o o l s u s p e n s i o n w a s a d d e d t o e a c h o f t w os u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s . T h e t u b e s w e r e t h e n h e l d s t a t i o n a r y o r p l a c e di n a r o l l e r d r u m a t 3 6 0 C . f o r f i v e d a y s , * * when t h e f l u i d s w e r e h a r v e s t e d .A n e u t r a l i z a t i o n t e s t ( s e e b e l o w ) c o u l d b e c a r r i e d o u t o n t h e s e f l u i d sd i r e c t l y t o d e t e r m i n e w h e t h e r a n a g e n t h a d b e e n i s o l a t e d , a n d , i f s o , i t s t y p e .H o w e v e r , w h e n t h e r e w a s n o u r g e n c y , i t w a s p r e f e r a b l e t o p a s s t h e a g e n to n c e o n o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s t o b e c e r t a i n t h a t a c y t o p a t h o g e n i c a g e n th a d b e e n i s o l a t e d b e f o r e m a k i n g t h e n e u t r a l i z a t i o n t e s t . F o r t h i s p a s s a g e0 . 1 m l . o f u n d i l u t e d f l u i d h a r v e s t e d f r o m t h e s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e w a su s e d a s t h e i n o c u l u m . T h e p a s s a g e t u b e s w e r e t h e n o b s e r v e d f o r c y t o p a t h i cc h a n g e s , a n d , i f p r e s e n t , t h e v i r u s w a s i d e n t i f i e d i n a t h i r d p a s s a g e b yn e u t r a l i z a t i o n w i t h t y p e - s p e c i f i c a n t i s e r a . W i t h s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s , t h ec y t o t o x i c i t y o f s t o o l s ( w h i c h i n o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s may i n t e r f e r ew i t h o b s e r v a t i o n o f s p e c i f i c , v i r a l c y t o p a t h i c c h a n g e s ) w a s n e v e r a p r o b l e m .H o w e v e r , b l i n d p a s s a g e o f t h e c u l t u r e f l u i d w a s r e q u i r e d b e f o r e t h ep r e s e n c e o f v i r u s c o u l d b e e s t a b l i s h e d .

I s o l a t i o n o f v i r u s i n o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s . To e a c h o f f o u r c u l t u r e t u b e ss h o w i n g o u t g r o w t h o f c e l l s , 0 . 1 m l . o f t h e t r e a t e d s t o o l s u s p e n s i o n ( o rt h r o a t s w a b e x t r a c t ) w a s a d d e d , a n d t h e t u b e w a s h e l d s t a t i o n a r y a t 3 6 0 C .T u b e s w e r e e x a m i n e d d a i l y f o r t e n d a y s . I f t h e s t o o l s w e r e t o x i c f o r c u l -t u r e s i t w a s u s u a l l y a p p a r e n t w i t h i n 2 4 h o u r s , w h e r e a s d e g e n e r a t i o n c a u s e db y a c y t o p a t h o g e n i c a g e n t d i d n o t u s u a l l y b e c o m e a p p a r e n t u n t i l b e t w e e nt h e t h i r d a n d f i f t h d a y s . I f s t o o l s w e r e t o x i c , f l u i d s f o r p a s s a g e w e r e h a r -v e s t e d o n t h e f i f t h d a y , o t h e r w i s e t h e y w e r e h a r v e s t e d w h e n d e g e n e r a t i o nw a s c l e a r l y e v i d e n t . P a s s a g e a n d n e u t r a l i z a t i o n t e s t s w e r e t h e n c a r r i e d o u t .

* M o r e r e c e n t l y v i r u s i s o l a t i o n s h a v e b e e n m a d e w i t h m o n o l a y e r c u l t u r e s p r e p a r e df r o m t r y p s i n i z e d m o n k e y k i d n e y s a c c o r d i n g t o Y o u n g n e r ( P r o c . S o c . E x p . B i o l . , N . Y . ,1 9 5 4 , 8 5 , 2 0 2 - 2 0 5 ) . We h a v e f o u n d t h a t m i x t u r e $ 1 9 9 i s n o t e s s e n t i a l a n d t h a t t h ec u l t u r e s g r o w o u t i n m o n o l a y e r s r e a d y f o r u s e i n t h r e e t o f o u r d a y s w h e n t h e t r y p s i n -i z e d c e l l s a r e d i s p e n s e d i n t h e f o l l o w i n g m e d i u m : 0 . 5 % l a c t a l b u m i n e n z y m a t i c h y d r o -l y s a t e ; 2 . 0 % o c a l f s e r u m ( f r o m a n i m a l s a b o u t s i x m o n t h s o f a g e ) ; a n d 9 7 . 5 % O H a n k s 'b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n .* * A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w i t h s t o o l s o f p a t i e n t s a n d w i t h e s t a b l i s h e d s t r a i n s o fp o l i o m y e l i t i s v i r u s s h o w e d t h a t v i r u s i s a d s o r b e d i n s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s i n a b o u t a nh o u r a n d t h e n m u l t i p l i e s i n t h e m t o r e a c h p e a k t i t e r s u s u a l l y i n f i v e d a y s . D u r i n g t h ep e r i o d o f v i r a l m u l t i p l i c a t i o n , t h e t o x i c f a c t o r i n s t o o l s b e c o m e s i n a c t i v a t e d ( o r p e r h a p sa d s o r b e d t o t h e t i s s u e f r a g m e n t s ) . T h e n u m b e r o f i s o l a t i o n s c a n b e i n c r e a s e d b y a b o u t1 0 p e r c e n t i f h a r v e s t s a r e a l s o m a d e o n t h e 1 0 t h a n d 1 5 t h d a y s .468

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


5/21

P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e I MELNICK e t a l .

I d e n t i f i c a t i o n o f v i r a l t y p e s b y n e u t r a l i z a t i o n t e s t s . F l u i d s f r o m p r i m a r yi s o l a t i o n i n k i d n e y t u b e s , o r f r o m s e c o n d p a s s a g e c u l t u r e s s h o w i n g a v i r a lt y p e o f d e g e n e r a t i o n , w e r e t e s t e d i n o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s a g a i n s t e a c h o ft h e t h r e e t y p e - s p e c i f i c p o l i o m y e l i t i s a n t i s e r a . T h e s e r a w e r e p r e p a r e d b yh y p e r i m m u n i z a t i o n o f m o n k e y s a n d h a d t i t e r s o f o v e r 1 : 1 , 0 0 0 a g a i n s t1 0 0 T C 5 0 d o s e s o f v i r u s . T h e b a c k g r o u n d f o r e s t a b l i s h i n g t h e c o n d i t i o n s o ft h e t e s t a s u s e d i n t h i s l a b o r a t o r y h a s b e e n r e p o r t e d i n d e t a i l e l s e w h e r e . 'I n b r i e f , 0 . 2 m l . o f u n d i l u t e d T C ( t i s s u e c u l t u r e ) f l u i d w a s m i x e d w i t h

T A B L E 1 . C O M P A R I S O N O F T I T E R S O F S T O O L S I N O U T G R O W T H C E L L C U L T U R E SW I T H T H E N U M B E R S F O U N D P O S I T I V E F O R V I R U S I NS U S P E N D E D C E L L C U L T U R E S

T i t e r i n o u t g r o w t h N o . o f R e s u l t s i n s u s p e n d e d c u l t u r e sc e l l c u l t u r e s s p e c i m e n s P o s i t i v e N e g a t i v eN e g . 4 2 0 4 21 0 - 1 3 4 1 4 2 01 0 - 2 6 4 21 0 4 2 2 0T o t a l 8 4 2 0 6 4

0 . 2 m l . o f e a c h a n t i s e r u m , p r e v i o u s l y d i l u t e d f i v e f o l d w i t h b a l a n c e d s a l ts o l u t i o n . A f t e r i n c u b a t i o n f o r o n e h o u r a t room t e m p e r a t u r e , 0 . 1 m l . o fe a c h s e r u m - v i r u s m i x t u r e w a s i n o c u l a t e d i n t o t w o t i s s u e c u l t u r e t u b e s . T h ec u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n a s t a t i o n a r y p o s i t i o n u n t i l r e a d , t h r e e a n d s i xd a y s l a t e r f o r k i d n e y t i s s u e , f o u r a n d e i g h t d a y s l a t e r f o r t e s t i c u l a r t i s s u e .T h e v i r u s w a s i d e n t i f i e d b y t h e s e r u m w h i c h n e u t r a l i z e d i t s c y t o p a t h o g e n i cp r o p e r t y . I f a v i r u s w a s n o t n e u t r a l i z e d b y a n y o f t h e t h r e e a n t i s e r a , i t w a st e s t e d a g a i n b y c a r r y i n g o u t t i t r a t i o n s o f t h e v i r u s i n t h e p r e s e n c e o f e a c h o ft h e a n t i s e r a . O c c a s i o n a l l y a p o l i o m y e l i t i s v i r u s o f h i g h t i t e r may n o t b en e u t r a l i z e d i f u n d i l u t e d T C f l u i d i s m i x e d w i t h 1 : 5 a n t i s e r u m .

C o m p a r i s o n o f t h e s e n s i t i v i t y o f s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s w i t h t h a t o fo u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s f o r i s o l a t i o n o f v i r u s . T h e s e e x p e r i m e n t s w e r e c o n -d u c t e d w i t h 7 0 f e c a l s a m p l e s o b t a i n e d f r o m 8 c h i m p a n z e e s f e d p o l i o m y e l i t i sv i r u s a n d w i t h 1 4 s p e c i m e n s f r o m h u m a n c a s e s o f p o l i o m y e l i t i s . T h e s p e c i -m e n s w e r e r u n b y t h e t w o t e c h n i q u e s o u t l i n e d a b o v e . O f t h e 8 4 s p e c i m e n s ,2 0 w e r e p o s i t i v e b y t h e s u s p e n d e d c e l l m e t h o d , b u t 4 2 y i e l d e d v i r u s i n c u l -t u r e s o f o u t g r o w t h c e l l s . A s s h o w n i n T a b l e 1 , t h e c o n c e n t r a t i o n o f v i r u s i n

4 6 9


6/21


t h e s t o o l s p e c i m e n s h a d a n i m p o r t a n t b e a r i n g o n t h e s e f i n d i n g s . T i t r a t i o n so f t h e p o s i t i v e s t o o l s i n c u l t u r e s o f e p i t h e l i a l o u t g r o w t h y i e l d e d v a l u e s o fa b o u t 1 0 - 1 f o r m o s t o f t h e s p e c i m e n s . O n l y e i g h t s a m p l e s g a v e h i g h e rv a l u e s a n d o f t h e s e , s i x w e r e f o u n d t o h a v e y i e l d e d v i r u s i n t h e s u s p e n d e dc u l t u r e t e c h n i q u e . T h e t w o s a m p l e s w h i c h t i t r a t e d t o 1 0 - w e r e p o s i t i v e b yb o t h m e t h o d s .

SEROLOGICAL METHODSD e t e r m i n a t i o n o f n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s . S e r a w e r e t e s t e d f o r t h e

p r e s e n c e o f n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e t h r e e t y p e s o f p o l i o m y e l i t i sv i r u s . T h e a p p l i c a t i o n o f t h e T C n e u t r a l i z a t i o n t e s t t o human s e r a h a s b e e nr e p o r t e d . ' "1 4 , 1 5 I n t h e p r e s e n t s t u d y t h e B r u n h i l d e , Y - S K , a n d L e o n TC-a d a p t e d s t r a i n s w e r e u s e d a s r e p r e s e n t a t i v e s o f T y p e s I , I I , a n d I I I v i r u s e s ,r e s p e c t i v e l y , a t c o n c e n t r a t i o n s r e p r e s e n t i n g 1 0 0 T C 5 0 d o s e s o f e a c h v i r u s .R e a d i n g s w e r e m a d e o n t h e t h i r d t o f o u r t h d a y f o r k i d n e y t u b e s , a n d o n t h ef o u r t h t o s i x t h d a y f o r t e s t i c u l a r c u l t u r e t u b e s . The r e s u l t s r e p o r t e d a r et h o s e o b t a i n e d w h e n t h e c o n t r o l t i t r a t i o n , c a r r i e d o u t s i m u l t a n e o u s l y w i t ht h e t e s t , i n d i c a t e d t h a t t h e d o s e o f v i r u s u s e d w a s e q u i v a l e n t t o 1 0 0 T C 5 0 . 'A n u m b e r o f u n i n o c u l a t e d c o n t r o l t u b e s , a n d t u b e s i n o c u l a t e d w i t h t h es e r u m a l o n e , w e r e p r e s e n t i n e a c h t e s t t o r u l e o u t n o n s p e c i f i c d e g e n e r a t i o n .T w o d i l u t i o n s , 1 : 5 a n d 1 : 5 0 ( o r 3 d i l u t i o n s , 1 : 5 , 1 : 2 0 , 1 : 8 0 ) , o f e a c h

s e r u m w e r e a d d e d , i n 0 . 2 m l . v o l u m e s t o e q u a l v o l u m e s o f s u s p e n s i o n s o fe a c h t y p e o f v i r u s c o n t a i n i n g 2 0 0 T C 5 0 d o s e s p e r 0 . 1 m l . T h u s a f t e r m i x i n g ,t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f s e r u m w e r e 1 : 1 0 a n d 1 : 1 0 0 ( o r 1 : 1 0 , 1 : 4 0 ,a n d 1 : 1 6 0 ) , a n d o f v i r u s , 1 0 0 T C 5 0 d o s e s p e r 0 . 1 m l . A f t e r t h e m i x t u r e h a ds t o o d f o r 1 h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e , 0 . 1 m l . o f e a c h s e r u m - v i r u s m i x t u r ew a s i n o c u l a t e d i n t o e a c h o f t w o o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e t u b e s .

D e t e r m i n a t i o n o f c o m p l e m e n t - f i x i n g a n t i b o d i e s . T h e p r o c e d u r e u s e d i nt h i s l a b o r a t o r y f o r C - F d e t e r m i n a t i o n i n p o l i o m y e l i t i s s t u d i e s h a s b e e nd e s c r i b e d e l s e w h e r e . ' B y c a r r y i n g o u t e a c h t i t r a t i o n o n p l a t e s a t t h r e e l o wc o n c e n t r a t i o n s o f c o m p l e m e n t , i t w a s g e n e r a l l y f o u n d p o s s i b l e t o u s e u n c o n -c e n t r a t e d i n f e c t e d t i s s u e c u l t u r e f l u i d s a s a n t i g e n s a n d t o a v o i d t h e c o n c e n -t r a t i o n p r o c e d u r e r e c o m m e n d e d b y S v e d m y r , E n d e r s , a n d H o l l o w a y . 1 ' T h eB r u n h i l d e , Y - S K , a n d L e o n s t r a i n s o f v i r u s were u s e d f o r t h e p r o d u c t i o no f t y p e s I , I I , a n d I I I a n t i g e n s , r e s p e c t i v e l y . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d t h er e s u l t s r e p o r t e d i n t h i s p a p e r were o b t a i n e d b y u s i n g u n c o n c e n t r a t e d a n t i -g e n s . I t w a s f o u n d t h a t many h e t e r o t y p i c r e a c t i o n s c o u l d b e e l i m i n a t e d a tt h e l o w c o n c e n t r a t i o n o f c o m p l e m e n t a n d a n t i g e n .470

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


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P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e M E LNICK e t a l .

RESULTSS T U D I E S ON C L I N I C A L SPECIMENS FROM NEW H AV E N DU RINGA YEAR OF LOW INCIDENCE OF THE D I S E A S E

O f 4 2 s t o o l s p e c i m e n s e x a m i n e d f r o m 3 4 p a t i e n t s , 1 9 ( f r o m 1 8 p a t i e n t s )w e r e p o s i t i v e f o r p o l i o m y e l i t i s v i r u s w h e n s u s p e n d e d m o n k e y k i d n e yt i s s u e c u l t u r e s w e r e e m p l o y e d f o r p r i m a r y i s o l a t i o n a t t e m p t s . I d e n t i f i c a -t i o n o f v i r u s t y p e b y T C n e u t r a l i z a t i o n t e s t s i n d i c a t e d t h a t v i r u s e s o f

T A B L E 2 . D I S T R I B U T I O N O F V I R U S T Y P E S AMONG C A S E S D I A G N O S E D A SP A R A L Y T I C A N D N O N P A R A L Y T I C P O L I O M Y E L I T I S I N AN E P I D E M I CAND A N O N E P I D E M I C A R E A , 1 9 5 2

P e r c e n t p o s i t i v e s a m p l e sT o t a l V i r u s n o t

N o . p o s i t i v e T y p e 1 2 3 i s o l a t e d , %NEW HAVEN _ -_-

P a r a l y t i c c a s e s 1 1 6 4 1 8 * 1 8 * 2 7 * 3 6N o n p a r a l y t i c c a s e s 2 3 4 8 1 3 2 6 9 5 2

L O C K HAVENP a r a l y t i c c a s e s 4 0 9 3 6 5 2 7 0 7N o n p a r a l y t i c c a s e s 3 0 8 0 6 7 1 3 0 2 0

* I n c l u d e s o n e b u l b a r c a s e .C a s e r a t e : New H a v e n a r e a , 1 1 p e r 1 0 0 , 0 0 0L o c k H a v e n a r e a , 1 2 0 p e r 1 0 0 , 0 0 0a l l t h r e e t y p e s h a d b e e n p r e s e n t i n t h e New H a v e n a r e a d u r i n g t h esummer o f 1 9 5 2 . I n T a b l e 2 t h e t o t a l n u m b e r o f c a s e s i s b r o k e n d o w ni n t o g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e n a t u r e o f t h e i l l n e s s i n v o l v e d a n d t h e t y p eo f v i r u s i s o l a t e d . I s o l a t i o n a t t e m p t s w h i c h g a v e n e g a t i v e r e s u l t s a r e a l s or e c o r d e d . I n v i e w o f t h e f i n d i n g o f a l l t h r e e t y p e s i n a p p r o x i m a t e l y e q u a lp r o p o r t i o n , s e v e r a l o f t h e s t o o l s p e c i m e n s w e r e r u n a g a i n , t h i s t i m e b ya n o t h e r w o r k e r , a n d t h e s a m e v i r u s t y p e w a s i s o l a t e d f r o m e a c h s p e c i m e n .T y p e I v i r u s w a s f o u n d i n 5 p a t i e n t s , a g e d 2 , 3 , 1 1 , 2 5 , a n d 2 9 y e a r s ;T y p e I I i n 8 , a g e d 1 , 4 , 4 , 5 , 6 , 1 2 , 1 5 , a n d 1 8 ; a n d T y p e I I I i n 5 , a g e d 4 ,9 , 1 1 , 1 3 , a n d 1 4 . S i x t e e n s a m p l e s w e r e n e g a t i v e . T h e t h r e e b u l b a r c a s e se a c h y i e l d e d a d i f f e r e n t t y p e o f v i r u s . T h e 8 p a r a l y t i c c a s e s y i e l d e d 4 p o s i -t i v e s p e c i m e n s , t w o b e l o n g i n g t o T y p e I I I a n d o n e t o e a c h o f t h e o t h e r t w ot y p e s . T h e 2 3 n o n p a r a l y t i c p a t i e n t s y i e l d e d 1 1 i s o l a t e s , 3 T y p e I , 6 T y p eI I , a n d 2 T y p e I I I v i r u s e s . No v i r a l t y p e s e e m e d t o h a v e a p r e d i l e c t i o n f o ra p a r t i c u l a r a g e g r o u p .

4 7 1


8/21


O f 4 4 t h r o a t s w z v a b s p e c i m e n s e x a m i n e d , 7 w e r e p o s i t i v e f o r p o l i o m y e l i t i sv i r u s , w i t h a l l 3 v i r a l t y p e s a m o n g t h e 7 i s o l a t e s . T h e n a t u r e o f e a c h c a s ey i e l d i n g v i r u s i n t h e t h r o a t , t o g e t h e r w i t h a c o m p a r i s o n w i t h t h e s t o o li s o l a t i o n a t t e m p t s o n t h e s e p a t i e n t s , i s r e c o r d e d i n T a b l e 3 . T h e s t o o l s o f 5o f t h e 7 p a t i e n t s h a d a l s o b e e n e x a m i n e d f o r p o l i o m y e l i t i s v i r u s , a n d o ft h e s e f i v e s t o o l s , a l l b u t o n e y i e l d e d p o l i o m y e l i t i s v i r u s . I n e a c h c a s e v i r u sT A B L E 3 . I S O L A T I O N S OF P O L I O M Y E L I T I S V I R U S E S FROM THROAT SWABS OFNE W HAVEN P A T I E N T S D I A G N O S E D AS P O L I O M Y E L I T I S C A S E ST y p e v i r u s V i r u si s o l a t e d f r o m N o . o f i s o l a t i o nt h r o a t s w a b p a t i e n t s N a t u r e o f c a s e f r o m s t o o l

I 2 N o n p a r a l y t i c N e g a t i v eN o n p a r a l y t i c T y p e II I 3 N o n p a r a l y t i c S p e c i m e n u n -a v a i l a b l eN o n p a r a l y t i c T y p e I IP a r a l y t i c S p e c i m e n u n -a v a i l a b l e

I I I 2 P a r a l y t i c T y p e I I IB u l b a r T y p e I I IN e g a t i v e 3 7T o t a l p o s i t i v e 7 / 4 4

o f t h e s a m e t y p e w a s i s o l a t e d f r o m t h e i n t e s t i n e a n d t h r o a t . T h e l o w e rf r e q u e n c y o f v i r u s r e c o v e r i e s f r o m t h e t h r o a t i s i n k e e p i n g w i t h t h e r e s u l t so f p r e v i o u s e x p e r i m e n t s i n w h i c h m o n k e y s h a d b e e n u s e d a s t e s t a n i m a l s .S T U D I E S ON C L I N I C A L SPECIMENS FROM L OCK H AV E N DURING A YEAROF HIGH INCIDENCE OF THE D I S E A S E

V i r u s i s o l a t i o n s . O f 1 2 8 s t o o l s p e c i m e n s t a k e n f r o m 7 0 p a t i e n t s , 9 0 f r o m6 1 p a t i e n t s w e r e p o s i t i v e f o r v i r u s . T h u s 87% o f t h e p a t i e n t s y i e l d e d v i r u s .T h e f o l l o w i n g b r e a k d o w n o f t h e d a t a w a s m a d e ( s e e T a b l e 2 ) :1 . T h i r t y - s e v e n o f 4 0 ( 9 3 % ) o f t h e p a r a l y t i c p a t i e n t s a n d 2 4 o f 3 0( 8 0 % ) o f t h e n o n p a r a l y t i c p a t i e n t s w e r e p o s i t i v e .2 . T y p e I v i r u s w a s r e c o v e r e d f r o m 4 6 p a t i e n t s , o f w h o m 2 6 ( 5 7 % )w e r e p a r a l y t i c a n d 2 0 ( 4 3 % o ) w e r e n o n p a r a l y t i c .

472

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


9/21


T A B L E 4 . S E R O L O G I C A L F I N D I N G S ON 1 8 P A T I E N T S WITH P A R A L Y T I CP O L I O M Y E L I T I S F R O M WHOM TYPE I V I R U S WAS I S O L A T E D

S e r o l o g i c a l f i n d i n g sS t o o l i s o l a t i o n s N e u t r a l i z i n g C . F .

Number Age D a y s T y p e D a y s a n t i b o d y t i t e r a n t i b o d y t i t e ro f i n a f t e r o f a f t e r T y p e T y p e T y p e T y p e T y p e T y p ep a t i e n t y e a r s o n s e t v i r u s o n s e t I I I I I I I I I I I I2 8 0 . 2 6 I 5 1 0 0 + 1 0 0 + 0 1 0 2 0 1 61 0 I 3 2 1 0 0 + 1 0 0 +

4 4 0 1 02 6 1 6 0 + 4 03 7 1 6 0 + 1 6 0

6 5 0 . 3 5 I

1 3 5 1 . 4 8 - 9 n e g . 7 1 0 0 + 1 01 2 - 1 3 I 2 5 1 0 0 + 08 3 1 . 5 8 I 7 1 6 0 + 2 09 - 1 2 n e g . 4 9 1 6 0 + 4 0

7 0 1 6 0 + 1 6 0 +2 2 1 6 n e g . 1 4 1 0 0 + 01 7 I 4 9 1 0 0 + 1 0

7 0 1 0 0 + 1 01 0 1 2 9 - 1 0 I 4 1 0 0 + 02 1 1 0 0 + 04 4 1 0 0 + 1 0

1 0 4 2 5 - 6 I 3 1 0 07 I 3 6 1 0 0 + 1 0

1 0 3 6 n e g . 4 1 0 0 + 3 28 I 2 4 1 0 0 + 09 I

0 3 2 8 0 80 0 ' O 00 4 0 00 3 2 0 00 0 0 80 3 2 0 1 60 0 0 1 60 3 2 0 40 3 2 0 00 0 0 00 0 0 00 1 6 0 00 0 0 00 3 2 0 00 3 2 0 00 4 0 00 8 0 40 0 0 00 0 4 0 0

1 3 3 5 I 2 1 0 0 + 02 6 1 0 0 + 04 7 1 0 0 + 0

8 2 3 9 I 6 1 6 0 + 3 01 1 I 2 8 1 6 0 + 1 04 1 1 6 0 + 01 1 0 3 8 I 9 1 0 0 + 3 2

3 4 1 0 0 + 0

0 0 0 00 3 2 0 00 3 2 0 00 0 0 00 8 0 00 8 0 00 00 00 1 6 0 0

1 0 =n e u t r a l i z i n g t i t e r o f l e s s t h a n 1 0 .6 0 =C - F t i t e r o f l e s s t h a n 4 .6 3 2 =C - F t i t e r o f 3 2 o r g r e a t e r .' G r e a t e r t h a n 4 When c o n c e n t r a t e d a n t i g e n w a s u s e d .

473


10/21


S e r o l o g i c a l f i n d i n g sm b e r Age

S t o o l i s o l a t i o n sD a y s T y p e

4 f i n a f t e r' i e n t y e a r s o n s e t4 4 4 4

63 5 1 01 5

o fviru s

Ineg.

D a y sa f t e ro n s e t

112

N e u t r a l i z i n ga n t i b o d y t i t e rT y p e

I0

100+I 7 3 2I 2 6 1 0 0

4 7 100+3 0 5 1 2 I 8 100+1 4 I 3 0 l o O +5 1 100+8 0 5 7 - 8 I 5 4 0

2 4 1 6 0 +3 9 1 6 0 +

1 1 2 6 7 - 9 I 5 100+4 0 100+5 3 100+

7 9 7 I 4 101 9 100+4 0 100+

1 8 7 3 2 8 I 4 1 6 03 5 1 6 0 +

T y p eI I01 000

100+1 01 00

4 03 00

3 200

1 000

160+8 0

C . F .a n t i b o d y t i t e r

T y p eI I I00

00

0

T y p eI

032

T y p e T y p eI I I I I0 00 0

0 0 0003 2 0 0

0 000 3 2 00 3 2 0

000

0 0 0 00 8 0 00 3 2 0 00 00 00 8 0 00 8 0 0000

1 6 0 +1 6 0 +

004 0 08 8 00 0 0

3 2 0 3 2

3 . T y p e I I v i r u s was i s o l a t e d f r o m 1 5 p a t i e n t s , o f w h o m 1 1 ( 7 3 % o ) w e r ep a r a l y t i c a n d 4 ( 2 7 % o ) were n o n p a r a l y t i c .4 . I n n o case was a T y p e I I I v i r u s i s o l a t e d .5 . When more t h a n o n e s p e c i m e n f r o m a s i n g l e p a t i e n t y i e l d e d v i r u s , t h esame t y p e was r e c o v e r e d f r o m e a c h s p e c i m e n .6 . Of t h e 4 0 p a r a l y t i c c a s e s , 2 6 ( 6 5 % o ) y i e l d e d T y p e I v i r u s , 1 1 ( 2 7 % o )

T y p e I I v i r u s , a n d 3 ( 9 % o ) no v i r u s .7 . Of t h e 3 0 n o n p a r a l y t i c c a s e s , 2 0 ( 6 7 % o ) y i e l d e d T y p e I v i r u s , 4( 1 3 % o ) T y p e I I v i r u s , a n d 6 ( 2 0 % o ) n o v i r u s .

S e r o l o g i c a l f i n d i n g s . 1 . P a t i e n t s f r o m w h o m T y p e I v i r u s was i s o l a t e d .S e r o l o g i c a l s t u d i e s w e r e made on s p e c i m e n s f r o m 1 8 p a t i e n t s w i t h p a r a l y t i ca n d f r o m 1 4 w i t h n o n p a r a l y t i c p o l i o m y e l i t i s i n t h i s c a t e g o r y ( T a b l e s 4 and5 , r e s p e c t i v e l y ) . T he i n d i v i d u a l s r e a c t e d s i m i l a r l y , i r r e s p e c t i v e o f t h e f o r mo f d i s e a s e , a n d w i l l t h e r e f o r e b e d e a l t w i t h t o g e t h e r .

47 4

N u tp a t

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


11/21

P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e I M E LNICK e t a l .

T A B L E 5 . S E R O L O G I C A L F I N D I N G S ON 1 4 P A T I E N T S WITH N O N P A R A L Y T I CP O L I O M Y E L I T I S F R O M WHOM TYPE I V I R U S WAS I S O L A T E D


Number A g e D a y s T y P e D a y s a n t i b o d y t i t e r a n t i b o d y t i t e ro f i n a f t e r o f a f t e r T y p e T y p e T y p e T y p e T y p e T y p ep a t i e n t y e a r s o n s e t z i r u s o n s e t I I I I I I I I I I I I7 8 0 . 8 2 I 1 1 0 0 3 2 0 0 0 0

3 I 1 9 1 0 0 + 0 0 3 2 0 06 I 4 2 1 0 0 + 0 0 3 2 0 0

1 7 1 . 5 5 n e g . 5 1 0 0 + 0 0 4 0 3 27 I 2 5 1 0 0 + 0 0 3 2 0 3 28 n e g .

5 0 2 4 - 5 I 4 0 07 I 1 8 1 6 0 + 4 0

3 2 1 6 0 + 1 05 4 2 7 n e g . 7 1 0 0 + 0

8 I 4 1 1 0 0 + 09 I

1 2 3 8 I 6 1 0 0 + 09 I 2 0 1 0 0 + 0

8 6 3 1 8 - 2 1 I 2 5 1 0 0 + 1 06 4 1 0 0 + 1 0 0 +

1 1 3 3 2 I 1 3 2 04 n e g . 2 2 1 0 0 + 1 06 I

4 8 7 4 I 4 1 0 1 05 - 9 I 2 2 1 0 1 03 8 0 0

0 0 0 80 0 0 80 1 6 0 80 00 00 3 2 0 00 0 0 00 3 2 0 00 00 00 3 2 0 000

000

0 0 00 0

4 3 8 0 02 2 1 0 3 I 5 4 0 1 0 0 0 0 07 I 2 3 1 6 0 0 0 8 0 0

4 4 1 6 0 + 0 0 1 6 0 04 0 1 0 8 I 7 1 0 0 + 1 0 1 0 0 + 0 0 81 0 I 2 7 1 0 0 + 0 1 0 0 + 8 0 84 1 1 4 3 I 1 3 2 3 2 3 2 3 2 0 3 2

6 I 2 4 1 0 0 + 1 0 0 + 1 0 0 + 3 2 0 3 2

4 7 5


12/21


S e r o l o g i c a l f i n d i n g sS t o o l i s o l a t i o n s N e u t r a l i z i n g C . F .Number A g e D a y s T y P e D a y s a n t i b o d y t i t e r a n t i b o d y t i t e ro f i n a f t e r o f a f t e r T y p e T y p e T y p e T y p e T y p e T y p ep a t i e n t y e a r s o n s e t v i r u s o n s e t I I I I I I I I I I I I

4 6 1 4 8 - 9 I 4 4 0 4 0 1 0 0 0 01 5 1 6 0 + 4 0 1 0 0 0 05 2 1 5 1 2 - 1 4 I 1 2 1 0 0 + 0 0 0 0 01 5 I 2 8 1 0 0 + 0 0 3 2 0 0

5 4 1 0 0 + 0 0 1 6 0 01 0 2 1 5 1 0 I 2 0 0 0 0 0 0

4 6 1 6 0 + 3 2 0 0 1 0 0G r e a t e r t h a n 4 w h e n c o n c e n t r a t e d a n t i g e n w a s u s e d .N i n e t e e n ( 5 9 % o ) a l r e a d y h a d h o m o l o g o u s n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y i n h i g ht i t e r ( 1 0 0 o r m o r e ) i n t h e f i r s t s e r u m s p e c i m e n . I n s u b s e q u e n t s a m p l e st h e s e t i t e r s r e m a i n e d h i g h . A s e n d - p o i n t s w e r e n o t a t t a i n e d i n t h e t i t r a t i o n s ,

n o t h i n g c a n b e s a i d a b o u t t h e t i m e w h e n p e a k a n t i b o d y t i t e r s w e r e r e a c h e d .T w e l v e o t h e r s ( 3 8 % o ) s h o w e d a r i s e i n T y p e I a n t i b o d y b e t w e e n t h e i r f i r s ta n d s e c o n d s e r u m s a m p l e s . O n e p a t i e n t ( N o . 4 8 ) s h o w e d a l o w t i t e r i n t h ei n i t i a l b l e e d i n g s w i t h n o s u b s e q u e n t r i s e .

C h a n g e s i n T y p e I I n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y l e v e l s o c c u r r e d i n many o f t h ep a t i e n t s who w e r e i n f e c t e d w i t h T y p e I v i r u s . T w e l v e s h o w e d i n c r e a s e s i nT y p e I I t i t e r b e t w e e n t h e f i r s t a n d l a t e r s e r a . T w e l v e o t h e r s h a d t r a n s i t o r yl o w t i t e r T y p e I I a n t i b o d i e s d e t e c t a b l e i n t h e e a r l y s e r a o n l y . T y p e I I In e u t r a l i z i n g a n t i b o d y w a s p r e s e n t o n l y i n a f e w i n d i v i d u a l s a n d i n o n l y o n e( N o . 4 1 ) w a s a n i n c r e a s e i n t i t e r d e m o n s t r a t e d .W i t h t h r e e e x c e p t i o n s ( N o s . 4 1 , 1 7 , a n d 1 0 4 ) h o m o l o g o u s C - F a n t i b o d i e sc o u l d n o t b e d e t e c t e d i n t h e f i r s t s e r u m , b u t t h e y a p p e a r e d i n t h e l a t e r s p e c i -m e n s o f a l l b u t f o u r p a t i e n t s ( 8 8 % o p o s i t i v e r e s p o n s e ) . When a n a n t i g e nc o n s i s t i n g o f a t e n f o l d c o n c e n t r a t e d T C f l u i d w a s u s e d , a r i s e i n t i t e r f r o ml e s s t h a n t w o t o g r e a t e r t h a n f o u r c o u l d b e d e t e c t e d i n t w o ( N o s . 1 0 , 1 0 2 )o f t h e t h r e e p a t i e n t s who w e r e n e g a t i v e w h e n t e s t e d w i t h u n c o n c e n t r a t e da n t i g e n .

O n l y o n e ( N o . 7 ) o f t h e p a t i e n t s f r o m w h o m T y p e I was i s o l a t e d s h o w e da n y T y p e I I C - F a n t i b o d y . I n t h i s o n e c a s e i t f i r s t a p p e a r e d i n t h e t h i r ds e r u m . N i n e ( 2 9 % o ) h a d T y p e I I I C - F a n t i b o d i e s b u t d u r i n g t h e p e r i o d476

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


13/21


T A B L E 6 . S E R O L O G I C A L F I N D I N G S O N 9 P A T I E N T S WITH P O L I O M Y E L I T I SF R O M WHOM TYPE I I V I R U S WAS I S O L A T E D


Number A g e D a y s T y p e D a y s a n t i b o d y t i t e r a n t i b o d y t i t e ro f i n a f t e r o f a f t e r T y p e T y p e T y p e T y p e T y p e T y p ep a t i e n t y e a r s o n s e t v i r u s o n s e t I I I I I I I I I I I IP a r a l y t i c c a s e s

4 7 1 . 7 7 - 8 I I 5 0 1 0 0 + 03 1 0 1 0 0 + 01 1 4 8 - 1 0 I I 6 3 2 1 0 0 + 01 1 I I 2 8 0 1 0 0 + 0

4 9 0 1 0 0 + 09 3 4 5 n e g . 3 0 1 0 0

6 I I 3 3 0 1 0 0 + 08 I I 4 4 0 1 0 0 + 0

9 1 7 1 2 I I 3 0 0 02 3 0 1 0 0 04 4 0 1 0 0 + 0

9 7 7 1 1 I I 7 4 0 4 0 01 3 I I 3 1 1 6 0 + 1 6 0 + 1 05 9 1 6 0 + 1 6 0 + 1 01 1 7 2 8 1 1 I I 5 1 0 0 + 1 0 0 + 0

2 7 1 0 0 + 1 0 0 + 05 4 1 0 0 + 1 0 0 + 0

N o n p a r a l y t i c c a s e s1 3 7 1 . 8 4 - 6 I I 2 1 0 0 + 3 2 08 I I 2 8 1 0 0 + 1 0 0 + 0

1 8 1 2 I I 0 1 0 0 + 1 0 0 + 0I I 2 3 1 0 0 + 1 0 0 + 02 0 1 4 1 0 I I 8 0 1 0 0 + 01 2 I I 4 6 0 1 0 0 + 01 4 n e g .

4 0 40 1 6 000 00 8 40 3 2 000 00 3 2 00 3 2 00 0 00 8 00 3 2 04 0 08 0 01 6 4 00 0 000 00 0 0

0 0 00 0 01 6 8 88 8 400 00 0 1 0

1 G r e a t e r t h a n 4 w h e n c o n c e n t r a t e d a n t i g e n was u s e d .

477


14/21


o f s t u d y , t h e T y p e I I I t i t e r i n c r e a s e d i n o n l y t w o o f t h e s e p a t i e n t s a n d i tf e l l i n t w o o t h e r s .2 . P a t i e n t s f r o m w h o m T y p e I I v i r u s w a s i s o l a t e d ( T a b l e 6 ) . N i n e o ft h e p a t i e n t s s t u d i e d w e r e i n t h i s g r o u p . F i v e h a d h o m o l o g o u s n e u t r a l i z i n ga n t i b o d y i n h i g h t i t e r a t t h e t i m e t h e f i r s t s e r u m w a s c o l l e c t e d a n d m a i n -t a i n e d a h i g h l e v e l f o r t h e p e r i o d o f s t u d y . T h e o t h e r f o u r d e v e l o p e dT y p e I I a n t i b o d i e s i n h i g h t i t e r b y t h e t i m e t h e s e c o n d s e r u m w a s c o l l e c t e d .One p a t i e n t ( N o . 1 1 ) h a d t r a n s i t o r y T y p e I a n t i b o d i e s . O n e ( N o . 1 8 )h a d T y p e s I a n d I I n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s a n d C - F a n t i b o d i e s a g a i n s t a l lt h r e e t y p e s p r e s e n t i n t h e f i r s t s e r u m s a m p l e ; o f t h e C - F a n t i b o d i e s , o n l y

t h e T y p e I I d i d n o t f a l l i n t i t e r i n t h e s e c o n d s p e c i m e n . A n o t h e r ( N o . 9 7 )m a n i f e s t e d s i m u l t a n e o u s i n c r e a s e s i n a n t i b o d i e s t o a l l t h r e e t y p e s o f v i r u s .I t i s n o t e w o r t h y t h a t N o . 9 7 w a s t h e o n l y p a t i e n t i n t h i s g r o u p t o s h o w a ni n c r e a s e i n T y p e I C - F t i t e r a n d t h a t t h i s i n c r e a s e w a s g r e a t e r t h a n t h a t i nT y p e I I a n t i b o d y . T h i s r a i s e s a q u e s t i o n a s t o w h e t h e r T y p e I v i r u s maya l s o h a v e b e e n i n v o l v e d i n t h i s d i s e a s e , f o r b o t h v i r a l t y p e s w e r e p r e v a l e n ti n L o c k H a v e n .F o u r o t h e r p a t i e n t s s h o w e d i n c r e a s e s i n h o m o l o g o u s C - F t i t e r , a n d , w h e nc o n c e n t r a t e d a n t i g e n w a s u s e d , a n t i b o d i e s c o u l d b e s h o w n i n t h e c o n -v a l e s c e n t b u t n o t t h e a c u t e p h a s e s e r u m o f a n o t h e r ( N o . 2 0 ) .3 . P a t i e n t s w i t h c l i n i c a l s y m p t o m s s u g g e s t i v e o f p o l i o m y e l i t i s b u t f r o mw h o m n o v i r u s w a s i s o l a t e d ( T a b l e 7 ) . N i n e p a t i e n t s i n t h i s g r o u p w e r es t u d i e d , t w o p a r a l y t i c a n d s e v e n n o n p a r a l y t i c . S e v e r a l o f t h e s e p a t i e n t ss h o w e d s e r o l o g i c a l r e s p o n s e s t o p o l i o m y e l i t i s v i r u s a n d i n c e r t a i n c a s e s t h er e s u l t s g i v e a n i n d i c a t i o n o f t h e t y p e o f v i r u s t h a t w a s i n v o l v e d . I n t h r e ec a s e s t h e r e w a s a r i s e i n T y p e I C - F a n t i b o d y a n d o f t h e s e t h e t w o t h a t

w e r e t e s t e d a l s o h a d T y p e I n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y p r e s e n t i n h i g h t i t e r i n a l ls e r a . T h e y d i d n o t p o s s e s s n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y a g a i n s t e i t h e r o f t h e o t h e rt w o t y p e s .

A n o t h e r p a t i e n t ( N o . 9 9 ) h a d T y p e I I C - F a n t i b o d y i n t h e c o n v a l e s c e n tb u t n o t i n t h e a c u t e s e r u m . T h i s i n d i v i d u a l h a d T y p e I I n e u t r a l i z i n g a n t i -b o d y i n h i g h t i t e r i n a l l t h r e e s p e c i m e n s a n d a n i n c r e a s i n g l e v e l o f T y p e In e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s .One p a t i e n t ( N o . 6 6 ) h a d n o d e t e c t a b l e a n t i b o d i e s o f e i t h e r s o r t a g a i n s t

a n y t y p e o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s .4 . I n t e g r a t i o n o f r e s u l t s f r o m a l l c a t e g o r i e s o f L o c k H a v e n p a t i e n t s . A l l

p e r s o n s s t u d i e d h a d n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e t y p e o f v i r u s i s o -l a t e d f r o m t h e i r s t o o l s . I n 2 4 o f t h e 4 1 f r o m w h o m v i r u s w a s i s o l a t e d( 5 9 % o ) t h i s a n t i b o d y w a s a l r e a d y p r e s e n t i n h i g h t i t e r a t t h e t i m e o f t h e478

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


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P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e M E LNICK e t a l .

T A B L E 7 . S E R O L O G I C A L F I N D I N G S ON 9 P A T I E N T S WITH C L I N I C A L S Y M P T O M SS U G G E S T I V E OF P O L I O M Y E L I T I S FROM WHOM V I R U S I S O L A T I O N SWERE N E G A T I V E * O R NOT T R I E D


Number A g e D a y s T y p e D a y s a n t i b o d y t i t e r a n t i b o d y t i t e ro f i n a f t e r o f a f t e r T y p e T y p e T y p e T y p e T y p e T y p ep a t i e n t y e a r s o n s e t v i r u s o n s e t I I I I I I I I I I I IP a r a l y t i c c a s e s

1 6 1 2 1 4 n e g . 1 1 0 1 0 0 + 05 3 0 1 0 0 + 01 4 1 8 1 2 n e g .

1 4 n e g .2 0 n e g .

1 7 1 . 7 5 n e g .7 n e g .8 n e g .

6 6 6 3 n e g .

5 1 7 1 7 n e g .1 8 n e g .1 9 n e g .1 1 2

4 1 0 0 + 1 0 0 + 1 0 0 +2 0 1 0 0 + 1 0 0 + 1 0 0 +6 7 1 0 0 + 1 0 0 + 1 0 0 +

N o n p a r a l y t i c c a s e s5 1 0 0 + 0 0

2 5 1 0 0 + 0 03 0 0 0

2 3 0 0 04 4 0 0 01 7 0 0 3 23 5 0 0 3 2

75 18 1 2 6 n e g . 3 1 0 0 + 02 1 1 0 0 + 05 0 1 0 0 + 0

9 9 1 3 8 n e g . 3 3 2 1 0 02 0 1 0 0 1 0 05 1 1 0 0 + 1 0 0

1 8 8 2 0

000000

1 22 8

0 0 3 20 0 3 20 3 20 3 20 3 2

000

4 0 3 23 2 0 3 20 00 00 0

000

00 000 000 0

3 2 0 00 04 01 6 00 00 3 20 3 2

000000

* B y b o t h s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e a n d o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s .

0 0 400 0

4 7 9


16/21


f i r s t s e r u m s p e c i m e n . I n c r e a s e s i n h e t e r o l o g o u s - t y p e n e u t r a l i z i n g a n t i b o d yw e r e f o u n d i n 1 3 o f 4 1 c a s e s ( 3 2 % ) .M o s t p e r s o n s ( 9 0 % w h e n t h e r e s u l t s w i t h c o n c e n t r a t e d a n t i g e n a r ei n c l u d e d ) s h o w e d a n i n c r e a s e i n C - F a n t i b o d i e s d u r i n g t h e p e r i o d o f s t u d ya g a i n s t t h e t y p e o f v i r u s i s o l a t e d f r o m t h e i r s t o o l s . H e t e r o l o g o u s C - F a n t i -b o d y i n c r e a s e s o c c u r r e d l e s s f r e q u e n t l y ; 1 0 % o o f t h e c a s e s s h o w e d a ni n c r e a s e i n a n t i b o d y a g a i n s t o n e o r t h e o t h e r h e t e r o l o g o u s t y p e .

T h e r e s u l t s , r e c o r d e d i n T a b l e s 4 , 5 , 6 , a n d 7 , o f t h e T y p e I n e u t r a l i z a -t i o n a n d C - F t e s t s o n a l l t h e s e r a w i t h w h i c h b o t h t e s t s w e r e m a d e ( f r o m4 7 L o c k H a v e n p a t i e n t s ) a r e b r o u g h t t o g e t h e r i n T a b l e 8 . A l l b u t o n e o fT A B L E 8 . N E U T R A L I Z A T I O N AND COMPLEMENT F I X A T I O N R E S P O N S E S INLoCK HAVEN P O L I O M Y E L I T I S P A T I E N T S

N e u t r a l i z a t i o n t i t e r s C-F t i t e r sd u r i n g c o u r s e F a l l i n R i s e i n t i t e r H i g h t i t e r i no f i l l n e s s N e g a t i v e t i t e r 2 x 4 x 8 x 1 6 x a l l s a m p l e s

N u m b e r o f p a t i e n t s i n e a c h c a t e g o r yN e g a t i v e 6 1 0 0 0 0 0F a l l i n t i t e r 1 0 0 0 0 0 0R i s e i n t i t e r 2 0 2 2 2 7 1H i g h t i t e r p r e s e n t i na l l s a m p l e s 3 1 1 2 6 1 0 0

t h e i n c r e a s e s i n T y p e I C - F w e r e a c c o m p a n i e d e i t h e r b y a c o n c u r r e n ti n c r e a s e i n n e u t r a l i z a t i o n t i t e r o r a c o n t i n u i n g h i g h l e v e l o f n e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s . C o n c e r n i n g T y p e I I s e r o l o g i c t e s t s , m o r e c o n v a l e s c e n t s e r ap o s s e s s e d n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y t h a n C - F a n t i b o d y b u t e i g h t o f n i n e p a t i e n t sw i t h a C - F a n t i b o d y i n c r e a s e a l s o s h o w e d a n i n c r e a s e i n , o r c o n t i n u i n g h i g hl e v e l o f , n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y . T h e r e w e r e t o o f e w p a t i e n t s w i t h a n i n c r e a s ei n e i t h e r T y p e I I I C - F o r n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y t o b e a r a n a l y s i s b u t t h e f e wt h a t w e r e p o s i t i v e f o r o n e k i n d o f a n t i b o d y s h o w e d l i t t l e c o r r e l a t i o n w i t ht h o s e p o s i t i v e f o r t h e o t h e r .DISCUSSION

T h i s r e p o r t i s c o n c e r n e d w i t h t h e a p p l i c a t i o n a n d d e v e l o p m e n t o f t i s s u ec u l t u r e m e t h o d s f o r u s e i n p o l i o m y e l i t i s l a b o r a t o r i e s c o n c e r n e d w i t h d i a g -n o s t i c a n d e p i d e m i o l o g i c a l w o r k . T h r e e a s p e c t s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d :4 8 0

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


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1 . T e c h n i q u e s f o r i s o l a t i n g v i r u s . C o m p a r a t i v e t e s t s o f s u s p e n d e d c e l lc u l t u r e s o f m o n k e y k i d n e y t i s s u e a n d o f c u l t u r e s o f o u t g r o w t h c e l l s i n d i -c a t e d t h a t t h e l a t t e r w e r e m o r e s e n s i t i v e f o r t h e i s o l a t i o n o f p o l i o m y e l i t i sv i r u s . When l a r g e a m o u n t s o f v i r u s w e r e p r e s e n t , v i r u s c o u l d b e i s o l a t e d b ye i t h e r m e t h o d , b u t f o r s m a l l a m o u n t s , t h e o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s p r o v e ds u p e r i o r .By t h e u s e o f o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s , v i r u s c o u l d b e i s o l a t e d a n d t y p e d i nf i v e t o s e v e n d a y s i f a m o d e r a t e a m o u n t o f v i r u s w a s p r e s e n t a n d t h e s p e c i -men w a s n o t h i g h l y t o x i c . * A f e w d a y s l o n g e r w e r e r e q u i r e d w h e ns u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s w e r e u s e d f o r t h e p r i m a r y i s o l a t i o n o f v i r u s .S u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s h a v e t h e a d v a n t a g e o f c i r c u m v e n t i n g t h e c y t o t o x i ca c t i o n o f c e r t a i n s t o o l s . H o w e v e r , c y t o t o x i c i t y o f s t o o l s i s a f a r m o r e s e r i -o u s p r o b l e m w i t h o u t g r o w t h s f r o m m o n k e y t e s t i c u l a r t i s s u e t h a n w i t h t h o s ef r o m m o n k e y k i d n e y t i s s u e .

2 . I s o l a t i o n a n d t y p i n g o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s e s f r o m c l i n i c a l s p e c i m e n so b t a i n e d i n a r e a s o f l o w a n d o f h i g h i n c i d e n c e o f t h e d i s e a s e . A l l t h r e e v i r a lt y p e s w e r e f o u n d i n a b o u t e q u a l p r o p o r t i o n s i n New H a v e n p a t i e n t s i n1 9 5 2 , a y e a r w h e n t h e d i s e a s e i n t h e a r e a w a s m i l d a n d t h e p r e v a l e n c e l o w .T y p e I a n d T y p e I I v i r u s e s w e r e b o t h i s o l a t e d d u r i n g a s e v e r e o u t b r e a k i nL o c k H a v e n , P e n n s y l v a n i a , d u r i n g t h e s a m e y e a r . H o w e v e r , i n t h e l a t t e re p i d e m i c T y p e I s t r a i n s w e r e i s o l a t e d a t t h r e e t i m e s t h e f r e q u e n c y o f T y p eI I s t r a i n s . T h e r e w a s n o c o r r e l a t i o n i n e i t h e r a r e a o f s t r a i n s o f o n e t y p ew i t h a c l i n i c a l f o r m o f t h e d i s e a s e . T y p e I I i n f e c t i o n s w e r e a s s e v e r e a st h o s e d u e t o T y p e I , a n d t h e r a t i o o f n o n p a r a l y t i c t o p a r a l y t i c i n f e c t i o n samong h o s p i t a l i z e d p a t i e n t s w a s n o g r e a t e r f o r T y p e I I t h a n f o r T y p e Iv i r u s .I t h a s b e e n s h o w n a b o v e t h a t o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s a r e m o r e s e n s i t i v ei n d e t e c t i n g s m a l l a m o u n t s o f v i r u s t h a n a r e s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s . S i n c ea l l b u t t h r e e i s o l a t i o n s f r o m t h e c l i n i c a l s p e c i m e n s w e r e m a d e b y t h e s u s -p e n d e d c e l l c u l t u r e t e c h n i q u e , s o m e s p e c i m e n s r e p o r t e d h e r e a s n e g a t i v eu n d o u b t e d l y c o n t a i n e d v i r u s . I t i s n o t e w o r t h y t h a t 5 8 o f 7 0 p a t i e n t s ( 8 3 % )f r o m a n e p i d e m i c a r e a ( L o c k H a v e n ) y i e l d e d v i r u s , i n c o n t r a s t t o 1 8 o f 3 4p a t i e n t s ( 5 3 % ) i n a n e n d e m i c a r e a (New H a v e n ) . P e r h a p s t h i s may b e a

* A m o r e r a p i d m e t h o d c a n b e u s e d i f a d e q u a t e s u p p l i e s o f i m m u n e s e r a a r e a v a i l a b l e .T h e s t o o l s u s p e n s i o n i n 0 . 2 5 m l . a m o u n t s i s d i s t r i b u t e d i n t h r e e t u b e s , t h e f i r s t c o n -t a i n i n g 0 . 2 5 m l . o f 1 : 5 T y p e I i m m u n e s e r u m , t h e s e c o n d , T y p e I I , a n d t h e t h i r d ,T y p e I I I s e r u m . A f t e r a n i n c u b a t i o n p e r i o d o f o n e h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e , 0 2 m l . o fe a c h m i x t u r e i s i n o c u l a t e d i n t o e a c h o f t w o o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e s . T h e v i r u s t y p e c a nb e i d e n t i f i e d a s s o o n a s i t i s i s o l a t e d , f o r d e g e n e r a t i o n w i l l b e o b s e r v e d i n t h e f o u rt u b e s c o n t a i n i n g t h e h e t e r o t y p i c s e r a , b u t n o t i n t h e t w o t u b e s c o n t a i n i n g t h e h o m o -t y p i c s e r u m . By t h i s t e c h n i q u e , w h i c h h a s a l s o b e e n u s e d a t t h e C h i l d r e n ' s H o s p i t a l i nB o s t o n , v i r u s c a n s o m e t i m e s b e i s o l a t e d a n d t y p e d w i t h i n 4 8 h o u r s .

4 8 1


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r e f l e c t i o n o f a l a r g e r o u t p u t o f v i r u s b y p a t i e n t s i n f e c t e d b y e p i d e m i c s t r a i n so f p o l i o m y e l i t i s v i r u s , o r o f a g r e a t e r c y t o p a t h o g e n i c i t y p o s s e s s e d b ye p i d e m i c s t r a i n s .

3 . S e r o l o g i c a l f i n d i n g s i n p a t i e n t s . I t i s now known t h a t n e u t r a l i z i n ga n t i b o d i e s t o p o l i o m y e l i t i s v i r u s d e v e l o p e a r l y i n t h e d i s e a s e , s o t h a t i t i sn o t u n e x p e c t e d t o f i n d t h e m p r e s e n t a t h i g h t i t e r a t t h e t i m e t h e p a t i e n t i sb r o u g h t i n t o t h e h o s p i t a l . T h e f a c t t h a t t h e r e s p o n s e may b e b r o a d e r t h a n t ot h e t y p e c a u s i n g t h e i n f e c t i o n a l s o m a k e s i t d i f f i c u l t t o d e p e n d o n n e u t r a l -i z i n g a n t i b o d y m e a s u r e m e n t s a l o n e f o r d i a g n o s t i c p u r p o s e s . T h e d i s c o v e r yb y S a b i n 1 ' t h a t t r a n s i t o r y T y p e I I n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s may a p p e a r i nt h e f a c e o f a T y p e I i n f e c t i o n h a s b e e n c o n f i r m e d . I n o n e i n s t a n c e t h er e v e r s e w a s f o u n d . T y p e I a n t i b o d i e s w e r e p r e s e n t o n l y i n t h e f i r s t o f t h r e es e r u m s a m p l e s i n a p a t i e n t who e x c r e t e d T y p e I I v i r u s a n d d e v e l o p e dT y p e I I a n t i b o d i e s i n h i g h t i t e r . D u r i n g c o n v a l e s c e n c e s o m e p a t i e n t s d e v e l -o p e d a n t i b o d i e s n o t o n l y t o t h e t y p e i s o l a t e d f r o m t h e s t o o l s , b u t t o o t h e rt y p e s a s w e l l . W h e t h e r t h e s e h e t e r o t y p i c a n t i b o d i e s p e r s i s t f o r y e a r s l i k e t h eh o m o t y p i c o n e s i s n o t k n o w n . F u r t h e r s t u d y i s n e e d e d b e f o r e t h e r 6 l e o ft h e s e p h e n o m e n a i n t h e i m m u n o l o g y o f t h e d i s e a s e may b e u n d e r s t o o d .

T h e r e c a n b e l i t t l e d o u b t a s t o t h e i d e n t i t y o f t h e i n f e c t i n g v i r u s i n t h o s ep e r s o n s f r o m w h o m v i r u s w a s i s o l a t e d , a n d i n w h o s e s e r a o n l y h o m o t y p i cC - F a n t i b o d y i n c r e a s e d i n t i t e r w h i l e h o m o t y p i c n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y w a sp r e s e n t i n h i g h o r i n c r e a s i n g l e v e l s . By t h e s e c r i t e r i a 2 2 o f t h e 4 0 p e r s o n so n w h o m c o m p l e t e d a t a w e r e o b t a i n e d h a d T y p e I a n d f o u r h a d T y p e I Ii n f e c t i o n s .When v i r u s i s o l a t i o n s w e r e n e g a t i v e o r n o t t r i e d , t h e s e r o l o g i c a l r e s u l t sa l o n e w e r e s o m e t i m e s i n d i c a t i v e o f t h e t y p e o f i n f e c t i o n . O f s e v e n i n d i -v i d u a l s i n t h i s c a t e g o r y , t w o f u l f i l l t h e a b o v e s e r o l o g i c a l c r i t e r i a f o r T y p e Ii n f e c t i o n a n d o n e f o r T y p e I I . O n e p o s s e s s e d n o a n t i b o d i e s a g a i n s t a n y t y p ea n d p r o b a b l y d i d n o t h a v e p o l i o m y e l i t i s .One p a t i e n t ( N o . 9 7 ) , f r o m w h o m T y p e I I v i r u s w a s i s o l a t e d , s h o w e di n c r e a s e s i n b o t h C - F a n d n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t b o t h T y p e s I a n dI I . T h i s may h a v e b e e n a h e t e r o t y p i c a n t i b o d y r e s p o n s e , b u t s i n c e b o t ht y p e s w e r e a c t i v e i n t h e c o m m u n i t y a t t h e t i m e o f t h e s t u d y , t h e r e i s a p o s s i -b i l i t y t h a t t h i s w a s t h e r e s u l t o f a d u a l i n f e c t i o n . A n o t h e r i n d i v i d u a l ( N o .7 ) , f r o m w h o m T y p e I v i r u s w a s i s o l a t e d , d e v e l o p e d C - F a n t i b o d i e s a g a i n s t

b o t h T y p e s I a n d I I b u t p o s s e s s e d o n l y t r a n s i t o r y n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e sa g a i n s t T y p e I I . T h i s i s t h e k i n d o f h e t e r o t y p i c r e s p o n s e w h i c h h a s b e e nf o u n d f r e q u e n t l y b y o t h e r s . 2 l "

T h e C - F r e s p o n s e s f o u n d i n t h i s s t u d y a p p e a r e d l a t e r i n t h e c o u r s e o f t h ed i s e a s e a n d w e r e m o r e f r e q u e n t l y m o n o t y p i c t h a n t h e r e s p o n s e s d e s c r i b e d

482

V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4


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b y o t h e r w o r k e r s . 2 " 5 P o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e s e d i f f e r e n c e s h a v e b e e nd i s c u s s e d i n a p r e v i o u s p a p e r . 'SUMMARY

P r i m a r y i s o l a t i o n s o f v i r u s f r o m h u m a n s t o o l s a n d t h r o a t s w a b s a n d f r o mc h i m p a n z e e s t o o l s w e r e m a d e i n s u s p e n d e d a n d i n o u t g r o w t h c e l l c u l t u r e sp r e p a r e d f r o m m o n k e y k i d n e y t i s s u e . I t w a s f o u n d t h a t t h e o u t g r o w t h c e l lc u l t u r e s w e r e m o r e s e n s i t i v e i n d e t e c t i n g s m a l l a m o u n t s o f v i r u s , a n d t h a tt h e c y t o t o x i c i t y o f s t o o l s w a s n o t f r e q u e n t l y a s e r i o u s p r o b l e m w i t h k i d n e yo u t g r o w t h c e l l s . A p e r i o d o f t h r e e t o f i v e d a y s w a s r e q u i r e d f o r t h e v i r u s t or e a c h m a x i m a l t i t e r i n t h e p r i m a r y c u l t u r e s a n d a f u r t h e r t h r e e t o f o u r d a y sw a s r e q u i r e d f o r t y p i n g t h e v i r u s b y n e u t r a l i z a t i o n t e s t s i n a s u b s e q u e n tp a s s a g e . T h e o v e r - a l l p e r i o d n e c e s s a r y f o r v i r u s i d e n t i f i c a t i o n c a n b es h o r t e n e d i f t h e p r i m a r y i s o l a t i o n s a r e m a d e i n t h e p r e s e n c e o f t y p e s p e c i f i ci m m u n e s e r u m f o r e a c h o f t h e t h r e e v i r u s t y p e s .

I n New H a v e n , C o n n e c t i c u t , w h e r e t h e i n c i d e n c e o f p o l i o m y e l i t i s w a sl o w i n 1 9 5 2 , a l l t h r e e t y p e s o f v i r u s w e r e i s o l a t e d . From s t o o l s p e c i m e n sT y p e I v i r u s w a s i s o l a t e d f r o m f i v e p a t i e n t s , T y p e I I f r o m e i g h t , a n d T y p eI I I f r o m f i v e . T h r o a t s w a b s y i e l d e d v i r u s l e s s o f t e n t h a n s t o o l s , b u t e v e nt h e s e v e n s t r a i n s i s o l a t e d f r o m t h r o a t s w a b s w e r e d i s t r i b u t e d a m o n g t h et h r e e t y p e s o f v i r u s . I n L o c k H a v e n , P e n n s y l v a n i a , w h e r e a s e v e r e o u t b r e a ko f p o l i o m y e l i t i s o c c u r r e d i n 1 9 5 2 , o n l y T y p e s I a n d I I w e r e i s o l a t e d . T y p e Iv i r u s w a s i s o l a t e d f r o m t h e s t o o l s o f 4 6 p a t i e n t s a n d T y p e I I f r o m 1 5 .

T h e r e s u l t s o f n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y t e s t s a g a i n s t t h e t h r e e t y p e s o fp o l i o m y e l i t i s v i r u s c o n f i r m t h e r e c e n t o b s e r v a t i o n s m a d e i n s e v e r a l l a b o r a -t o r i e s t h a t s u c h a n t i b o d i e s d e v e l o p r a p i d l y a n d a r e u s u a l l y p r e s e n t a t t h et i m e t h e p a t i e n t i s b r o u g h t i n t o t h e h o s p i t a l . I n t h e p r e s e n t s t u d y , o f 4 1p a t i e n t s f r o m w h o m p o l i o m y e l i t i s v i r u s was i s o l a t e d , o n l y 1 5 s h o w e d h i g h e rc o n c e n t r a t i o n s o f h o m o t y p i c a n t i b o d y i n t h e c o n v a l e s c e n t s e r u m s p e c i m e n st h a n i n a c u t e p h a s e s p e c i m e n s , w h e r e a s i n 2 5 p a t i e n t s t h e h o m o t y p i c a n t i -b o d y w a s p r e s e n t i n h i g h t i t e r t h r o u g h o u t t h e p e r i o d o f o b s e r v a t i o n . S a b i n ' sf i n d i n g s o n t h e a p p e a r a n c e o f t r a n s i t o r y h e t e r o t y p i c n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e sd u r i n g t h e a c u t e p h a s e o f t h e d i s e a s e h a v e b e e n c o n f i r m e d . O t h e r p a t i e n t sd e v e l o p e d h e t e r o t y p i c n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s i n t h e c o n v a l e s c e n t p h a s e .

D e t e r m i n a t i o n s o f c o m p l e m e n t - f i x i n g a n t i b o d i e s i n t h e s a m e s e r a m a d ew i t h m i n i m a l a m o u n t s o f a n t i g e n r e v e a l e d a n t i b o d y r e s p o n s e s h o m o t y p i cw i t h t h e v i r u s i s o l a t e d f r o m t h e s t o o l s i n a h i g h p e r c e n t a g e o f p a t i e n t s( 9 0 % ) a n d h e t e r o t y p i c i n c o m p a r a t i v e l y f e w ( 1 0 % ) . T h e s e a n t i b o d i e s d i dn o t g e n e r a l l y b e c o m e d e t e c t a b l e u n t i l more t h a n o n e w e e k a f t e r t h e o n s e t o ft h e d i s e a s e a n d o f t e n i n c r e a s e d a f t e r t h e f o u r t h w e e k .

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Y A L E JOURNAL OF BIOLOGY AND MEDICINE V o l u m e 2 6 , J u n e 1 9 5 4

No c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n t h e t y p e o f i n f e c t i n g v i r u s , t h e s e v e r i t yo f t h e d i s e a s e , a n d t h e i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s e . E a c h o f t h e t h r e e b u l b a rc a s e s f r o m New H a v e n y i e l d e d a d i f f e r e n t t y p e o f v i r u s . O f t h e 4 6 L o c kH a v e n p a t i e n t s f r o m w h o m T y p e I v i r u s w a s i s o l a t e d , 5 7 % w e r e p a r a l y t i c ;o f t h e 1 5 f r o m w h o m T y p e I I w a s i s o l a t e d , 73% w e r e p a r a l y t i c . T h e s e r o -l o g i c a l r e s p o n s e s w e r e s i m i l a r i n t h e p a r a l y t i c a n d n o n p a r a l y t i c c a s e s a n di n t h e T y p e I a n d T y p e I I i n f e c t i o n s .REFERENCES

1 B l a c k , F . L . a n d M e l n i c k , J . L . : S p e c i f i c i t y o f t h e p o l i o m y e l i t i s c o m p l e m e n tf i x a t i o n t e s t . Y a l e J . B i o l . , 1 9 5 4 , 2 6 , 3 8 5 - 3 9 3 .2 C a s a l s , J . , O l i t s k y , P . K . , a n d S a b i n , A . B . : D e v e l o p m e n t , p e r s i s t e n c e a n d s i g -n i f i c a n c e o f T y p e 2 p o l i o m y e l i t i s c o m p l e m e n t f i x i n g a n t i b o d y i n m a n . J . E x p .M . , 1 9 5 2 , 9 6 , 3 5 - 5 3 .3 D u n c a n , D . , F r a n k l i n , A . E . , W o o d , W . , a n d R h o d e s , A . J . : C u l t i v a t i o n o f p o l i o -m y e l i t i s v i r u s i n t i s s u e c u l t u r e . V . O b s e r v a t i o n s o n v i r u s p r o p a g a t i o n i nc e r t a i n a n i m a l t i s s u e s w i t h a s y n t h e t i c n u t r i e n t m e d i u m . C a n a d . J . M . S c . ,1 9 5 3 , 3 1 , 7 5 - 8 3 .

4 K i b r i c k , S . a n d E n d e r s , J . F . , c i t e d b y W e l l e r , T . H . : T h e a p p l i c a t i o n o f t i s s u e -c u l t u r e m e t h o d s t o t h e s t u d y o f p o l i o m y e l i t i s . N . E n g l a n d J . M . , 1 9 5 3 , 2 4 9 ,1 8 6 - 1 9 5 .5 L e d i n k o , N . a n d M e l n i c k , J . L . : P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e . V . R e a c -t i o n o f v i r u s a n d a n t i b o d y ; v a r i a b l e s o f t h e q u a n t i t a t i v e n e u t r a l i z a t i o n t e s t .Am. J . H y g . , 1 9 5 3 , 5 8 , 2 2 3 - 2 4 7 .6 L e d i n k o , N . , R i o r d a n , J . T . , a n d M e l n i c k , J . L . : M u l t i p l i c a t i o n o f p o l i o m y e l i t i sv i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e s o f m o n k e y t e s t e s . I . G r o w t h c u r v e s o f T y p e I ( B r u n -h i l d e ) a n d T y p e 2 ( L a n s i n g ) s t r a i n s a n d d e s c r i p t i o n o f q u a n t i t a t i v e n e u t r a l -i z a t i o n t e s t . Am. J . H y g . , 1 9 5 2 , 5 5 , 3 2 3 - 3 3 8 .7 M e l n i c k , J . L . a n d L e d i n k o , N . : D e v e l o p m e n t o f n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s a g a i n s tt h e t h r e e t y p e s o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s d u r i n g a n e p i d e m i c p e r i o d . T h e r a t i o o fi n a p p a r e n t i n f e c t i o n t o c l i n i c a l p o l i o m y e l i t i s . Am . J . H y g . , 1 9 5 3 , 5 8 , 2 0 7 - 2 2 2 .8 M e l n i c k , J . L . a n d R i o r d a n , J . T . : P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e . I V . P r o -t e i n f r e e n u t r i e n t m e d i a i n s t a t i o n a r y a n d r o l l e r t u b e c u l t u r e s . P r o c . S o c . E x p .B i o l . , N . Y . , 1 9 5 2 , 8 1 , 2 0 8 - 2 1 3 .9 M o r a n n , G . a n d M e l n i c k , J . L . : P o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e . V I . U s e o fk i d n e y e p i t h e l i u m g r o w n o n g l a s s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . , N . Y . , 1 9 5 3 , 8 4 ,5 5 8 - 5 6 3 .

1 0 M o r g a n , J . F . , M o r t o n , H . J . , a n d P a r k e r , R . C . : N u t r i t i o n o f a n i m a l c e l l s i nt i s s u e c u l t u r e . I . I n i t i a l s t u d i e s o n s y n t h e t i c m e d i u m . P r o c . S o c . E x p . B i o l . ,N . Y . , 1 9 5 0 , 7 3 , 1 - 8 .1 1 R i o r d a n , J . T . , L e d i n k o , N . , a n d M e l n i c k , J . L . : M u l t i p l i c a t i o n o f p o l i o m y e l i t i sv i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e s o f m o n k e y t e s t e s . I I . D i r e c t i s o l a t i o n a n d t y p i n g o fs t r a i n s f r o m h u m a n s t o o l s a n d s p i n a l c o r d s i n r o l l e r t u b e s . Am. J . H y g . , 1 9 5 2 ,5 5 , 3 3 9 - 3 4 6 .1 2 R o b b i n s , F . C . , E n d e r s , J . F . , W e l l e r , T . H . , a n d F l o r e n t i n o , G . L . : S t u d i e s o nc u l t i v a t i o n o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n t i s s u e c u l t u r e . V . D i r e c t i s o l a t i o n a n ds e r o l o g i c i d e n t i f i c a t i o n o f v i r u s s t r a i n s i n t i s s u e c u l t u r e f r o m p a t i e n t s w i t hn o n p a r a l y t i c a n d p a r a l y t i c p o l i o m y e l i t i s . Am . J . H y g . , 1 9 5 1 , 5 4 , 2 8 6 - 2 9 3 .1 3 S a b i n , A . B . : T r a n s i t o r y a p p e a r a n c e o f T y p e 2 n e u t r a l i z i n g a n t i b o d y i n p a t i e n t si n f e c t e d w i t h T y p e 1 p o l i o m y e l i t i s v i r u s . J . E x p . M . , 1 9 5 2 , 9 6 , 9 9 - 1 0 6 .1 4 S a l k , J . E . : S t u d i e s i n h u m a n s u b j e c t s o n a c t i v e i m m u n i z a t i o n a g a i n s t p o l i o -m y e l i t i s . I . P r e l i m i n a r y r e p o r t o f e x p e r i m e n t s i n p r o g r e s s . J . Am. M . A s s . ,1 9 5 3 , 1 5 1 , 1 0 8 1 - 1 0 9 8 .

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21/21


1 5 S v e d m y r , A . , E n d e r s , J . F . , a n d H o l l o w a y , A . : C o m p l e m e n t f i x a t i o n w i t h t h r e et y p e s o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s e s p r o p a g a t e d i n t i s s u e c u l t u r e . Am . J . H y g . , 1 9 5 3 ,5 7 , 6 0 - 7 0 .1 6 S y v e r t o n , J . T . , S c h e r e r , W. F . , a n d E l w o o d , P . M . : S t u d i e s o n t h e p r o p a g a t i o no f p o l i o m y e l i t i s v i r u s e s . V . T h e a p p l i c a t i o n o f s t r a i n HeLa h u m a n e p i t h e l i a lc e l l s f o r i s o l a t i o n a n d t y p i n g . J . L a b . C l i n M . , 1 9 5 4 , 4 3 , 2 8 6 - 3 0 2 .1 7 W e l l e r , T . H . , E n d e r s , J . F . , R o b b i n s , F . C . , a n d S t o d d a r d , M . B . : S t u d i e s o n t h ec u l t i v a t i o n o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s i n t i s s u e c u l t u r e . I . T h e p r o p a g a t i o n o fp o l i o m y e l i t i s v i r u s e s i n s u s p e n d e d c e l l c u l t u r e s o f v a r i o u s human t i s s u e s .J . I m m u n o l . , 1 9 5 2 , 6 9 , 6 4 5 - 6 7 1 .

1 8 Y o u n g n e r , J . S . , L e w i s , L . J . , W a r d , E . N . , a n d S a l k , J . E . : S t u d i e s o n p o l i o -m y e l i t i s v i r u s e s i n c u l t u r e s o f m o n k e y t e s t i c u l a r t i s s u e . I I I . I s o l a t i o n a n di m m u n o l o g i c i d e n t i f i c a t i o n o f p o l i o m y e l i t i s v i r u s e s f r o m f e c a l s p e c i m e n s b ym e a n s o f r o l l e r t u b e c u l t u r e s . Am . J . H y g . , 1 9 5 2 , 5 5 , 3 4 7 - 3 5 6 .

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