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18-1114-21 Edition AB Ion Exchange Chromatography Principles and Methods Ion Exchange Chromatography – Principles and Methods

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18-1114-21

Edition AB

Ion ExchangeChromatographyPrinciples and Methods

Ion Exchange Chromatography – Principles and M

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Ion ExchangeChromatography

Principles and Methods

ISBN 91 970490-3-4

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1. Introduction ............................................................................................9

2. Ion exchange chromatography .........................................................10The theory of ion exchange.................................................................10

The matrix.....................................................................................11Charged groups .............................................................................13Resolution in ion exchange chromatography .................................13

Capacity factor ........................................................................15Efficiency.................................................................................16Selectivity.................................................................................17

Capacity ........................................................................................18

3. Product Guide .......................................................................................20MonoBeads ...................................................................................20MiniBeads .....................................................................................20SOURCE .......................................................................................20Sepharose High Performance ion exchangers .................................21Sepharose Fast Flow ion exchangers ..............................................21Sepharose Big Beads ion exchangers...............................................21STREAMLINE ion exchangers ......................................................21DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B .......................22DEAE Sephacel..............................................................................22Sephadex ion exchangers ...............................................................22Bulk quantities...............................................................................22Equipment.....................................................................................22

4. MonoBeads and MiniBeads ..............................................................23MonoBeads.....................................................................................23

Properties ......................................................................................24Chemical stability ....................................................................24Physical stability ......................................................................25Flow rate..................................................................................27Capacity ..................................................................................27Recovery..................................................................................28Reproducibility ........................................................................29

Availability ....................................................................................30MiniBeads .......................................................................................30

Properties ......................................................................................31Chemical stability ....................................................................31Physical stability ......................................................................32Reproducibility ........................................................................33

Availability ....................................................................................33

Contents

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5. SOURCE ................................................................................................34Properties ......................................................................................37

Chemical stability ....................................................................37Flow rate..................................................................................38Capacity ..................................................................................40Recovery..................................................................................40Reproducibility ........................................................................41

Availability ....................................................................................41

6. Sepharose based ion exchangers .......................................................42Chemical stability ..........................................................................42Physical stability ............................................................................43

Sepharose High Performance ion exchangers.........................43Properties ......................................................................................44

Physical stability ......................................................................44Capacity ..................................................................................44Flow rate..................................................................................46

Availability ....................................................................................46Sepharose Fast Flow ion exchangers ........................................46

Properties ......................................................................................47Physical stability ......................................................................47Capacity ..................................................................................47Flow rate..................................................................................49

Availability ....................................................................................50Sepharose Big Beads ion exchangers.........................................50

Properties ......................................................................................51Physical properties ...................................................................51Capacity ..................................................................................51Flow rate..................................................................................51

Availability ....................................................................................51STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE ......................52

Properties ......................................................................................53Physical stability ......................................................................53Capacity ..................................................................................53

Availability ....................................................................................54DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B.............54

Properties ......................................................................................54Physical stability ......................................................................54Capacity ..................................................................................55Flow rate..................................................................................56

Availability ....................................................................................57

7. DEAE Sephacel .....................................................................................58Properties ......................................................................................58

Chemical stability ....................................................................58Physical stability ......................................................................59

3

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Capacity ..................................................................................59Flow rate..................................................................................60

Availability ....................................................................................60

8. Sephadex ion exchangers ...................................................................61Properties ......................................................................................61

Chemical stability ....................................................................61Physical stability ............................................................................62

Swelling ...................................................................................62Ionic strength dependence ........................................................62pH dependence ........................................................................62Capacity ..................................................................................62

Availability ....................................................................................64

9. Experimental design ............................................................................65Choice of ion exchanger ..............................................................65

Specific requirements of the application .........................................65Column separation, batch separation or...................................65 expanded bed adsorptionThe scale of the separation .......................................................65The required resolution ............................................................65The required throughput ..........................................................66Scaleability...............................................................................66Reproducibility ........................................................................67Economy .................................................................................67

The molecular size of the sample components ................................67Choice of exchanger group ............................................................68

Determination of starting conditions .......................................69The isoelectric point .................................................................69Test-tube method for selecting starting pH ...............................69Electrophoretic titration curves (ETC) .....................................70Chromatographic titration curves (retention maps) ..................74

Choice between strong and weak ion exchangers ...........................76Choice of buffer.............................................................................76

Choice of buffer pH and ionic strength.....................................76Choice of buffer substance .......................................................77Test-tube method for selecting starting ionic strengths..............79

10. Experimental Technique.....................................................................80Column chromatography............................................................80

Choice of column...........................................................................80Column design .........................................................................80Column dimensions .................................................................81

Quantity of ion exchanger .............................................................81Preparation of the ion exchanger ...................................................81

Pre-swollen ion exchangers ......................................................81

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Pre-packed ion exchange media ...............................................81Sephadex ion exchangers .........................................................82Alternative counter-ions ...........................................................82Decantation of fines .................................................................82

Packing the column........................................................................82Column Packing Video Film.....................................................82Checking the packing ...............................................................83Equilibrating the bed ...............................................................84

Sample preparation........................................................................85Sample concentration...............................................................85Sample composition .................................................................85Sample volume.........................................................................85Sample viscosity .......................................................................85Sample preparation ..................................................................86

Sample application ........................................................................87Sample application with an adaptor .........................................87Other methods of sample application.......................................89Sample application onto a drained bed .....................................89Sample application under the eluent .........................................89

Elution ..........................................................................................90Change of pH ..........................................................................90Change of ionic strength ..........................................................91Gradient direction....................................................................91Choice of gradient type ............................................................91Resolution using a continuous gradient ....................................93Choice of gradient shape ..........................................................94Sample displacement ................................................................95

Gradient generation.......................................................................96Gradient formation with two pumps or a single pump .............96in combination with a switch valveGradient Mixer ........................................................................96

Batch separation............................................................................97Expanded bed adsorption ...........................................................98

Expanded bed technology ..............................................................99Basic principle of operation............................................................99STREAMLINE adsorbents ..........................................................100STREAMLINE columns ..............................................................100Auxiliary equipment ....................................................................100

Regeneration ................................................................................101Cleaning, sanitization and sterilization procedures ............101

Cleaning ......................................................................................101Sanitization .................................................................................101Sterilization .................................................................................101Protocols for cleaning-in-place (CIP),...........................................102sanitization and sterilization

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SOURCE and Sepharose Based ion exchangers......................102MonoBeads and MiniBeads columns......................................102DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers..............103

Storage of gels and columns......................................................103Prevention of microbial growth..............................................103Storage of unused media ........................................................104Storage of used media ............................................................104Storage of packed columns.....................................................104

Determination of the available and dynamic capacities.....104Calculation ............................................................................106

11. Process considerations .....................................................................107Defining the purpose ..................................................................108The strategic focus ......................................................................109

Capture .......................................................................................109Intermediate purification .............................................................111Polishing......................................................................................111

Selection of chromatography media .......................................112Base matrix properies and derivitization chemistry.................113Bead size ................................................................................113Documentation and technical support....................................113Regulatory support ................................................................113Vendor certification ...............................................................114Delivery capacity ...................................................................114

Method design and optimization ............................................114Binding conditions.......................................................................114Elution ........................................................................................115Sample load .................................................................................116Flow rate .....................................................................................117

Selecting a column ......................................................................118Aspects of column design .............................................................119

Flow distribution system ........................................................119Material resistance and durability ..........................................119Sanitary design.......................................................................119Pressure vessel safety..............................................................120Regulatory support ................................................................120Ergonomics............................................................................120

Packing large scale columns......................................................120Column configuration .................................................................120Packing the column......................................................................121

Scale-up .........................................................................................121

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12. Applications ........................................................................................124The design of a biochemical separation ........................................124Application examples ..................................................................127

Enzymes ................................................................................127Isoenzymes ............................................................................128Immunoglobulins...................................................................129Nucleic acid separation ..........................................................129Polypeptides and polynucleotides...........................................130Antisense phosphorothioate oligonucleotides .........................132

Areas of application.....................................................................133Purification of a recombinant Pseudomonas ...............................136aeruginosa exotoxin A, PE553D

Strategy..................................................................................141

13. Fault-finding chart .............................................................................143

14. Ordering information .......................................................................151

15. References ............................................................................................155

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BioProcess Media are designed, manufactured and supported forindustrial bioprocessing.

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Polishing, from synthetic oligonucleotides to recombinant proteins.• High and reliable productivity in the production hall.

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1. IntroductionAdsorption chromatography depends upon interactions of different types betweensolute molecules and ligands immobilized on a chromatography matrix. The firsttype of interaction to be successfully employed for the separation of macromolecu-les was that between charged solute molecules and oppositely charged moietiescovalently linked to a chromatography matrix. The technique of ion exchangechromatography is based on this interaction.

Ion exchange is probably the most frequently used chromatographic technique forthe separation and purification of proteins, polypeptides, nucleic acids, polynucle-otides, and other charged biomolecules (1). The reasons for the success of ionexchange are its widespread applicability, its high resolving power, its high capaci-ty, and the simplicity and controllability of the method.

This handbook is designed as an introduction to the principles of ion exchangechromatography and as a practical guide to the use of the media available fromPharmacia Biotech. The handbook is illustrated with examples of different typesof biological molecules which have been separated using ion exchange chromato-graphy and different ways the technique can be used. For information on specificseparations, the reader is recommended to consult the original literature.

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2. Ion exchange chromatographyThe theory of ion exchange

Separation in ion exchange chromatography depends upon the reversible adsorp-tion of charged solute molecules to immobilized ion exchange groups of oppositecharge. Most ion exchange experiments are performed in five main stages. Thesesteps are illustrated schematically below.

Fig. 1. The principle of ion exchange chromatography (salt gradient elution).

The first stage is equilibration in which the ion exchanger is brought to a startingstate, in terms of pH and ionic strength, which allows the binding of the desiredsolute molecules. The exchanger groups are associated at this time with exchange-able counter-ions (usually simple anions or cations, such as chloride or sodium).

The second stage is sample application and adsorption, in which solute moleculescarrying the appropriate charge displace counter-ions and bind reversibly to thegel. Unbound substances can be washed out from the exchanger bed using startingbuffer.

In the third stage, substances are removed from the column by changing to elutionconditions unfavourable for ionic bonding of the solute molecules. This normallyinvolves increasing the ionic strength of the eluting buffer or changing its pH. InFigure 1 desorption is achieved by the introduction of an increasing salt concentra-tion gradient and solute molecules are released from the column in the order oftheir strengths of binding, the most weakly bound substances being eluted first.

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The fourth and fifth stages are the removal from the column of substances not elu-ted under the previous experimental conditions and re-equilibration at the startingconditions for the next purification.

Separation is obtained since different substances have different degrees of interac-tion with the ion exchanger due to differences in their charges, charge densitiesand distribution of charge on their surfaces. These interactions can be controlledby varying conditions such as ionic strength and pH. The differences in chargeproperties of biological compounds are often considerable, and since ion exchangechromatography is capable of separating species with very minor differences inproperties, e.g. two proteins differing by only one charged amino acid, it is a verypowerful separation technique.

In ion exchange chromatography one can choose whether to bind the substancesof interest and allow the contaminants to pass through the column, or to bind thecontaminants and allow the substance of interest to pass through. Generally, thefirst method is more useful since it allows a greater degree of fractionation andconcentrates the substances of interest.

The conditions under which substances are bound (or free) are discussed in detailin the sections dealing with choice of experimental conditions, Chapter 9. In addi-tion to the ion exchange effect, other types of binding may occur. These effects aresmall and are mainly due to van der Waals forces and non-polar interactions.

Ion exchange separations may be carried out in a column, by a batch procedure orby expanded bed adsorption. All three methodologies are performed in the stagesof equilibration, sample adsorption etc. described previously.

The matrixAn ion exchanger consists of an insoluble matrix to which charged groups havebeen covalently bound. The charged groups are associated with mobile counter-ions. These counter-ions can be reversibly exchanged with other ions of the samecharge without altering the matrix.

It is possible to have both positively and negatively charged exchangers (Fig. 2).Positively charged exchangers have negatively charged counter-ions (anions) avai-lable for exchange and are called anion exchangers. Negatively charged exchang-ers have positively charged counter-ions (cations) and are termed cation exchang-ers.

The matrix may be based on inorganic compounds, synthetic resins or polysaccha-rides. The characteristics of the matrix determine its chromatographic propertiessuch as efficiency, capacity and recovery as well as its chemical stability, mechanical

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Fig. 2. Ion exchanger types.

strength and flow properties. The nature of the matrix will also affect its beha-viour towards biological substances and the maintenance of biological activity.

The first ion exchangers were synthetic resins designed for applications such asdemineralisation, water treatment, and recovery of ions from wastes. Such ionexchangers consist of hydrophobic polymer matrices highly substituted with ionicgroups, and have very high capacities for small ions. Due to their low permeabilitythese matrices have low capacities for proteins and other macromolecules. In addi-tion, the extremely high charge density gives very strong binding and the hydro-phobic matrix tends to denature labile biological materials. Thus despite theirexcellent flow properties and capacities for small ions, these types of ion exchang-er are unsuitable for use with biological samples.

The first ion exchangers designed for use with biological substances were the cellu-lose ion exchangers developed by Peterson and Sober (2). Because of the hydrophi-lic nature of cellulose, these exchangers had little tendency to denature proteins.Unfortunately, many cellulose ion exchangers had low capacities (otherwise thecellulose became soluble in water) and had poor flow properties due to their irre-gular shape.

Ion exchangers based on dextran (Sephadex), followed by those based on agarose(Sepharose CL-6B) and cross-linked cellulose (DEAE Sephacel) were the first ionexchange matrices to combine a spherical form with high porosity, leading toimproved flow properties and high capacities for macromolecules. Subsequently,developments in gel technology have enabled this macroporosity to be extended tothe highly cross-linked agarose based media such as Sepharose High Performance,Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads, and the synthetic polymer matrices,MonoBeads, and SOURCE. These modern media enable fast, high capacity, highresolution ion exchange chromatography to be carried out at both analytical andpreparative scales. Non-porous polymer matrices, e.g. MiniBeads, are availablefor extremely high resolution micropreparative or analytical separations.

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Charged groupsThe presence of charged groups is a fundamental property of an ion exchanger.The type of group determines the type and strength of the ion exchanger; theirtotal number and availability determines the capacity. There is a variety of groupswhich have been chosen for use in ion exchangers (3); some of these are shown inTable 1.

Table 1. Functional groups used on ion exchangers.

Anion exchangers Functional group

Diethylaminoethyl (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2

Quaternary aminoethyl (QAE) -O-CH2-CH2-N+(C2H5)2-CH2-CHOH-CH3

Quaternary ammonium (Q) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3

Cation exchangers Functional group

Carboxymethyl (CM) -O-CH2-COO-

Sulphopropyl (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-

Methyl sulphonate (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

Sulphonic and quaternary amino groups are used to form strong ion exchangers;the other groups form weak ion exchangers. The terms strong and weak refer tothe extent of variation of ionization with pH and not the strength of binding.Strong ion exchangers are completely ionized over a wide pH range (see titrationcurves on page 49) whereas with weak ion exchangers, the degree of dissociationand thus exchange capacity varies much more markedly with pH.

Some properties of strong ion exchangers are:• Sample loading capacity does not decrease at high or low pH values due to loss

of charge from the ion exchanger.• A very simple mechanism of interaction exists between the ion exchanger and

the solute. • Ion exchange experiments are more controllable since the charge characteristics

of the media do not change with changes in pH. This makes strong exchangers ideal for working with data derived from electrophoretic titration curves. (see Chapter 9)

Resolution in ion exchange chromatographyThis section discusses the main theoretical parameters which affect the separationin ion exchange chromatography. For more in-depth information the reader isreferred to standard works on the subject (4, 5).The result of an ion exchange experiment, as with any other chromatographicseparation, is often expressed as the resolution between the peaks of interest.

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The resolution (Rs) is determined from the chromatogram as shown in Figure 3.

Fig. 3. Determination of the resolution (Rs) between two peaks.

The resolution is defined as the distance between peak maxima compared with theaverage base width of the two peaks. Elution volumes and peak widths should bemeasured with the same units to give a dimensionless value to the resolution.

Rs is a measure of the relative separation between two peaks and can be used todetermine if further optimization of the chromatographic procedure is necessary.If Rs = 1.0 (Fig. 4) then 98% purity has been achieved at 98% of peak recovery,provided the peaks are Gaussian and approximately equal in size. Baseline resolu-tion requires that Rs ³1.5. At this value purity of the peak is 100%.

Note: A completely resolved peak is not equivalent to a pure substance. This peakmay represent a series of components which are not resolvable using the selectedseparation parameter.

The resolution achievable in a system is proportional to the product of the selecti-vity, the efficiency and the capacity of the system, the three most important para-meters to control in column chromatography. The analytical expression for Rs is:

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Fig. 4. Separation results with different resolutions.

Capacity factorThe capacity or retention factor k is a measure of the retention of a componentand should not be confused with loading capacity (mg sample/ml) or ionic capaci-ty (mmol/ml).

The capacity factor is calculated for each individual peak. For example k for peak1 in Figure 5 is derived from the equation:

In the equation for Rs, k is the average of k1 and k2.

Adsorption techniques such as ion exchange chromatography can have highcapacity factors since experimental conditions can be chosen which lead to peakretention volumes greatly in excess of Vt (Vt is also often denoted Vm). This can

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Vt

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be seen in contrast with the technique of gel filtration where capacity is limitedsince all peaks must elute within the volume (Vt - V0).

Fig. 5. Hypothetical chromatogram. V0 = void volume, VR1 = elution volume for peak 1,VR2 = elution volume for peak 2, Vt = total volume, wb1 = peak width for peak 1, wb2 =peak width for peak 2.

EfficiencyThe column efficiency is related to the zone broadening which occurs on thecolumn and can be calculated from the expression:

VR1 where wh is the peak width

wh at half peak height

and is expressed as the number of theoretical plates (N) for the column under spe-cified experimental conditions. Efficiency is frequently stated as the number oftheoretical plates per metre chromatographic bed, or expressed as H (height equi-valent to a theoretical plate, HETP), which is the bed length (L) divided by theplate number.

H = L/N

Since the observed value for N depends on experimental factors such as flow rateand sample loading, it is important that comparisons are done under identical con-ditions. In the case of ion exchange chromatography, efficiency is measured underisocratic conditions, using a substance which does not interact with the matrix,e.g. acetone.

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One of the main causes of zone broadening in a chromatography bed is longitudi-nal diffusion of the solute molecules. The effect is minimized if the distances avai-lable for diffusion, in both the mobile phase and stationary phase, are minimized.In practice this is achieved by using small uniform bead sizes and important deve-lopments in ion exchange chromatography have been the introduction of 10 µmand 15 µm diameter particles such as MonoBeads and SOURCE, to give high effi-ciency preparative media. The highest efficiency is achieved with the non-porous,3 µm diameter MiniBeads, designed for analytical and micropreparative applications.

After bead size, the second major contributory factor to efficiency is good experi-mental technique. Badly, unevenly packed chromatography beds and air bubbleswill lead to channelling, zone broadening and loss of resolution. Good separationsrequire well packed columns and the importance of column packing increases indirect proportion to the performance required.

SelectivityThe selectivity (a) defines the ability of the system to separate peaks i.e. the distan-ce between two peaks. The selectivity factor can be calculated from the chromato-gram (Fig. 5) using the expression

k2 VR2 - V0 VR2a = = Å

k1 VR1 - V0 VR1

Good selectivity is a more important factor than high efficiency in determiningresolution (Fig. 6) since Rs is linearly related to selectivity but quadratically relatedto efficiency. This means that a four fold increase in efficiency is required to dou-ble the resolution under isocratic conditions.

Fig. 6. The effect of selectivity and efficiency on resolution.

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Selectivity in ion exchange chromatography depends not only on the nature andnumber of the ionic groups on the matrix but also on the experimental conditions,such as pH and ionic strength. It is the ease and predictability with which theseexperimental conditions, and thus the selectivity, can be manipulated which givesion exchange chromatography the potential of extremely high resolution.

CapacityThe capacity of an ion exchanger is a quantitative measure of its ability to take upexchangeable counter-ions and is therefore of major importance. The capacitymay be expressed as total ionic capacity, available capacity or dynamic capacity.

The total ionic capacity is the number of charged substituent groups per gram dryion exchanger or per ml swollen gel. Total capacity can be measured by titrationwith a strong acid or base.

The actual amount of protein which can be bound to an ion exchanger, under defi-ned experimental conditions, is referred to as the available capacity for the gel. Ifthe defined conditions include the flow rate at which the gel was operated, theamount bound is referred to as the dynamic capacity for the ion exchanger. Availa-ble and dynamic capacities depend upon:

The properties of the protein.The properties of the ion exchanger.The chosen experimental conditions.

The properties of the protein which determine the available or dynamic capacityon a particular ion exchange matrix are its molecular size and its charge/pH rela-tionship. The capacity of an ion exchanger is thus different for different proteins.

On a porous matrix used for ion exchange chromatography, molecules which aresmall enough to enter the pores will exhibit a higher available capacity than thosemolecules which are restricted to the charged substituents on the surface of the gel.

Similarly, since the interaction is ionic, the protein’s charge/pH relationship mustbe such that the protein carries the correct net charge, at a sufficiently high surfacecharge density, to be bound to a particular ion exchanger under the chosen bufferconditions.

The properties of the ion exchange matrix which determine its available capacityfor a particular protein are the exclusion limit of the matrix, and the type andnumber of the charged substituents. High available capacity is obtained by havinga matrix which is macroporous and highly substituted with ionic groups whichmaintain their charge over a wide range of experimental conditions. Non-porous

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matrices have considerably lower capacity than porous matrices, but higher effici-ency due to shorter diffusion distances.

The experimental conditions which affect the observed capacity are pH, the ionicstrength of the buffer, the nature of the counter-ion, the flow rate and the tempera-ture. The flow rate is of particular importance with respect to dynamic capacity,which decreases as the flow rate is increased. These conditions should always betaken into consideration when comparing available capacities for different ionexchangers.

Methodologies for determining the available and dynamic capacities for an ionexchanger are given in Chapter 10.

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3. Product GuidePharmacia Biotech manufactures a wide range of ion exchange media suitable foranalytical, micropreparative, small scale preparative, and process scale applica-tions. The product range is summarized below.

MonoBeads (page 23)Mono Q and Mono S are strong ion exchangers based on MonoBeads, monodis-perse 10 µm hydrophilic polymer particles. Mono Q and Mono S are the establis-hed standards for high performance ion exchange separations and are best suitedfor analytical and small scale preparative applications.

MiniBeads (page 30)MiniBeads, a non-porous matrix of monodisperse 3 µm hydrophilic polymer par-ticles, is the base for two strong ion exchangers, Mini Q and Mini S. Both mediaare available pre-packed in Precision Columns 3.2/3, for micropreparative chro-matography in SMART System. With a specially designed column holder, thesecolumns can also be used in FPLC and HPLC systems.

SOURCE (page 34)SOURCE 15Q, SOURCE 15S, SOURCE 30Q and SOURCE 30S are strong ionexchangers based on the same type of rigid polymer matrix as MonoBeads, poly-styrene/divinyl benzene beads. SOURCE 15Q and SOURCE 15S are based on 15 µm monodisperse particles while SOURCE 30Q and SOURCE 30S are basedon 30 µm mondisperse particles. SOURCE ion exchange media are designed forhigh performance applications at both research and industrial scales. They providehigh capacity at high flow rates and at a minimum of back-pressure, thus allowingshort cycle times, high productivity and scaleability.

SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very high resolution (effici-ency) is required. SOURCE 30 matrices gives, in comparison with SOURCE 15matrices, slightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressu-re. This makes SOURCE 30 ideal for purification with more complex samples andlarger volumes. Using SOURCE 30, a higher degree of purification can be obtai-ned with high productivity. Typically working flow rate ranges for ion exchangersbased on SOURCE 15 and SOURCE 30 are 30-600 cm/h and 300-1000 cm/hrespectively.

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Sepharose High Performance ion exchangers (page 43)

Q and SP Sepharose High Performance are strong ion exchangers based on a 34µm highly cross-linked agarose matrix, providing high physical and chemical sta-bility. These media are ideal for intermediate and final purification. They shouldbe used when resolution is the main objective. As resolution and efficiency aremaintained with increasing column diameter and sample load, separations usingthese media are easy to scale up. Typical working flow rates are 50-150 cm/h.

Sepharose Fast Flow ion exchangers (page 46)Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 µm highly cross-linked 6%agarose beads of high chemical and physical stability. The range consists of theweak exchangers DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow as wellas the strong exchangers Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow. Theexceptional flow characteristics make these ion exchangers the first choice forseparating crude mixtures early in a purification scheme. Here, fast removal and acombination of good resolution and high flow rate are essential. Typical workingflow rates for these media are 100-300 cm/h. Sepharose Fast Flow ion exchangersare ideal for purifications with high demands on productivity.

Sepharose Big Beads ion exchangers (page 50)Q and SP Sepharose Big Beads are strong ion exchangers designed for industrialapplications. They are based on 100-300 µm highly cross-linked 6% agarosebeads. The large particle size combined with high physical stability of the basematrix ensures rapid processing, even for viscous samples. Sepharose Big Beads istherefore the choice at the beginning of a purification scheme, where viscosity andback-pressure may limit the throughput attainable with ion exchangers based onsmaller bead sizes, such as Sepharose Fast Flow ion exchangers. The mediumshould be chosen when large volumes are handled and fast adsorption is requiredand when resolution is of less importance.

STREAMLINE ion exchangers (page 52)STREAMLINE adsorbents, available as STREAMLINE DEAE and STREAMLINE SP, are specially designed for use in STREAMLINE columns forexpanded bed adsorption. Together they enable the high flow rates needed forhigh productivity in industrial applications of fluidized beds. STREAMLINEadsorbents, based on cross-linked 6% agarose beads with a mean particle size of200 µm, are designed to handle samples directly from both fermentation homoge-nates and crude samples from cell culture/fermentation at working flow rates oftypically 200-400 cm/h.

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DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B(page 54)

DEAE and CM Sepharose CL-6B ion exchangers are based on 90 µm cross-linked6% agarose beads. These two gels are the traditional agarose based ion exchang-ers from Pharmacia Biotech. Their performance has been demonstrated in severalhundred applications for the separation of proteins, polysaccharides, nucleicacids, membrane components and other high molecular weight substances. Sepharose CL-6B based ion exchangers are typically used with working flow ratesof up to 60 cm/h.

DEAE Sephacel (page 58)DEAE Sephacel is a beaded cellulose ion exchanger for separations over a widemolecular weight range (up to l x 106 for globular proteins). DEAE Sephacel is themedium of choice when a cellulose ion exchanger is needed for standard chroma-tography of proteins, nucleic acids or other biopolymers.

Sephadex ion exchangers (page 61)Sephadex ion exchangers are bead-formed media based on cross-linked dextran.They are available as strong and weak ion exchangers covering the pH range 2-10.Sephadex ion exchanger are suitable for batch-type applications.

Bulk quantitiesAll Pharmacia Biotech ion exchangers are available in larger pack sizes or largerpre-packed columns. Contact your local Pharmacia Biotech supplier for furtherinformation.

EquipmentPharmacia Biotech also supply a full range of equipment for operating all of theion exchangers covered in this handbook. Information regarding specific equip-ment is available upon request from Pharmacia Biotech.

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Page 25: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

4. MonoBeads and MiniBeadsMonoBeads

MonoBeads are unique, highly efficient, pH stable ion exchange media, specifical-ly designed for high resolution separations of proteins, peptides, and oligonucleo-tides. An example of the type of separation which can be achieved is shown inFigure 7.

Fig. 7. Characterization of venom from the White Faced Hornet by cation exchange chro-matography (6).Conditions: Venom (7 mg) dissolved in 50 mM BICINE, pH 8.4 (buffer A); Column, Mono S HR 5/5; Buffer B, 0.35 M NaCl in Buffer A; Gradient, 0-100% B in 40 ml; flowrate, 1 ml/min; detection, 280 nm at 0.05 AUFS.

MonoBeads ion exchangers are based on a 10 µm beaded hydrophilic polystyre-ne/divinyl benzene resin which has been substituted with quaternary amine groupsto yield the strong anion exchanger, Mono Q, or with methyl sulphonate groupsto yield the strong cation exchanger, Mono S.

Note: Substitution with the same ionic groups as Polybuffer Exchanger PBE 94gives Mono P - the matrix used for high resolution chromatofocusing. For furtherinformation on the technique and media for chromatofocusing the reader shouldcontact Pharmacia Biotech.

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The name MonoBeads is derived from the unique monodisperse nature of thematrix. This monodispersity (Fig. 8) was accomplished through a process develo-ped by Professor John Ugelstad of SINTEF, Trondheim, Norway.

Fig. 8. An electron micrograph of MonoBeads showing their distinct monodispersity.

The resolution which can be achieved on any chromatographic matrix is a resultof a combination of the efficiency and selectivity of the system. Maximum efficien-cy is obtained through the use of small, perfectly spherical, monodisperse parti-cles, optimally packed in a well designed column. All pre-packed MonoBeadscolumns have efficiencies at about 25 000 plates per metre. High efficiency, coup-led with the excellent selectivity of the Q and S substituents, results in high resolu-tion separations.

Scale-up to SOURCE Q and S (see Chapter 5), Q and SP Sepharose High Performance and Q and SP Sepharose Fast Flow (see Chapter 6) is simple, sincethese gels have similar selectivities to MonoBeads based media.

PropertiesChemical stabilityThe gels are stable for continuous use in the pH range 2-12, although pH values ashigh as 14 can be used during cleaning and sanitizing procedures. MonoBeads canbe used with solutions of most buffers used in biochemical separations of bio-molecules and in water-alcohol (C1 - C4) and acetonitrile-water solutions.The resistance of the MonoBeads matrix to organic solvents allows complete clea-ning and the use of conditions necessary for the solubilization of very hydrophobicsamples. An example of the use of MonoBeads with organic solvents is given inFigure 9, which shows the analysis of the peptide bacitracin on Mono S using lithium chlorate as the eluting salt and 90% methanol as the liquid phase (7).

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Fig. 9. Separation of the pep-tide bacitracin on Mono S. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Dimethylsulphoxide (DMSO) and similar solvents can be used, but will change theseparation properties of the gels. Aqueous solutions of urea, ethylene glycol andsimilar compounds can be used but will increase the back-pressures due to theirhigher viscosities. Non-ionic detergents, zwitterionic detergents or detergents withthe same charge as the ion exchange groups may be used. Oxidizing agents shouldbe avoided.

Physical stabilityMonoBeads are based on highly rigid beads which means that they can be used athigh flow rates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix thesehigh flow rates do not result in high back-pressures. For example, an HR 5/5column (5 mm inner diameter and 50 mm bed height) packed with a MonoBeadsmatrix normally generates a back-pressure of 1.0-1.5 MPa (10-15 bar) when ope-rated at a flow rate of 1 ml/min (300 cm/h).

Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratoryperistaltic pumps.

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A summary of the characteristics of MonoBeads is shown in Table 2.

Table 2. Characteristics of MonoBeads.

Properties Mono Q Mono S

Type of gel strong anion exchanger strong cation exchanger

Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-

-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH2-CHOH-CH2SO3-

Total ionic capacity (µmoles/ml gel) 270-370 140-180

Total protein binding capacity (mg/ml gel)

Thyroglobulin (MW 669 000) 25 N.D.

HSA (MW 68 000) 65 N.D.

a-lactalbumin (MW 14 300) 80 N.D.

IgG (MW 150 000) N.D. 75

Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 75

Typical protein recoveries (%) 90-100 90-100

Typical enzyme activity recoveries (%) >80 >80

Average particle size (µm) 10 ±0.5 10 ±0.5

MW range (proteins) up to 107 up to 107

working pH range* 3-11 3-11

pH stability**long term 2-12 2-12

short term 2-14 2-14

N.D. = Not determinedSolvent restrictions: The ion exchangers are stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethylsulphoxide, dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel.Avoid oxidizing and reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the samecharge as the gel.* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

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Flow rateThe rigid monodisperse nature of the media enables high flow rates to be used onMonoBeads columns. Normal recommended flow rates for high resolution sepa-rations are in the range 150 to 600 cm/h for HR 5/5 columns. Higher flow ratescan be used during column washing and regeneration.

In addition, the absence of buffering capacity means that buffer exchange and re-equilibration can be executed quickly and with small amounts of buffer. Detailsof the recommended flow rates to be used on the different columns are given inTable 3.

Capacity The high substitution levels coupled with the large pore size of the matrix, theexclusion limit for globular proteins is 107, give MonoBeads exchangers highcapacities for large proteins as well as for smaller polypeptides and peptides.

Typical saturation capacities are in the range of 60 mg protein per ml of gel andtypical sample loading capacities are in the region of 25 mg of protein per ml ofgel. Data on the saturation capacities for some specific proteins are given in Table 2.

Table 3. Chromatographic properties of pre-packed columns of MonoBeads.

Properties PC 1.6/5 HR 5/5 HR 10/10 HR 16/10 BioPilot Column35/100 60/100

Column volume (ml) 0.1 1 8 20 100 300

Column dimensions 1.6x50 5x50 10x100 16x100 35x100 60x100i.d. x bed height (mm)

Recommended workingflow rate range (ml/min) 0.01-0.40 0.5-2.0 up to 6 up to 10 up to 32 up to 94

Max operating 5 5 4 3 2 2pressure (MPa)

Number of theoreticalplates per meter (N/m) 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000 25 000

Normal separationtimes (min) 5-20 5-20 40 40 60-90 60-90

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The titration curves for Mono Q and Mono S (Fig. 10) show no buffering capaci-ty which means that the loading capacity does not vary with pH over the workingrange of the gel.

Fig. 10. Titration curves for Mono Q and Mono S. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

RecoveryNon-specific interactions to the MonoBeads matrix are very low and consequent-ly recoveries are high. Recoveries of protein mass are typically 90-100% and ofprotein activity greater than 80%. Examples of protein activity recoveries areshown in Table 4.

Table 4. Protein activity recoveries (%) from MonoBeads columns.

Protein Mono Q Mono S

b-Glucuronidase 106 N.D.b-Glucosidase N.D. 93Phosphodiesterase 80 N.D.Creatine Kinase 90 N.D.Enolase N.D. 95Lactate Dehydrogenase N.D. 102Aldolase N.D. 94

N.D. = Not determined

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ReproducibilityThe stability of the MonoBeads matrix together with controlled synthesis andcolumn packing procedures ensure very reproducible separations both over timeand from column to column. Figure 11 shows the reproducibility of a separationperformed on three different Mono S columns.

Fig. 11. Reproducible separations on three Mono S HR 5/5 columns. (Work byPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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AvailabilityMono Q and Mono S are available pre-packed in columns HR 5/5, HR 10/10 and HR 16/10, containing 1, 8 and 20 ml of gel respectively. The media are alsoavailable in BioPilot Columns 35/100 and 60/100 containing respectively 100 and 300 ml bed volumes, for chromatography at BioPilot scale. MonoBeads ionexchangers are also available as Mono Q PC 1.6/5 and Mono S PC 1.6/5, pre-packed columns specially designed for micropurification on SMART System.These columns can also be used in other high performance chromatography sys-tems by using a column holder for Precision Columns. For further informationabout the column holder, please contact your Pharmacia Biotech representative.For ordering information, see Chapter 14.

MiniBeadsMiniBeads is the base matrix for 3 µm high resolution ion exchange media. Thisnon-porous matrix, consisting of monodisperse hydrophilic polymer beads is sub-stituted with Q and S functional groups to give Mini Q and Mini S. Both mediaare packed in Precision Columns 3.2/3 (3.2 mm inner diameter and 30 mm bedheight) for micropreparative chromatography on SMART System. With a special-ly designed column holder, these columns can also be used in FPLC and HPLC sys-tems.

MiniBeads are highly efficient pH-stable adsorbents designed for high performan-ce micropurification of proteins, peptides and polynucleotides. The monodispersi-ty permits the use of high flow rates at relatively low back-pressures. The mainproperties are listed in Table 5.

Due to the smaller particle size, Mini Q and Mini S give faster separations withhigher resolution of peaks than ion exchangers based on MonoBeads, see Figure 12. This resolution is crucial for success when separating complex samplesin the pg to µg micropreparative scale.

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Fig. 12. Comparison of (A) Mini S PC 3.2/3 and (B) Mono S PC 1.6/5. Mini S PC 3.2/3gives a faster separation and a better resolution of the peaks. Similar results have beenfound with Mini Q PC 3.2/3 and Mono Q PC 1.6/5. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

PropertiesChemical stabilityMiniBeads may be used in aqueous solutions and nearly all organic solutions com-monly used in chromatography of proteins, oligonucleotides and peptides. Asexamples, the matrix is stable to 100% acetonitrile, 75% acetic acid, 2 M NaOHand 1 M HCl. Dimethylsulphoxide (DMSO), dimethylformamide, and formic acidand similar solvents will change the separation properties of the gels. Aqueoussolutions of urea, ethylene glycol and similar compounds can be used but willincrease the back-pressure due to their higher viscosities. Non-ionic detergents,zwitterionic detergents or detergents with the same charge as the ion exchangegroups may be used. Oxidizing agents should be avoided.

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Sample: Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A, Cytochrome C, Lysozyme (6:10:6:5), 25 µg/ml gel (6 µg Mini S,2.5 µg Mono S )

Buffer A: 20 mM acetic acid, pH 5.0Buffer B: Buffer A with 0.5 M lithium chlorideGradient: 0–100% B in 20 col. vols. (6 min Mini S, 10 min Mono S). Flow rate: 10 cm/min (800 µl/min Mini S, 200 µl/min Mono S)Instrument: SMART System with µPeak Monitor

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Physical stabilityThe combination, non-porous and monodisperse beads gives MiniBeads very highphysical stability. It has better flow kinetics and can withstand higher back-pressure(up to 10 MPa) than MonoBeads.

Note: These back-pressures are beyond the operating limits of standard laboratoryperistaltic pumps.

Table. 5. Main properties of Mini Q PC 3.2/3 and Mini S PC 3.2/3.

Properties Mini Q PC 3.2/3 Mini S PC 3.2/3

Type of gel strong anion exchanger strong cation exchanger

Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-

-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH2-CHOH-CH2SO3-

Total ionic capacity (µmoles/ml gel) 60-90 16-30

Column dimensions i.d. x bed height (mm) 3.2 x 30 3.2 x 30

Column volume (ml) 0.24 0.24

Average particle size (µm) 3 µm 3 µm

Binding capacity (mg/column)

a-amylas (MW 49 000) Å 1.4 N.D.

Trypsin inhibitor (MW 20 100) Å 1.4 N.D.

Ribonuclease (MW 13 700) N.D. Å 1.3

Lysozyme (MW 14 300) N.D. Å 1.3

Max loading capacity (mg/column) 1-1.5 1-1.5

Practical loading capacity (µg/column) ²200 ²200

Typical protein recoveries (%) 70-90 70-90

working pH range* 3-11 3-11

pH stability**long term 3-11 3-11

short term 1-14 1-14

Maximum flow rate (ml/min) 1.0 1.0

Operational pressure limit (MPa) 10 10

Normal separation times (min) 5-20 5-20

N.D. = Not determined* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

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ReproducibilityFigure 13 shows a long life test and reproducibility test on Mini S PC 3.2/3. Longlife and reproducibility are a result of the stabile nature of MiniBeads togetherwith controlled synthesis and column packing procedures.

Fig. 13. Long life test on Mini S PC 3.2/3. The chromatograms show the 1st, 5th and 201stseparation of a series run on the same column. The same consistently good stability andreproducibility have been confirmed on Mini Q PC 3.2/3 (data not shown here). (Work byPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

AvailabilityMini Q and Mini S are available pre-packed in Precision Columns 3.2/3. For ordering information, see Chapter 14.

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Column: Mini S PC 3.2/3Sample: Chymotrypsinogen A, Ribonuclease A,

Lysozyme 6 mg in proportions 1:3:1Buffer A: 20 mM acetic acid, pH 5.0Buffer B: 20 mM acetic acid, pH 5.0 with 0.4 M NaClFlow rate: 400 ml/minGradient: 0–100% B in 12 min

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Page 36: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

5. SOURCESOURCE ion exchangers are high performance media for fast and high resolutionseparations of biomolecules such as proteins, peptides and oligonucleotides.Examples are given in Figure 14, 18 and Figure 19.

SOURCE media are available in two particle sizes, 15 and 30 µm, and as anion and cation exchangers. The strong anion exchangers SOURCE 15Q and 30Q are produced by substi-tution of the base matrices with quaternary amino groups. For the strong cation exchangers, SOURCE 15S and 30S, the matrices have been substituted with methyl sulphonate groups. Table 6 summarizes the general properties of SOURCE ion exchangers.

Fig. 14. An example of a fast and high resolution separation on SOURCE. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

SOURCE is based on monodisperse, hydrophilized and rigid polystyrene/divinylbenzene beads with controlled pore structure. The beads have a uniform size dis-tribution, see Figure 15, and allow perfect packing of stable chromatographybeds. Monodispersity together with the absence of broken beads and fine particlesgive low operating back-pressures.

Fig. 15. Light microscope photograph of SOURCE. Note the uniform size distribution and absence of broken beads and bead fragments.

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Column: RESOURCE S 1 ml6.4 mm diam x 30 mm bed height

Sample: Snake venom 4 mg/ml, 0.1 mlFlow rate: 5 ml/min (180 cm/hBuffer A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8Buffer B: Buffer A + 0.4 M NaClGradient: 0 - 100% buffer B, 20 ml (20 col. vol.)System: FPLC System

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Table 6. Characteristics of SOURCE 15Q and 15S, and SOURCE 30Q and 30S.

Properties SOURCE 15Q SOURCE 30Q SOURCE 15S SOURCE 30S

Type of gel strong anion exchangers strong cation exchangers

Charged group -O-CH2-CHOH-CH2-O- -O-CH2-CHOH-CH2-O-

-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 -CH2-CHOH-CH2SO3-

Matrix Polystyrene/divinyl benzene

Bead form Rigid, spherical, porous monodisperse

Mean particle size (µm) 15 30 15 30

Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)

Lysozyme (MW 14 500) N.D. N.D. 80 80

BSA (MW 67 000) 45 45 N.D. N.D.

MW range (proteins) up to 107 up to 107 up to 107 up to 107

working pH range** 2-12 2-12 2-12 2-12

pH stability*** long term 2-12 2-12 2-12 2-12

short term 1-14 1-14 1-14 1-14

Maximum flow rate (cm/h) 18001 20002 18001 20002

Recommended working 30-600 300-1000 30-600 300-1000flow rate range (cm/h)

Operating temperature (°C) 4-40 4-40 4-40 4-40

N.D. = Not determinedSolvent restrictions: SOURCE is stable in alcohol/water solutions (C1-C4). 100% dimethyl sulphoxide,dimethylformamide, and formic acid can change the separation properties of the gel. Avoid oxidizingand reactive reagents. Detergents can be used if they are non-ionic or have the same charge as the gel.* Determined by frontal analysis at a flow rate of 300 cm/h, using a 5.0 mg/ml solution of protein in 20mM sodium phosphate buffer, pH 6.8 (lysozyme) and 20 mM BIS TRIS PROPANE buffer, pH 7.0(BSA).** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.1) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographicsystem used. A linear flow rate of 1800 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at abed height of 3 cm.2) Maximum flow rate to be applied, will depend on the pressure specification of the chromatographicsystem used. A linear flow rate of 2000 cm/h will give a pressure drop of approximately 10 MPa at abed height of 10 cm.

A uniquely wide pore size distribution and a large specific surface area offer excel-lent resolution and capacity for a wide range of molecules; from small peptidesand oligonucleotides up to large proteins. The performance is well maintained athigh flow rates and high sample loads. This is illustrated in Figure 16 and 17,which show separations of model protein mixtures on SOURCE 30Q.

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Fig. 16. The influence of increasing flow rate on resolution. (Work by Pharmacia Biotech,Uppsala, Sweden.)

Fig. 17. The influence of increasing sample load on resolution. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

SOURCE 15 and SOURCE 30 ion exchangers are designed for research andindustrial applications, with emphasis on high performance, high capacity, highreproducibility, and easy scaleability.

In comparison with media based on SOURCE 15 matrix, SOURCE 30 givesslightly less resolution (lower efficiency) but at much lower back-pressure. Thismakes SOURCE 30 ideal for purifications with more complex samples and largervolumes. Using SOURCE 30, a high degree of purification can be obtained with

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Column: SOURCE 30Q, 10 mm i.d. x 50 mm (4 ml)Sample: Mixture of lactoglobulin B and amyloglucosidaseSample load: 1 mg/ml bed volumeEluent A: 20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0Eluent B: 0.5 M sodium chloride, 20 mM BIS-TRIS PROPANE, pH 7.0Flow rate: a) 4 ml/min (300 cm/h)

b) 13 ml/min (1000 cm/h)Gradient: 0-100% B, 20 column volumes

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Column: SOURCE 30S, 5 mm i.d. x 50 mm (1 ml)Sample: Mixture of chymotypsinogen, cytochrome C and lysozymeSample load: a)1 mg

b) 10 mgEluent A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8Eluent B: 0.5 M sodium chloride, 20 mM sodium phosphate, pH 6.8Flow rate: 1 ml/min (300 cm/h)Gradient: 0-100% B, 20 column volumes

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high productivity. SOURCE 15 matrices are ideal for purification when very highresolution (efficiency) is required.

SOURCE 15 media are available in pre-packed RESOURCE columns. Thesecolumns are convenient for lab research applications and method development.

PropertiesChemical stabilityThe hydrophilized polymeric matrix has high chemical stability and can be usedover a wide pH range allowing flexibility in the choice of conditions for separa-tion.

The wide pH stability range, 1-14, allows cleaning and sanitization with harshagents like 1 M NaOH. Additionally, in applications such as the purification ofsynthetic oligonucleotides, the wide pH stability also allows use of a high pH buf-fer to prevent aggregation, see Figure 18.

Fig. 18. Purification of 19 mer DNA oligonucleotide on RESOURCE Q 1 ml scaled up toBioProcess Special column 100 mm diameter. Separation optimized for sample load, yieldand purity of product. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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Column: a) RESOURCE Q 1 ml (6.4 mm diam x 30 mm bed height)b) SOURCE 15Q in BioProcess Special, 240 ml(100 mm diam. x 30 mm bed height)

Sample: a) 800 µmoles synthesis of 19 mer DNA oligo, load 5 mgb) As a), load 820 mg

Sequence: ATACCGATTAAGCAAGTTTEluent A: 10 mM NaOH pH 12Eluent B: A + 1.5 M NaClFlow rate: a) 1.6 ml/min (300 cm/h), b) 385 ml/min (300 cm/h)Gradient: 0.25-0.75 M NaCl in 30 column volumesSystem: a) FPLC, b) BioProcess 6 mm, controlled by UNICORN™

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Flow rateSOURCE media are based on highly rigid beads which allows use at high flowrates. As a consequence of the monodisperse nature of the matrix, these high flowrates do not result in high back-pressures. The back-pressure from SOURCEmedia is much lower than for other media of the same particle size range. The lowback-pressure offers the advantage of being able to run at very high flow rates onmedium pressure equipment, as well as with acceptable flow rates on low pressureequipment. As an example, when a RESOURCE 1 ml column is used at the maxi-mum flow rate of FPLC or HPLC systems (about 10 ml/min, 1800 cm/h) separa-tions are completed in less then 3 minutes, see Figure 19. At flow rates of 1ml/min (180 cm/h) the extremely low back-pressures (typically around 0.1 MPa, 1 bar, 15 psi) allow high resolution separations in about 20 minutes with systemsbased only on a peristaltic pump, see Figure 20.

Fig. 19. Separation of pancreatin (Sigma) on RESOURCE Q 1 ml at 9.6 ml/min (1800cm/h). System: FPLC. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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Column: RESOURCE Q 1ml6.40 mm diam x 30 mm bed height

Sample: Pancreatin 5 mg/ml, 0.2 mlFlow rate: 9.6 ml/min (1800 cm/h)Buffer A: 20 mM BIS TRIS PROPANE, pH 7.5Buffer B: Buffer A + 0.5 ml NaClGradient: 0 - 80% buffer B, 20 ml (20 col. vol.) System: FPLC

Page 41: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

Fig. 20. Separation of snake venom (Sigma) on RESOURCE S 1 ml at 1.0 ml/min (180cm/h). System: GradiFrac equipped with Peristaltic Pump P-1. Although high performanceseparations with RESOURCE Q and S do not put special demands on the pump, resolutionobtained on the column can be lost through mixing in dead spaces. Low dead volumes,accurate gradient generation, and a good detector and fraction collector are also essentialfor good results. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Fig. 21. Pressure versus flow rate curves that can be expected with SOURCE media. Curvein a) shows that RESOURCE 1 ml columns can be used with high pressure equipment orperistaltic pumps. The curves in b) are from a large scale column packed with SOURCE 15media to 4 different bed heights. Curve c) shows the flow characteristics of the monosizedSOURCE 30 matrix compared with polysized media with mean diameters of 35 and 50 µmrespectively. The pressure flow data were determined in a 100 mm i.d. column with a bedheight of 10 cm. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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POROS is a registred trademark of Perseptive Biosystems.S HyperD F is a registred trademark of BioSepra.

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Recommended flow rates for high resolution separations are in the range 30 to600 cm/h for SOURCE 15Q and 15S and 300 to 1000 cm/h for SOURCE 30Qand 30S.

Figure 21 shows pressure versus flow rate characteristics of SOURCE 15 andSOURCE 30.

Capacity SOURCE ion exchangers have high capacities for large proteins as well as forsmaller polypeptides, peptides and oligonucleotides. This is a result of an optimi-zed pore size distribution, a high substitution level and a large binding surfacearea. Figure 22 shows breakthrough curves at different flow rates on RESOURCEQ and RESOURCE S.

SOURCE Q and S retain their charge and can therefore be used over a wide pHrange, 2-12, without variation in loading capacity.

Fig. 22. Breakthrough curves at different flow rates (superimposed).a) RESOURCE Q 1 ml. Sample: Bovine serum albumin (Sigma), 5 mg/ml.b) RESOURCE S 1 ml. Sample: Lysozyme, 5 mg/ml (Sigma).(Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

RecoveryThe recovery of protein mass is typically 90-100%. In the application described inChapter 12, purification of exotoxin A, the recovery in the SOURCE 30Q stepwas 91%.

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ReproducibilityEmphasis during development has been on quality, reproducibility and scaleabili-ty, features which are particularly important for industrial applications understrict regulatory control. Through the combination of high quality assurance stan-dards and a patented manufacturing process, the particle structure is consistentboth bead-to-bead and batch-to-batch. Modal particle diameter varies betweenbatches within ± 1 µm for SOURCE 15 and ±2 µm for SOURCE 30. The reprodu-cibility of a separation of a standard protein mixture performed on four differentproduction batches of SOURCE 30S, see Figure 23, is an example that reflects thereproducible qualities of SOURCE media.

Fig. 23. Quality control evaluation of 4 production batches of SOURCE 30S. (Work byPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

AvailabilitySOURCE 15Q and 15S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml, 200 ml, 500 mland 1 litre. SOURCE 30Q and 30S are available in pack sizes of 10 ml, 50 ml,200 ml, 1 litre, and 5 litres.

RESOURCE Q and S are pre-packed columns with SOURCE 15Q and 15S respec-tively. They are available in 1 and 6 ml sizes, packed to a bed height of 3 cm. Forordering information please refer to Chapter 14.

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Column: SOURCE 30S, 4 separate batches, 7.5 mm i.d. x 50 mm (2.2 ml)

Sample: Mixture of chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozyme

Sample load: 0.32 mg/ml bed volumeEluent A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8Eluent B: 0.5 M sodium chloride,

20 mM sodium phosphate, pH 6.8Flow rate: 2.2 ml/min (300 cm/h)Gradient: 0 - 100% B, 20 column volumes

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6. Sepharose based ion exchangers

Pharmacia Biotech offers a range of ion exchange media based on agarose, whichis cross-linked to produce Sepharose High Performance, Sepharose Fast Flow, Sepharose Big Beads, Sepharose CL-6B and STREAMLINE base matrices.Exchanger groups are attached to the gels by stable ether linkages to the monosac-charide units to give the final ion exchange gels.

The polysaccharide chains of Sepharose based ion exchangers are arranged inbundles (Fig. 24). These bundles are further strengthened by different degrees ofintra-chain cross-linking which provide a high matrix rigidity. The resulting struc-ture is macroporous and the capacity of the gels very good for globular proteinsup to 106 in molecular weight.

The gels, particularly the most highlycross-linked forms, e.g. Sepharose FastFlow and Sepharose High Performance ionexchangers, have good flow properties andstable bed volumes that are largely insensi-tive to changes in ionic strength and pH.They also show extremely low non-specificadsorption of macromolecules (8).

Fig. 24. Structure of cross-linked agarose gels.

Chemical stabilitySepharose ion exchangers tolerate extreme working conditions of temperature,pH and chemical agents. They are stable in water, salt solutions, and organic sol-vents. Details on the pH stability range for each gel is given in the appropriate sec-tion below.

The ion exchangers can be used in solutions of non-ionic detergents such as Triton X-100® and with strongly dissociating solvents such as 8 M urea and 6 Mguanidine hydrochloride (9). The Sepharose based ion exchangers also tolerate 1 M acetic acid, 30% isopropanol, 30% acetonitrile, 70% ethanol and 1 MNaOH. Under oxidizing conditions, limited hydrolysis of the polysaccharidechains may occur.

The gel-forming fibres of agarose are stiff bundles of polysaccharide chains ratherthan flexible single chains (10). For this reason the water in the gel can be replacedby other solvents with relatively little effect on pore size. Sepharose ion exchangers

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Triton® is a registred trademark of Rohm and Haas Co.

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can be used in polar organic solvents and in aqueous/organic mixtures. The gelmatrix is stable in a wide variety of solvents including ethanol, dimethylformami-de, tetrahydrofuran, acetone, dimethylsulphoxide, chloroform, dichloromethane,dichloroethane and dichloroethane/pyridine (50:50).

Sepharose is very resistant to microbial attack due to the presence of the unusualsugar, 3,6-anhydro-L-galactose. However, most buffers can support bacterialgrowth and so a antimicrobial agent should be used in storage (see page 103).

Physical stabilityThe highly cross-linked structure of the modern Sepharose based ion exchangers,e.g. Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance, not only gives themincreased chemical stability but also results in improved physical stability. Thisimproves flow properties enormously compared to Sepharose CL-6B gels. Cross-linking prevents fluctuations in bed volume under conditions of increasing ionicstrength. Thus Sepharose ion exchangers can be regenerated and re-equilibratedrepeatedly in the column. Repacking between experiments is thus eliminated,improving reproducibility.

Sepharose ion exchangers can be used at temperatures up to 70 °C and can be ste-rilized repeatedly in the salt form by autoclaving at 121 °C, pH 7, for 30 minutes.

Sepharose High Performance ionexchangers

Sepharose High Performance ion exchange media are based on 34 µm highlycross-linked agarose beads. The small bead size gives the media high efficiency,which in combination with high selectivity offers the possibility of high resolutionstandard chromatography separations.

In addition, the use of identical functional groups to those used in Q and SP Sepharose Fast Flow, Mono Q and Mono S and SOURCE Q and SOURCE Smedia, at comparable substitution levels (i.e. same selectivity), simplifies scalingup from FPLC and up to BioPilot and BioProcess scales.

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PropertiesPhysical stabilityThe high degree of cross-linking of Sepharose High Performance renders themedia extremely stable physically. The high rigidity of the cross-linked agarosematrix eliminates volume variations due to changes in pH or ionic strength.

CapacityAs is the case with all ion exchangers, the capacity depends upon the accessibilityof the charged groups and their number. Sepharose High Performance gels havean exclusion limit of approximately 4 x 106 and are highly substituted with strongion exchange groups. Thus they remain charged and maintain consistently highcapacities for proteins over a broad working pH range (Table 7). This allows theselection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.Titration curves for Q and SP Sepharose High Performance are similar to thosefor Q and SP Sepharose Fast Flow, which are shown in Figure 26.

Capacity varies from case to case depending on protein properties and flow rate.As an example, the dynamic capacity for human serum albumin on Q Sepharose High Performance is approximately 70 mg per ml gel at 150 cm/h(start buffer 20 mM Tris, pH 8.2). The dynamic capacity for ribonuclease on SP Sepharose High Performance has been estimated to 55 mg/ml gel at 150 cm/h(start buffer 0.1 M sodium acetate, pH 6.0). The characteristics of the media areshown in Table 7. Characteristics specific for HiLoad, HiTrap and BioPilotcolumns pre-packed with Q and SP Sepharose High Performance are shown inTable 8.

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Table 7. Characteristics of Q and SP Sepharose High Performance.

Product Q Sepharose SP SepharoseHigh Performance High Performance

Type of gel strong anion strong cation

Total ionic capacity (µmol/ml gel) 140-200 140-200

Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)

BSA (MW 67 000) 70 N.D.

Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 55

Recommended working up to 150 up to 150flow rate range (cm/h)

Approx. mean particle size (µm) 34 34

Particle size range (µm) 24-44 24-44

working pH range** 2-12 4-13

pH stability***short term 1-14 3-14

long term 2-12 4-13

N.D. = Not determined* The dynamic binding capacity was determined at a linear flow rate of 150 cm/h using a 10.0 mg/mlsolution of BSA in 20 mM Tris buffer, pH 8.2 and a 5.0 mg/ml solution of ribonuclease in 100 mMsodium acetate, pH 6.0.** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

Table 8. Characteristics of HiLoad, HiTrap and BioPilot columns pre-packed with Q and SP Sepharose High Performance.

Product HiLoad HiTrap BioPilot Column16/10 26/10 1 ml 5 ml 35/100 60/100

Column dimensions (mm) 16x100 26x100 7x25 16x25 35x100 60x100(inner diameter x bed height)

Bed volume (ml) 20-22 53-58 1 5 100 300

Maximum flow rate* (ml/min) 5 13 4 20 25 70

Recommended working up to 5 up to 13 1 5 up to 24 (for SP) up to 70 (for SP)flow rate range (ml/min) up to 16 (for Q) up to 47 (for Q)

Max pressure* (MPa) 0.3 0.3 0.3 0.31.1 1.1

Number of theoretical >12 000 >12 000 N.D. N.D. >10 000 >10 000plates per meter** (N/m)

* Max. pressures and flow rates should not be used routinely. ** Determined with acetone.

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Flow rateThe rigidity of Sepharose High Performance based ion exchangers together withthe small particle size distribution of the 34 µm beads confers excellent flow pro-perties. Flow rates achievable with Sepharose High Performance media and pre-packed columns are given in Table 7 and 8.

AvailabilityQ and SP Sepharose High Performance are available in packs of 75 ml, 1 and 5 litres.

To ensure optimal performance and reproducibility Sepharose High Performancemedia are also available in pre-packed HiLoad columns with dimensions 16 and26 mm in internal diameter and 10 cm in bed height.

Q and SP Sepharose High Performance are also available in pre-packed, ready-to-use 1 ml and 5 ml columns, HiTrap Q and HiTrap SP respectively. They are desig-ned for method scouting, group separations, sample clean-up or sample concen-tration.

For pilot scale separations, Q Sepharose High Performance is available in pre-packed BioPilot columns of 100 ml (35/100) and 300 ml (60/100). SP Sepharose High Performance pre-packed in BioPilot columns 35/100 and60/100 are available on request. For ordering information, please refer to Chapter 14.

Sepharose Fast Flow ion exchangers Sepharose Fast Flow ion exchangers are based on 90 µm agarose beads. A higherdegree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchangers, isused to give the media greatly improved physical and chemical stability. This high

Fig. 25. Partial structure of Sepharose Fast Flow ion exchange media.

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stability allows the gels to be used at the higher flow rates required for modernlaboratory separations as well as meeting the throughput and cleaning-in-placerequirements of process scale chromatography.

To give a complete range of ion exchange media Sepharose Fast Flow is availablewith the weak exchanger groups, DEAE and CM and the strong exchanger groupsQ and SP. Figure 25 shows the partial structures of these media. Characteristics ofthe different ion exchangers based on Sepharose Fast Flow is listed in Table 9.

Table 9. Characteristics of Q, SP, DEAE and CM Sepharose Fast Flow.

Product Q Sepharose SP Sepharose DEAE Sepharose CM SepharoseFast Flow Fast Flow Fast Flow Fast Flow

Type of gel strong anion strong cation weak anion weak cation

Total ionic capacity 180-250 180-250 110-160 90-130(µmol/ml gel)

Recommended 100-300 100-300 100-300 100-300working flow raterange (cm/h)

Approx. meanparticle size (µm) 90 90 90 90

Particle size range (µm) 45-165 45-165 45-165 45-165

working pH range* 2-12 4-13 2-9 6-10

pH stability**short term 1-14 3-14 1-14 2-14

long term 2-12 4-13 2-13 4-13

* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

PropertiesPhysical stabilitySepharose Fast Flow ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for pack-ing or in pre-packed columns. The highly cross-linked nature of the matrix meansthat the bead size and bed volumes do not change with changes in ionic strengthor pH.

CapacityAs is the case with all ion exchangers the capacity is dependent upon the accessibi-lity of the charged groups and their number. Sepharose Fast Flow ion exchangersare highly substituted and have an exclusion limit of approximately 4 x 106 giving

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high capacity for proteins. Capacity data for Fast Flow ion exchange media aregiven in Table 10. Characteristics specific for pre-packed columns with Q and SPSepharose Fast Flow, HiLoad columns, are shown in Table 11.

Table 10. Capacity data for Sepharose Fast Flow ion exchangers.

Ion Exchanger Q Sepharose SP Sepharose DEAE Sepharose CM SepharoseFast Flow Fast Flow Fast Flow Fast Flow

Total ionic capacity(µmol/ml gel) 180-250 180-250 110-160 90-130

Dynamic binding capacity*(mg/ml gel)

Thyroglobulin (MW 669 000) 3 N.D. 3.1 N.D.

HSA (MW 68 000) 120 N.D. 110 N.D.

a-lactalbumin (MW 14 300) 110 N.D. 100 N.D.

IgG (MW 160 000) N.D. 50 N.D. 15

Bovine COHb (MW 69 000) N.D. 50 N.D. 30

Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 70 N.D. 50

N.D. = Not determined*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. For anion exchangers (DEAE and Q) the starting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3 and for cation exchangers (CM and S) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were therespective start buffers containing 2.0 M NaCl.

Table 11. Characteristics of HiLoad columns pre-packed with Q and SP Sepharose Fast Flow.

Product HiLoad 16/10 HiLoad 26/10

Bed volume (ml) 20-22 53-58

Maximum flow rate* (ml/min) 10 26

Recommended working up to 7 up to 18flow rate range (ml/min)

Max pressure* (MPa) 0.3 0.3

Number of theoretical plates per meter** (N/m) >3000 >3000

* Max. pressures and flow rates should not be used routinely.** Determined with acetone.

Q Sepharose Fast Flow and SP Sepharose Fast Flow are highly substituted withstrong ion exchange groups. These groups remain charged and maintain consi-stently high capacities over broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respective-ly. This allows the selection of a pH value and buffer that best suit the propertiesof the sample. Titration curves for both gels are shown in Figure 26. The workingpH ranges for DEAE Sepharose Fast Flow and CM Sepharose Fast Flow are 2-9and 6-10 respectively.

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Fig. 26. Titration curves; approximately 5 ml Q and SP Sepharose Fast Flow in 50 ml 1 M KCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Flow rateThe optimal cross-linking of Sepharose Fast Flow confers excellent flow properti-es on the matrix. This is illustrated in Figure 27 which shows the relationship bet-ween flow rate and operating pressure for DEAE Sepharose Fast Flow.

Fig. 27. Flow rate as a function of pressure drop of DEAE Sepharose Fast Flow. Column: Pharmacia XK 50/30 fitted with 1/4 inch tubing. Gel bed height 15 cm. Gel volume 294 ml. Eluent 0.1 M NaCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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Flow rates achievable with Fast Flow media are above 300 cm/h at 0.1 MPa (1 bar) in an XK 50/30 column packed with a 15 cm high bed of gel. In laboratoryseparations where the best possible separation is frequently a major considerationthis flow rate is frequently traded off against improved resolution. In industrialprocessing, the high throughput properties of Sepharose Fast Flow ion exchangersgive significantly reduced cycle times and improved productivity.

Availability DEAE and CM Sepharose Fast Flow are available in packs of 500 ml, 10 and 60litres. Q and SP Sepharose Fast Flow are available in packs of 25 ml, 300 ml, 5and 60 litres and are also available pre-packed in HiLoad 16/10 and 26/10columns. Q, DEAE and CM Sepharose Fast Flow are supplied in 20% ethanol andSP Sepharose Fast Flow in 20% ethanol with 0.2 M sodium acetate. For orderinginformation, please refer to Chapter 14.

Sepharose Big Beads ion exchangersSepharose Big Beads ion exchangers are based on 100-300 µm agarose beads. Ahigher degree of cross-linking, compared to Sepharose CL-6B based ion exchang-ers, is used to give the media greatly improved physical and chemical stability.Due to its excellent physical stability and large bead size, Sepharose Big Beads canbe run at high flow rates even with viscous samples. Table 12, gives the characte-ristics of Q and SP Sepharose Big Beads.

Table 12. Characteristics of Q and SP Sepharose Big Beads.

Product Q Sepharose Big Beads SP Sepharose Big Beads

Type of gel strong anion strong cation

Total ionic capacity (µmol/ml gel) 180-250 180-250

Recommended workingflow rate range (cm/h) 1200-1800 1200-1800

Approx. mean particle size (µm) 200 200

Particle size range (µm) 100-300 100-300

working pH range* 2-12 4-13

pH stability**short term 2-14 3-14

long term 2-12 4-13

* working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

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PropertiesPhysical stabilitySepharose Big Beads ion exchangers are supplied pre-swollen and ready for pack-ing. The average bead diameter is 200 µm with a bead size distribution of 100-300 µm. The highly cross-linked nature of the matrix means that the bead size andbed volumes do not change with changes in ionic strength or pH.

CapacityQ and SP Sepharose Big Beads are highly substituted with strong ion exchangegroups. These groups remain charged and maintain consistently high capacitiesover broad working pH ranges of 2-12 and 4-13 respectively. This allows theselection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.Figure 28 shows typical binding capacities of SP Sepharose Big Beads.

Fig. 28. Typical binding capacities of SP Sepharose Big Beads media. The binding capacity was measuredwith frontal analysis in acetate pH 5 for bovine serum albumin and format pH 4.1 for b-lactoglo-bulin at linear flow rates of 12 and 300 cm/h. (Work by PharmaciaBiotech, Uppsala, Sweden.)

Flow rateBecause of its flow characteristics, Q and SP Sepharose Big Beads is the choice forinitial purification when high viscosity precludes the use of ion exchangers withsmaller bead size, e.g. Sepharose Fast Flow ion exchangers. Even with viscositiesas high as 2.5 times water a high flow rate (500 cm/h) is maintained in industrialcolumn operation.

AvailabilityQ and SP Sepharose Big Beads are available in packs of 1 and 10 litres. Forordering information, please refer to Chapter 14.

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STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE

STREAMLINE adsorbents are specifically developed for expanded bed adsorp-tion, see page 98 for details, and are based on a modified Sepharose matrix, cross-linked 6% agarose.

STREAMLINE adsorbents have been designed with a well-defined density distri-bution, which is required in expanded bed adsorption. This is achieved throughinclusion of inert crystalline quartz material in the base matrix. Mean particledensity is approximately 1.2 g/ml drained gel. The porosity is comparable to Sepharose Fast Flow ion exchangers, with an exclusion limit of 4 x 106 for globular proteins.

Table 13. Characteristics of STREAMLINE ion exchange adsorbents.

Product STREAMLINE SP STREAMLINE DEAE

Type of gel strong cation weak anion

Total ionic capacity (µmol/ml gel) 170-240 130-210

Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)Lysozyme (MW 14 500) 70 N.D.

BSA (MW 67 000) N.D. 55

Recommended working flow rate range (cm/h)- sample application 200-400 200-400

- elution 50-150 50-150

Approx. mean particle size (µm) 200 200

Particle size range (µm) 100-300 100-300

working pH range** 4-13 2-9

pH stability***short term 3-14 1-14

long term 4-13 2-13

N.D. = Not determined*The binding capacity was determined in STREAMLINE 50 column at a linear flow rate of 300 cm/husing a 2.0 mg/ml solution of protein in phosphate buffer, pH 7.5 (lysozyme) and 50 mM Tris-HClbuffer, pH 7.5 (BSA).** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance.pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

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PropertiesPhysical stabilitySTREAMLINE adsorbents are supplied pre-swollen and ready for use. The avera-ge bead diameter is 200 µm with a bead size distribution of 100-300 µm. Thehighly cross-linked nature of the matrix means that the bead size and bed volumesdo not change with changes in ionic strength or pH.

CapacityAs is the case with all ion exchangers the binding capacity of STREAMLINEadsorbents are dependent on each different molecule’s size and pI, the flow rateetc. In general, the adsorption characteristics of STREAMLINE adsorbents aresimilar to those of a packed bed in chromatography, a direct result of the stabilityof the expanded bed during feed application. This is illustrated in Figure 29 whichcompares the breakthrough curves for a model protein with STREAMLINEDEAE in packed mode and expanded mode at two scales of operation.

Fig. 29. Breakthrough capacity curve comparisons. Running conditions: BSA in 50 mMTris-HCl, pH 7.5, linear flow rate 300 cm/h. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

STREAMLINE SP and STREAMLINE DEAE are highly substituted with ionexchange groups. These groups remain charged and maintain consistently highcapacities over the working pH ranges of 4-13 and 2-9 respectively. This allowsthe selection of a pH value and buffer that best suit the properties of the sample.

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Availability STREAMLINE SP and DEAE are available in packs of 300 ml and 7.7 litres.For ordering information, please refer to Chapter 14.

DEAE Sepharose CL-6Band CM Sepharose CL-6B

DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B are macroporous bead-formed(mean particle size of 90 µm diameter) ion exchangers derived from the cross-linked agarose gel Sepharose CL-6B. DEAE or CM groups are then attached to thegel by ether linkages to the monosaccharide units to give the final ion exchange gel(Fig. 30).

DEAE Sepharose CL-6B and CM Sepharose CL-6B have good chemical and physi-cal stability and can be used to advantage in the ion exchange chromatography ofproteins, polysaccharides, nucleic acids, membrane components and other highmolecular weight substances.

Fig. 30. Partial structure of Sepharose CL-6B ion exchangers.

PropertiesPhysical stabilityDEAE and CM Sepharose CL-6B are supplied pre-swollen and ready for packing.As stated earlier, the cross-linked nature of the matrix means that the bed volumechanges very little with changes in ionic strength or pH (approximately 2% chan-ge when the pH is reduced from 10 to 4).

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CapacitySince DEAE and CM Sepharose CL-6B are weak ion exchangers, the number ofligand groups which are charged and hence the capacity for macromolecules isdependent upon pH. This dependency is illustrated by the titration curves forDEAE and CM Sepharose CL-6B (Fig. 31).

Fig. 31. Titration curves; Approximately 5 ml DEAE and CM Sepharose CL-6B both in 50 ml 1 M KCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

The working pH ranges for the media are 2-9 for DEAE Sepharose CL-6B and 6-10 for CM Sepharose CL-6B.

DEAE and CM Sepharose CL-6B have exclusion limits of approximately 4 x 106. Capacity data for Sepharose CL-6B ion exchangers are summarized inTable 14.

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Table 14. Characteristics of Sepharose CL-6B ion exchangers.

DEAE Sepharose CL-6B CM Sepharose CL-6B

Total ionic capacity (µmol/ml gel) 130-170 100-140

Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)Thyroglobulin (MW 669 000) 2.0 N.D.

IgG (160 000) N.D. 9.5

Bovine COHb (MW 69 000) N.D. 75

HSA (MW 68 000) 170 N.D.

a-lactalbumin (MW 14 300) 150 N.D.

Ribonuclease (MW 13 700) N.D. 120

Recommended working flow rate range (cm/h) up to 60 up to 60

Approx. mean particle size (µm) 90 90

Particle size range (µm) 45-165 45-165

working pH range** 2-9 6-10

pH stability***short term 2-14 2-14

long term 3-12 4-13

N.D. = Not determined*Capacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. Forthe anion exchanger (DEAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for the cation exchangers(CM) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start buffers containing 2.0 MNaCl.** working pH range refers to the pH range over which the ion exchange groups remain charged andmaintain consistently high capacity.*** pH stability, long term refers to the pH interval where the gel is stable over a long period of timewithout adverse effects on its subsequent chromatographic performance. pH stability, short term refers to the pH interval for regeneration and cleaning procedures.

Flow rateThe cross-linked structure of Sepharose CL-6B ion exchangers allows flow rates ofup to 100 cm/h to be used. Figure 32 illustrates the variation of flow rate withpressure drop for DEAE and CM Sepharose CL-6B.

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Fig. 32. Flow rate as a function of pressure drop in columns (5x10 cm bed volume) ofDEAE and CM Sepharose CL-6B. pH 7.0; Ionic strength 0.02. (Work by Pharmacia Bio-tech, Uppsala, Sweden.)

As in all types of chromatography, resolution is dependent on flow rate (5). There-fore in applications where resolution is critically important high flow rates shouldbe avoided or an exchanger based on Sepharose High Performance used.

For applications where high flow rates and large throughput of material are requi-red, ion exchangers based on Sepharose Fast Flow or Sepharose Big Beads shouldbe used since these forms have been specially developed with these criteria inmind.

AvailabilityDEAE and CM-Sepharose CL-6B are available in packs of 500 ml and 10 litres.The gels are supplied in 20% ethanol. For ordering information, please refer toChapter 14.

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7. DEAE SephacelDEAE Sephacel is a bead-formed cellulose ion exchanger produced from highpurity microcrystalline cellulose. Cellulose is a naturally occurring polymer consis-ting of b(1-4) linked glucose units. In the native state, adjacent polysaccharidechains are extensively hydrogen bonded, forming microcrystalline regions. Theseregions are interspersed with amorphous regions with less hydrogen bonding.Limited acid hydrolysis results in preferential loss of the amorphous regions andgives so-called microcrystalline cellulose.

During the production of DEAE Sephacel the microcrystalline structure is brokendown and the cellulose is regenerated to give a bead-formed (40-160 µm) gel. Thegel is strengthened by cross-linking with epichlorohydrin, although the main struc-ture-forming bonds are still hydrogen bonds. Functional groups are attachedduring the synthesis by ether linkages to glucose units of the polysaccharide chainsto give the structure shown in Figure 33.

Fig. 33. Partial structure of DEAE Sephacel.

PropertiesChemical stabilityDEAE Sephacel is stable in aqueous suspension within the range pH 2-12. Hydro-lysis may occur in strongly acidic solutions and the macromolecular structure isbroken down in strongly alkaline solutions. The free base form of the DEAEgroup is inherently unstable at high pH values. Strong oxidizing agents should beavoided.

DEAE Sephacel is susceptible to microbial attack, especially in the presence ofphosphates, and should therefore be stored in the presence of antimicrobial agentswhen not in use (see page 103). Samples containing enzymes capable of hydro-lysing b-glucosidic linkages should be purified on MonoBeads, MiniBeads, SOURCE, Sepharose or Sephadex based ion exchangers.

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Physical stabilityThe cross-linked bead form of DEAE Sephacel gives it increased physical stabilitycompared to ordinary microgranular celluloses. It has a stable bed volume over awide range of ionic strengths (approx. 5% change between I = 0.05 and I = 0.5)and pH values and can therefore be re-equilibrated in the column.

DEAE Sephacel can be sterilized by autoclaving at pH 7 for 30 minutes at 121 °C.During autoclaving, minute quantities of carbohydrate are released; these can bewashed away with sterile buffer solution.

CapacityDEAE Sephacel is macroporous and has an exclusion limit for proteins with mole-cular weights of approximately 1 x 106. The binding of substances with molecularweights substantially greater than 1 x 106 will be restricted to charged groups onthe surface of the beads. Capacity data for DEAE Sephacel is summarized in Table 15.

Table 15. Capacity data for DEAE Sephacel.

Total ionic capacity Dynamic binding capacity* (mg/ml gel)

(µmol/mg gel) (µmol/ml gel) albumin thyroglobulin

DEAE Sephacel 130-150 100-140 160 10

*Capacity was determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. Thestarting buffer was 0.05 M Tris, pH 8.3 Limit buffer was start buffer containing 2.0 M NaCl.

The adsorption kinetics for bead-formed cellulose ion exchangers are substantiallythe same as for conventional cellulose ion exchangers (11). As with other weak ionexchangers the capacity varies with pH. The titration curve for DEAE Sephacel isshown in Figure 34.

Fig. 34. Titration of 1 g DEAE Sephacelin 1 M KCl. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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Flow rateAs with other ion exchangers, resolution decreases with increasing flow rate. Flowrates of 10 cm/h are usually suitable for the resolution of protein mixtures onDEAE Sephacel. Figure 35 illustrates the variation of flow rate as a function ofpressure drop for DEAE Sephacel. For applications requiring higher flow ratesSOURCE or Sepharose based ion exchangers should be used.

Fig. 35. Flow rate as a function of the pressure drop across beds of DEAE Sephacel. 0.1 M Tris-HCl buffer solution pH 7.6. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

AvailabilityDEAE Sephacel is supplied in packs of 500 ml as a suspension in 20% ethanol.For ordering information, please refer to Chapter 14.

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8. Sephadex ion exchangersSephadex ion exchangers are produced by introducing functional groups ontoSephadex, a cross-linked dextran matrix. These groups are attached to glucoseunits in the matrix by stable ether linkages.

Sephadex is suitable as a base for an ion exchanger matrix since it is hydrophilicand shows very low non-specific adsorption.

Sephadex ion exchangers are derived from either Sephadex G-25 or Sephadex G-50 and swell readily in aqueous solutions. Ion exchangers based onSephadex G-25 are more tightly cross-linked than those based on Sephadex G-50and therefore swell less and have greater rigidity. Ion exchangers based on Sephadex G-50 are more porous than those based on Sephadex G-25 and therefo-re have a better capacity for molecules with molecular weights larger than 30 000.

The full range of Sephadex ion exchangers is shown in Table 16. Anion and cationexchangers are designated as A-25 or A-50 and C-25 or C-50, respectively, depen-ding on the matrix porosity.

Table 16. Sephadex ion exchangers.

Types Description Functional groups Counter ion

DEAE A-25 Weakly basic Diethylaminoethyl ChlorideSephadex A-50 anion exchanger

QAE A-25 Strongly basic Diethyl-(2-hydroxy- ChlorideSephadex A-50 anion exchanger propyl)aminoethyl

CM C-25 Weakly acidic Carboxymethyl SodiumSephadex C-50 cation exchanger

SP C-25 Strongly acidic Sulphopropyl SodiumSephadex C-50 cation exchanger

PropertiesChemical stabilitySephadex ion exchangers are insoluble in all solvents. They are stable in water, saltsolutions, organic solvents, alkaline and weakly acidic solutions. In strongly acidicsolutions, hydrolysis of the glycosidic linkages may occur and thus pH valuesbelow 2 should be avoided, particularly at elevated temperatures. Sephadex ionexchangers can also be used in the presence of denaturing solvents which can beimportant when substances are to be separated on the basis of their electrostaticproperties alone (12, 13, 14).

Exposure to strong oxidizing agents or dextranases should be avoided. Duringregeneration, the ion exchanger can be exposed to 0.2 M NaOH for a short time

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without appreciable hydrolysis. Sephadex ion exchangers are susceptible to attackby dextranases and should be stored in the presence of an antimicrobial agent (seepage 103).

Physical stabilitySwollen Sephadex ion exchangers can be sterilized by autoclaving for up to 30 minat 121 °C, at neutral pH in the salt form. During autoclaving, minute quantities ofcarbohydrate are released; these can be washed away with sterile buffer.

SwellingThe swelling properties of Sephadex ion exchangers are related to those of theparent Sephadex G-types, those based on 50-types swelling more than those basedon 25-types. Due to the presence of charged groups in the matrix, the swellingvaries with ionic strength and pH.

Ionic strength dependenceAt low ionic strengths, repulsion between groups carrying the same charge on thematrix is maximal, and swelling of the gel is at its greatest. The degree of swellingdecreases with increasing ionic strength.

Note: Sephadex ion exchangers should not be swollen in distilled water since thebead structure may be broken down due to strong ionic interactions.

pH dependenceThe degree of dissociation and hence the extent to which an ion exchanger is char-ged is dependent on pH. Repulsion between charged groups is greatest at pH valu-es where the ion exchanger is fully dissociated, and decreases at pH values close tothe pK of the charged groups.

Note: QAE Sephadex and SP Sephadex have swelling properties quite independentof pH since they are charged over a very wide pH range.

CapacityDue to differences in swelling characteristics, ion exchangers based on SephadexG-25 have a much higher ionic capacity per ml gel than those based on SephadexG-50. (Table 17).

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Table 17. Total ionic capacity data for Sephadex based ion exchangers.

Ion exchanger Total ionic capacity

(µmol/mg dry gel) (µmol/ml wet gel)

DEAE A-25 3.5 ±0.5 500

Sephadex A-50 175

QAE A-25 3.0 ±0.4 500

Sephadex A-50 100

CM C-25 4.5 ±0.5 550

Sephadex C-50 170

SP C-25 2.3 ±0.3 300

Sephadex C-50 90

Thus for smaller biomolecules (MW < 30 000) the A-25 and C-25 types have ahigher available capacity. In the molecular weight range 30 000 to 100 000 howe-ver, the A-50 and C-50 exchangers have higher available capacities due to theirlarger pore size.

Fig. 36. Titration of 0.1 gram of Sephadex ion exchangers in 50 ml 1 M KCl. (Work byPharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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If working with larger molecules (MW > 100 000), a higher available capacity isfrequently observed with the A-25 and C-25 types since at these molecular weightsbinding is only occurring on the bead surface and the higher ionic capacity can beused to advantage.

As capacity also depends upon the number of substituent groups which are char-ged under given buffer conditions, it will also vary with pH. The variation of thecharge on Sephadex ion exchangers with pH is illustrated by their titration curves(Fig. 36).

Dynamic capacity data for Sephadex ion exchangers are given in Table 18.

Table 18. Dynamic capacity (mg/ml wet gel) data for Sephadex ion exchangers

Protein Thyroglobulin HSA a-lactalbumin IgG Bovine COHb(MW) (669 000) (68 000) (14 300) (160 000) (69 000)

Ion exchanger

DEAE A-25 1.0 30.0 140.0 N.D. N.D.

Sephadex A-50 2.0 110.0 50.0 N.D. N.D.

QAE A-25 1.5 10.0 110.0 N.D. N.D.

Sephadex A-50 1.2 80.0 30.0 N.D. N.D.

CM C-25 N.D. N.D. N.D. 1.6 70.0

Sephadex C-50 N.D. N.D. N.D. 7.0 140.0

SP C-25 N.D. N.D. N.D. 1.1 70.

Sephadex C-50 N.D. N.D. N.D. 8.0 110.0

N.D. = Not determinedCapacities were determined using the method described in Chapter 10 at a flow rate of 75 cm/h. Foranion exchangers (DEAE and QAE) the starting buffer was 0.05M Tris, pH 8.3 and for cationexchangers (CM and SP) 0.1 M acetate buffer, pH 5.0. Limit buffers were the respective start bufferscontaining 2.0 M NaCl.

AvailabilitySephadex ion exchangers are supplied as dry powders in packs of 100 g and 500 g.Bulk quantities of 5 kg or more are available on request. For ordering infor-mation, please refer to Chapter 14.

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9. Experimental designChoice of ion exchanger

No single ion exchanger is best for every separation. The choice of matrix andionic substituent depends on:

1. The specific requirements of the application2. The molecular size of the sample components3. The isoelectric points of the sample components

Specific requirements of the applicationColumn separation, batch separation or expanded bed adsorptionIf the separation is to be carried out using a batch separation technique ratherthan column chromatography, the flow and packing characteristics of the matrixare of minor importance. The economy and high capacity of Sephadex based ionexchangers make them a natural choice.

In large scale applications, capturing proteins from crude samples containing par-ticulate matter, expanded bed adsorption using STREAMLINE has proven to beeffective and cost efficient.

The scale of the separationThe amount of sample to be processed is an important parameter when choosingan ion exchange medium. For laboratory scale separations, any of the PharmaciaBiotech range of ion exchangers can be used. However for large scale separations,which must satisfy the throughput and cleaning-in-place (CIP) requirements ofindustry, the choice of a BioProcess Media such as SOURCE, Sepharose High Per-formance, Sepharose Fast Flow, Sepharose Big Beads or STREAMLINE adsorbentis indicated.

The same reasoning applies to experiments designed as method scouting for even-tual scale-up since such procedures should be developed using the gel which willeventually be used at the larger scale. SOURCE media and Sepharose Fast Flowbased exchangers are extremely well suited to this type of method optimization aswell as routine laboratory separations.

The required resolutionWhen choosing an ion exchanger it is important to decide the degree of resolutionrequired from the separation. Normally analytical or semi-analytical separations

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place high demands on resolution. In contrast, resolution is frequently traded offagainst capacity and speed in the case of preparative work.

Resolution in ion exchange chromatography depends upon the selectivity and effi-ciency of the media. Maximum selectivity is often obtained by choosing one of thegels carrying the strong exchanger groups Q or S/SP, since strong ion exchangerscan be used at any pH tolerated by the sample molecules.

Maximum efficiency is obtained by choosing a gel based on a small particle sizematrix. The media in order of their particle sizes and potential efficiencies areMiniBeads (3 µm) > MonoBeads (10 µm) > SOURCE 15 (15 µm) > SOURCE 30(30 µm)> Sepharose High Performance (34 µm) > Sepharose Fast Flow/ SepharoseCL-6B/ Sephacel (90 µm) > Sephadex (40-125 µm in dry form) > STREAMLINEadsorbents/Sepharose Big Beads (200 µm).

The media thus offering the highest degree of resolution are MiniBeads, MonoBeads and SOURCE 15 exchangers for high resolution in SMART, FPLCand HPLC systems and SOURCE 30 and Sepharose High Performance exchangersfor high resolution standard chromatography.

The required throughputHow much material which can be processed in a defined time is determinedamongst other things by the capacity, the flow characteristics of the media and thesize of the column. All of the ion exchangers available from Pharmacia Biotechhave high capacities for macromolecules but differ considerably in their flow pro-perties. The media which have optimal flow characteristics are MiniBeads formicropreparative chromotography in SMART System, MonoBeads and SOURCE15 for high performance, FPLC separations, and SOURCE 30, Sepharose HighPerformance, Sepharose Fast Flow and Sepharose Big Beads media for laboratoryand process scale preparative separations.

The uniform size distribution of beads in SOURCE media provides comparativelylow pressure drops over packed beds and thus makes SOURCE ion exchangersalso ideal for scaling up in industrial applications such as the separation of closelyrelated product variants.

ScaleabilityFrequently ion exchange separations are carried out initially on a small scale tooptimize conditions before committing the sample to full scale separations. It isthus important to choose an ion exchanger which will allow simple and conveni-ent scale up so that methods established on a small column can be applied more orless directly to the larger column. Detailed information on scaling up ion exchangeseparations is given in Chapter 11.

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ReproducibilityReproducibility is obtained when the characteristics of the chromatography bedremain unchanged during the course of the separation and during regeneration ofthe column. The more rigid varieties of Pharmacia Biotech ion exchangers, such asMiniBeads, MonoBeads, SOURCE, Sepharose High Performance, Sepharose FastFlow and Sepharose Big Beads, show no changes in bed size with changes in pHand ionic strength and can thus be washed and regenerated in the columns provi-ding additional reproducibility.

The use of media which are supplied pre-packed and tested, such as MiniBeads,MonoBeads, RESOURCE, HiTrap columns pre-packed with Sepharose High Per-formance and HiLoad columns pre-packed with Sepharose High Performance orSepharose Fast Flow assures reproducibility since variability in column packing iseliminated.

EconomyColumn or batch procedures in which the ion exchanger is used once and thrownaway, as well as applications requiring large amounts of gel, may make economy amajor consideration. Sephadex A-50 and C-50 ion exchangers are the least expen-sive in terms of bed volume, followed by Sephadex A-25 and C-25 ion exchangers.Using expanded bed adsorption, STREAMLINE product line, reduces the numberof operations in a process by fusing the function clarification, concentration andadsorption into one operation. It offers process developers the selectivity affordedby chromatography, the throughput of ultra-filtration and the convenience ofsmall scale centrifugation.

The molecular size of the sample componentsThe accessibility of the sample components to the charged groups will determinethe available capacity of the ion exchanger for those particular substances. All ofthe ion exchange media supplied by Pharmacia Biotech, with the exception of Sephadex based media, have exclusion limits for globular proteins in excess of 1 x 106.

Steric factors only affect the separation of charged solutes via their influence onthe available capacity for each substance. When choosing ion exchangers it isunnecessary to consider the possibility of gel filtration effects on the sample. Sam-ple molecules, although always larger than those of the eluent buffer, cannotmigrate ahead of the eluting buffer since they then encounter conditions whichfavour their re-binding to the matrix. Only uncharged solutes will be fractionatedaccording to size as in gel filtration. These uncharged molecules will normally beremoved during the initial isocratic elution phase which proceeds the applicationof the gradient.

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The exclusion limits for the different media and subsequent effects on availablecapacity are given in the relevant sections covering each gel type.

When working with samples of unknown molecular weight the use of MonoBeads, SOURCE and Sepharose based ion exchangers is recommended sincethey are particularly easy to handle and have good capacities over a large molecu-lar weight range.

Choice of exchanger groupSubstances are bound to ion exchangers when they carry a net charge opposite tothat of the ion exchanger. This binding is electrostatic and reversible.

In the case of substances which carry only one type of charged group the choice ofion exchanger is clear-cut. Substances which carry both positively and negativelycharged groups, however, are termed amphoteric and the net charge which theycarry depends on pH (Fig. 37). Consequently at a certain pH value an amphotericsubstance will have zero net charge. This value is termed the isoelectric point (pI)and at this point substances will bind to neither anion or cation exchangers. ThepH ranges in which the protein is bound to anion or cation exchangers and anarbitrary range of stability are shown in Figure 37.

Fig. 37. The net charge of protein as a function of pH.

The pH of the buffer thus determines the charge on amphoteric molecules duringthe experiment. In principle therefore, one could use either an anion or a cationexchanger to bind amphoteric samples by selecting the appropriate pH. In practicehowever, the choice is based on which exchanger type and pH give the best separa-tion of the molecules of interest, within the constraints of their pH stability.

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Methods for determining the optimum pH and corresponding ion exchanger typeare discussed later in this chapter.

Many biological macromolecules become denatured or lose activity outside a cer-tain pH range and thus the choice of ion exchanger may be limited by the stabilityof the sample. This is illustrated in Figure 37. Below its isoelectric point a proteinhas a net positive charge and can therefore adsorb to cation exchangers. Above itspI the protein has a net negative charge and can be adsorbed to anion exchangers.However, it is only stable in the range pH 5-8 and so an anion exchanger has to beused.

In summary:

1. If the sample components are most stable below their pI’s, a cation exchanger should be used.

2. If they are most stable above their pI’s, an anion exchanger should be used.

3. If stability is high over a wide pH range on both sides of pI, either type of ion exchanger can be used.

Determination of starting conditionsThe isoelectric pointThe starting buffer pH is chosen so that substances to be bound to the exchangerare charged. The starting pH should be at least 1 pH unit above the isoelectricpoint for anion exchangers or at least 1 pH unit below the isoelectric point forcation exchangers to facilitate adequate binding. Substances begin to dissociatefrom ion exchangers about 0.5 pH units from their isoelectric points at ionicstrength 0.1 M (15).

There are comprehensive lists of isoelectric points determined for proteins (16, 17)which can be useful in the design of ion exchange experiments.

If the isoelectric point of the sample is unknown, a simple test can be performed todetermine which starting pH can be used.

Test-tube method for selecting starting pH1. Set up a series of 10 test-tubes (15 ml).

2. Add 0.1 g Sephadex ion exchanger or 1.5 ml Sepharose or Sephacel ion exchanger to each tube.

3. Equilibrate the gel in each tube to a different pH by washing 10 times with 10 ml of 0.5 M buffer (see page 78 for choice of buffers for ion exchange). Use arange of pH 5-9 for anion and pH 4-8 for cation exchangers, with 0.5 pH unit intervals between tubes.

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4. Equilibrate the gel in each tube at a lower ionic strength (0.05 M for Sephadex or 0.01 M for Sepharose and Sephacel ion exchangers) by washing 5 times with 10 ml of buffer of the same pH but lower ionic strength.

5. Add a known constant amount of sample to each tube.

6. Mix the contents of the tubes for 5-10 minutes.

7. Allow the gel to settle.

8. Assay the supernatant for the substance of interest. The results may appear as shown in Figure 38 (a).

The pH to be used in the experiment should allow the substance to be bound, butshould be as close to the point of release as possible. If too low (or high) a pH ischosen, elution may become more difficult and high salt concentrations may haveto be used. In Figure 38 the buffer chosen should be pH 7.0.

Fig. 38. Test-tube methods for selecting ion exchange conditions.

Electrophoretic titration curves (ETC)While information on the pI of the sample components gives valuable indicationsconcerning the choice of starting conditions, it does not give a picture of how thecharge on the molecules varies with pH (Fig. 37), nor indicate at what pH or onwhich exchanger type maximum resolution could be expected.

Electrophoretic titration curves (Fig. 39) enable the determination of the chargepH relationship for the molecules present across a continuum of pH and are a par-ticularly useful way of predicting suitable conditions for an ion exchange separa-tion (18).

An electrophoretic titration curve is obtained by electrophoresis of the sample atright angles to a pH gradient in a horizontal slab gel of agarose or polyacrylamide(19, 20). The pH gradient is established in the gel by isoelectric focusing prior to

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Page 73: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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sample application. A schematicdescription of the various steps isshown in Fig. 40. A detailed descriptionof the method using PhastSystem elec-trophoresis systems is available uponrequest from Pharmacia Biotech.

Fig. 39. The electrophoretic titration curve of chicken breast muscle. (19)

Fig. 40. The major steps in making electrophoretic titration curves.

Electrophoresis of the sample perpendicular to the pH gradient produces a seriesof curves, unique for each component, since the relative electrophoretic mobilityof each component will be different depending on its net charge at given pH valu-es. The pH value where each curve intersects the line of sample application repre-sents the pH at which that particular component has a zero net charge, the pI forthat component.

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Prefocused ampholytesin a gel provides a stablepH gradient for electro-phoresis

Electrophoresis is performedperpendicular to the pH gradi-ent. Positively charged mole-cules migrate to the cathodeand negatively charged to theanode.

Electrophoretic mobilityof component B at pHvalues 5 and 9 correlateswith its net charge

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72

Fig. 41. Column selection based on electrophoretic titration curve analysis.

Maximum resolution can be expected at a pH where there is maximum separationbetween the titration curves for individual solutes, using the ion exchanger typeindicated by the charge of the molecules at that particular pH. At this pH the diffe-rence in electrophoretic mobilities and hence net charges between the species isgreatest. This principle is illustrated in Figure 41. The protein’s stability at the indi-cated pH must be taken into consideration before applying these conditions to theseparation.

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If maximum separation is observed at a pH where the sample molecules are positi-vely charged, i.e. below their isoelectric points, maximum resolution will be obtai-ned using a cation exchanger such as Mono S, SOURCE S or SP Sepharose FastFlow.

If the largest difference in electrophoretic mobility is found at a pH where thecomponents of interest are negatively charged, i.e. above their isoelectric points,an anion exchanger such as Mono Q, SOURCE Q or Q Sepharose Fast Flowshould be chosen.

If maximum separation of the curves occurs at the position of sample applicationi.e. at the isoelectric points of the molecules, then maximum resolution may beachieved using the technique of chromatofocusing. Further information on techni-ques and media for chromatofocusing is available on request.

Measurement of pH can be done using a surface electrode or by running pI cali-bration proteins as a narrow band at the top or bottom of the slab gel during thefirst dimension electrophoresis as the pH gradient is established in the gel. Thissection of the gel is removed and stained before the sample is applied for thesecond dimension electrophoresis and then afterwards replaced to estimate pHvalues.

Staining the titration curve with a general protein stain such as Coomassie Bluedoes not give any information about the charge/pH relationship for specific pro-teins unless they can be clearly identified by their isoelectric points. To gain positi-ve identification it is necessary to use a specific detection technique such as zymo-graphic analysis or immunofixation as illustrated in Figure 42.

In addition to information regardingoptimal starting conditions, the elec-trophoretic titration curves alsoreveal important information whichwill assist the interpretation of thechromatogram after the run.

Fig. 42. The electrophoretic titrationcurve of chicken breast muscle usingzymogram detection for creatine kinase.(19)

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Since the lines on the ETC reflect the degree of charge of the components at diffe-rent pH’s, the curves may be used to predict the order in which the componentswill be eluted from the column. The molecular species with the lowest electropho-retic mobility at a certain pH has logically the lowest charge at that particular pHand should be the first substance eluted from the column in the gradient. Similarlythe species showing highest electrophoretic mobility will be the most stronglyretained on a column of opposite charge and should be eluted last. The order inwhich solutes are eluted cannot be predicted with 100% certainty from the titra-tion curve since electrophoretic mobility depends on the total net charge on amolecule and ion exchange chromatography depends on the net charge on thesolutes surface.

Chromatographic titration curves (retention maps)For those ion exchanger types which allow rapid separations, optimal starting pHand choice of anion or cation exchanger can be determined using chromatographictitration curves (18).

In a specified salt gradient, the retention of particular molecular species is depen-dent upon the molecules net charge and charge density. These in turn depend uponthe pH of the eluent. The chromatographic titration curve is based on this rela-tionship between retention and buffer pH.

The methodology is extremely simple. The sample is analysed in a series of rapidseparations, carried out on a cation exchanger (Mono S) or an anion exchanger(Mono Q), using the same salt gradient but over a range of pH’s.

A plot is then made, for each separated peak, of elution salt concentration, elutiontime or elution volume against pH. This will produce a series of curves as illustra-ted in Fig. 43.

An analysis of this composite plot for the point of maximum separation will indi-cate at what pH and on which type of exchanger maximum resolution betweenany two or more components can be expected.

The conditions used (column type, buffers, pH, etc.) during the rapid runs for thegeneration of the chromatographic titration curves can be directly applied whendeveloping the final optimized procedure.

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Fig. 43. Chromatographic titration curves.

A280nm A280nm A280nm

C

B

A

C B

AC

B

A

Data from seven chromatograms plotted as chromatographictitration curves - A, B, C.

a)Mono SpH 3.0

b)Mono SpH 5.0

f)Mono QpH 11.0

Elution ionicstrength

Elution conc.

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a

b Mono S

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A

C

B

3 4 5 6

9 1110 12pH

d

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fMono Q

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Choice between strong and weak ion exchangersHaving selected a suitable starting pH to use on a cation or anion exchanger, it isnecessary to choose between a strong and weak ion exchange group. In those caseswhere maximum resolution occurs at an extreme of pH and the molecules of inter-est are stable at that pH, the choice is clearly to use a strong exchanger. The majo-rity of proteins however, have isoelectric points which lie within the range 5.5 to7.5 and can thus be separated on both strong and weak ion exchangers. Someadvantages in using a strong ion exchanger are discussed in Chapter 2.

Choice of bufferAs with the choice of ion exchanger, there are a number of variables which have tobe considered. These include:

1. The choice of buffer pH and ionic strength.

2. The choice of buffering substance.

3. The price of the buffer if it is to be used in production process.

Choice of buffer pH and ionic strengthThe choice of buffer pH has been discussed in the previous section. It should bepointed out, however, that in many applications the optimum separation may beachieved by choosing conditions so that major and troublesome contaminants arebound to the exchanger while the substance of interest is eluted during the washphase (21). This procedure is sometimes referred to as “starting state elution”.

Note: Concentration of sample does not occur with starting state elution.

The highest ionic strength which permits binding of the selected substances andthe lowest ionic strength that causes their elution should normally be used as thestarting and final ionic strengths in subsequent column experiments (i.e. the star-ting and limiting buffers for gradient elution). A third and higher ionic strengthbuffer is frequently employed as a wash step before column regeneration and re-use.

The required concentration of the start buffer will vary depending on the nature ofthe buffering substance. A list of some suitable buffers and suggested start concen-trations is shown in Table 19. In the majority of cases a starting ionic strength of atleast 10 mM is required to ensure adequate buffering capacity.

Salts also play a role in stabilizing protein structures in solution and so it is impor-tant that the ionic strength should not be so low that protein denaturation or pre-cipitation occurs. A major advantage of using Pharmacia Biotech ion exchangers isthat they have excellent capacities and so the initial ionic strength of the buffer canbe quite high without significantly affecting capacity for sample.

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In the case of pre-packed ion exchangers and columns which can be run conveni-ently quickly, trial experiments using salt gradients will allow the determination ofan optimal starting ionic strength.

In the case of Sephadex based exchangers for batch applications or where columnrunning times are prohibitively long, a simple test-tube technique is recommendedas a test for a suitable ionic strength.

Choice of buffer substanceIf the buffering ions carry a charge opposite to that of the functional groups of theion exchanger they will take part in the ion exchange process and cause local dis-turbances in pH. It is preferable, therefore, to use buffering ions with the samecharge sign as the substituent groups on the ion exchanger. There are of courseexceptions to this rule as illustrated by the frequency with which phosphate buf-fers are cited in the literature in connection with anion exchangers. In thoseinstances when a buffering ion which interacts with the ionic groups on the matrixis used, extra care must be taken to ensure that the system has come to equilibriumbefore application of sample.

In cases where substances purified by ion exchange chromatography have to befreeze dried it is advantageous to use volatile buffer systems. Examples of such sys-tems are shown in Table 20.

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Table 19. Buffer tables.

Buffer substances for cation exchange chromatography

pKa pH Substance Conc. dpKa/ Counter-ion Comments(25°C) interval (mM)dT (°C)

2.00 1.5-2.5 Maleic acid 20 Na+ Dicarboxylic acid2.88 2.38-3.38 Malonic acid 20 Na+/Li+ Dicarboxylic acid3.13 2.63-3.63 Citric acid 20 -0.0024 Na+ Dicarboxylic acid3.81 3.6-4.3 Lactic acid 50 Na+

*3.75 3.8-4.3 Formic acid 50 Na+/Li+

*4.21 4.3-4.8 Butanedioic acid 50 -0.0018 Na+

*4.76 4.8-5.2 Acetic acid 50 Na+/Li+

*5.68 5.0-6.0 Malonic acid 50 Na+/Li+ Dicarboxylic acid*7.20 6.7-7.6 Phosphate 50 -0.0028 Na+ Often needs

purification before use

*7.55 7.6-8.2 HEPES 50 -0.0140 Na+/Li+ Zwitterionic*8.35 8.2-8.7 BICINE 50 -0.0180 Na+ Zwitterionic

Buffer substances for anion exchange chromatography

pKa pH Substance Conc. dpKa/ Counter-ion Comments(25°C) interval (mM)dT (°C)

*4.75 4.5-5.0 N-methyl 20 -0.015 Cl-

piperazine*5.68 5.0-6.0 Piperazine 20 -0.015 Cl-/HCOO-

*5.96 5.5-6.0 L-histidine 20 Cl-

*6.46 5.8-6.4 bis-Tris 20 -0.017 Cl-

*6.80 6.4-7.3 bis-Tris propane 20 Cl-

*7.76 7.3-7.7 Triethanolamine 20 -0.020 Cl-/CH3COO-

*8.06 7.6-8.0 Tris 20 -0.028 Cl- Often needspurification before use and

*8.52 8.0-8.5 N-methyl- 50 -0.028 SO2-/Cl-/ especially

diethanolamine CH3COO- sensitive totemperature

*8.88 8.4-8.8 Diethanolamine 20 at pH 8.4 -0.025 Cl- change.50 at pH 8.8

*8.64 8.5-9.0 1,3-diamino- 20 -0.031 Cl-

propane*9.50 9.0-9.5 Ethanolamine 20 -0.029 Cl-

*9.73 9.5-9.8 Piperazine 20 -0.026 Cl-

*10.47 9.8-10.3 1,3-diamino- 20 -0.026 Cl-

propane11.12 10.6-11.6 Piperadine 20 -0.031 Cl-

12.33 11.8-12.0 Phosphate 20 -0.026 Cl-

* Recommended on the basis of experiments performed in our laboratories.

+0.0002

+0.0002

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Table 20. Volatile buffer systems.

pH Substance Counter-ion

2.0 Formic acid H+

2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO-

3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO-

3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3OO-

4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO-

6.8-8.8 Trimethylamine/HCl Cl-

7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO-

8.5-10.0 Ammonia/acid CH3COO-

7.0-12.0 Trimethylamine/CO2 CO3-

7.0-12.0 Triethylamine/CO2 CO3-

7.9 Ammonium bicarbonate HCO3-

8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO3-

8.5-10.5 Ethanolamine/HCl Cl-

8.9 Ammonium carbonate CO3-

Test-tube method for selecting starting ionic strengths1. Set up a series of tubes with ion exchanger as detailed on page 69.

2. Equilibrate the gel in each tube with 0.5 M buffer at the selected starting pH (10 x 10 ml washes).

3. Equilibrate the gel in each tube to a different ionic strength, at constant pH, using a range from 0.05 M to 0.5 M NaCl for Sephadex ion exchangers and from 0.01 M to 0.3 M NaCl for Sephacel and Sepharose ion exchangers. This will require 5 x 10 ml washes. Intervals of 0.05 M NaCl are sufficient.

4. Add sample, mix and assay the supernatant to determine the maximum ionic strength which permits binding of the substance of interest and the minimum ionic strength required for complete desorption.

In the hypothetical example shown in Figure 38 (b) the ionic strength for samplebinding (start buffer) would be at most 0.15 M and for elution at least 0.3 M.

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10. Experimental TechniqueThere are three ways of performing an ion exchange separation: by column chro-matography, by batch methods, and by expended bed adsorption. This section willmostly deal with column chromatography.

Column chromatographyChoice of column

Good results in column chromatography are not solely dependent on the correctchoice of gel media. The design of the column and good packing technique are alsoimportant in realising the full separation potential of any gel. These factors arebuilt into the pre-packed columns supplied by Pharmacia Biotech and should beconsidered before packing a chromatography column in the laboratory.

Column designThe material used in the construction of the column should be chosen to preventdestruction of labile biological substances and minimize non-specific binding toexposed surfaces. The bed support should be designed so it is easily exchangeableto restore column performance whenever contamination and/or blockage in thecolumn occurs. Bed supports made from coarse sintered glass or glass wool cannotbe recommended because they soon become clogged, are difficult to clean andcause artifacts (22). Dead spaces must be kept to a minimum to prevent re-mixingof separated zones.

The pressure specifications of the column have to match the back-pressure genera-ted in the packed bed when run at optimal flow rate. This is particularly importantwhen using high performance media with small bead size.

Pharmacia Biotech has developed a series of standard columns suitable for ionexchange chromatography. All are easy to dismantle and reassemble to allow tho-rough cleaning, which is a particularly important aspect when handling biologicalsamples.

Further information on the full range of Pharmacia Biotech chromatographycolumns are available upon request.

Larger chromatography columns, specially designed for pilot and process scalechromatography are also available. Some aspects regarding process scale columnsare described in Chapter 11.

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Column dimensionsAs for most adsorptive, high selectivity techniques, ion exchange chromatographyis normally carried out in short columns. A typical ion exchange column is packedto a bed height of 5-15 cm. Once the separation parameters have been determined,scale-up is easily achieved by increasing the column diameter.

Quantity of ion exchangerThe amount of ion exchanger required for a given experiment depends on theamount of sample to be chromatographed and on the available or dynamic capaci-ty of the ion exchanger for the sample substances. For the best resolution in ionexchange chromatography, it is not usually advisable to use more than 10-20% ofthis capacity, although this value can be exceeded if resolution is adequate. Thecapacity data given for each specific ion exchanger in respective product Chapterserves as a guideline for calculating the required amount of ion exchanger neededfor a given experiment.

Preparation of the ion exchangerHaving chosen the appropriate ion exchanger and starting buffer it is essentialthat the exchanger is brought to equilibrium with start buffer before sample appli-cation. Preparation of Sephadex ion exchangers, which are supplied as powders,differs somewhat from the other ion exchangers available from Pharmacia Bio-tech, which are supplied pre-swollen and/or pre-packed.

Pre-swollen ion exchangersSOURCE, Sepharose based, and DEAE Sephacel ion exchange media are suppliedready to use. To prepare the gel, the supernatant is decanted and replaced withstarting buffer to a ratio of approximately 75% settled gel to 25% buffer.

If large amounts of ion exchangers are to be equilibrated with a weak buffer, theion exchanger should first be equilibrated with a 10 times concentrated buffersolution at the correct pH, and then with a few volumes of starting buffer.

Pre-packed ion exchange mediaMiniBeads and MonoBeads are supplied pre-packed in PC and HR columnsrespectively. SOURCE 15 are available pre-packed and ready to use in RESOURCE columns, 1 or 6 ml. Pre-packed HiLoad columns are XK Columnspre-packed with Sepharose Fast Flow and Sepharose High Performance ionexchangers. Sepharose High Performance ion exchangers are also available pre-packed in HiTrap columns, 1 and 5 ml. For pilot scale applications, Mono Q,Mono S and Q Sepharose High Performance are available in pre-packed BioPilot

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Columns of 100 ml(35/100) and 300 ml (60/100). SP Sepharose High Performan-ce pre-packed in BioPilot Columns are available on request. For the above mentio-ned pre-packed columns, the preparation consists of washing out the 20% ethanolpacking solution with 5 column volumes of start buffer.

Sephadex ion exchangersSephadex ion exchangers should be swollen at the pH to be used in the experi-ment. Complete swelling takes 1-2 days at room temperature or 2 hours (at pH 7)in a boiling water bath. Swelling at high temperature also serves to de-aerate thegel. Vigorous stirring (e.g. with a magnetic stirrer) and swelling in distilled watershould be avoided due to the risk of damaging the beads.

The required amount of ion exchanger should be stirred into an excess of startingbuffer. Remove the supernatant and replace with fresh buffer several times duringthe swelling period. Instead of decantation, the ion exchanger can be washedextensively on a Büchner funnel after the initial swelling.

Alternative counter-ionsIf ion exchangers are to be used with counter-ions other than those supplied (i.e.other than sodium or chloride) then the following procedure should be used.

Suspend the required amount of ion exchanger in and excess of 0.5-1.0 M solutionof a salt of the new counter-ion. After sedimentation and decantation, re-suspendthe ion exchanger in the buffer to be used in the experiment. Decant and re-suspendthe ion exchanger in this buffer several times.

Decantation of finesDecantation of fines is not necessary with any Pharmacia Biotech ion exchangers.

Packing the columnAs with any other chromatographic technique, packing is a very critical stage in anion exchange experiment. A poorly packed column gives rise to poor and unevenflow, zone broadening, and loss of resolution.

Detailed packing instructions are to be found in the instructions supplied withrespective media.

Column Packing Video FilmA video film describing the correct methodologies for packing laboratory columnsis available and can be ordered from your local distributor of Pharmacia Biotechproducts.

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Checking the packingThe bed should be inspected for irregularities or air bubbles using transmittedlight from a lamp held behind the column. Be careful in the choice of any dye sub-stances used for checking beds as many of them are strongly charged. For exam-ple, Blue Dextran 2000 binds strongly to anion exchangers.

Testing the bed is easily done by injecting a test substance on the column and cal-culating the number of theoretical plates (N) or the height equivalent to a theoreti-cal plate (H).

Choose a test substance which shows no interaction with the media and which hasa low molecular weight, to give full access to the interior of the beads.

Acetone at a concentration of 1% (v/v) can be used with all kinds of chromato-graphic media and is easily detected by UV-absorption. Keep the sample volumesmall to ensure a narrow zone when the sample enters the top of the column. Foroptimal results, the sample volume should be ²0.5% of the column volume for acolumn packed with a medium of approximately 30 µm bead diameter and ² 2%of the column for a column packed with a medium of approximately 100 µm beaddiameter. Keep the linear flow rate low to reduce zone spreading due to non-equi-librium at the front and rear of the zone. For 30 µm media the flow rate should bebetween 30-60 cm/h and for 100 µm media, 15-30 cm/h. Use the following equa-tions to calculate the number of theoretical plates (N) and the hight equivalent to atheoretical plate (H).

H = L/N

where

VR is the volume eluted from the start of sample application to the peak maximumand wh is the peak width measured as the width of the recorded peak at half of thepeak height, see Figure 44. L is the height of the packed bed.

Measurements of VR and wh can be made in distance (mm) or volume (ml) butboth parameters must be expressed in the same unit.

N = 5.54 x2

VR

wh)(

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Fig 44. A UV trace for acetone in a typical test chromatogramshowing the HETP and Asvalue calculations.

As a general rule of thumb, a good H value is about two to three times the meanbead diameter of the gel being packed. For a 90 µm particle packing, this meansan H value of 0.018-0.027 cm.

Another useful parameter for testing the packed bed is the symmetry factor (As)

As =

wherea = 1st half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)b = 2nd half peak width at 10% of peak height. (see Figure 44)

As should be as close as possible to 1. A reasonable As value for a short columnsuch as an IEX column is 0.80-1.80. (For longer gel filtration columns it will pro-bably fall within 0.70-1.30).

An extensive leading edge is usually a sign that the gel has been packed too tightlyand extensive tailing is usually a sign that the gel has been packed too loosely.

Equilibrating the bedRun at least two bed volumes of buffer through the ion exchange bed to allow thesystem to reach equilibrium. Counter-ion concentration, conductivity, and pH ofthe eluent should be checked against the ingoing solution. It is often sufficient justto measure the pH of the effluent.

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Sample preparationSample concentrationThe amount of sample which can be applied to a column depends on the dynamiccapacity of the ion exchanger and the degree of resolution required. For the bestresolution it is not usually advisable to use more than 10-20% of this capacity(23). Information on the available capacities for the different exchangers is givenin the relevant product sections. Methods for determining available and dynamiccapacities are given later in this chapter.

Sample compositionThe ionic composition should be the same as that of the starting buffer. If it is not,it can be changed by gel filtration on Sephadex G-25 using e.g. Pharmacia BiotechDisposable Column PD-10, Fast Desalting Column HR 10/10 or HiTrap DesaltingColumns, dialysis, diafiltration or possibly by addition of concentrated start buffer.

Sample volumeIf the ion exchanger is to be developed with the starting buffer (isocratic elution),the sample volume is important and should be limited to between 1 and 5% of thebed volume. If however, the ion exchanger is to be developed with a gradient, star-ting conditions are normally chosen so that all important substances are adsorbedat the top of the bed. In this case, the sample mass applied is of far greater impor-tance than the sample volume. This means that large volumes of dilute solutions,such as pooled fractions from a preceding gel filtration step or a cell culture super-natant can be applied directly to the ion exchanger without prior concentration.Ion exchange thus serves as a useful means of concentrating a sample in additionto fractionating it.

If contaminants are to be adsorbed, and the component of interest is allowed topass straight through, then the sample volume is less important than the amountof contaminant which is present. Under these conditions there will be no concen-tration of the purified component, rather some degree of dilution due to diffusion.

Sample viscosityThe viscosity may limit the quantity of sample that can be applied to a column. Ahigh sample viscosity causes instability of the zone and an irregular flow pattern.The critical variable is the viscosity of the sample relative to the eluent. A rule ofthumb is to use 4 cP as the maximum sample viscosity. This corresponds to a pro-tein concentration of approximately 5%. Approximate relative viscosities can bequickly estimated by comparing emptying times from a pipette.

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If the sample is too viscous, due to high solute concentration, it can be dilutedwith start buffer. High viscosity due to nucleic acid contaminants can be alleviatedby precipitation with a poly-cationic macromolecule such as polyethyleneimine orprotamine sulphate. Nucleic acid viscosity can also be reduced by digestion withendonuclease. Such additives may however be less attractive in an industrial pro-cess since they will have to be proven absent from the final product.

Sample preparationIn all forms of chromatography, good resolution and long column life time dependon the sample being free from particulate matter. It is important that “dirty” sam-ples are cleaned by filtration or centrifugation before being applied to the column.This requirement is particularly crucial when working with small particle matri-ces, such as MiniBeads (3µm), MonoBeads (10 µm), SOURCE (15 and 30 µm) and Sepharose High Performance (34µm).

The “grade” of filter required for sample preparation depends on the particle sizeof the ion exchange matrix which will be used. Samples which are to be separatedon a 90 µm medium can be filtered using a 1 µm filter. For 3, 10, 15, 30 and 34 µmmedia, samples should be filtered through a 0.45 µm filter. When sterile filtrationor extra clean samples are required, a 0.22 µm filter is appropriate.

Samples should be clear after filtration and free from visible contamination bylipids. If turbid solutions are injected onto the column, the column lifetime, resolu-tion and capacity can be reduced. Centrifugation at 10 000 g for 15 minutes canalso be used to prepare samples. This is not the ideal method of sample prepara-tion but may be appropriate if samples are of very small volume or adsorb non-specifically to filters.

Note: The latter may indicate that the substance in question may also adsorbstrongly to chromatography matrices. Care should therefore be taken and perhapsa buffer additive such as glycerol or a detergent used.

Crude samples containing lipids, salts, etc. can be passed through a suitably sizedcolumn of Sephadex G-25 e.g. Pharmacia Biotech Desalting Column PD-10, FastDesalting Column HR 10/10 or HiTrap Desalting Column. Preliminary sampleclean-up can be achieved simultaneously in this way.

In expanded bed adsorption sample preparation is not as crucial as for columnchromatography. Samples can be applied directly to the expanded bed withoutprior sample preparation, e.g. filtration, centrifugation etc. (Expanded bedadsorption is described in detail on page 98.)

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Sample applicationThere are a number of ways to apply the sample.

Sample application with an adaptorThis is the recommended method for all ion exchange media with the exception ofSephadex based media and is always the method used with pre-packed columns orwhen upward elution is employed. The sample may be applied to the column viathe adaptor in one of the following ways.

Sample loops are a convenient way ofapplying small samples in a reproducible manner without interrupting the liquidflow on the column. Sample loops can beused in conjunction with LV-4 or SRV-4 valves (Fig. 45) or in conjunction with the manual valves V-7 and IV-7 or the motor-ized valves MV-7 and IMV-7 (Fig. 46).

Fig. 45. Sample application using an SA-5 in a sample loop system.

Sample applicators SA-5, SA-50. These are reservoirs which, used in combinationwith a suitable valve, e.g. SRV-4, allow the sample to be introduced via a closedsample loop system using a pump (Fig. 45). As well as their large capacity (up to 6ml for the SA-5 and 45 ml for the SA-50) the sample applicator offers the advanta-ge of serving as a pulse damper and bubble trap.

Fig. 46. Sample application using V-7, IV-7 or motorized MV-7 or IMV-7 valves.

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SRV-1

To column

SRV-4

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Page 90: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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Superloops can be used together with the manual valves V-7 and IV-7 or the moto-rised valves MV-7 and IMV-7 when larger volumes of sample have to be applied(Fig. 47). Superloops are available with capacities of 10, 50 and 150 ml. (The 150ml Superloop is most often used in BioPilot System.)

Fig. 47. Sample application using a Superloop.

Syringe method (Fig. 48). The valves LV-3 and LV-4 can be used as syringe holdersto give a very simple method for the application of small samples in standard chro-matography. Using this method the sample is allowed to run onto the columnunder gravity.

Fig. 48. Sample application using a syringe.

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Sample reservoir (Fig. 49). In a similar way, a sample reservoir (e.g. R9, RK 16/26)can be connected via a 3-way valve to apply larger samples.

Fig. 49. Sample application using a reservoir. This is also an example of upward elution.

Other methods of sample applicationThe following methods can be used with Sephadex based ion exchangers where itis not recommended to use an adaptor due to the variability of the bed height.They are not recommended for the more rigid ion exchanger types.

Sample application onto a drained bedThis method requires the least equipment but is very difficult to do well. Alloweluent to drain to the bed surface, then pipette the sample onto the gel surface andallow it to drain into the gel. When all the sample has entered the bed, the top ofthe column is washed with aliquots of starting buffer and is connected up for elu-tion. The drawback with this system is that disturbances to the bed surface resultin uneven sample application and band skewing.

Sample application under the eluentHere excess eluent is left on top of the column. Some very thin capillary tubing isattached to a syringe and the free end is flared by gentle heating. The syringe is filled with sample which is then layered on top of the bed by positioning the end of

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the tubing just above the surface and slowly pressing out the sample. Note that thesample must be denser than the eluent or made denser by the addition of a sugar,e.g. glucose (24). The column can then be connected for elution.

ElutionIf starting conditions are chosen such that only unwanted substances in the sampleare adsorbed, then no change in elution conditions is required since the substanceof interest passes straight through the column. Similarly no changes are required ifsample components are differentially retarded and separated under starting condi-tions. This procedure is termed isocratic elution, and the column is said to be deve-loped under starting conditions. Isocratic elution can be useful since no gradientapparatus is required for the run and, if all retarded substances elute, regenerationis not required.

Normally, however, separation and elution are achieved by selectively decreasingthe affinity of the solute molecules for the charged groups on the gel by continu-ously changing either buffer pH or ionic strength or possibly both. This procedureis termed gradient elution.

Change of pHAs shown in Figure 37 on page 68, the net charge on a molecule depends on pH.Thus altering the pH towards the isoelectric point of a substance causes it to loseits net charge, desorb, and elute from the ion exchanger. Figure 50 shows use of adecreasing pH gradient in separation of haemocyanin fractions (25).

Fig. 50. Elution pattern of whole stripped haemocyanin on DEAE Sepharose CL-6B. Sample applied in 0.1 M sodium phosphate buffer pH 6.8 and eluted with decreasing pH gradient (25). (Reproduced by kindpermission of the authors and publisher.)

Since many proteins show minimum solubility in the vicinity of their isoelectricpoints, care and precautions must be exercised to avoid isoelectric precipitation onthe column. The solubility of the sample components at the pH and salt concen-trations to be used during separation should always be tested in advance.

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Change of ionic strengthAt low ionic strengths, competition forcharged groups on the ion exchanger isat a minimum and substances are boundstrongly. Increasing the ionic strength increases competition and reduces theinteraction between the ion exchangerand the sample substances, resulting intheir elution. Figure 51 shows the elu-tion of mouse IgM on SP Sepharose FastFlow using a concentration gradient ofNaCl.

Fig. 51. Isolation of mouse IgM onSP Sepharose Fast Flow. (Courtesy of Dr. H. F. J. Savelkoul, Erasmus University, Rotterdam, The Netherlands.)

Gradient directionGuidelines for the choice of ascending or descending gradients are given in Table 21.

Table 21. Choosing the direction of the gradient for elution.

Direction of Direction ofIon exchanger pH gradient ionic strength gradient

Anion exchanger decreasing increasing

Cation exchanger increasing increasing

Choice of gradient typeThe components in the sample usually have different affinities for the ionexchanger and so variations in the pH and ionic strength of the eluent can causetheir elution at different times and thus their separation from each other. One canchoose to use either continuous or stepwise gradients of pH or ionic strength.

Stepwise pH gradients are easier to produce and are more reproducible than linearpH gradients. In the case of weak ion exchangers the buffer may have to titrate theion exchanger and there will be a short period of re-equilibration before the newpH is reached. Gradients of pH can be also used in combination with ionicstrength gradients.

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Stepwise ionic strength gradients are produced by the sequential use of the samebuffer at different ionic strengths. Stepwise elution is technically simple and offersthe potential of high resolution in preparative applications. Care must be exerci-sed in the design of the steps and the interpretation of results since substances elu-ted by a sharp change in pH or ionic strength elute close together. Peaks tend tohave sharp fronts and pronounced tailing since they frequently contain more thanone component. Tailing may lead to the appearance of false peaks if a buffer chan-ge is introduced too early. For these reasons a first separation using a continuousgradient is always recommended as a means of characterising the sample and anindication of suitable steps. The differences between continuous and stepwise gra-dient elution are shown in Figure 52.

Continuous pH gradients are difficult to produce at constant ionic strength, sincesimultaneous changes in ionic strength, although small, also occur. Linear pH gra-dients cannot be obtained simply by mixing buffers of different pH in linear volu-me ratios since the buffering capacities of the systems produced are pH dependent.A relatively linear gradient can be produced over a narrow pH interval (Max. 2 pH units) by mixing two solutions of the same buffer salt adjusted, respectively,to 1 pH unit above and 1 pH unit below the pKa for the buffer.

Fig. 52. Continuous and stepwise gradient elution of b-galactosidase from Escherichia colion Mono Q HR 5/5 (26). (Reproduced by kind permission of the authors and publisher.)

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Continuous ionic strength gradients are the most frequently used type of elution inion exchange chromatography. They are easy to prepare and very reproducible.Two buffers of differing ionic strength, the start and limit buffers, are mixed toget-her and if the volume ratio is changed linearly, the ionic strength changes linearly.

The limit buffer may be of the same buffer salt and pH as the start buffer, but athigher concentration, or the start buffer containing additional salt e.g. NaCl.

Gradient elution generally leads to improved resolution since zone sharpeningoccurs during elution. In all forms of isocratic elution, a limiting factor withregards to achievable resolution is zone broadening as a result of longitudinal dif-fusion. In gradient elution, the leading edge of a peak is retarded if it advancesahead of the salt concentration or pH required to elute it. In contrast the trailingedge of the peak is exposed to continuously increasing eluting power. Thus thetrailing edge of the peak has a relatively higher speed of migration, resulting inzone sharpening, narrower peaks and better resolution.

Gradient elution also reduces zone broadening by diminishing peak tailing due tonon-linear adsorption isotherms.

Resolution using a continuous gradientTo optimize a separation it is important first to consider the objectives of the expe-riment, since the desired features of a separation i.e. speed, resolution and capaci-ty, are often mutually exclusive. In the case of ion exchange separations the speedof separation is not solely related to the flow rate used in the experiment but alsoto the steepness or slope of the gradient applied.

Novotny (27) has shown that the retention of charged molecules on an ionexchange column is related to the volume of the column and the molarity differen-ce across it. This means that long shallow gradients will give maximum separationbetween peaks but that the separation time will be longer and peak broadeninglarger. In contrast short steep gradients will give faster separations and sharperpeaks but the retention differences between peaks will be reduced. The effect ofgradient slope on resolution is illustrated in Figure 53.

It should be remembered that the sample loading also has a major influence onresolution since the width of the peaks is directly related to the amount of substancepresent.

In practice it is recommended that trial experiments be carried out to allow theselection of optimal run parameters in terms of gradient shape and length.

As a general rule a gradient of 0.05 to 0.5 M salt over a volume of 10 to 20column volumes at the flow rate recommended for the medium (see individualmedia sections) can be used for initial investigative separations.

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Fig. 53. Effect of gradient slope on resolution. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden).

Choice of gradient shapeLinear Gradients. It is strongly recommended that initial experiments with a newseparation problem be carried out using linear gradient elution. The results obtai-ned can then serve as a base from which optimization can be planned. If betterresolution is required then the separation can be improved by altering the shape orslope of the gradient.

Convex gradients can be used to improve resolution in the last part of the gradientor to speed up a separation when the first peaks are well separated and the last feware adequately separated.

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Page 97: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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Concave gradients can be used to improve resolution in the first part of the gradi-ent or to shorten the separation time when peaks in the latter part of the gradientare more than adequately separated.

Complex gradients can be generated to use the maximum resolution offered byisocratic resolution when required combined with steeper gradient portions whereresolution is adequate or unnecessary (Fig. 54). Complex gradients offer the maxi-mum flexibility in terms of combining resolution with speed during the same sepa-ration. A knowledge of the chromatographic behaviour of the sample obtainedfrom previous separations using simpler gradients is essential.

Fig. 54. Anion exchange chroma-tography of a mixture of pyridine nucleotides on Mono Q (28): Sample, 100 µl of 100 µM NAD, 100 µM NADH, 250 µM NADP and 250 µM NADPH; column, Mono Q HR 5/5; buffer A, 20 mM triethanolamine, pH 7.7; buffer B, buffer A with 1.0 M KCl; gradient, 0% B for 2 ml,0-20% B in 15 ml, 20-100% B in 5 ml, 100% B for 3 ml; flow rate, 1 ml/min.

Sample displacementWhen a sample of solutes, such as proteins, is applied to the top of an ionexchange column the species with the highest charge density will bind at the top,displacing more weakly bound species or preventing such from binding.

In effect a degree of separation occurs on the column during sample loading, withthe solutes stacked on the column in order of their relative charges and strengthsof binding.

On application of a gradient the increasing salt concentration will cause the mostweakly bound molecules to migrate and leave the column first. For this reason“reverse flow elution” should never be used in the ion exchange separation ofcomplex mixtures. Under such conditions early desorbing substances would haveto migrate through all other bound species, possibly displacing them, and lead tolost resolution.

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Gradient generationAccurate and reproducible pH and ionic strength gradients are best formed usingpurpose designed equipment. The choice of gradient generating system willdepend upon the type of ion exchange media and the required complexity of thegradient.

Gradient formation with two pumps or a single pump in combina-tion with a switch valveMaximum flexibility in terms of gradient production is achieved by using twoseparate pumps for start and limit buffers or a single pump in combination with aswitch valve.

Using gradient programmers, e.g. GP-250 Plus or LCC-501 Plus, or using chroma-tography systems which are controlled via a controlling software, e.g. UNICORNand FPLCdirector, the proportions of the start and limit buffers which constitutethe eluent being supplied to the column are programmed for specific times or volu-mes during the separation. The relative amounts of start and limit buffer thenincrease or decrease in a linear fashion between two such “breakpoints” to produ-ce the gradient. The more breakpoints which have been programmed the morecomplex the gradient.

Further information on controlling software, gradient programmers and relatedpump systems is available from Pharmacia Biotech.

Gradient MixerThe Pharmacia Gradient Mixer GM-1can be used to make linear ionic strengthor pH gradients of up to 500 ml in volume (Fig. 55). The mixing chambershould contain the starting buffer andthe other chamber the limiting buffer. Although the Gradient Mixer GM-1 willnot produce linear pH gradients it can beused to form reproducible continuouspH gradients from two solutions of different pH and similar ionic strength.

Fig. 55. Gradient elution system using the Gradient Mixer GM-1.

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An example of a decreasing pH gradient produced by the Gradient Mixer GM-1is shown in Figure 56. The gradient was produced from 0.1 M solutions of Tris(free base), pH 10.5 and Tris-HCl, pH 7.5.

Usually changes in pH also produce small changes in ionic strength. These can be estimated by monitoring conductivity.

Fig. 56. Gradient from pH 10.5 to 7.5 in 400 ml produced using the Gradient Mixer GM-1.pH –, conductance - - -. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Batch separationThere is essentially no difference in separation procedure between a column deve-loped by stepwise elution and a batch procedure. Either the substance of interestor contaminants may be attached to the ion exchanger.

Although batch procedures are less efficient than column techniques they mayoffer advantages in particular cases. When very large sample volumes with lowprotein concentration have to be processed, the sample application time on acolumn can be very long and filtration of such a large sample can also be ratherdifficult to perform. Binding the sample in batch mode will be much quicker andthere will be no need to remove particulate matter.

A batch procedure can also be an attractive approach if high sample viscositygenerates high back-pressure in a column procedure or if high back-pressure isgenerated by contaminants such as lipids, which may cause severe fouling andclogging of the column.

Batch separation is a very rapid technique and no technical difficulties are causedby the swelling or shrinkage of Sephadex ion exchangers. The shrinkage may evenbe an advantage in some applications.

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When working with batch ion exchange, the starting conditions are selected in thesame way as in column chromatography, i.e. choose buffer pH an ionic strength tobind the substance of interest but to prevent as many contaminants as possiblefrom binding.

To maximize recovery, the starting conditions should be selected so that the pro-tein of interest binds much stronger than is usual in column chromatography.Unless the proteins adsorbs to 100%, losses during subsequent washing will beinevitable, especially if the volume of liquid is large compared to the volume ofadsorbent. To keep recovery high, the pH in a batch experiment may have to beseveral units away from the isoelectric point of the protein.

Batch separation is carried out by stirring the ion exchanger previously equilibra-ted in the appropriate buffer with the solution to be treated until the mixture hasreached equilibrium. This usually takes about one hour. The slurry is then filteredand washed with the buffer solution. In cases of incomplete adsorption this proce-dure should be repeated on the filtrate with a new batch of ion exchanger. Thenelution buffer is added (1-2 times the volume of the sedimented gel) and stirreduntil desorption is complete, which can take up to 30 minutes or more. Finally,suction is used to filter the buffer containing the desorbed product of interest fromthe adsorbent. The gel can also be packed in a column after the washing step andbe eluted stepwise in the same way as during normal column chromatography.Resolution will however be lower for such a combined batch and column proce-dure compared with a normal column procedure, since the sample is bound uni-formly throughout the gel slurry and the subsequent chromatographic bed.Under these conditions stepwise elution is recommended since gradient elutionwill give broad bands and poor resolution.

Batch chromatography is very useful for concentrating dilute solutions and sepa-rating the substances of interest from gross contaminants during the initial stagesof a purification scheme.

Note: Fines will be generated if the ion exchangers are stirred too vigorously. Thiswill increase the time required for filtration.

Expanded bed adsorptionExpanded bed adsorption is a unit operation that uses STREAMLINE adsorbentsand columns for recovering proteins directly from crude samples. Proteins arerecovered in a single pass without the need for prior clarification. STREAMLINEhas proven effective in purification proteins from fermentation or cell culture inextracellular processes, and has demonstrated its suitability when used with brothfrom cell lysis and homogenization in intracellular processes with soluble proteins.STREAMLINE reduces the number of operations in a process by fusing the func-tions of clarification, concentration and capture (see page 109) in one operation.

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It offers the selectivity afforded by chromatography, the throughput of ultra-filtra-tion and the convenience of small scale centrifugation.

Crude feed from the fermentor containing the desired product and undesired cells,cell debris and particulates is applied to the expanded bed. Target products arebound by the adsorbent while particulates and contaminants pass through unhin-dered. The desired molecule is then eluted as in packed bed chromatography.

Expanded bed technologyExpanded bed adsorption is based on fluidization. The sedimented bed begins toexpand as the adsorbent particles are raised by an upward liquid flow. The diffe-rence between a fluidized bed and expanded bed is that in an expanded bed theadsorbent particles display very little back-mixing. This is achieved through theunique design of the column and the adsorbents. The column has a special flowdistributor at the bottom, the adsorbent particles have a well-defined size and den-sity distribution. The particles are kept in suspension by the balance betweenupward flow rate and particle sedimentation velocity. As the bed expands with theupward liquid flow, the movement of any given particle is very small. This createsa stable, homogeneous expanded bed and a liquid flow which is characterized by aconstant velocity profile, i.e. plug flow. The stability of the expanded bed giveSTREAMLINE characteristics that are similar to those of a packed bed in chromatography.

Basic principle of operation 1. STREAMLINE adsorbent is poured into STREAMLINE column and allowed

to sediment (Fig. 57 a).

2. An upward liquid flow of equilibration buffer is applied to the column and STREAMLINE adsorbent particles are suspended in the flow, creating a stable fluidized bed (Fig. 57 b).

3. The sample, a mixture of soluble proteins, contaminants, cells, or cell debris, is passed upwards through the expanded bed. The target proteins are bound on STREAMLINE adsorbent while particulates and contaminants pass through the expanded bed unrestricted. Loosely bound material is washed out with the upward flow of the buffer (Fig. 57 c).

4. The liquid flow is reversed to downward flow. By using suitable buffer conditions, the bound proteins are eluted from STREAMLINE adsorbent in a sedimented bed mode. The eluate contains the target proteins, increased in concentration, free from particulates and ready for further purification (Fig. 57 d).

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Fig. 57. The principle ofoperation of expandedbed adsorption.

STREAMLINE adsorbentsSTREAMLINE adsorbents are described in detail in Chapter 6.

STREAMLINE columnsSTREAMLINE columns are designed to suit the different stages of process deve-lopment. STREAMLINE 50 column is designed for method optimization. A set-upwith this column can handle 1-20 l from the fermentor at a throughput of 6 l/h. Aset-up with STREAMLINE 200 column, for pilot scale and verification of theoptimized methods, can handle 50-300 l of sample at a throughput of 100 l/h.STREAMLINE CD column, custom designed for industrial manufacturing, canhandle production volumes of samples at a throughput of several thousands oflitres per hour.

Auxiliary equipmentTo operate expanded bed adsorption in method optimization some auxiliary equ-ipment is needed. For example, a peristaltic pump, manual valves, UV, pH andconductivity monitors and a recorder, all standard laboratory equipment. For production installations STREAMLINE is engineered to your specifications.

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a b c d

Buffer Feed Eluate

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RegenerationAfter each cycle, bound substances must be washed out from the column to resto-re the original function of the media. Ion exchange adsorbents can normally beregenerated after each run by washing with a salt solution until an ionic strengthof about 2 M has been reached. This should remove any substances bound byionic forces. The salt should contain the counter-ion to the ion exchanger to facili-tate equilibration.

To prevent a slow build up of contaminants on the column over time, more rigo-rous cleaning protocols may have to be applied on a regular basis, see below.

Cleaning, sanitization and sterilization procedures

CleaningCleaning-in-place (CIP) is the removal from the purification system of very tightlybound, precipitated or denatured substances generated in previous purificationcycles. In some applications, substances such as lipids or denatured proteins mayremain in the column bed instead of being eluted by the regeneration procedure. Ifcontaminants accumulate on the column over a number of purification cycles,they may affect the chromatographic properties of the column. If fouling is severe,it may also block the column, increasing the back-pressure and reducing the flowrate.

A specific CIP protocol should be designed according to the type of contaminantsthat are known to be present in the sample. NaOH is a very efficient cleaningagent that can be used for solubilizing irreversibly precipitated proteins and lipids.NaOH can effectively be combined with solvent or detergent based cleaning methods.

SanitizationSanitization is the inactivation of microbial populations. When a packed columnis washed with a sanitizing agent, the risk of contaminating the purified productwith viable micro-organisms is reduced. The most commonly used sanitizationmethod in chromatography today is to wash the column with NaOH. NaOH hasa very good sanitizing effect and also has the addition advantage of cleaning thecolumn.

SterilizationSterilization, which is not synonymous with sanitization, is the destruction or eli-mination of all forms of microbial life in the system.

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Protocols for cleaning-in-place (CIP), sanitization and sterilization.

Suggested protocols for cleaning-in-place (CIP), sanitization and sterilization thatcan be applied to each specific ion exchanger from Pharmacia Biotech are summerized below.

SOURCE and Sepharose based ion exchangersCIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE and Sepharose based ionexchangers media are summarized in Table 22.

Table 22. Suggested CIP, sanitization and sterilization protocols for SOURCE 15 and 30,and Sepharose based ion exchangers media from Pharmacia Biotech.

Purpose Procedure

Removal of precipitated proteins 4 bed volumes of 0.5-1.0 M NaOH at 40 cm/hfollowed by 2-3 bed volumes of water.

Removal of strongly bound 4-10 bed volumes of up to 70% ethanol or hydrophobic proteins, lipo- 30% isopropanol followed by 3-4 bed volumesproteins and lipids of water.

or1-2 bed volumes of 0.5% non-ionic detergent(e.g. in 1 M acetic acid) followed by 5 bed volumes of 70% ethanol to remove the detergent, and 3-4 bed volumes of water.

Sanitization 0.5-1.0 M NaOH with a contact time of 30-60 min.

Sterilization Autoclave the medium at 121 °C for 15 min.

MonoBeads and MiniBeads columnsDue to the small particle size of MonoBeads and MiniBeads, they are more sensiti-ve to particulate matter such as precipitated proteins from the sample or buffersolutions than the larger bead size matrices. Preventative measures to ensure cle-anliness of the sample and buffers are essential to ensure long column life. Samplepreparation procedures are described earlier in this Chapter. Should precipitatedmaterial be present, as indicated by a decrease in performance or an increase inback-pressure, the columns may be cleaned using the detailed instructions inclu-ded with the column.

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DEAE Sephacel and Sephadex based ion exchangers Due to the relatively large volume changes of Sephadex based gels in different sol-vents, we recommend cleaning and washing with organic solvents on a Büchnerfunnel, since the gel needs to be repacked after such treatment.

Remove ionically bound proteins by washing the column with 0.5-1 bed volumeof a 2 M NaCl solution.

Remove precipitated proteins, hydrophobically bound proteins and lipoproteinsby washing the column with 0.1 M NaOH solution, contact time 1-2 hours, follo-wed by binding buffer until free from alkali. Alternatively, wash the column with2 bed volumes of 6 M guanidine hydrochloride.

Strongly hydrophobically bound proteins, lipoproteins and lipids can be removedby washing the gel with up to 70% ethanol or 30% isopropanol. Alternatively,wash the gel with 2 bed volumes of a non-ionic detergent in a basic or acidic solu-tion. Use for example, 0.1-0.5% non-ionic detergent (e.g. Triton X-100) in 0.1 Macetic acid. After treatment with detergent always remove residual detergents bywashing with 5 bed volumes of 70% ethanol.

Re-equilibrate the ion exchanger with starting buffer.

Storage of gels and columnsPrevention of microbial growthAs well as endangering the sample, bacterial and microbial growth can seriouslyinterfere with the chromatographic properties of ion exchange columns and mayobstruct the flow through the bed. During storage an antimicrobial agent shouldalways be added to the ion exchanger. Antimicrobial agents may be eluted fromthe columns during equilibration before starting a run.

Recommended antimicrobial agents for anion exchangers:Equilibrate the column with 20% ethanol in 0.2 M acetate.

Recommended antimicrobial agents for cation exchangers:Equilibrate the column with 20% ethanol or 0.01 M NaOH.

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Storage of unused mediaUnused media should be stored in closed containers at +4 °C to +25 °C. Note thatit is important that the media are not allowed to freeze as the structure of thebeads may be disrupted by ice crystals. This disruption will generate fines.

Storage of used mediaUsed media should be stored at a temperature of +4 °C to +8 °C in the presence ofan antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to therecommendation given above. Note that it is important that the media are notallowed to freeze as the structure of the beads may be disrupted by ice crystals.This disruption will generate fines.

Storage of packed columnsPacked columns should be stored at a temperature of +4 °C to +8 °C in the presen-ce of an antimicrobial agent, e.g. 0.01 M NaOH or 20% ethanol according to therecommendation given above. For long-term storage, the packed column shouldbe thoroughly cleaned before equilibration with the storage solution. Recyclingthe storage solution through the column or flushing the column once a week withfresh storage solution is recommended to prevent bacterial growth.

Determination of the available and dynamic capacities

The available capacity of an ion exchanger can be determined by a batch test-tubemethod similar to that used for the determination of suitable buffer pH and bin-ding and elution ionic strengths, see page 70 and Figure 38. In this case a series ofsolutions with different concentrations of the protein are added to a known quan-tity of ion exchanger, equilibrated at a suitable binding pH and ionic strength.Assaying the supernatants after mixing will show the maximum protein concen-tration which can be bound per ml of ion exchanger.

For a more realistic and useful measurement of the available capacity of an ionexchanger, a dynamic method is recommended (see page 18 for definition of avai-lable and dynamic capacity). The type of equipment necessary for this determina-tion is shown in Figure 58. FPLC System can also be used for this determination.

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Fig. 58. Experimentalset-up for the determi-nation of the dynamiccapacity of an ionexchanger.

A defined amount of gel is introduced into the column (Normally a quantity of gelto give a bed volume of approximately 1 ml is sufficient). The gel is packed andequilibrated until the eluate is of the same pH as the starting buffer. The exactvolume of gel is calculated from the known column diameter and the measuredbed height. In the case of a pre-packed column the amount of gel is already prede-termined.

The protein solution (1 to 5 mg/ml in start buffer) is applied to the column byswitching the sample application valve. To ensure that the column is fully loaded,

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sample application is not interrupted until the recorder shows 50% full scaledeflection, FSD, (0% = starting buffer; 100% = the protein solution in startingbuffer).

Sample application is stopped by re-setting the valve to allow passage of start buf-fer. Washing is continued until 0% full scale deflection is approached (Fig. 59).

Fig. 59. Graph obtained with the set-up in Figure 58 used in the determi-nation of dynamic capacity.

After the wash phase, adsorbed protein is eluted with a stepwise change in ionicstrength (e.g. 2 M NaCl) or pH. Fractions are collected as long as the UV-absorp-tion is above 2% FSD. These fractions are pooled and the UV-absorption of thepool is measured.

CalculationThe maximum amount of protein that can be bound to the column (A) at the cho-sen flow rate is:

A = C x VC = The protein concentration in the pooled fractions (mg/ml).V = volume of pooled fractions.

C = A280/ E

A280 = absorbance of solution at 280 nm in 1 cm cell.E = absorbance of standard solution (1 mg/ml) at 280 nm in a 1 cm cell.

The protein capacity is calculated as: A/gel volume

This calculation assumes that the recovery of bound protein from the column is100%. This can be checked by comparison with the quantity of protein applied tothe column.

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11. Process considerationsWhen an ion exchange step is to be part of a purification sequence for a manufac-turing process (in contrast to analytical chromatography or small scale preparati-ve applications), method development work has to find conditions which give thehighest throughput with the highest yield and the lowest possible cost.

Fig. 60. Questions that must be addressed to assure a rational process design

The design must ensure that the purity requirements of the final product are met,and also considering the special safety issues involved in production of biophar-maceuticals, such as infectious agents, pyrogens, immunogenic contaminants andtumorigenic hazards. In general, the purity issues must be addressed in relation tothe nature of the source material and the intended use of the final product. It isimportant to define the impurities and contaminants which have to be removedfrom the source material during downstream processing.

”What kind of application will the product be used in?”What are the purity issues in relation to the source material and intended use of final product? What has to be removed?

”What kind of starting material do I have?”What are the major ”Headaches”?

”What final scale am I thinking of?”What consequences will this have for the technical approach?

”What is my purification strategy?”

First, CAPTUREWhat will be the major purpose for the initial chromatographic step? Is my proposal rational?

Then, INTERMEDIATE PURIFICATIONWhat will be the major purpose with each subsequent chromatographic step?

Finally, POLISHINGWhat will be the major purpose of the polishing stage? Looking back upstream, does the overall balance and sequence of techniques appear logical?

”How do I get the most out of my process?”Will my process be more productive, safe, robust, economic and easier to use than one which our competitors could do?Will I arrive at the final process faster than our competitors?

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Another important aspect of process development is to assure that scaleability,robustness and consistency are designed into the process from the very beginning.This is secured by careful selection of appropriate chromatography media, by theway a particular chromatographic step is optimized and by an early identificationof different sources of variation and how they can be eliminated or controlledduring processing.

To assure a rational process design, a number of questions must be adressed.These questions are summerized in Figure 60 and will be discussed below.

Defining the purposeTo reach the targets for yield and purity in as few steps as possible, and with thesimplest possible design, it is not efficient to add one step to another until the puri-ty requirements have been fulfilled. Instead a specific purpose is assigned to eachstep which is included in the complete scheme. The specific purification problemassociated with a particular step, will depend greatly on the characteristics of theingoing feed material to be processed in the step. Thus, the purpose of a particularstep depends on if it is placed at the beginning, to handle a crude feed stock, in themiddle, after partial purification or at the end when final purity is achieved.

The different stages in downstream processing can be divided into capture, inter-mediate purification and polishing (Fig. 61).

Fig. 61. Different stages in downstream processing

When ion exchange chromatography is applied in capture, the purpose will be toadsorb the protein of interest quickly from the crude feed stock and isolate it fromcritical contaminants such as proteases and glycosidases. The product should beconcentrated and transferred to an environment which will conserve potency/acti-

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vity. At best, significant removal of other critical contaminants can also be achieved.

In polishing, on the other hand, most impurities have already been removed exceptfor trace amounts or closely related substances such as microheterogeneous struc-tural variants of the product. When ion exchange chromatography is applied insuch a step the purpose will be to reduce these variants and trace contaminants toa level that will be acceptable for final product quality by applying scaleable highresolution ion exchange chromatography techniques.

When ion exchange chromatography is applied in intermediate purification, i.e.steps performed on clarified feed between capture and polishing, the purpose is toremove most of the significant impurities such as proteins, nucleic acids, endotox-ins and viruses down to safe levels.

The strategic focusIn any chromatographic step there are four main performance properties to adjustto reach a fully optimized procedure (Fig. 62), resolution, speed, capacity andrecovery.

Fig. 62. The optimal pro-cess must be defined within the context of competing goals.

In general, optimization of any of these can only be realized at the expense of theothers. The relative priority of these parameters will vary depending on whether aparticular chromatographic step is for capture, intermediate purification or polish-ing. This will steer the optimization of the critical processing parameters in anyparticular step, as well as the selection of the most suitable chromatographymatrix to be used in the step.

CaptureIn a typical capture situation, throughput (i.e. capacity and speed) will be veryimportant for processing of large sample volumes, keeping the scale of equipment

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as small as possible and giving the shortest possible cycle time. Binding capacityfor the product in the presence of the impurities will be one of the most criticalparameters to reduce the scale of work as much as possible.

High speed may be required to reduce sample application time, particularly ifproteolysis or other destructive effects occur. The characteristics of the feed andthe anticipated final scale of work will form the basis for the balance betweencapacity and speed in a capture situation (Fig. 63).

Fig. 63. In a typical capture situ-ation the strategic planning willfocus on capacity and speed. Ifscale of work is the main prob-lem, binding capacity will havehigher priority than speed, i.e. itwill be more important to utilize the total binding capacity of thebed than to apply very high flowrates during sample application.If time is the main problem,speed will have higher prioritythan binding capacity, i.e. it willbe more important to apply high flow rates, even if thismeans that a somewhat largerbed volume is needed for proces-sing of a specific amount of feed.

In capture, an important factor impacting capacity is the selectivity during sampleadsorption. Typically binding conditions are selected to avoid binding contamina-ting substances so that more binding sites are available for the protein of interest.This also allows stepwise elution of the product in concentrated form.

Recovery is another parameter that will be of great concern in any preparativesituation, especially for production of a high value product. Recovery generallybecomes more important further downstream because of the increased value ofthe purified product. Recovery is influenced by destructive processes in the sampleand unfavourable conditions on the column.

Resolution of similar components is not of greatest concern in a typical capturesituation. However, there is usually significant resolution and purification frommolecules with gross physicochemical difference from the product.

In principle, a capture step is designed to maximize capacity and/or speed at theexpense of some resolution. The separation from impurities is usually achievedduring binding of the product which can simply be eluted, in concentrated form,by a step.

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Intermediate purificationIn intermediate purification steps, achieving resolution of similar components willbe more and more important further downstream. Capacity will still be importantto maintain productivity, i.e. amount of product produced per volume of chroma-tography media and time unit.

As in a capture step, selectivity during sample adsorption will be important, notonly to achieve high binding capacity, but also to contribute to the purification byachieving a degree of separation already during sample application. However, incontrast to a capture step, selectivity during sample desorption from the columnbecomes important as we go downstream. This is usually achieved by applying amore selective desorption principle, such as a continuos gradient or a multi-stepelution procedure.

Hence, the delicate problem in an intermediate purification step will be to decideon the optional balance between capacity and resolution (see Fig. 64). Speed willusually be less critical in a typical intermediate purification step due to the factthat impurities causing proteolysis and other destructive effects should have beenremoved in the capture step and also due to the fact that sample volume has beenreduced at this stage.

Fig. 64. In a typical intermediatepurification situation the strategicplanning will focus on resolutionand capacity. The requirementsfor resolution must be defined incontext with the nature of the feedand the purity requirements in thefinal product. Capacity must alsobe considered to ensure a highproductivity. The optimal balancemust be defined which then willdecide how selectivity parametersshould be optimized during sam-ple application to achieve therequirements for resolution (puri-fication) and capacity in the system.

PolishingIn a polishing step the prime issue will be resolution, since this is the last chance toreach the required quality of the product by removal of trace contaminants suchas host proteins, structural variants of product, reagents, leachables, endotoxins,nucleic acids and viruses.

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Page 114: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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Fig. 65. In a typical polishing situa-tion the strategic planning willfocus almost entirely on resolution.However, since more expensive,high resolution media will be used,it will also be important to verifythat the high resolution achievedduring the scouting experiments atlaboratory scale can be maintainedalso when preparative loadings areapplied in the final productionscale.

Selectivity during sample desorption from the column will be very important andcan be maximized by working on the shape and slope of a continuos gradient elu-tion technique. The resolution required may not be achieved by working on theselectivity alone, but high efficiency media with small bead size usually have to beused in a typical polishing situation (see Fig. 65).

Selection of chromatography mediaWhen chromatography media are to be selected for use in an industrial processthere are a number of important selection criteria to take into consideration toassure a safe and smooth transfer from research phase to routine production.

Fig. 66. Pre-selection of separation media.

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The number of separation media on the market is quite enormous and it will notbe possible to include all different alternatives in the initial media screening. Thenumber of media have to be reduced to cut down time and effort spent on themethod scouting phase of process development. Only those media supporting theissues of scaleability and suitability for the different stages in a process, listed insi-de the filter in Figure 66, should be considered for testing.

Base matrix properties and derivitization chemistryBase matrix properties and derivitization chemistry govern the chemical and phy-sical stability of the chromatography media and are very closely related to the sca-leability of the complete process. The design in of scaleability by selection of suita-ble media will assure that the media can be packed in large scale columns withoutchange in performance and flow/pressure characteristics and that efficient mainte-nance procedures can be applied to secure a long media life time. The possibility ofany toxic substances leaking from the media into the product stream is also closelyrelated to the properties of the base matrix and the chemistry used for couplingspacers and ligands to the matrix.

Bead sizeThe particle size and the range of particle size distribution may also have animpact on scaleability in the sense that particle size is closely related to the back-pressure generated in the column during a chromatographic run. The optimalbead size in any particular chromatographic step will depend on the characteris-tics of the feed and the degree of purification required in this step. In a final polis-hing step, for instance, there will be a need for smaller beads, i.e. high efficiency, toaccomplish separation of closely related compounds. In such a step, media with anarrow particle size distribution will help to give a lower back-pressure at a givenbed height and flow rate compared to media with a wider particle size distribution.

Documentation and technical supportComprehensive documentation is required for chromatography media to be usedin industrial processes, to facilitate the work with setting up and validating thecomplete process. Chromatography media used in production processes are trea-ted as raw materials. As with any type of raw material, acceptance criteria have tobe established and every new batch of media has to be subjected to tests before itcan be brought into production.

Regulatory supportInformation on possible extractable compounds and what kind of methods to useto quantify these compounds should be provided by the vendor. Leakage data onthe most relevant extractable compounds should be available.

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Vendor certificationVendor certification programmes should be initiated for all vendors of critical chemicals or materials and should certainly include the chromatography media supplier. Such programmes should be implemented to assure a long term, reliablesupply of chromatography media of high quality and consistency.

Delivery capacityThe delivery capacity of the vendor is an important issue during the vendor certifi-cation phase to secure timely deliveries of large quantities of media when the puri-fication process is scaled up. The largest batch size that the vendor can provideshould be discussed and put in relation to the column size that will be used in thefinal production scale. The stock situation and lead times should be discussed toestimate the consequences for continuity in production in case of an urgent needfor a new batch of media.

Long-term contracts, based on forecasts provided by the user, should be discussedto secure future timely deliveries. Long-term delivery guarantees should also bediscussed to assure that the same quality of chromatography media can be delive-red during the entire life cycle of the product to be purified.

Method design and optimizationThe main purpose of optimising a chromatographic step is to reach the pre-defi-ned purity level with highest possible product recovery by choosing the most suit-able combination of the critical chromatographic parameters. In process chroma-tography, in contrast to analytical or small scale preparative chromatography, thisalso has to be accomplished as quickly, cheaply and easily as possible. The methodmust be designed carefully to be robust despite variations in feed stock and otherconditions in the production hall.

The following sections will give some guidelines for optimising the critical opera-tional parameters which affect the maximum utilization of an ion exchange chro-matography step to be used in a production process.

Binding conditionsSelectivity during adsorption to an ion exchanger is optimized by careful selectionof pH and ionic strength of the start buffer. A pH far away from the isoelectricpoint of the molecule of interest will give stronger binding and increased capacitybut may also have a negative impact on selectivity due to increased binding of con-taminating molecules. If retention of the molecule of interest is low at selectedstart conditions, due to the pH being very close to the isoelectric point, it will startto elute from the column during sample application (isocratic elution) when thesample volume is increased in a preparative situation. The choice of optimal pH

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will always be a balance between selectivity and capacity which in turn dependson the purpose and strategic focus of any particular chromatographic step.

The buffer system should be selected to give maximum buffering power at theleast possible ionic strength to ensure high binding capacity of the molecule ofinterest. To achieve this, the pKa of the buffer should ideally not be more than 0.5 pH units away from the pH being used. Generally, 10 mM of a buffer is theminimum desirable level. Ideally, one of the buffering species should also beuncharged, and so not contribute to the ionic strength. In large scale applications,economic considerations often limit the choice to acetate, citrate, phosphate, orother inexpensive components.

The pH and conductivity in the binding buffer can sometimes cause aggregation/precipitation in the sample when it has been equilibrated to start conditions. Ifaggregates are formed they may be excluded by the beads and lost in the flowthrough fraction with loss of recovery as a consequence. The extent of aggrega-tes/precipitate formation depends on the pre-column residence time, after samplehas been transferred to start conditions. This problem is often recognized as ascale-up problem since the pre-column residence time may increase considerablyupon scale up.

ElutionElution from ion exchangers is usually accomplished by applying a continuos orstepwise increase of the ionic strength of the eluting buffer, thereby weakening theelectrostatic interaction between the bound molecule and the adsorbent. Depending on the purpose and strategic focus, as previously outlined, differentdesorption principles can be applied to achieve the objectives of any particularchromatographic step in the most optimal way.

• Stepwise elution

• Gradient elution

• Isocratic elution

Stepwise elution is often preferred in large scale applications since it is technicallymore simple than elution with continuos gradients. Stepwise elution will alsodecrease buffer consumption, shorten cycle times and allow the molecule of inter-est to be eluted in a more concentrated form.

Single-step elution and two-step elution can be characterized as being a ’’groupseparation” technique. This type of elution is usually applied in initial chromato-graphic steps (capture) where the purpose is to remove bulk impurities and sub-stances differing greatly from the product. In a large scale initial chromatographicstep, using a crude feed material, media with a large bead size are favoured toavoid problems with high back-pressure and reduced media life time due to highviscosity and severe fouling during sample application. In such an application itwill be very difficult, unless the selectivity is extremely high, to resolve closely rela-

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ted contaminants from the molecule of interest, even when applying very shallowgradients. The strategy will be to resolve the ”group” of substances that the mole-cule of interest belongs to from ”group(s)” containing the contaminating substan-ces. This can most conveniently be achieved by eluting one ”group” at a time byapplying one or several steps with increasing eluting strength.

In later purification steps however, applying feed material that has been partlypurified and using chromatography media with higher resolving power, it will beeasier to resolve closely related substances by applying multi-step or gradient elu-tion techniques. Resolution is maximized by working on the shape or slope of agradient or the eluting strength of different steps in a multi-step procedure. Sucheluting techniques can be characterized as being ”fine separation” techniques asopposed to the ”group separation” refered to above.

In final purification steps (polishing), where the main focus will be to reach thepredefined purity of the molecule of interest, resolution is maximized by applyingshallow gradients or even isocratic elution using high resolution media with smallbead size.

When stepwise elution is applied, one has to keep in mind the danger of gettingartefact peaks when a subsequent step is administered too early after a tailingpeak. For this reason it is recommended to use continuos gradients in the initialexperiments to characterize the sample and its chromatographic behaviour.

Elution by pH gradients is not generally applied. This is because, changing the pHby applying a pH gradient is frustrated by the buffering power of the moleculesadsorbed on the column and, in case of weak ion exchangers, the buffering of theadsorbent groups themselves. For stepwise applications, pH elution can be quitesuccessful. The pH change will be delayed compared with the new buffer frontbecause of these titrations, but eventually the bound molecule is desorbed, coinci-dent with a rapid pH change.

Sample loadWhen the selectivity parameters have been defined to achieve the most optimalbalance between resolution, capacity, speed and recovery, in ion exchange chro-matography, as for most other adsorption techniques, there are then basically twoalternative routes to follow for optimization of sample load and flow rate to achie-ve highest possible productivity in the system.

I. In a typical capture situation the sample will be applied to the column, non-bound substances will be washed out from the column and the compound of inter-est will be eluted from the column with a simple step elution procedure. The diffe-rence in eluting strength, between the different steps will usually be large, i.e. itwill be possible to elute one group of compounds while the others are still retainedon the column. In this mode, the entire bed volume can be utilized for sample bin-

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ding and the prime consideration when optimising for highest possible producti-vity is to define the highest possible sample load over the shortest possible sampleapplication time with acceptable loss in yield.

The dynamic binding capacity for the protein of interest should be determined byfrontal analysis, i.e. by continuously applying sample on the column up to thepoint where the compound of interest starts leaking off at the column outlet.PAGE, ELISA or other appropriate techniques are used for the determination ofthe break-through profile of the compound of interest.

II. In many intermediate purification steps, and always in a polishing step, therequirements for resolution will set the limit for the amount of sample that can beapplied to the column. Sample is mainly bound in the upper part of the bed sincethere will be a need for a certain bed height to achieve separation between closelyrelated substances moving down the column with different velocities in a shallowgradient of elution buffer.

Maximum sample loading is defined by running a series of experiments with gra-dually increased sample load. Optimal conditions will be the maximum sampleload that provides a resolution still high enough to meet the pre-defined purityrequirements.

Flow rateThe maximum flow rate that can be applied in any particular ion exchange chro-matography step will differ between different parts of the chromatographic cycle.

Since low molecular weight substances show high diffusion rates, i.e. are transpor-ted rapidly between the mobile phase and stationary phase, the flow rate duringequilibration, washing and regeneration procedures is limited primarily by therigidity of the chromatography media and by system constraints regarding pressu-re specification. Larger molecules, i.e. the substances to be separated during thechromatographic run, show a lower diffusion rate which will limit the flow ratethat can be applied during sample adsorption and desorption.

In a typical capture situation, the flow rate during sample application has to becontrolled so that the residence time in the column allows for a complete bindingwithout leakage in the flow through fraction. Maximum flow rate is defined byrunning the frontal analysis test (break-through) refered to above at a number ofdifferent flow rates. Optimal conditions will depend on the requirements for speedand capacity in the system. If speed, i.e. sample application time, is critical due toproteolysis or other detrimental effects in the feed material, a higher flow rate mayhave to be used on the expense of the binding capacity in terms of amount of sam-ple that can be applied per volume of media. If speed is not a big issue, bindingcapacity can be increased on the expense of flow rate which will reduce the scaleof work in the final production process. Occasionally, high back-pressure, due to

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Selecting a columnWhen a chromatographic step is being developed to be a part of a manufacturingprocess and the time has come for scaling up, the next crucial step in ensuring areliable product quality and maximum production economy is the decision aboutwhich column to use. Information on large scale columns from Pharmacia Biotechis available upon request. Different demands are put on a column for productioncompared with one used for the initial laboratory scale and scale-up experiments.Flexibility, which is needed in laboratory scale and scale-up is achieved by using acolumn with a movable adaptor. In production, consistency in performance andsafety of the end product are the main concerns. Here the column packing has tobe reproducible, materials of construction have to be well characterized for leaka-ge and the design mechanically stable.

A number of criteria have to be considered. These criteria are more dependent onthe scale of operation than on the media and are thus very similar in their impor-tance for ion exchange, hydrophobic interaction, gel filtration and affinity chro-matography. Their ranking and importance change when moving through a chro-matographic process is shown in Figure 67.

Fig. 67. In the initialcapturing, handlinglarge volumes at highflow rates is important.When moving towardsthe final steps, thedemand for low deadvolume columns andsystems to achieve highresolution becomesmore and more impor-tant.

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the viscosity and crude nature of the feed, may set the limit for maximum flowrate during sample application.During elution, the flow rate will affect resolution between compounds to beseparated and also the concentration of these compounds in the product pool.When there is a need for high concentration in the product pool, a lower flow ratemay have to be applied to minimise the volume (dilution) of the elutedproduct/fractions. This is particularly important in a step preceding a gel filtrationstep, where the sample volume is limiting for loading capacity.

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Aspects of column designFlow distribution systemThe most important factor in process column construction is to design the flowdistribution system to give as even a flow distribution as possible at the columninlet and outlet. The aim is to retain HETP values of the same order as in the labo-ratory column. This is usually achieved by a construction where the radial back-pressure is negligible compared to the axial back-pressure at the column inlet, seeFigure 68. The simplest method is to place a coarse mesh net between the columnend piece and the finer mesh net retaining the bed, to create channels for radialdistribution. This may be combined with multiple inlet/outlet ports depending oncolumn diameter. Depth filters are more easily clogged due to the relatively largefilter surface. This may be a severe disadvantage in continuous operation.

Fig. 68. Radial and axial back- pressure in a column distributionsystem.

Material resistance and durabilityWetted components must be constructed from materials with high chemical resis-tance against the harsh chemicals which are frequently used for cleaning-in-place(CIP) and sanitization procedures such as 1 M NaOH, salts, acids, etc.Stainless steel of high grades is most commonly used for very large columns.However, stainless steel does not always have sufficient corrosion resistance whenhigh salt concentrations in acidic solution are used. In this case fluoroplastic coa-ted stainless steel is recommended. Materials should be chosen to minimize leaka-ge and be tested for toxicity.

Sanitary designEffective cleaning and sanitizing of packed columns depends on the total columndesign, including the absence of threaded fittings and the smoothness of wettedsurfaces. It is important to minimize dead volumes in the column to hinder bacte-rial attachment and facilitate cleaning. Columns constructed from calibratedborosilicate glass allow the use of thin O-rings in the adaptor and end piece and

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give minimum dead volumes. Borosilicate also has a smooth and durable surfacewhich facilitates cleaning. Plastic columns are usually less expensive but mostplastics do not meet pharmaceutical industry demands for chemical resistance,hygienic design and in-line cleaning. They may however be well suited for scale-upexperiments.

Pressure vessel safetyLarge scale columns should be regarded as pressure vessels even if the actual work-ing pressures usually are kept low. Large volumes of organic solvents may behandled during cleaning which calls for explosion proof equipment. The columndesign has to meet local regulations to be approved.

Regulatory supportRegulatory support for process scale columns should be available from thecolumn supplier to provide information on materials necessary for registration ofthe process including chemical stability, toxicological tests, physical data andcolumn construction.

ErgonomicsFor easy handling of process columns it is important that they are constructed in astable way and are easy to pack and clean. Large columns should preferably havelockable wheels.

In laboratory columns, the bed height can easily be adjusted using moveable adap-tors. In large columns, adaptors may be impractical and too heavy to handle. Therefore, columns with fixed end pieces are selected in many applications.

Valves should be easy to reach and remove when the column is taken apart.

Packing large scale columnsColumn configuration

Process columns with a moveable adaptor are essentially packed in the same wayas laboratory columns with adaptors. In essence, this means that the gel slurry iscompressed by a flowing liquid until the bed height has stabilized, at which pointthe flow is stopped and the adaptor is lowered onto the gel surface and secured inplace.

Large scale columns are, however, frequently supplied with fixed end pieces. Thiscalls for a different packing technique. An extension tube is fitted on top of thecolumn as a reservoir for the gel slurry. When the bed has been packed and settledat the join between the extension tube and the column, the extension tube is remo-ved and the top column lid is secured in place. With this method it is important to

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calculate the exact amount of media that is required to get the appropriate bedheight.

Packing the columnDetailed packing instructions for ion exchange media in process columns will notbe given here. Please refer to the instructions supplied with respective media andrespective column.

Scale-upWhen the IEX step has been optimized at laboratory scale, the method can be sca-led-up. Provided that scaleability has been ”designed-in” during the developmentphase, scale-up to final production scale should be straightforward.”Design-in” of scaleability has to do with how the chromatographic step has beendesigned and optimized (robustness, simplicity, costs, capacity etc.) and the choiceof appropriate chromatography media (chemical stability, physical stability, beadsize, cost etc.).

Some general guidelines for scaling up are outlined in Table 23.

Table 23. Scale-up guidelines.

Maintain Increase Check system factors

Bed height Column diameter Distribution system

Linear flow rate Volumetric flow rate Wall effects

Sample concentration Sample load Extra column zone Gradient volume/bed volume spreading

Increasing the bed volume by increasing the column diameter and increasing volu-metric flow and sample load accordingly, will ensure the same cycle time as in thelaboratory scale method development. The column bed height, linear flow rate,sample concentration and ratio of sample to gel, all optimized at laboratory scale,will be kept the same. If a gradient is used for elution, the ratio of gradient volumeto bed volume will remain constant and, therefore, the time required for the gradi-ent to develop and the effect on resolution, will remain the same on the largercolumn. The same principle is applied for the volume of each step in a step elutionprocedure.

Different system factors may affect performance after scale-up. If the large scalecolumn has a less efficient flow distribution system, or the large scale system intro-duces large dead volumes, peak broadening may occur. This will cause extra dilu-tion of the product fraction or even loss of resolution if the application is sensitiveto variations in efficiency (plate number) in the system used.

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scaling up to a larger diameter column means that most of the bed support genera-ted by the friction against the column wall is lost. This can give increased bedcompression and poorer flow/pressure characteristics.

If all the above aspects are taken into consideration, chromatographic variabilityis normally not a major issue when scaling up.

Non-chromatographic factors may have a more significant effect on performanceduring scaling up. These factors include: changes in sample composition and con-centration that often occur as the fermentation scale increases, precipitation in thefeed stock due to longer holding times when large volumes are handled, non-reproducibility of the buffer quality due to inadequate equipment for consistentlypreparing large quantities of buffer solutions, and microbial growth in feed-stockor buffers due to increased handling and longer holding times.

Figure 69 shows a 700-fold scale up of a model protein separation on SOURCE30S going from a 2.2 ml column to a 1.57 liter column in one step.

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123

Column: SOURCE 30S, a) 7.5 mm i.d. x 50 mm (2.2 ml)b) 200 mm i.d. x 50 mm (1.57 l)

Sample: Mixture of chymotrypsinogen, cytochrome C and lysozymeSample load: 0.32 mg/ml bed volumeEluent A: 20 mM sodium phosphate, pH 6.8Eluent B: 20 mM sodium phosphate + 0.5 M NaCl, pH 6.8Flow rate: 300 cm/h ; a) 2.2 ml/min b) 1.57 l/minGradient: 0-100% B; 20 column volumesSystem: a) FPLC System

b) BioProcess Engineering System

Fig 69. 700-fold scale up from a 2.2 ml lab-scale column to a 1.57litre production scale FineLINE 200 column. (Work by PharmaciaBiotech, Uppsala, Sweden.)

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124

12. ApplicationsIon exchange has proven to be one of the major methods of fractionation of labilebiological substances. From the introduction of the technique in the 1960s´ to thedevelopment of modern high performance media, ion exchange chromatographyhas played a major role in the separation and purification of biomolecules andcontributed significantly to our understanding of biological processes. The exam-ples given in the following section have been drawn from the published literatureas well as from work in our own laboratories.

For detailed information on specific subjects the reader is referred to the originalwork.

The design of a biochemical separationIon exchange chromatography, in common with other separation techniques inthe life sciences, is rarely sufficient as the sole purification stage in the separationor analysis of complex biological samples. Ion exchange is frequently combinedwith other techniques which separate according to other parameters such as size(gel filtration), hydrophobicity (hydrophobic interaction chromatography orRPC) or biological activity (affinity chromatography).

Fig. 70. Frequency of useof fractionation techniqu-es (1). (Reproduced bykind permission of theauthors and publisher.)

Not only is the choice of techniques important. The order in which they areemployed will also play a role in determining the speed, the convenience and theoverall yield for the purification.

90

80

70

60

50

40

30

20

10

Popularity of fractionation techniques

Homogenization

PrecipitationIEX

AC

GF

1 2 3 4 5 6 7Stage in purification scheme

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125

Sample loading, sample dilution and impurity contamination are usually maximalat the beginning of a separation scheme. At this stage the high capacity, high selec-tivity and concentrating effect of ion exchange makes the technique ideal.

This suitability is reflected in Figure 70 which shows the frequency of use of diffe-rent fractionation techniques in published protein purification schemes (1).

The use of multi-dimensional chromatography with ion exchange as a first step iswell illustrated by the separation of monoclonal IgG2b from cell culture medium(Fig. 71). An initial purification and concentration of the antibody from 500 mlcell culture medium by cation exchange chromatography on SP Sepharose HighPerformance was followed by a second fractionation by gel filtration using Superdex 200 prep grade.

Fig. 71. Purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.

The sample composition with regards to ionic strength and pH should be takeninto consideration when designing the separation scheme. In ion exchange chro-

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Lane 1 and 5: Marker proteins HMW kitLane 2: Starting material (crude cell culture medium)Lane 3: Pooled material after cation exchange chromatographyLane 4: Pooled material after gel filtration

Native electrophoresis using PhastSystem with PhastGel 8-25 and silver staining

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matography solutes bind to the gel at low ionic strength and are eluted from thecolumn at a higher ionic strength. The converse situation occurs in hydrophobicinteraction chromatography. Thus if these two techniques are to be used in a sepa-ration scheme it is logical to have them adjacent to each other. This principle isillustrated in Figure 72 which shows the purification of human a2-macroglobulinfrom Cohn Fraction III.

After initial purification by affinity chromatography on Blue Sepharose CL-6B toremove albumin, the sample was applied to a Q Sepharose High Performancecolumn and eluted with an increasing salt concentration gradient. Relevant frac-tions were then pooled and a2-macroglobulin was purified to homogeneity byhydrophobic interaction chromatography on a Phenyl Sepharose High Performance column.

Fig. 72. Purification of human a2-macroglobulin. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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2.4 mg protein.Lane 4: Purified a2-M from Phenyl Sepharose High Performance.

80 µg protein.Lane 5: 3 incubated 2 hours with 200 mM methylamine, pH 8.0Native PAGE using PhastSystem with PhastGel 4-15 and silver staining.

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Towards the end of a separation scheme the complexity and the volume of sampleto be handled is smaller, but in most cases the need for higher resolution is increa-sed. Ion exchange chromatography, particularly with MonoBeads, SOURCE, orSepharose High Performance media can also be used at this stage (Fig. 73).

Fig. 73. Use of ion exchange in the final purification of cellulase. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Application examplesIon exchange chromatography has been used successfully to separate all classes ofcharged biological molecules. The following are some representative examples.

Enzymes In the purification of biologically active proteins such as enzymes the recovery ofbiological activity is usually as important as the recovery of protein mass or degreeof homogeneity. Ion exchange chromatography has played a role in the purifica-tion of thousands of enzymes, and using modern matrices with optimized separa-tion conditions gives extremely high recoveries. This is exemplified by the separa-tion of enzymes from chicken breast muscle on Mono Q (Fig. 74). The recovery ofcreatine kinase in this separation was 89%.

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Page 130: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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Fig. 74. Separation of creatine kinase from a partially purified preparation of chicken bre-ast muscle on Mono Q. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

IsoenzymesNormally the isoforms of an enzyme have approximately the same molecularweight. This makes their separation impossible by gel filtration. However, thesmall differences in charge properties resulting from altered amino acid composi-tion enable the separation of isoenzymes using ion exchange chromatography.

N-Acetyl b-D-glucosaminidases have beenwidely investigated in the diagnosis of hae-matological malignancies. In the case ofcommon acute lymphoblastic leukaemia,an isoenzyme, referred to as “Intermediate1 Form” has been reported (29). Using highresolution ion exchange chromatography(Fig. 75) this previously “single” peak hasbeen resolved into a number of componentisoenzymes which had previously only beendetectable using isoelectric focusing.

Fig. 75. Separation of Leukaemic cell N-Acetylb-D-glucosaminidase isoenzymes by anionexchange chromatography on Mono Q. NA-Gluactivities associated with distinct peaks (Ia-IXa)are indicated in relation to the NaCl gradients(29). (Reproduced by kind permission of theauthors and publisher.)

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ImmunoglobulinsIon exchange is frequently used for the purification of immunoglobulins. Figure71 shows the purification of rat monoclonal IgG2b from cell culture supernatant.As illustrated in Figure 76 the technique can also be applied to the purification ofmonoclonal immunoglobulin from ascites fluid.

Fig. 76. Ion exchange purification of mouse monoclonal IgG1 from ascites fluid. (Reprodu-ced by kind permission of Dr. LeRoy Baker, Eli Research Laboratories, Eli Lilly and Com-pany, Indianapolis, USA.)

Nucleic acid separation Nucleic acids, being charged molecules, can also be fractionated and purifiedusing ion exchange chromatography. A recent application of the technique in thisarea is the purification of plasmids from bacterial cultures. This process is traditio-nally done by centrifugation using CsCl gradients. Figure 77 shows the separationof plasmid HB101 (pBR322) by anion exchange chromatography on Q SepharoseHigh Performance. Subsequent analysis showed the electrophoretic purity of theplasmid to be equivalent to that obtained by centrifugation, as was its behaviourin ligation and transformation assays. The time, however, required for the prepa-ration was 1 hour using the chromatographic method and approximately 8 hoursusing centrifugation.

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Page 132: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

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Fig. 77. Ion exchange purification of plasmid DNA. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,Sweden.)

Polypeptides and polynucleotidesIon exchange chromatography is not limited in its application to macromoleculessuch as proteins and nucleic acids. The technique can be used in the separationofpeptides as illustrated by the separation of cyanogen bromide fragments of col-lagen (Fig. 78).

Fig. 78. Separation of CNBr-peptides from a-1 chains of collagen type 1. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

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1 2 3 4 5

Lane 1: Crude alkaline lysate of HB 101 (pBR322)Lane 2: Fraction 1-20 (hydrolyzed RNA)Lane 3: OC-peak (chromosomal DNA)Lane 4: CCC-peak (supercoiled DNA)Lane 5: pBR 322 purified by CsCl gradients

Electrophoresis in horizontal 0.8 % agarose gels (GNA-100).DNA was vizualized by ethidiumbromide staining and illumination with UV light.

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In peptide mapping applications ion exchange chromatography can be usedadvantageously as a complement to reverse phase chromatography since bothoffer high resolution but separate according to different parameters (30).

Fig. 79. Ion exchange separation of DNA restriction fragments form pBR322 cleaved byHaeIII (31). (Reproduced by kind permission of the authors and publishers.)

Analogously, ion exchange can be used to separate oligonucleotides such asrestriction fragments of DNA (31) (Fig. 79) and even individual nucleotides (32,33, 34) (Fig. 80).

Fig. 80. Ion exchange separation of nucleotides. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala,Sweden.)

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Antisense phosphorothioate oligonucleotidesPhosphorothioate analogs of DNA have been identified as promising candidatesfor oligonucleotide therapy, a major advantage being their in-vivo resistance todegradation by nucleases.

Technology for automated gram-scale synthesis of phosphorothioate DNA oligo-mers has developed rapidly in recent years. In contrast, the large scale purificationtechnology for therapeutic or diagnostic oligonucleotides has received little atten-tion, and has largely been based on scaling up methods suitable for analysis orresearch.

In this application example, a novel method* for purifying synthetic phospho-thioate oligonucleotides in large scale using SOURCE 30Q is shown. The methodincludes adsorption of trityl-on oligonucleotide on SOURCE 30Q, washing with10 mM NaOH and 2 M sodium chloride to remove non-tritylated failure sequen-ces, on-column cleavage of the trityl groups using 0.4% trifluoroacetic acid, was-hing with 10 mM NaOH and eluting the oligonucleotide with a sodium chloridegradient to further purify it from shorter sequences. After elution, SOURCE 30Qis regenerated with 30% isopropanol in 2 M sodium chloride to wash away theadsorbed trityl-groups.

A 25-mer phosphorothioate oligonucleotide produced on OligoPilot II DNA/RNASynthesizer was purified with this method. A 25% ammonia solution containingthe crude oligonucleotide mixture obtained after synthesis was applied directlyonto a 0.8 liter SOURCE 30Q column. The chromatogram from the gradient elu-tion is shown in Figure 81. Analysis of the pool revealed a yield of 1.56 g productwith a purity of 97% as determined by capillary electrophoresis, see Fig 82. Theoverall recovery was approximately 70%. The complete process (cleavage andpurification) took less then three hours.

Fig. 81. Preparative purifica-tion of 25-mer phospho-rothioate oligonucleotide onSOURCE 30Q. (Work byPharmacia Biotech, Uppsala,Sweden.)

*patent pending

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Fig. 82. Capillary electrophoresis of the pool and side fractions from the preparative puri-fication of 25-mer phosphorothioate oligonucleotide shown in Fig. 81. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.)

Areas of applicationIn the preceding chapters the examples which have been used to illustrate theprinciples and practice of ion exchange chromatography have mostly been basedon analytical and preparative applications from the research laboratory.

Ion exchange chromatography also has many important applications in the fieldof industrial and pilot scale preparations. Many blood products such as albuminand IgG (35) as well as the products of recombinant DNA technology, such asgrowth factors and pharmaceutically important enzymes (Fig. 83), are purifiedusing this technique.

An example of a pilot scale purification of a recombinant protein using ionexchange chromatography is given at the end of this chapter. For further informa-tion on the application of ion exchange chromatography at pilot and process sca-les the reader is advised to contact Pharmacia Biotech.

Analytical applications of ion exchange chromatography are to be found in diver-se areas such as quality control of purified products or process monitoring in bio-technology. Figure 84 shows the use of cation exchange in monitoring a fermenta-tion process for the production of ß-galactosidase.

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Samples: All samples were desalted on NAP 10 Columnsa) Poolb) Fraction 4c) Fraction 10

Capillary: µPAGE (5% T, 5% C), capillary length: 40 cm (J&W Scientific, FISON)Buffer: Tri-borate and urea buffer (J&W Scientific, FISON)Running conditions: 8 kV, 10 s (sample) 16 kV, 30 min (run)Data collection: FPLCdirector

a) c)b)

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Fig. 83. Process scale purification of recombinant superoxide dismutase by ion exchangechromatography on Q Sepharose Fast Flow. (Work by Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden.

Fig. 84. Monitoring the productionof b-galactosidase (36).

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Other areas of application include food research where FPLC ion exchange can beused in the study of wheat varietals (Fig. 85) and in clinical research where ionexchange chromatography has been used in studies such as the relationship bet-ween post-partum depression and b-endorphin secretion (Fig. 86) and the correla-tion of proteinuria with different renal conditions (Fig. 87).

A chromatogram of the urine from patients exhibiting tubular proteinuria, due toacute pyelonephritis, severe burns or renal transplants, shows distinct peaks cor-responding to b2-microglobulin, retinol binding protein and a1-acid glycoprotein.The disappearance of these peaks could be correlated with the reversal of theircausal lesion (39).

Fig. 85. Protein profiles of wheat varietal gliadins (37).

Fig. 86. Cation exchange of chromatography by plasma b-endorphin (38).

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3Lhf?J5?eV/hf?.Y?e

Sample.

Column:Flow rate:Buffer A.

Buffer B.

Gradient:

Detection:Fraction size:

2 ml plasma from pregnantwoman in labourMono S HR 5/51.2 ml/min0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,20% acetonitrile0.05 M NH4 Ac, pH 5.5,20% acetonitrile2 min 0% B,0-100% in 17 min280 nm and RIA0.6 ml

Cation exchange FPLC of a 2-ml plasma sample collected from a pregnant woman in labour. A. The elution pattern ( ) ofUV-absorbing material and the concentration of buffer B (---). B. Elution ofb-endorphin immunoreactivity: the position ofelution of referenceb-endorphin in (1). [125 ] b-endorphin (2) andb-lipotropin are shown by the vertical lines.

Proportion of buffer B ( )Absorbance,280 nm MM ( )

A1 32

1.0

0.9

0.8

0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1

10

9

8

7

6

5

4

3

2

1

1 10 20 30 40 50 Fraction No.

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

1 10 20 30 40 50 Fraction No.

B1 32

b-endorphin immunoreactivity,pg/tube

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136

Fig. 87. Anionexchange of urine inrenal proteinuria(39).

Purification of a recombinant

Pseudomonas aeruginosa exotoxin A, PE553DThis application shows a purification process for a genetically modified recombi-nant Pseudomonas aeruginosa exotoxin A (MW 55 000) expressed in the peri-plasm of E. coli. The process was developed for large scale production of modifi-ed toxin, conjugation to a polysaccharide and use as a vaccine. The purificationstrategy used chromatography media differentiated to tackle the problems of cap-ture, intermediate purification and polishing (for further information please referto Chapter 11.) The result was a highly purified exotoxin A from crude cell homogenate usingonly four chromatography steps, and taking less than half the time of a more con-ventional approach.

Exotoxin A was captured directly from unclarified E. coli homogenate by expan-ded bed adsorption using STREAMLINE DEAE adsorbent in a STREAMLINE200 column (Fig. 88). The following intermediate purification step was hydro-phobic interaction chromatography (HIC) on Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (highsub) packed in a BPG 200 column (Fig. 89). This step removed a substantial partof the UV absorbing material (including nucleic acids) that could interfere withthe following steps. The second intermediate purification step on SOURCE 30Q,packed in FineLINE 100 column, removed the majority of the remaining conta-minants (Fig. 90). The polishing step was HIC on SOURCE 15PHE (Fig 91). Theprocess resulted in a pure protein, according to PAGE and RPC analysis (Fig 92and 93), and the overall recovery was 51 % (Table 24).

Urine protein chromatogram from a renal-transplant patient, illustrating thedistinct peaks of the low MW proteins.The retinal-binding proteins (RBP) iscontaminated with a small amount of transferrin (TSF).b2m = b2 -microglobulin,AGP =a1-acid glycoprotein,a1m = a1 -microglobulin,ALB = albumin. Diagonal line illustrates gradient from bufferA to buffer B.

A280nmb2 m

RBP+

TSFAGP

+a1m

ALB

0 10 20 30 Vol (ml)

Sample:Column:Flow rate:Buffer A:Buffer B:Gradient:Detection:

0.5 ml desalted urineMono Q HR 5/52 ml/min6.25 mM Bis-Tris propane, pH 7.5BufferA + 0.35 M NaCl, pH 9.50-100% in 25 ml280 nm, 0.05AUFS

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137

Fig. 88. Capture by expan-ded bed adsorption on STREAMLINE DEAE.

Fig. 89. Intermediate purifi-cation by hydrophobic inter-action chromatography onPhenyl Sepharose 6 FastFlow (high sub).

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Column: STREAMLINE 200 (i.d. 200 mm)Medium: STREAMLINE DEAE, 4.7 lSample: 4.7 kg of cells were subjected to osmotic shock and suspended

in a final volume of 180 litres 50 mM Tris buffer, pH 7.4 before application onto the expanded bed.

Buffer A: 50 mM Tris buffer, pH 7.4Buffer B: 50 mM Tris, 0.5 M sodium chloride, pH 7.4Flow rate: 400 cm/h during sample application and wash

100 cm/during elutionSystem: BioProcess Modular

Column: BPG 200/500 (i.d. 200 mm)Medium: Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub), 4.7 L (150 mm bed height)Sample: 4.5 L of the previous pool were adjusted to 0.6 M ammonium

sulphate and applied onto the column A: 50 mM phosphate, 0.7 M ammonium sulphate, pH 7.4B: 20 mM phosphate, pH 7.4C: Distilled waterFlow rate: 120 cm/h

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138

Fig. 90. Intermediate purifica-tion by ion exchange chroma-tography on SOURCE 30Q.

Fig. 91. Polishing by hydro-phobic interaction chromato-graphy on SOURCE 15PHE.

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Column: FineLINE 100 (i.d. 100 mm)Medium: SOURCE 30Q, 375 ml (50 mm bed height)Sample: from the previous pool, diluted 1 to 3 with distilled water

1.5 l/cycle were appliedBuffer A: 20 mM phosphate, pH 7.4Buffer B: Buffer A + 1.0 sodium chlorideGradient: 0 to 50% B, 20 column volumesFlow rate: 600 cm/h

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Column: 35 mm i.d.Medium: SOURCE 15 HPESample: from the previous step, adjusted to 1.0 M ammonium sulphate,

0.5 l/cycle was appliedBuffer A: 1.0 M ammonium sulphate, 50 mM phosphate, pH 7.4 Buffer B: 50 mM phosphateGradient: 0-45%B, 15 column volumesFlow rate: 200 cm/h

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139

Fig. 92. a) SDS-PAGE on PhastGel Gradient 8-25b) Native PAGE on PhastGel Gradient 8-25

Table 24

Purification step Volume, litre Total protein, gram Exotoxin A, gram* Step recovery*

Bacterial extract 180 351 10.8STREAMLINEDEAE 13.5 140 8.54 79Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub) 11.4 41 6.60 77

SOURCE 30Q 30.2 12.6 6.04 91SOURCE 15PHE 12.2 n.d. 5.5 91

*Activity was determined with a radial immunodiffusuin assay using Goat anti-exotoxin A antibodies(List, USA).

Lane 1 LMW markersLane 2 pool from

SOURCE 15 PHELane 3 pool from

SOURCE 30QLane 4 pool from

Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)

Lane 5 LMW markers

Lane 1 pool from Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)

Lane 2 pool from SOURCE 30QLane 3 pool from SOURCE 15PHE

a

b

1 2 3 4 5

1 2 3

Page 142: Ion Exchange Chromatography - ualberta.ca...Protein Purification Handbook 18-1132-29 Ion Exchange Chromatography Principles and Methods 18-1114-21 Affinity Chromatography Principles

140

Fig. 93. Reversed phase chromatography analysis of pools obtained after the purificationsteps.

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Column: µRPC C2/C18, SC 2.1/10Sample: a) pool from Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (high sub)

b) Pool from SOURCE 30Qc) Pool from SOURCE 15 PHE

Sample load: 50µLA: 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) in waterB: 0.1% TFA in acetonitrileGradient: 25-75% B over 47 minutesFlow rate: 150 µL/minSystem: SMART System

a)

c)

b)

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141

StrategyThe starting point for developing the purification strategy was experience from asuccessful downstream process for purification of another modified Pseudomonasaeruginosa exotoxin, LysPE38 (Fig. 94). Refinements included reducing the num-ber of steps by the introduction of STREAMLINE DEAE for capture, and achie-ving high flow rates through the use of high performance SOURCE media for lateintermediate purification and polishing.

Fig. 94. Comparison of the two purification schemes.

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142

This approach of using media designed for different stages in a downstream pro-cess speeded up process development and shortened the production schedule.Comparison with the earlier process for purification of a similar exotoxin demon-strates the dramatic savings in time achieved.

Interestingly, the use of ion exchange at more than one stage is a common charac-teristic of large-scale processes. Note that the role and mode of use of the ionexchanger is very different in the different stages. In the example shown, theanion exchanger, STREAMLINE DEAE, is used for expanded bed adsorption ofthe product from the crude, unfiltered E. coli lysate. STREAMLINE is optimisedto handle such crude feedstocks. Particles, the bulk of the impurities and much ofthe water are removed in a group separation. Sample application conditions areoptimised to achieve maximum selectivity during capture of the product and thestepwise elution conditions achieve maximum concentration during elution.

Later in the process, anion exchange is again used, but this time to remove pro-teins which have very similar characteristics to the product. This time SOURCE30Q is used with gradient elution. The uniform, small diameter particles help toachieve good resolution with excellent flow rates and low back-pressures. Thelinear salt gradient further improves resolution. Note also that a different pH hasbeen chosen to increases the binding strength of the product and further improvethe resolution during elution.

In other examples ion exchange can be used repeatedly in the same process undereven more divergent conditions, in one step to bind only impurities and allow theproduct to pass through and later to bind the product. Furthermore, anion andcation exchange can be combined in the same scheme or pH and salt gradient elu-tion can be alternated to achieve removal of different impurities. All of this is anindication of why ion exchange is such a useful technique in industrial purifica-tion.

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143

13. Fault finding chartProblem Cause RemedyColumn is clogged. Presence of lipoproteins Prior to chromatography,

or protein aggregates. precipitate with 10% Dextran Sulphate or 3% polyvinylpyrrolidone.

Precipitation of proteins Modify the eluent to in the column caused by maintain stability.removal of stabilizing agents during fractionation.

Filter is clogged. Replace the filter. Always filter samples and buffer before use.

Microbial growth Microbial growth rarelyhas occurred in the occurs in columns during column. use, but steps should

always be taken to prevent infection of packed columns, buffers and gel suspensions. Store gel in the presence of 20% ethanol or an antimicrobial agent, see page 103.

No flow through Outlet closed. Open outlet.the column

No flow from pump. With peristaltic pumps check the condition of the tubings. Check for leaks at all connections.

Clogged end-piece or Remove and clean, adaptor or tubing. if possible.

Reduced or poor Bed surface blocked Clean using recommended flow through the by precipitated methods.column. proteins.

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144

Problem Cause RemedyReduced or poor Bed compressed. Repacking the column may flow through the be necessary.*column.

Microbial growth. Microbial growth rarely occurs in columns during use, but steps should always be taken to prevent infection of packed columns, buffers and gel suspensions. Store gel in the presence of 20% ethanol or an antimicrobial agent, see page 103.

Fines. Do not use a magnetic stirrer; it can break the beads.

Back pressure Turbid sample has been Improve sample solubility increases during a applied to the column. by the addition of run or during monoethylene glycol, successive runs. detergents or organic

solvents.

Clogged column filter. Prefilter buffers and samples. Change filter.

Precipitation of protein Clean the column andin the column filter and/ exchange or clean the or at the top of the gel bed. filter.

Change pH and/or add urea. Develop a procedure with deter-gents.

Additives which were used for initial sample solubilization should be included in the solu-tions used for chromatography.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilotcolumns.

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Problem Cause RemedyBack-pressure Precipitation of Lipoproteins may beincreases during a lipoproteins at increased precipitated prior torun or during ionic strength. chromatography by the successive runs. addition of 10% dextran sul-

phate and1 M calcium chloride to final concentrations of 0.2% and 0.5 M respectively.

The protein does Incorrect buffer pH. Use a buffer pH closernot elute in the to the pI of the protein.salt gradient.

Ionic strength too low. Use a more concentrated limit buffer.

The protein does Solutions have wrong pH. Calibrate your pH meter,not elute. prepare new solutions and

try again.

Protein elutes in Ionic strength of start Decrease ionic strength the wash phase. buffer is too high. of start buffer.

The ionic strength of the Buffer exchange on sample.sample is too high or the pH is wrong.

The column is not Repeat or prolong the properly equilibrated. equilibration step.

Ionic detergents or other Clean the column. additives are adsorbed to the column.

The resolution The gradient slope Use a shallower gradient obtained is less is too steep. or a plateau in the gradient.than expected.

Microbial growth has See above.occurred in the column.

Flow rate is too high. Run the separation at a lower flow rate.

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Problem Cause RemedyThe resolution Proteins or lipids have Clean and regenerate theobtained is less precipitated on the column. than expected. column.

Improper filtration of Regenerate the column, the sample before filter the sample and repeat application to the the chromatography step.column.

Aggregate formation of Use urea or zwitterions, proteins in sample and betaine up to 10% or strong binding to gel. taurine up to 4%.

Column is poorly packed. Check the packing by running a coloured compound and obser-ving the band. Repack the column if necessary.*

Too much sample mass Decrease the sample load.has been loaded onto the column.

The column is dirty. Clean and regenerate the column.

Detector cell volume is Change the flow cell.too big.

Large mixing spaces in Reduce all post column or after column. volumes.

Leading or very Overloaded column. Decrease the sample loadrounded peaks and repeat the run.observed in the chromatogram.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilotcolumns.

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Problem Cause RemedyLeading or very Column is poorly packed. Check the packing by rounded peaks running a coloured observed in the compound and observing chromatogram. the band. Repack the

column if necessary.*

Column needs Clean and regenerate theregeneration. column. If this does not help

replace with a new one.

Tailing of the peak Sample too viscous. Reduce the amount is observed in the of protein.chromatogram.

Precipitation of protein Remove nucleic acids. in the column filter and/ Clean the column andor at the top of the gel bed. exchange or clean the

filter.

Previous elution Incorrect buffer pH Prepare new solutions.profile cannot be and ionic strength.reproduced.

The sample has altered Prepare fresh sample.during storage.

Proteins or lipids have Clean and regenerate the precipitated on the column.column.

Sample has not been Regenerate the column,filtered properly. filter the sample carefully

and repeat this step.

Incomplete equilibration. Equlibrate until conductivity is constant.

Previous elution Aggregate formation of Use urea or zwitterions, profile cannot be proteins in sample and betaine up to 10% or reproduced. strong binding to gel. taurine up to 4%.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilotcolumns.

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Problem Cause RemedyLow recovery of Sample substance may Determine the pH andactivity while not be stable in the salt stability of the protein.normal recovery elution buffers and is of protein. therefore inactivated.

Enzyme separated from Test by pooling fractions co-factor or similar. and repeating the assay.

Microbial growth. Microbial growth rarely occurs in columns during use, but steps should always be takento prevent infection of packed columns, buffers and gel suspensions. Store gel in the pre-sence of 20% ethanol or an anti-microbial agent, see page 103.

Protein amount in The protein may have Add protease inhibitorsthe eluted fractions been degraded by to the buffers to preventis much less than proteases. proteolytic digestion.expected.

Adsorbtion to filter Use another type of during sample filter or use detergents.preparation.

Microbial growth has Microbial growth rarely occursoccurred in the column. in columns during use, but steps

should always be taken to pre-vent infection of packed columns, buffers and gel suspen-sions. Store gel in the presence of 20% ethanol or an anti-microbial agent, see page 103.

Protein amount in Non-specific adsorption. Try adding ethylene glycol the eluted fractions (e.g. 10%) to the buffers to is much less than prevent any hydrophobic expected. interactions.

Sample precipitates. May be caused by removal of salts or sample dilution.

Hydrophobic proteins. Chaotropic salts may be used for elution.

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Problem Cause RemedyMore activity is Different assay Use the same assayrecovered than conditions have been conditions for all the assayswas applied to used before and after the in your purificationthe column chromatographic step. scheme.

Removal of inhibitors Replace if necessary.during separation.

Peaks too small. Wrong sensitivity range Adjust.on detector.

Sample absorbs poorly Use a different wavelength.at the chosen wavelength.

Recorder range Adjust.incorrectly set.

Excessive zone Check the column packingbroadening and re-pack if necessary.

Bubbles in the bed. Column packed or stored Small bubbles can often beat cool temperature and removed by passing well then warmed up. de-gassed buffer upwards

through the column. Column may need to be re-packed. Take special care if buffers are used after storage in a fridge or cold-room. Do not allow column to warm up due to sunshine or heating system. A water-jacket is a good safeguard. Use de-gassed buffers.

Eluent not properly De-gas the eluent de-gassed. thoroughly.

Cracks in the bed. Large air leak in column. Check all connections forleaks. Repack the column*.

Distorted bands as Air bubble at the top Re-install the adaptorsample runs into of the column or taking care to avoidthe bed. in the inlet adaptor. air bubbles.

* Does not apply for pre-packed MonoBeads, MiniBeads, RESOURCE, HiTrap, HiLoad and BioPilotcolumns.

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Problem Cause RemedyDistorted bands Particles in eluent or Filter or centrifuge the as sample runs sample. sample. Protect eluents into the bed. from dust.

Clogged or damaged net Dismantle the adaptor, clean in upper adaptor. or replace the net. Keep particles

out of samples and eluents.

Distorted bands as Column poorly packed. Gel suspension too thick orsample passes too thin. Bed packed at adown the bed. temperature different from

run. Bed insufficiently packed (too low packing pressure, too short equilibration). Column packed at too high pressure.

Negative peaks at Refractive index effects. Buffer exchange the samplesolvent front. to start buffer.

Strange peaks in Buffer impurities. Clean the buffer by running itchromatogram. through precolumn. Use high

quality reagents.

Peaks on blank Incomplete elution. Wash the column accordinggradients. to recommended method.

Spikes in Air bubble trapped Use de-gassed solutions.chromatogram. in UV cell.

UV baseline rises Salt concentration, Work well below or abovewith gradient. micelle formation. the CMC or change the

gradient so that the increase in UV absorption does not occur while the samples are eluting.

Impurities in buffers. Use high quality reagents.

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14. Ordering information

Product Quantity/Pack Size Code No.

MonoBeadsMono Q, PC 1.6/5 1 17-0671-01Mono Q HR 5/5 1 17-0546-01Mono Q HR 10/10 1 17-0556-01Mono Q HR 16/10 1 17-0506-01Mono Q 35/100 1 17-1001-01Mono Q 60/100 1 17-1002-01Mono S, PC 1.6/5 1 17-0672-01Mono S HR 5/5 1 17-0547-01Mono S HR 10/10 1 17-0557-01Mono S HR 16/10 1 17-0507-01Mono S 35/100 17-1021-01Mono S 60/100 1 17-1022-01

MiniBeadsMini Q, PC 1.6/5 1 17-0671-01Mini S, PC 1.6/5 1 17-0671-01Precision Column Holder 1 17-1455-01

SOURCE QRESOURCE Q 1 ml 1 17-1177-01RESOURCE Q 6 ml 1 17-1179-01SOURCE 15Q 10 ml 17-0947-20SOURCE 15Q 50 ml 17-0947-01SOURCE 15Q 200 ml 17-0947-05SOURCE 15Q 500 ml 17-0947-02SOURCE 15Q 1 l 17-0947-03SOURCE 30Q 10 ml 17-1275-10SOURCE 30Q 50 ml 17-1275-01SOURCE 30Q 200 ml 17-1275-02SOURCE 30Q 500 ml 17-1275-03SOURCE 30Q 1 l 17-1275-04

SOURCE SRESOURCE S 1 ml 1 17-1178-01RESOURCE S 6 ml 1 17-1180-01SOURCE 15S 10 ml 17-0944-10SOURCE 15S 50 ml 17-0944-01SOURCE 15S 200 ml 17-0944-05SOURCE 15S 500 ml 17-0944-02SOURCE 15S 1 l 17-0944-03SOURCE 30S 10 ml 17-1273-20SOURCE 30S 50 ml 17-1273-01SOURCE 30S 200 ml 17-1273-02SOURCE 30S 500 ml 17-1273-03SOURCE 30S 1 l 17-1273-04

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152

Product Quantity/Pack Size Code No.

Q Sepharose High Performance

HiTrap Q 5 x 1 ml 17-1153-01HiTrap Q 5 x 5 ml 17-1154-01HiLoad 16/10 Q Sepharose HP 1 17-1064-01HiLoad 26/10 Q Sepharose HP 1 17-1066-01BioPilot Column Q Sepharose HP 35/100 1 17-1011-21BioPilot Column Q Sepharose HP 60/100 1 17-1012-21Q Sepharose High Performance 75 ml 17-1014-01Q Sepharose High Performance 1 l 17-1014-03Q Sepharose High Performance 5 l 17-1014-05

SP Sepharose High Performance

HiTrap SP 5 x 1 ml 17-1151-01HiTrap SP 5 x 5 ml 17-1152-01HiLoad 16/10 SP Sepharose HP 1 17-1137-01HiLoad 26/10 SP Sepharose HP 1 17-1138-01BioPilot Column SP Sepharose HP 35/100 1 17-1031-21BioPilot Column SP Sepharose HP 60/100 1 17-1032-21SP Sepharose High Performance 75 ml 17-1087-01SP Sepharose High Performance 1 l 17-1087-03SP Sepharose High Performance 5 l 17-1087-04

Q Sepharose Fast Flow

HiLoad 16/10 Q Sepharose Fast Flow 1 17-1060-01HiLoad 26/10 Q Sepharose Fast Flow 1 17-1062-01Q Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0510-10Q Sepharose Fast Flow 300 ml 17-0510-01Q Sepharose Fast Flow 5 l 17-0510-04

SP Sepharose Fast Flow

HiLoad 16/10 SP Sepharose Fast Flow 1 17-1135-01HiLoad 26/10 SP Sepharose Fast Flow 1 17-1136-01SP Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0729-10SP Sepharose Fast Flow 300 ml 17-0729-01SP Sepharose Fast Flow 5 l 17-0729-04

DEAE Sepharose Fast Flow

DEAE Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0709-10DEAE Sepharose Fast Flow 500 ml 17-0709-01DEAE Sepharose Fast Flow 10 l 17-0709-05DEAE Sepharose Fast Flow 60 l 17-0709-60

CM Sepharose Fast Flow

CM Sepharose Fast Flow 25 ml 17-0719-10CM Sepharose Fast Flow 500 ml 17-0719-01CM Sepharose Fast Flow 10 l 17-0719-05CM Sepharose Fast Flow 60 l 17-0719-60

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153

Product Quantity/Pack Size Code No.

Sepharose Big Beads

Q Sepharose Big Beads 1 l 17-0989-03Q Sepharose Big Beads 10 l 17-0989-05

SP Sepharose Big Beads 1 l 17-0657-03SP Sepharose Big Beads 10 l 17-0657-05

STREAMLINE

STREAMLINE DEAE 300 ml 17-0994-01STREAMLINE DEAE 7.5 l 17-0994-02

STREAMLINE SP 300 ml 17-0993-01STREAMLINE SP 7.5 l 17-0993-02

Sepharose CL-6B

DEAE Sepharose CL-6B 500 ml 17-0710-01DEAE Sepharose CL-6B 10 l 17-0710-05CM Sepharose CL-6B 500 ml 17-0720-01CM Sepharose CL-6B 10 l 17-0720-05

Sephacel

DEAE Sephacel 500 ml 17-0500-01DEAE Sephacel 10 l 17-0500-05

Sephadex

DEAE Sephadex A-25 100 g 17-0170-01DEAE Sephadex A-25 500 g 17-0170-02DEAE Sephadex A-25 5 kg 17-0170-03DEAE Sephadex A-25 40 kg 17-0170-07

DEAE Sephadex A-50 100 g 17-0180-01DEAE Sephadex A-50 500 g 17-0180-02DEAE Sephadex A-50 5 kg 17-0180-03DEAE Sephadex A-50 40 kg 17-0180-07

QAE Sephadex A-25 100 g 17-0190-01QAE Sephadex A-25 500 g 17-0190-02QAE Sephadex A-25 5 kg 17-0190-03

QAE Sephadex A-50 100 g 17-0200-01QAE Sephadex A-50 500 g 17-0200-02QAE Sephadex A-50 5 kg 17-0200-03

CM Sephadex C-25 100 g 17-0210-01CM Sephadex C-25 500 g 17-0210-02CM Sephadex C-25 5 kg 17-0210-03CM Sephadex C-25 40 kg on request

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Product Quantity/Pack Size Code No.

CM Sephadex C-50 100 g 17-0220-01CM Sephadex C-50 500 g 17-0220-02CM Sephadex C-50 5 kg 17-0220-03

SP Sephadex C-25 100 g 17-0230-01SP Sephadex C-25 500 g 17-0230-02SP Sephadex C-25 5 kg 17-0230-03SP Sephadex C-25 40 kg on request

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