Interacciones entre el proceso inflamatorio y nutrición de hierro en

sujetos obesos y/o diabéticos tipo 2

Mónica Andrews, Miguel Arredondo.Laboratorio de Micronutrientes. INTA. Universidad de Chile

Financiamiento: Beca Ciencias Básicas SOCHED 2010FONDECYT: 1085173

Factores Ambientales

Factores No Modificables

Factores Genéticos

pO2

Hipoxia

Inflamación

Trayhurn et al, 2004. Br J Nutr. 92:347-355Hintze KJ et al, 2010. Biol Trace Elemn Res.

INFLAMACIÓN

HIPOXIA

NF-kB

TNF-ɑ IL-6

Aumento proteínas fase aguda

Resistencia periférica a la insulina

Disminución adiponectina

Resistencia a la insulina hepática

Redistribución del hierro corporal

1) Trayhurn et al, 2004. Br J Nutr. 92:347-3552) Hintze KJ et al, 2010. Biol Trace Elemn Res.3) Aso Y et al, 2010.Diabetes Res Clin Pract. 90(3):250-5

OBESIDAD DIABETES

FERRITINA

• Sun et al, 2008. Endocrinol Metab. Elevados niveles de ferritina se asociaron a mayor riesgo de desarrollo de DMT2 en población China de mediana edad, independiente de la presencia de obesidad. • Fumeron et al, 2006. Diabetes Care. Niveles de ferritina sérica fue un factor predictivo independiente del incremento de los niveles de insulina plasmática en 3 años en población francesa.

• Ford et al, 1999. Diabetes Care. Datos NHANES reportaron una asociación positiva entre IMC y los niveles de ferritina sérica en hombres y mujeres.

HEPCIDINA

Fernández-Real et al, 2009. J Clin Endocrinol Metab. Reportó niveles aumentados de hepcidina y prohepcidina en sujetos con intolerancia a la glucosa.

Jiang et al. 2011. Diabetes Research. Encontró altos niveles de hepcidina en pacientes DMT2, los que se correlacionaban positivamente con los niveles de ferritina e IL-6.

HEPCIDINA

Alteración de la movilización del Hierro: Enterocito

Macrófagos

Disminución de la captación del Hierro

Estado Proinflamatorio Crónico

Anemia de la Inflamación

Ferritina

Saturación de transferrina

Hipoferremia

Sobrecarga de hierro en macrófagos

Nemeth et al, 2006. Annu Rev Nutr. 26:323-342Ganz et al, 2009 Semin Hematol. 46(4):387-393

IL-6TNF-αIL-1

Hep

Hep

Hep

Hep

FtFt

FtFt

Ferroportina

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+ Fe

2+

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+

Fe

Ferritina

Toledano et al. 2009 Am J Emerg Med. 27:761-764Zafón et al, 2010. Obes rev. 11(4):322-328Nemeth et al, 2006. Annu Rev Nutr. 26:323-342

IL-1

Hep

IL-6

IL-6

IL-6 TNF-αTNF-α

Entonces……

pO2

pO2

pO2pO2

pO2

pO2 pO2pO2

HIF-1α

TNF-α MIFIL-6

Angiogenesis

IRS Tir

Ser

Glut-4

Fos tir

GK

Hep

Ft

Hepcidina

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+

Fe 2+

ROS

Glucosa

Mfn2Mfn2

ROS

pO2

TNF-αIL-6

NF-kB

Caracterizar el metabolismo del hierro, del

estado proinflamatorio y de la actividad

mitocondrial en Células Mononucleares Periféricas

(CMPs) de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2

con inflamación crónica leve.

OBJETIVO GENERAL

OBJETIVO ESPECÍFICOS

Caracterizar a sujetos obesos y diabéticos tipo 2 con

parámetros bioquímicos (glicemia, perfil lipídico, PCR)

y de nutrición de hierro (hierro sérico, ferritina sérica,

receptor de transferrina).

Determinar el contenido de hierro intracelular en

CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes tipo 2

desafiadas con distintas concentraciones de Fe y/o

glucosa.

Medir la abundancia relativa de los RNAm de los

genes de HIF-1, Hepcidina, NFkB, Mitofusina 2, IL-6 y

TNFα de CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes

tipo 2.

MATERIALES Y

MÉTODOS

Metodología: Estudio Clínico

30 Controles (CN)

30 Obesos (OB)

30 Obesos diabéticos (DMOB)

Tamaño muestral:

Frecuencia de obesidad y diabetes

Poder de 80%

α = 0.05

Criterios de Inclusión

Individuos de sexo masculino, > 40 años, sin ingesta de suplementos de hierro.

IMC < 28 kg/mt2

Circunferencia Abdominal < 100 cm,

Glicemias en ayunas < 100 mg/dl

IMC mayor a 30 kg/mt2

Circunferencia Abdominal > 102 cm

Obesos: glicemia en ayunas < a 126 mg/dl

Criterios de exclusión

Sujetos vegetarianos, bajo tratamiento farmacológico

para disminuir de peso, tratamiento con IECAs o

bloqueadores de los canales de calcio o aspirina,

poseer más de 3 criterios de síndrome metabólico

según ATP III, y PCRhs > 3 mg/l

Diabéticos: Uso de insulina

Diabéticos y Obesos: Uso de IECAs, bloqueadores de

los canales de calcio o aspirina. Poseer antecedentes

de IAM, angina pectoris o by pass coronario.

En ambos grupos ser vegetarianos

30 ml de sangre

Parámetros Bioquímicos y

nutrición de hierro (12 ml )

Cultivos de CMPs

(18 ml)

Glicemia

Insulina

Perfil lipídico: VLDL, LDL, HDL, TG

PCR Fe sérico

Ft sérica

RTf

Actividad Hem oxigenasa

RNA

Contenido de hierro

Gradiente de Ficoll

Medio RPMI por 20 horas

Hierro 5 µM

Hierro 40 µM

Glu 20 mM + Fe 5 µM

Determinación de Fe

RNA

Obtención de CMPs

Resultados

Controlesn= 30

Obesosn= 30

Diabéticosn= 30

P

Edad (años) 51.6 ± 8.7 52.7 ± 8.1 54.7± 5.9 NS

Peso (Kg) 72.7 ± 5.7 99.1 ± 17.3 ** 92.3 ± 6.7 ** p< 0.0001

IMC (Kg/mt2) 25.8 ± 1.6 34.2 ± 4.5 ** 31.9 ± 1.8 ** p< 0.01

Cir. Abdominal (cm) 91.6 ± 4.3 110.9 ± 11.7** 106.6 ± 6.9** p< 0.0001

Presión sistólica (mmHg) 128.4 ± 16.6 132.8 ± 17.2 148.1 ± 27.5 * p< 0.05

Presión diastólica (mmHg) 84.3 ± 15.9 83.0 ± 8.5 84.5 ± 10.2 NS

Glicemia basal (mg/dl) 85.2 ± 9.8 99.9 ± 13.9 183.4 ± 85.6 ** p< 0.01

Glicemia pp (mg/dl) 87.7 ± 26.9 129.4 ± 65.1 p<0.01

Insulina basal (ng/dl) 6.5 ± 2.9 20.2 ± 30.4** 20.8 ± 10.9** p< 0.01

Colesterol Total (mg/dl) 183.5 ± 34.6 189.9 ± 35.7 198.3 ± 51.8 NS

HDL (mg/dl) 33.9 ± 9.7 30.9 ± 5.9 31.1 ± 9.2 NS

LDL (mg/dl) 116.7 ± 24.8 120.7 ± 23.9 124.9 ± 54.8 NS

Triglicéridos (mg/dl)* 164.7 (59.9-356.0)

191.1(55.9-856.7)

243.6 (86.7-968.9)

NS

Tabla N°1Características generales de la población estudiada.

ANOVA de una vía * p< 0.05; ** p<0.01

Objetivo 1: Caracterizar a sujetos obesos y diabéticos tipo 2 con parámetros bioquímicos (glicemia,

perfil lipídico, PCR) y de nutrición de hierro (hierro sérico, ferritina sérica, receptor de transferrina).

* Datos expresados como promedio geométrico, entre paréntesis los rangos

Controlesn= 30

ObesosN= 30

Diabéticosn= 30

P

Hemoglobina (g/dl) 16.3 ± 1.0 16.1 ± 1.0 15.0 ± 1.8 NS

Hematocrito (%) 45.7 ± 2.3 46.6 ± 2.5 41.8 ± 6.6 NS

Ferritina sérica (µg/L)1 42.8 (10.7-102.2)

67.5 (35.6-111.7)

95.5 (45.8-150.3)**

p<0.01

Fe total (µg/dl) 99.7.0 ± 26.7 108.0 ± 25.0 80.2 ± 31.1 NS

TIBC (µg/dl) 327.4 ± 42.1 332.5 ± 42.3 343.9 ± 54.9 NS

Saturación transferrina (%) 30.4 ± 8.0 31.9 ± 6.8 23.3 ± 7.9 * p<0.05

Receptor Transferrina (µg/dl) 2.7 (0.5-5.4)

3.1(2.8-4.5)

4.1 (2.2-5.9)

NS

TBI (mg/Kg) 4.0 ± 1.2 7.4 ± 1.0** 7.4 ± 0.5** p<0.01

PCR hs (µg/dl)1 1.1 ( 0.0 – 6.1)

3.0 (0.0-11.8)

4.1 (2.2-11.9) **

p<0.01

Tabla N°2Caracterización de la nutrición de hierro y del estado pro-inflamatorio de

controles, DMOB y obesos. ANOVA de una vía * p<0.05; ** p<0.01.

1 Datos expresados como promedio geométrico, entre paréntesis los rangos

Figura Nº 1Concentración de hierro intracelular de CMPs de controles, pacientes DMT2 y obesos, expuestas

a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa. A) Controles; B) Pacientes obesos; C) Pacientes DMOB.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05. **P<0.01)

Objetivo 2: Determinar el contenido de hierro intracelular en CMPs de sujetos obesos con y sin diabetes

tipo 2 desafiadas con distintas concentraciones de Fe y/o glucosa.

Figura Nº 2: Expresión del RNAm de HIF en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 3: Expresión del RNAm de Hepcidina en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 4: Expresión del RNAm de NF-kB en CMPsA) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 5: Expresión del RNAm de IL-6 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 6: Expresión del RNAm de TNF-α en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 7: Expresión del RNAm de Mfn-2 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 8: Expresión del RNAm de TLR-2 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 9: Expresión del RNAm de TLR-4 en CMPs. A) controles; B) Obesos; C) Diabéticos expuestas a distintas concentraciones de hierro y/o glucosa; D) condiciones basales; E) CMPs con 40 μM Fe; F) CMPs con 20 mM Gluc; G) Db Anémicos basales; H) Db Anémicos 40 μM Fe; I) Db Anémicos 20 mM Gluc.

(ANOVA de una vía, *denotan diferencias significativas p<0.05, **p<0.01, ***p<0.0001); T test para diferencias entre DM anémicos y no anémicos

A B C

D E F

G H I

Figura Nº 10Correlación entre los niveles plasmáticos de PCR (μg/dl) y ferritina (μg/L)

A) diabéticos, B) Obesos, C) Controles

Figura Nº 11Correlación entre IMC (Kg/mt2) y niveles plasmáticos de ferritina (μg/L)

A) diabéticos, B) Obesos, C) Controles

Figura Nº 12Correlación entre HOMA y ferritina (μg/L) en sujetos obesos

Tabla Nº3Correlación entre IMC, PCR y Ferritina y la abundancia relativa de los RNAm de

Hepcidina, Nf-Kb, IL-6 y Mfn-2 de sujetos DMT2

Tabla Nº4Correlación entre IMC, PCR y Ferritina y la abundancia relativa de los RNAm de

Hepcidina, Nf-Kb, IL-6 y Mfn-2 de sujetos Obesos

TLR-2TLR-4

IL-6 IL-1TNF-α

Nf-Kb

Diabetes

H de CAGS

ROS

IL-6 TNF-α

Hepcidina

Fe

Fe

Fe

Fe

Fe

NFkB

ROS

P

Fe

Fe

Mfn-2Mfn-2 Mfn-2Mfn-2

ROS AGEs

Inflamación

FosforilaciónOxidativa

1. En los pacientes diabéticos obesos se observó un perfil inflamatorio dado por PCRus mayor que en los obesos y en controles. Esto fue reafirmado por la mayor expresión de genes asociados a la inflamación.

2. Tanto el estímulo con Fe como con glucosa produjo una mayor expresión de Nf-Kb y de TLR-2 en diabéticos obesos y en obesos, lo que indujo a una mayor abundancia que genes efectores como IL-6, TNF-α y Hepcidina.

3. Tanto en diabéticos obesos como en obesos se encontró una disminuida expresión de Mfn-2, lo que podría sugerir alteraciones en la actividad mitocondrial de estos sujetos

Conclusiones

GRACIAS