PROGRAMA DE MESTRADO EM SAÚDE MATERNO INFAN TIL

ESTUDO DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANO (H TLV-1)

NA MEDULA ÓSSEA DE PACIENTES PEDIÁTRICOS COM LEUCEM IA

LINFOBLÁSTICA AGUDA DE CÉLULAS T (LLA-T)

HEIKE ERNA BRAND

RECIFE 2008

INSTITUTO MATERNO INFANTIL

PROFESSOR FERNANDO FIGUEIRA

HEIKE ERNA BRAND

ESTUDO DO VÍRUS LINFOTRÓPICO DE CÉLULAS T HUMANO (H TLV-1)

NA MEDULA ÓSSEA DE PACIENTES PEDIÁTRICOS COM LEUCEM IA

LINFOBLÁSTICA AGUDA DE CÉLULAS T (LLA-T)

Linha de pesquisa: Saúde da criança

Dissertação apresentada ao Colegiado do Mestrado em

Saúde Materno Infantil do IMIP como parte dos requisitos

para obtenção do grau de Mestre em saúde Materno-

Infantil.

Orientador: Prof. João Guilherme Bezerra Alves

Co-Orientadora: Dra. Norma Lucena-Silva

RECIFE 2008

Aluna: Heike Erna Brand

Biomédica

Tel. (81) 8778-8069 ou (81) 3231-1589

e-mail. heikebrand@yahoo.com.br

Orientador: Prof . João Guilherme Bezerra Alves

Coordenador do programa de Pós-Graduação do IMIP

Professor Adjunto da UPE

Doutor em Medicina – UFPE

Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira – IMIP

Rua dos Coelhos, 300 Boa Vista

Recife – PE – Brasil CEP 50.070-550

Tel. (81) 2122-4122

e-mail. joaoguilherme@imip.org.br

Co-Orientadora: Dr. Norma Lucena-Silva

Pesquisadora Sênior do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz

Responsável pelo Laboratório de Biologia Molecular do Serviço de Oncologia do

Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira – IMIP

Rua dos Coelhos, 300 Boa Vista

Recife – PE – Brasil CEP 50.070-550

Tel. (81) 2122-4764

e-mail. norma.lucena@cehope.com.br

AGRADECIMENTOS

À Diretória do IMIP pelo apoio financeiro através da bolsa de Mestrado no periodo

de Mar 2007-Jun 2008. E ao CNPq pela bolsa de Mestrado a partir de julho 2008.

Ao Serviço de Oncologia Pediátrica do Instituto Materno Infantil, em especial a Dr.

Francisco Pedrosa, pela oportunidade em desenvolver esse projeto.

A Dra Norma Lucena pela excelente orientação, apoio, estímulo, aprendizagem e

confiança em fazer esse trabalho.

Ao Prof. João Guilherme pelo apoio de todo o momento e no direcionamento dos

meus passos.

Aos Professores do Mestrado e a 13. turma do Mestrado, pelo aprendizado, ajuda e

paciência em entender o meu português.

Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular, pela receptibilidade a minha

pessoa e as minhas perguntas.

Às minhas amigas alemãs, Iris, Michaela e Konny, que sempre estiveram presentes

em momentos difíceis, mesmo à distância.

Às minhas amigas brasileiras, Graça, Germannya, Celina e a Família de Purna

Ananda Ashram que me ajudaram em várias formas e me mostraram a beleza do

Brasil.

E, aos meus pais que sempre apoiaram as minhas decisões de vida.

Dedico aos pais

que sofreram a perda de um filho por câncer

Nesta vida, não podemos fazer grandes coisas.

Podemos apenas fazer pequenas coisas com

grande amor.

Madre Tereza de Calcutá

RESUMO

Introdução. A leucemia de células T (LLA-T) ocorre tanto no adulto quanto na criança. O vírus linfotrópico de células T (HTLV-1) é o agente etiológico de uma fração das LLA-T que ocorrem no adulto conhecida por leucemia de células T do adulto (ATL). Mundialmente são 10-20 milhões pessoas infectadas pelo HTLV-1. Contudo, apenas 2-5% dos indivíduos infectados desenvolvem a ATL após 40-60 anos de infecção. A medula óssea tem sido considerada um reservatório para o vírus pela incapacidade das células precursoras hematopoéticas, que albergam o vírus, serem incapazes de expressarem antígenos virais e, por conseguinte, de serem reconhecidas pelo sistema imune, sendo esse um dos mecanismos propostos de evasão da resposta imune em portadores assintomáticos durante latência clínica. A via de transmissão do vírus pela amamentação e durante o parto é um fator de risco para adquirir a ATL, enquanto a transmissão sexual ou endovenosa parece estar relacionada com o desenvolvimento da paraparesia espástica tropical. A criança pode, portanto, ser portadora do vírus já ao nascimento. Contudo, a associação do vírus na leucemogenesis da leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T) pediátrica é pouco estudada. Objetivo. Determinar da freqüência do HTLV-1 e a expressão de genes virais na medula óssea de pacientes pediátricos com LLA-T e descrever as alterações celulares e características clínicas nos pacientes infectados pelo vírus. Metodologia. Amostras de medula óssea, armazenadas em banco de células, de 24 pacientes pediátricos diagnosticados com LLA-T entre 2004-2007 no Serviço de Oncologia Pediátrica do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP) foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) específica para detecção do genoma do HTLV-1 e análise de expressão de genes virais e celulares. Resultados. O genoma de HTLV-1 foi encontrado em 6 das 24 (25%) amostras de medula óssea. Mas também, quatro dos pacientes negativos mostraram expressão de genes virais. Considerando ambos resultados, do genoma e de RNA do HTLV-1, a presença do HTLV-1 apresentou uma freqüência de 33%. O grupo de 10 crianças com LLA-T e infecção pelo HTLV-1 apresentou uma menor contagem de leucócitos periféricos (p<0,02) e uma menor expressão celular do fator de transcrição c-fos (p<0,01) em relação ao grupo de 14 crianças com LLA-T sem infecção. Conclusão. A frequência do HTLV-1 e a expressão dos genes virais na medula óssea de crianças com LLA-T foi relatada pela primeira vez. Houve uma menor contagem de leucócitos e expressão celular do fator de transcrição c-fos nas crianças portadores de LLA-T e infectadas pelo HTLV-1. Os dados apontam para o início de atividade viral no portador jovem. A presença do HTLV-1 na medula óssea sugere o envolvimento na leucemogênese suscitando mais estudos.

Palavras-chave : HTLV-1, medula óssea, LLA-T, criança.

ABSTRACT

Introduction. The acute T-cell lymphoblastic leukemia (T-ALL) is a disease which shows manifestation in the adult as well as the child. The Human T-cell linfoma vírus-1 (HTLV-1) is known to be the etiologic agent of a subpopulation of T-ALL which manifests only in the adult, known as adult T-cell leukemia (ATL). Worldwide, 10-20 million people are infected with HTLV-1. However, only 2-5% of infected people develop ATL and only 40-60 years after infection. The bone marrow was thought to be a deposit for virus, due to lacking capacity of hematopoetic stem cells, which are infected by virus, to express viral antigens. This will result in the loss of detection through the immune response in asymptomatic carriers during clinical latency. One risk factor to acquire ATL is the route of transmission through breast milk, whereas sexual or intravenous transmission shows relation in the development of the tropical spastic Paraparesis (HAM/TSP). Therefore, children can already be considered to be carriers of the virus. However the association between the virus and pediatric acute T-cell lymphoblastic leukemia (T-ALL) is rarely studied. Objective. Determination of frequency of HTLV-1 and expression of viral genes in bone marrow of pediatric patients with T-ALL and description of cellular alterations and clinical characteristics of patients infected by the virus. Material and Methods. Bone Marrow (BM) samples, stored at the tumor bank, of 24 pediatric patients diagnosed with T-ALL between 2004-2007 at the pediatric Oncology Service of the Instituto Materno Infantil Prof Fernando Figueira (IMIP) were submitted to polimerase chain reaction (PCR) specific for detection of HTLV-1 provirus and viral gene expression. Results. Proviral DNA of HTLV-1 was found in 6 out of 24 (25%) BM samples. Four patients, negative for detection of provirus showed viral gene expression. Considering both results of provirus and mRNA expression, the presence of HTLV-1 give a frequency of 33%. Those 10 children with T-ALL and HTLV-1 infection showed lower leucocytes counts in blood (p<0,02) and a lower expression level of cellular transcription factor c-fos in relation to the 14 children with T-ALL and without viral infection. Conclusion. The frequency of HTLV-1 and the expression of viral genes in bone marrow in children with T-ALL were reported for the first time. Smaller leukocyte counts and lower expression levels of the cellular transcription factor c-fos in children carriers of T-ALL infected with HTLV-1 was observed. The data indicate a viral activity early in life. The presence of HTLV-1 in bone marrow suggests the involvement of leukemogenesis in T-ALL and recommends more studies. Keywords: HTLV-1, Bone Marrow, T-ALL, Leukemia, pediatric

LISTA DE ABREVIATURAS

ATL leucemia de célula T no adulto

APC célula apresentadora de antígeno

BLV vírus linfotrópico bovino

BM Bone Marrow (Medula óssea)

bp pares de bases

CD cluster of differentiation

(marcador na superfície de células hematopoéticas)

cDNA DNA complementar

CD4+ CD característico para linfócito auxilar

CD8+ CD característico para linfócito citotóxico

CD34+ CD característico para célula tronco hematopoética

CFU Colony forming Unit (unidade formadora de colônia)

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento científico e tecnológico

CNS Central nervous system (sistema nervoso central)

CTL linfócito T citotóxico

DHL lactato dehidrogenase

DNA ácido desoxiribonucléico

EGIL Grupo Europeu de Estudos de Leucemias

ELISA Enzima linked imunoabsorband assay

Env gene viral codificando proteínas de “envelope”

FAB Grupo cooperativo Franco-Americano-Britânico

Gag gene de antigene viral

HAM/TSP mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia tropical espástica

HIV vírus da imunodeficiência humana

HTLV-1 vírus linfotrópico de células T tipo 1

IDH dermatite infecciosa associada ao HTLV-1

IL Interleucina

IL-R receptor de interleucina

IMIP Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira

KDa Kilo Dalton

LLA leucemia linfoblástica aguda

LTR terminais longos de repetição

MHC Major Histocompatibility Complex

(complexo de histocompatibilidade maior)

MIC Critérios morfológicos, imunológicos e citogenéticos

MO Medula óssea

MW Molecular Weight (Peso Molecular)

Nested-PCR

PCR aninhada

NK Natural killer cell (célula assasina natural)

ORF Open Reading Frame

PB peripheral blood (sangue periférico)

PBMC células mononucleares do sangue periférico

PCR reação em cadeia da polimerase

Pol gene viral codificando a polimerase viral

primer oligonucleotídeo (iniciador)

Pro gene viral codificando a protease viral

mRNA ácido ribonucléico menssageiro

RT transcrição reversa

SP Sangue periférico

STLV vírus linfotrópico de células T de simio

WHO World Health Organization (Organização Mundial de Saúde)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Hematopoiese ………………………………………………………….. 1

Figura 2 Mapa geográfico do Brasil mostrando a soroprevalência do

HTLV-1 nos estados…………………………………………………… 5

Figura 3 Mecanismo da infecção das células pelo HTLV-1 ………………… 7

Figura 4 Genoma do HTLV-1 …………………………………………….… 9

Figura 5 Esquema dos diferentes processamentos e Isoformas de mRNAs

virais ……………………………………………………………………... 10

Figura 6 Interação da proteína viral TAX nas vias metabolicas ……………... 13

Figura 7 Modelo da evolução de infecção pelo HTLV-1 até o

desenvolvimento de ATL …………………………………….………... 15

Figura 8 Modelo de latência do HTLV-1 na doença HAM/TSP ……………… 17

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 1

2 OBJETIVOS ...................................................................................... 19

2.1 Objetivo geral .................................................................................. 19

2.2 Objetivos específicos ..................................................................... 19

3 REFERÊNCIAS ................................................................................. 20

4 ARTIGO PRINCIPAL ........................................................................ 28

SEGUNDO ARTIGO 51

5 ANEXOS e APÊNDICES ................................................................. 53

Apêndices I – Termo de Consentimento livre e escla recido

Anexo I – Aprovação Comitê de Ética

Anexo II – Carta de submissão à resvista - segundo artigo

1. INTRODUÇÃO

As leucemias são neoplasias hematológicas malignas e heterogêneas, que

têm a sua origem em células da medula óssea. Os primeiros casos foram relatados

no século XIX com a observação de alteração da medula óssea em pacientes

falecidos1. Desde esta época, o conhecimento sobre a procedência e o

desenvolvimento, tanto dos métodos diagnósticos como das formas de tratamento,

avançaram e de acordo com esses critérios, hoje as leucemias são classificadas em

vários tipos e subtipos.

A hematopoiese consiste no processo de maturação em cascata da linhagem

hematopoiética, iniciada pelas células pluripotentes que residem na medula óssea1

(fig.1).

fig1.

http://images.google.com.br

Dependendo do tipo da linhagem com desenvolvimento comprometido, dar-se

origem a um tipo de leucemia específico, como a leucemia mielóide ou linfóide. A

forma linfóide pode ser dividida segundo as células afetadas em: de células B ou de

células T. Em geral, as leucemias se distinguem em agudas e crônicas. As formas

agudas são caracterizadas pelo acúmulo das células-troncos (blastos) e a perda da

capacidade de diferenciação para células maduras. Modelos mais complexos foram

desenvolvidos para classificar as leucemias, com o objetivo de estratificá-las quanto

ao risco e melhor adequar o protocolo de tratamento. Os modelos variam quanto aos

métodos diagnósticos e se dividem em classificação FAB (Grupo cooperativo

Franco-Americano-Britânico, 1976, critérios morfológicos-citoquímicos), MIC (1986,

critérios morfológicos, imunológicos e citogenéticos), EGIL (Grupo Europeu de

Estudos, 1995, critérios imunofenotípicos) e WHO (World Health Organization, 2001,

critérios citogenéticos/moleculares, história de terapia prévia ou aspectos

mielodisplásicos)2-5 .

O diagnóstico laboratorial da leucemia inclui a hemograma e a mielograma

para a análise morfológica com contagem e testes citoquímicos das células. O

diagnóstico da leucemia aguda é dado pelo aumento de blastos na medula óssea e,

portanto, depende do modelo usado, ou seja, 20% para a WHO ou 30% para o

grupo FAB. A imunofenotipagem é uma técnica importante no diagnóstico, que se

baseia na determinação dos marcadores celulares (Cluster of differentiation, CD),

usando a citometria de fluxo. Com esse método, mudanças quantitativas e

qualitativas na hematopoiese podem ser identificadas, desta forma, permite a

identificação do estágio de maturação do clone leucêmico6. A análise molecular é

outra abordagem metodológica na caracterização do clone leucêmico que visa à

identificação da alteração genética associada a gênesis da leucemia7.

Mundialmente, o câncer é a primeira causa de morte. De acordo com a WHO,

em 2005, mais de 70% de todas as mortes causadas pelo câncer ocorreram em

países de renda per capita média ou baixa8. O câncer pediátrico representa 0,5% a

3% de todos os tumores, na maioria das populações. Os tumores predominantes no

paciente infantil são as leucemias. No Brasil, as leucemias abrangem 15 a 45% entre

todos os tumores infantis e no Recife, 22,57% de casos novos de tumores, são

devido a essa doença hematológica9,10. A leucemia linfoblástica aguda (LLA)

representa 80% de todos os casos de leucemia na criança e 15% desses são devido

às células T7, 11.

A LLA-T se encontra tanto no adulto quanto na criança. A etiologia não é bem

determinada mas fatores de risco ambientais (radiação durante gravidez, fumo) ou

fatores genéticos foram discutidos. Queixas e manifestações clínicas inespecíficas

envolvem febre, anemia, leucócitos baixo ou >100.000/µl, fadiga, dor óssea e

possível envolvimento do sistema nervoso central (SNC). As formas de tratamento

incluem quimioterapia, radioterapia, uso de esteróides e transplantes de medula

óssea. Na criança, a taxa de remissão é alta, chegando a atingir 100%, embora a

sobrevida livre de eventos em 10 anos, é apenas cerca de 63% e no adulto 25-35%7.

A leucemia de célula T do adulto (ATL) representa mais uma entidade entre

as leucemias linfóides e não deveria ser confundida com a LLA-T do adulto. Na

criança foram relatados casos esporádicos, com sintomas parecidos de ATL12, mas

em geral, a doença se refere só ao adulto.

A ATL foi descoberta no Japão em 1977 e existem quatro subtipos distintos.

Estes estão relacionados às características clínicas e se dividem em agudo, crônico,

smoldering e tipo linfoma. Manifestações clínicas típicas são hipercalcemia, lesões

de pele, crescimento de linfonodo, elevação de lactato desidrogenase (DHL),

números de leucócitos aumentados e massa de mediastino revelado ao raio X. Além

disso, na forma aguda também se encontram no esfregaço de sangue periférico,

linfócitos com uma morfologia característica, as chamadas flower cells13. As formas

agudas e tipo linfoma são mais agressivos e, o prognóstico é reservado. O tempo de

sobrevida médio, relacionado a essas formas, é de um ano. Ao lado da

quimioterapia combinada e transplantes de células-troncos alogênicas como as de

cordão umbilical, novas formas de tratamento incluindo drogas alvo de estruturas

moleculares e anticorpos monoclonais têm surgido14, 15.

HTLV-1

De acordo com a WHO, o HTLV-1 é reconhecido como agente etiológico da

ATL. Ele é um retrovírus delta, que faz parte da família Retroviridae de gênero de

HTLV-BLV16. Ele foi o primeiro retrovírus associado ao câncer no ser humano e

descoberto em 198017. Além da ATL, o vírus também é responsável por outras

doenças, como a mielopatia associada ao HTLV-1/paraparesia espástica tropical

(HAM/TSP), uma doença neurodegenerativa; a uveite, uma doença oftalmológica; a

dermatite infecciosa (IDH) e a artropatia inflamatoria crônica associada ao HTLV-1

(HAAP)18, 12,19. Outros tipos de HTLV foram descorbertos. O HTLV-2, apesar de não

estar relacionado ao desenvolvimento de leucemia, foi isolado primeiro num paciente

com a leucemia de células pilosas20. Recentemente, os HTLV-3 e HTLV-4 foram

isolados em indivíduos na África21.

Mundialmente 10-20 milhões pessoas são infectadas com HTLV-1. Áreas

endêmicas com mais de 1% da população infectada são: Japão, África Sub-

Saariano, América do Sul e as Ilhas do Caribe22. De acordo com dados mais

recentes obtidos em estudos com doadores de sangue, o Brasil tem o maior número

absoluto de pessoas infectadas pelo HTLV-1 no mundo. Estimativas calculam 2,5

milhões de Brasileiros infectados23. Um estudo feito nas capitais dos 27 estados no

Brasil mostrou a maior prevalência na região Norte e Nordeste. Com 10,0/1000 em

São Luís (Nordeste) comparados com 0,4/1000 em Florianópolis (Sul). Pernambuco

mostrou uma prevalência de 7,5/1000 pessoas infectadas24 (fig.2).

fig2. Catalan-Soares B et al. 2005

O vírus é transmitido sexualmente, através de sangue contaminado,

verticalmente pela amamentação ou durante o parto12,25. Mas, apenas 2-5% dos

portadores do HTLV-1 desenvolvem uma das doenças relacionadas ao vírus e

geralmente só 40 a 60 anos pós-infecção, sendo, portanto, a maioria dos indivíduos

infectados portadores assintomáticos15.

O diagnóstico de infecção pelo HTLV-1 é feito através da determinação de

anticorpos no soro pelo ELISA que são produzidos contra proteínas estruturais do

vírus26. Contudo, se mostrou que este teste pode subestimar a prevalência da

infecção. Um estudo de prevalência, realizado em Salvador/Brasil, com 1385

indivíduos não conseguiu detectar anticorpos em menores de 13 anos de idade27.

Testes confirmatórios são o Western Blot, que detecta proteínas virais e a PCR, que

identifica DNA proviral nas células mononucleares do sangue periférico26.

Uma característica do retrovírus é o genoma viral constituído de duas fitas

simples de RNA. O RNA viral, após a entrada na célula, é transcrito reversamente

em DNA viral, chamado provírus e assim pode se integrar no genoma da célula do

hospedeiro. A integração do HTLV-1 no genoma ocorre de forma aleatória e é

específica para cada célula infectada16.

Para a disseminação do vírus, existem várias possibilidades. Em contraste

com outros retrovírus, como o HIV, infecções de células pelo virion de HTLV-1 no

sobrenadante (livre de células) não se mostraram eficientes, todavia essa

possibilidade foi documentada em testes in vitro28. O HTLV-1 infecta uma célula

principalmente pelo contato célula infectada com célula não infectada. Na conjunção

entre essas células se forma um centro organizado de microtúbulos (MTOC) que é

estabilizado pelas várias moléculas celulares. No MTOC se cria uma sinapse viral

através da qual o RNA viral consegue entrar na célula ainda não infectada (fig.3)29.

Uma outra possibilidade para a disseminação do vírus e a forma mais

importante, inclui a proliferação da célula infectada. Assim o provírus integrado no

genoma do hospedeiro é entregue à célula filha durante o processo da divisão

celular (mitose)15.

fig.3 Matsuoka et al. Nature Reviews 2007

O HTLV-1, após a infecção, preferencialmente se integra no genoma

de células linfóide T (CD4+), aonde as proteínas virais conduzem as alterações

intracelulares15. Assim, durante muito tempo, pensou-se que o vírus tinha um

tropismo para esse tipo de célula30. Entretanto, outras células também mostraram

suscetibilidade ao vírus, como linfócitos T supressores29, linfócitos T citotóxico,

monócitos do sangue periférico, macrofágos, células dendríticas, células NK,

linfócitos B, astrócitos presentes no SNC, células gliais, fibroblastos, células

endoteliais e epiteliais31. Concomitantemente, as células CD34+ mostraram

suscetibilidade à infecção com HTLV-1. Análises com CD34+ humanas em

camundongos transgênicos mostraram a presença do provírus em todas as

linhagens hematopoéticas (incluindo linfócitos T, monócitos/macrófagos), depois da

diferenciação in vitro e in vivo. Se a infecção pelo HTLV-1 também altera o padrão

da diferenciação para uma linhagem específica conduzido, por exemplo, pela

ativação ou repressão de genes diferentes, ainda não está esclarecido32.

Em humanos, a suscetibilidade das células CD34+ ao vírus tem mostrado

resultados controversos. Um estudo utilizando a metodologia da PCR-Hibridização in

situ mostrou que em pacientes com HAM/TSP até 95% das células da medula óssea

(MO) estavam infectadas com provírus, apesar do mRNA viral não estar expresso31.

Outro estudo em pacientes com ATL usando a PCR mostrou a presença do vírus em

células mononucleares isolados da MO, contudo, células CD34+ purificadas através

da citometria de fluxo mostraram-se não infectadas32.

A defesa celular envolve os linfócitos T como principal mediador. A população

de linfócitos T se divide em células T auxiliares (CD4+), em células citotóxicas

(CD8+) e em células T supressoras (CD4-, CD8+). Os linfócitos T auxiliares e

citotóxicos circulam entre os órgãos linfóides ou não linfóides e o sangue periférico

(SP), procurando complexos de histocompatibilidade maior (MHC) na superfície das

células. Esses linfócitos interagem através dos seus receptores de células T (TCR)

com os MHCs das células, enquanto os linfócitos T supressores modulam a resposta

imunológica negativamente33. As alterações sofridas pelos linfócitos infectados

resultam em imortalidade das células e depois em transformações que prejudicam a

sua funcionalidade comprometendo a defesa, permitindo infecções oportunistas,

especialmente por Strongyloides stercoralis, Pneumocystis jiroveci e Mycobacterium,

que são frequentes em pacientes com ATL. Na infecção pelo HTLV-1, os CTLs

destroem as células CD4+ infectadas controlando a carga proviral sendo, portanto,

um dos principais reguladores da infecção15. Todavia, foi mostrado que durante a

infecção natural com HTLV-1, um número significante de CTLs também podem ser

infectadas; em conseqüência, essas CTLs se programam para a auto-destruição e

assim limitam a defesa antiviral31.

O genoma viral tem um tamanho de nove mil pares de bases (9kb) e é

dividido em várias regiões, a saber: LTR, gag, pol, env e pX (fig. 4). Em ambos as

extremidades (5´e 3´) se localizam os longos terminais de repetição (LTR), que têm

seqüências idênticas e servem como promotores para o vírus e a regulação da

transcrição dos RNA’s virais. As seqüências gag, pol e env representam genes que

codificam as proteínas estruturais e a região pX codifica as proteínas reguladoras do

vírus34. A ausência de um local de integração específica do HTLV-1 no genoma do

hospedeiro e a falta de um oncogene no genoma viral, sugeriu que um produto viral

deveria conduzir a imortalização das células infectadas. Várias proteínas virais são

codificadas na região pX, cuja atividade de imortalização em células primárias CD4+

tem sido atribuída35.

fig.4 Matsuoka et al. Nature Reviews 2007

Quando o provírus é integrado ao genoma e a célula T é ativada, um conjunto

de fatores de transcrição celular e co-fatores intracelulares se ligam ao LTR e iniciam

um nível basal de transcrição de mRNAs virais. Este é um processo complexo e a

etapa de iniciação ainda não está completamente entendida31. O acúmulo celular da

proteína viral TAX estabiliza e fortalece a ligação de fatores celulares ao LTR,

aumentando a transcrição dos genes virais16.

A primeira fita de RNA transcrita, representa uma fita de ribonucleotídeos,

completa da seqüência do provírus. Esse RNA primário (unspliced) será submetido a

um processamento alternativo que remove os íntrons e recombina os éxons em

seqüências determinadas. O provírus possui três éxons e os transcritos produzidos

podem ser distinguidos como unspliced, single spliced ou double spliced,

dependendo dos éxons incluídos36 (fig. 5). Assim, o vírus consegue criar uma

variedade de fitas de mRNA com um genoma viral relativamente pequeno.

Recentemente, um transcrito adicional foi descoberto codificando a proteína HTLV-1-

bZip (HBZ). Esse transcrito é produzido pela ação do promotor 3´LTR e está

codificado na fita negativa do provírus37. A transcrição de HBZ pode ser feita apartir

de dois sítios de iniciação e por isto resulta em dois transcritos de mRNA

diferentes38.

fig.5 Matsuoka et al. Nature Reviews 2007

Quantificações de mRNAs virais em vários tipos de células infectadas,

mostraram variabilidade na expressão, entre os tipos das células. Entretanto, os

níveis de expressão dos mRNAs entre si, foram iguais em cada célula39. Após a

transcrição dos genes virais, os mRNAs são traduzidos no citoplasma em proteínas,

usando a maquinaria da célula do hospedeiro.

A proteína REXp27 é uma proteína de tamanho 27 kDa que regula a

expressão dos genes virais pós-transcricional. Ela é responsável pelo transporte dos

mRNA’s virais unspliced ou single spliced, do núcleo para o citoplasma16. Uma

proteína REX truncada, de 21 kDa (p21Rex), também foi observada. Esta proteína é

traduzida a partir de um transcrito entre éxon 1 e 3 (single spliced) que é

preferencialmente produzido de provírus defeituosos (com deleções nas seqüências

gag, pol e env).

A função de p21 não é completamente esclarecida, mas uma ação

antagonista ao REXp27 foi sugerida16,40. A p12 possivelmente participa bloqueando a

apoptose da célula T dependente de interleucina 2 (IL-2). Adicionalmente, uma

redução da expressão das proteínas MHC classe I na superfície da célula foi

observada em células que expressam p1231. A proteína viral de 30kDa (p30) age

como modulador negativo pós-transcricional na expressão das proteínas virais41. A

proteína p13 é feita por um processamento simples do mRNA entre éxon 1 e éxon 3.

Na proteína p13 existe uma seqüência sinal para localização mitocondrial

(mitochondrial targeting signal, MTS) onde a p13 conduz alterações morfologicas à

mitocondria31. O interesse pela proteína HBZ surgiu mais recentemente a partir de

experimentos com camundongos transgênicos de TAX. Esses camundongos

desenvolveram uma série de tumores, contudo, nenhuma relação entre TAX e o

desenvolvimento de leucemia foi relatada, sugerindo a participação de uma outra

proteína viral no desenvolvimento da ATL e a possibilidade de HBZ estar envolvida

neste processo42. A HBZ mostrou uma função bimodal dependendo da forma em

que se apresenta, mRNA ou como proteína43. Além disso, a HBZ interage com

fatores de transcrição inibindo a interação entre eles e a TAX ou as seqüências em

promotores44. A expressão de mRNA HBZ é de 20-50x menor do que o mRNA Tax.

Todavia, ao contrário do mRNA de Tax, o mRNA de HBZ sempre é expresso em

células primárias de ATL. Ao lado da função supressora da proteína HBZ, o mRNA

de HBZ figura como estimulador na proliferação das células T42.

A TAX é uma fosfoproteína de 40kDa preferencialmente localizada no núcleo

na maioria das células e é resultado de um processamento duplo (double splicing)

de mRNA primário, entre éxon 1, 2 e 3. Esta proteína tem um papel pleiotrópico e é

a mais estudada entre as proteínas virais. As suas principais funções são: o

reconhecimento pelo sistema imunológico, a modificação da transcrição dos mRNAs

virais, a imortalização, transformação e oncogenêses das células infectadas pelo

HTLV-1. Esse processo ocorre nos vários níveis que envolve a modulação na

transcrição de genes celulares, repressão de apoptose, progressão do ciclo celular,

inativação de genes de supressores de tumores, amplificação de centrosomos e

dano de DNA estrutural31,16,45-47.

A modulação na transcrição exercida por TAX geralmente leva a um aumento

na transcrição de genes celulares incluindo os fatores de crescimento, citocinas,

receptores de fatores de crescimento, moléculas de adesão celular, transmissores

de sinais citoplasmáticos e fatores de transcrição nuclear15. A única repressão da

transcrição induzida pela TAX é a da enzima responsável pelo reparo de DNA, a

DNA polimerase beta16. A proteína não se liga diretamente ao promotor, mas

interage fisicamente pelos seus domínios com fatores de transcrição. Entre eles,

Nuclear Factor-kappa B (NFκB), Serum Response Factor (SRF) , Sp1/CBP, AP-1 e

c-Amp responsive element binding protein (CREB)16 (fig.6).

A seqüência sinal para exportação da TAX permite que a TAX produzida no

citoplasma seja secretada pela célula48. A estimulação de genes endógenos pela

TAX extracelular foi comprovada49. Contudo, a TAX no citoplasma mostrou um papel

importante na modulação de algumas vias de sinalização, interagindo com uma

variedade de proteínas e resultando em alterações downstream na via, como a via

de NFκB que também está envolvida em vários processos celulares50,31.

fig. 6 Yao et al. Frontiers in Bioscience

2000

HTLV-1 e ATL

As células envolvidas na ATL, encontradas no sangue periférico, são

predominantemente CD4+ e em 90-99% dessas células foram achados HTLV-1

positivos30. Para o desenvolvimento da doença, a célula infectada tem de passar por

várias etapas. A primeira etapa após a infecção é a imortalização, que resulta em

proliferação das células e é caracterizada pelo crescimento dependente de IL-2.

Esta proliferação é resumida a expressão constitutiva da cadeia α do Receptor IL-2

(IL-2R), que forma junto com as cadeias β e γ, um receptor funcionalmente ativo.

Porém, isto pode não ser suficiente para desenvolver a ATL sendo necessário mais

alterações ao nível genético ou epigenético e, provavalmente, uma alteração na

defesa imunológica do hospedeiro51. Após a imortalização, a célula sofre um

processo de transformação. Nesse processo, a célula desenvolve a possibilidade da

proliferação independente da ação de IL-2, mesmo na presença de uma expressão

aumentada da cadeia α de IL-2R52,16.

O processo inicial da transformação, a razão da latência clínica prolongada e

o porquê apenas 2-5% das pessoas infectadas com HTLV-1 desenvolvem a ATL,

ainda não são conhecidos. Vários fatores de riscos foram descritos, entre eles, o

sexo31, a hereditariedade15, aumento do número de linfócitos atípicos associado à

carga proviral53,54, baixo nível de anticorpos anti-TAX no soro54 e a transmissão

vertical de HTLV-115.

As mulheres geralmente apresentam uma maior prevalência de infecção pelo

HTLV-1, por serem mais vulneráveis à transmissão do vírus por via sexual. Todavia,

os homens têm uma probabilidade 40% maior em adoecer com ATL31. Um maior

número de casos de ATL foi descrito em famílias sugerindo uma predisposição

genética para desenvolver esse tipo de leucemia15. Pacientes com IDH durante a

infância, geralmente manifestam ATL55.

A mutagêneses na formação de tumores, pela inserção do retrovírus no

genoma, é bem documentada em animais56. O local da integração do provírus do

HTLV-1 no genoma do hospedeiro varia entre os pacientes com ATL, mas mostrou

uma integração preferencial em regiões ricas em nucleotídeos AT57 e, 53% das

integrações ocorrem em regiões de genes58. Adicionalmente, em cerca de 30% dos

pacientes existe uma correlação alta entre o número de cópias integradas por célula

e a manifestação clínica da doença, tendo 50,6% mostrado uma única cópia do

provírus enquanto em 20,6% dos casos foram encontrados múltiplos locais de

integração em células mononucleares de sangue periférico16.

Uma observação feita em células leucêmicas isoladas de paciente com ATL

em contraste com células infectadas em HAM/TSP é a ausência ou expressão baixa

da proteína viral TAX. Transcritos foram detectados apenas em aproximadamente

40% de células de ATL. A TAX causa alterações intracelulares, mas também induz a

resposta imunológica. Dessas observações, resultou a idéia de que a maioria das

células infectadas seria destruída logo pelas CTLs. Assim, apenas a célula infectada

que desenvolveu um mecanismo de baixar o nível da expressão das proteínas virais,

não seria atingida pela destruição e sobreviveria. Esta célula continuaria a se

proliferar, aumentando os números de células infectadas no corpo e se tornaria

leucêmica. Esta idéia explica, como as células infectadas na ATL conseguem se

expandir, mesmo com o sistema imunológico não afetado (fig. 7)15.

fig.7 Yasunaga J-I et al. Cancer Control 2007

Vários mecanismos para escapar da defesa imunológica foram propostos.

Provírus defeituosos, com deleções de seqüências gag-pol59, mutações nas

seqüências de TAX no local de ligação com HLA-A60 foram relatados. A perda da

região LTR no genoma viral em 39% dos casos com ATL, que é necessário para a

expressão dos mRNAs virais, também foi descrito61. Outro mecanismo de escape

imune proposto a partir da observação de mais de 50 regiões hipermetiladas no

genoma celular encontradas em células de ATL foi a ocorrência de modificações

epigenéticas, que interferem no processo da transcrição de genes62.

Contudo, o maior fator de risco em adquirir a ATL em comparação com outras

doenças causadas por HTLV-1, é a via da transmissão do vírus. A amamentação foi

relacionada a ATL, enquanto a infecção intravenosa ou por via sexual, mostrou uma

maior ocorrência em HAM/TSP63. A hipótese é, que a via da primeira infecção dê ao

vírus acesso para um conjunto de células específicas influenciando de forma

diferente o curso da doença. A maioria das células dentríticas e macrófagos se

encontram em membranas de mucosa. Assim pensou-se, que essas seriam as

células alvos do vírus, durante a infecção inicial pela amamentação31. As células

dendríticas são células apresentadoras de antígenos (APC) que eficientemente

capturam antígenos na periferia, deslocando-se aos órgãos linfáticos secundários

onde estimulam células nativas T e B ou células de memória31. Ratos infectados

oralmente com HTLV-1 mostraram uma resposta imunológica baixa em comparação

com as vias de transmissão intraperitoneal ou intravenosa, todavia, a carga proviral

era alta64. Isto pode ser atribuído às células dendríticas e macrófagos que

permanecem na fase pós-mitótica no ciclo vital, e como conseqüência promovem

uma expressão baixa de proteínas virais, que são necessários para o

reconhecimento pelas CTLs31.

A latência clínica é prolongada nas ATL e HAM/TSP e caracterizada como o

estado que envolve uma resposta imunológica efetiva e a intervenção na expansão

do vírus. A evasão da resposta imunológica pelos mecanismos que envolvem a

perda da expressão das proteínas virais já foi mencionada. Experimentos feitos em

macacos mostraram mais uma alternativa: a medula óssea como reservatório do

vírus. Logo após a infecção dos macacos via intravenosa, o provírus foi localizado

em células da MO e do sangue periférico31. As células CD4+ e CD8+ normalmente

migram entre os tecidos linfóides incluindo a MO e o sangue periférico, desta forma

os linfócitos T infectados conseguem entrar em contato com as células-troncos

hematopoéticas (CD34+)31 (fig. 8).

fig.8 Grant C et al. J Cell Physiol 2002

A conseqüência patológica que resulta da invasão do vírus na MO é que

CD34+ não serão suscetíveis à resposta imunológica. As células CD34+ são

transcricionalmente ativas, mas são incapazes de expressar as proteínas virais. Esta

incapacidade é devido à ausência de fatores de transcrição específicos, necessários

para a iniciação no promotor viral31. A invasão da medula pelo vírus facilitaria a

disseminação periférica com células infectadas. Células T pré-tímicas infectadas

poderiam levar a infecção aos órgãos linfóides secundários, onde vários outros tipos

de células se encontram em proximidade com as células infectadas. Para ressaltar a

importância da idéia de um reservatório do vírus durante a latência clínica, se

mostrou que a eliminação da população infectada na MO tem influência no

desenvolvimento da infecção pelo HTLV-1. Um jovem, doente com anemia congênita

e infecção pelo HTLV-1 em decorrência das várias transfusões de sangue, mostrou

eliminação completa após o tratamento com quimioterapia e transplante alogênico.

Toda a carga proviral em sgue periférico e MO desapareceu em 320 dias após o

transplante e, ficou ausente até pelo menos 60 meses65.

A partir de um estudo feito na Europa, que mostrou uma soroprevalência de

HTLV-1 seis vezes maior em gestantes do que em doadores de sangue, é esperado

que as soroprevalências encontradas no Brasil estejam subestimadas66. Embora a

via de transmissão pela amamentação e a possibilidade da criança nascer portadora

do vírus, a associação da LLA-T ao vírus em pacientes pediátricos é pouco

investigada. Estudos na criança encontrados na literatura científica principalmente

envolvem a determinação de anticorpos, diagnóstico molecular em células

mononucleares do sangue periférico ou focam a manifestações clínicas12,67. A LLA-T

é caracterizada pela proliferação de células-troncos CD34+ da medula óssea com

uma leucocitose elevada e tem um prognóstico per si mais reservado. Investigar a

participação do vírus na génesis da LLA-T e o possível controle que ele exerce na

célula regulando a expressão de genes celulares poderá contribuir para uma melhor

estratificação dos casos e abordagem terapêutica.

Nesse estudo, determinamos a presença de HTLV-1 na medula óssea de

pacientes infanto-juvenis com LLA-T e a expressão de isoformas de mRNA virais.

Também foram investigadas as alterações intracelulares induzidas pelo vírus e a

influência da presença viral nas características clínicas e celulares dos pacientes.

2 OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Determinar a freqüência do HTLV-1 na medula óssea de pacientes pediátricos

portadores de leucemia de células T, diagnosticados entre 2004-2007 no Serviço de

Oncologia Pediátrica do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP)

no Recife, Brasil.

2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Em pacientes pediátricos de LLA-T diagnosticados entre 2004-2007 no Serviço de

Oncologia Pediátrica do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira (IMIP)

no Recife, Brasil:

1. Determinar a freqüência do provírus de HTLV-1 na medula óssea.

2. Determinar a expressão de genes virais na medula óssea.

3. Identificar possíveis alterações induzidas pelo vírus no nível da expressão de

protooncogenes.

4. Descrever a associação entre a presença viral e as variáveis biológicas,

clínicas e laboratoriais.

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4 ARTIGO PRINCIPAL

baseado nas normas da Revista international:

Leukemia Research

Detection of Human T-Cell Leukemia Virus Type I (HT LV-1) Provirus

and viral mRNA Isoforms, in Bone Marrow of Pediatri c Acute T-cell

Leukemia patients

AUTHORS

Brand, Heike1

Neves, Lídia1

Alves, João Guilherme Bezerra1

Pedrosa, Francisco1

Lucena-Silva, Norma1,2

The Pediatric Oncology Service, IMIP1 and Aggeu Magalhães Research

Center/Fiocruz2.

Corresponding author: Dr. Norma Lucena-Silva, The Pediatric Oncology

Service/Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira; Rua dos Coelhos, n.300,

Quinto andar, Boa Vista, cep:50070-550, Recife, Pernambuco, Brazil. Tel.: 55 81

21224764. e-mail: norma.lucena@hotmail.com

JOURNAL SUBMISSION

Leukemia Research [Elsevier]

Abstract

To investigate the association of HTLV-1 in pediatric T-cell leukemia we used

patient’s bone marrow for determining the virus presence and the gene activity of

proto-oncogenes normally upregulated by viral protein TAX. Proviral DNA was

detected in 6 out of 24 (25%) patients. Interestingly, four provirus-negative samples

showed viral gene expression. The expression of protooncogene c-fos is suggestive

of downregulated, depending on proviral load or viral mRNA expression. Overall,

these data indicate HTLV-1 infiltration of BM early in life and show the possibility of

viral gene expression in a cellular compartment, so far known as being transiently

silent.

Keywords: HTLV-1, T-cell leukemia, Bone Marrow, pediatric, Provirus, mRNA

I. Introduction

Acute Leukemias represent the most frequent type of leukemia in children and 15%

of those have T-cell origin. The remission rate is high, around 80%, but the event free

survival for more than 10 years lies at aprox. 63% [1].

The Human T-Cell Leukemia Virus Type I (HTLV-1) is known to be the etiologic

agent of adult T-cell leukemia (ATL) and other HTLV-1 related diseases, like HTLV-1

associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) [2]. One risk factor to

acquire ATL is the route of transmission of virus, via breast milk [3]. However, only 2-

5% of infected people develop ATL and only after a long latent period of 40-60 years

[4].

The cells mainly affected by HTLV-1 infection, are CD4+ T-lymphocytes. These cells

have the capacity to shuttle into the Bone Marrow (BM), where they thought to be

able to infect CD34+ hematopoetic stem cells. BM was proposed to be a viral

reservoir, since asymptomatic carriers need to develop a mechanism to escape host

immune surveillance during clinical latency. The lack of expression of specific cellular

transcription factors in hematopoetic stem cells, normally necessary for viral gene

transcription, would enable CD34+ cells to escape from host immune defence.

During differentiation into more mature cells, the expression of those factors will

recuperate [5] and transcriptional active HTLV-1 infected cells could than be

constantly be delivered to peripheral blood (PB). In vitro and In vivo studies have

already shown susceptibility of CD34+ cells to HTLV-1 and detection of viral

sequences in all hematopoetic lineages, after differentiation [6]. In situ-Hibridization

technique used in HAM/TSP patients, showed 90-95% of cells in BM positive for

proviral load, although the virus was not found to be transcriptional active in these

cellular compartment [7]. These data was confirmed in BM of ATL patients, although

the infection of CD34+ progenitor cells was not detectable [8].

In the present study, we used the nested-PCR technique to detect provirus of HTLV-

1 in BM samples of pediatric patients with T-ALL. In order to demonstrate the

possibility of active viral gene transcription in this cellular compartment, we measured

the expression of viral mRNA isoforms. In an attempt to study the influencies of virus

on the cellular environment, we did a relative quantification of the c-fos and c-myc

mRNA. Finally, we investigated wether the presence of the HTLV-1 in BM is related

to differences on clinical and laboratorial variables.

II. Material and Methods

2.1. Patients

BM samples collected for diagnosis purpose in the Pediatric Oncology department at

the Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira (IMIP) Recife/Brazil are

afterwards stored at -80oC in a tumor bank with the authorization of the child legally

responsable. From the 31 patients diagnosed with T-ALL in the Oncology

department, between 2004 and 2007, 24 which still had BM stored were included in

our study. Clinical and Imunophenotyping data were obtained from clinical records.

Approval for the study was obtained from the institutional review board and informed

consent was provided, according to the declaration of Helsinki.

2.2. Detection of Provirus

5x106 cells were used for Isolation of genomic DNA, using DNAzol BD Reagent

(Invitrogen) according to the manufacturer’s instruction. DNA was purified afterwards,

using Phenol and precipitated with Ethanol under standard protocols. 100ng DNA

was used as template for the 1.PCR and 1µl out of the 1.PCR was used as template

in the Nested PCR. Conditions used in both PCR’s were, 1x PCR buffer, 0.75mM

MgCl2, 300µM dNTP’s, 1U Taq (Biotools) and 25pmol of each forward and reverse

primer (Figure 1). GAPDH primers were used in a separated reaction. PCR program

used for both Provirus PCR’s were: 95ºC for 3 min, 40 cycles at 95ºC 30 sec, 60ºC

30 sec, 72ºC 30 sec, and 72ºC for 7 min. For GAPDH 30 cycles 95ºC 3 min, 55ºC 1

min, 72ºC 2 min, and 72ºC for 7 min. Amplified products were separated on 2%

agarose gel, bands cut and purified using PURE Link Quick Gel extraction Kit

(Invitrogen).

2.3. Sequencing

10ng of purified PCR product was used for sequencing including 3.2pmol/µl specific

forward or reverse primer, 0.5µl Big Dye, 1µl Save Money Buffer in a total volume of

10µl. Conditions used for reaction were 92ºC 2min, 40 cycles 92ºC 15 sec, 55ºC 15

sec, 60ºC 4min. Samples were afterwards precipitated with Isopropanol, washed,

resuspended in 10µl High Dye Formamide and submitted for reading in the DNA

Sequencer 3100 (Applied/Hitashi).

2.4. Detection of viral mRNA Isoforms

5x106 cells were used for Isolation of total RNA using TRIzol Reagent (Invitrogen),

according to the manufacturer’s instruction. The RNA was resuspended in 20µl

H20/Depc and 5 µl used for treatment with 10U DNase I for 30min at 37ºC. DNase I

was inactivated by storing samples over night at -80ºC. Following day, c-DNA

synthesis was made using Superscript II RT (Invitrogen) and 0.2µg/µl Random

Hexamer primers in total volume of 20µl, following instructions of manufacturer. A

DNase I Control was set up (data not shown) for sample No. 20, by using the same

RT conditions, without adding Superscript Enzyme. Following, 1µl was used as

template for the 1.RT-PCR and for the Nested-PCR, 1µl out of the 1.RT-PCR. Primer

combinations for each HTLV-1 RNA reaction see Figure 1b. Reaction conditions for

PCRs were the same as mentioned above. Program conditions for the 1.PCR were

94ºC 3min, 40cycles 94ºC 1min, 58ºC 1min, 72ºC 1min and 72ºC 7 min. For the

Nested PCR 30 sec were used for denature, annealing and extension. GAPDH

program conditions were as used for genomic DNA. c-myc and c-fos RT-PCR

conditions were 94ºC 3min, 30 cycles 94ºC30sec, 58ºC 30sec, 72ºC 30sec and 72ºC

7 min. Amplified PCR products were separated on 2% Agarose Gel, cut and Gel

purified as mentioned above and submitted to sequencing. Protooncogene

expression was quantified and calibrated with GPDH expression levels using the

Kodak 1 D3.5 software.

2.5. Statistical analysis

The Epi-info program, Version 6.04B was used for the statistical analysis. The CDs

counts above 20% were considered positive. The continuous variables LDH, c-fos

and c-myc were segregated in two groups using the median value as cut off. Age and

leucocytes groups were choosen based on the literature. The qualitative and discrete

variables were represented by absolute frequency (n) and relative frequency (%) and

their significance analyzed using the chi-square test or Fisher’s exact test. The level

of rejection for the hypothesis of nullity (having HTLV-1) was always equal to or less

than 0.05% (α=5%).

III. Results

3.1. Characteristics of patient sample

All 24 patients included in this study were from Pernambuco, a state in the Northeast

of Brazil, which shows one of the highest rates of HTLV-1 prevalence (7.5/1000)

nation wide. Age at diagnosis lied between 1 to 15 years, 18 patients where male

and 6 female. High blastic infiltration rates (56 to 98%) were observed in all patient

BM samples, and the imunofenotyping using cytoCD3, CD3, CD45, CD34, CD8,

CD4, CD7 antibodies confirmed the diagnosis of T-cell leukemia. Leucocytes counts

and serum lactate dehydrogenase varied widely. Four patients at time of study had

already died. Mediastinal Mass was present in 14 (58%) out of 24 cases (Table 1).

3.2. Detection of Provirus in BM

Six patients (No. 3, 6, 9, 10, 18, 20) where tested positive for HTLV-1 in Bone

Marrow, showing a specific PCR product of 180bp in size (Figure 2). Unspecific PCR

products were present in Sample No. 11 and No. 3. Bands from sample No. 3, 6 and

9 were cut, gel purified and submitted to sequencing which confirmed specific

sequence for HTLV-1. The observed result corresponds to a frequency of 25% of

HTLV-1 infected BM in pediatric patients.

3.3. Detection of viral gene expression

Splicing is used in HTLV-1, to generate a variety of mRNA transcripts. Examining

different viral mRNA Isoforms four samples where shown to be transcriptionally

active, albeit not belonging to the same samples shown to be positive for provirus

(Figure 3).

Sample No. 5 was tested positive by using primer of Exon3 in the pX region.

Sequencing of the expected 180bp band confirmed HTLV-1 sequence. Due to primer

localization it was not possible to distinguish between unspliced mRNA, single

spliced env mRNA Isoforms or even viral genomic RNA, but other possible viral

mRNA variants like p30II or p12I could be excluded, due to no observed product in

the same sample, when using other primer sets.

Sample No. 25 was the unique positive for the Isoform HBZ. Expected size was

203bp.

Sample No.2, 26 and 27 showed different sized bands by using primers constructed

to detect mainly single spliced (Exon1 to Exon3) or some of the double spliced

mRNA Isoforms. Expected band sizes under PCR conditions chosen were 328bp

(Tax/Rex), 213bp (p13II), 138bp (p21Rex). Sample No. 2 showed an unusual band

size of aprox. 260bp. Sequencing of the band revealed a 88% homology with human

pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6) kinase (PDXK). No. 26 showed 3 bands at aprox.

260bp, 220 and 140bp and No. 27 showed two bands at aprox. 320 and 140bp.

Using primers for detection of double spliced (Exon2-Exon3) mRNA Isoforms,

expected band sizes under condition chosen were 589bp (p12I), 529bp (p30I) and

57bp (Tax/Rex). The 1.PCR showed a band of aprox. 180bp in samples No. 1, 8, 9,

10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 22 and 27. The Nested-PCR showed the same band size,

although the bands were much fainter and disappeared in sample No. 8, 20 and 22.

Bands from the 1.PCR of sample No. 1 and 10 were cut, gel purified and sequenced.

Sequencing revealed a 95% identity with 5/131 Gaps, for MAD1-like protein in both

samples.

3.4. Expression profile of c-myc and c-fos

All samples were tested in RT-PCR for proto-oncogene c-myc and c-fos gene

expression and quantified and calibrated with GAPDH expression levels. The

samples showed a large variable expression level, with median values of 35 for c-

myc and 117 for c-fos (Table 1).

3.5. Analysis of HTLV-1-infected T-ALL

Considering HTLV-1 positive-samples that were positive for provirus DNA or for

expression of unspliced or HBZ mRNA, the frequency of viral detection even

increases to 33%. HTLV-1 infected patients showed leucocytes counts and c-fos

expression levels statistically different from the non-infected patients. c-fos showed

expression levels lower than its median value in 87.5% (p=0.02) and leucocytes

counts lower than 100.00/mm3 in 75% (p=0.01) of the HTLV-1 positive cases.

Nevertheless, the differences between HTLV-1 positive and negative samples were

seen with precaution, because of the small sampling (Table 2).

Table 1. Summary of clinical and laboratorial features of the studied T-ALL

patients.

PV+= Provirus load positive, HBZ+= mRNA Isoform, Ex3= Unspliced mRNA

Isoform, Ex1/3= single spliced mRNA Isoforms, Ex2/3= double spliced mRNA

Isoforms, which corresponded to mRNA sequence of MAD1-like protein, c-myc and

c-fos calibraded with GPDH expression.

Table 2. Frequency of clinical and laboratorial characteristics found in the studied

population according by HTLV-1 presence based on viral DNA and

mRNA detection for unspliced and HBZ Isoforms.

Figure 1A. Schematic representation of the localization of primers on provirus

and viral mRNA sequences used in Nested-PCR and Nested-RT-PCRs.

1B. Sequence description of primers used.

Figure 2. Detection of HTLV-1 provirus load using Nested-PCR.

PV= Provirus GAPDH= internal control

Sample No. 3, 6, 9, 10, 18 and 20 show specific amplified bands with expected size of 180bp. Band

pattern above observed in sample No. 3 and No. 11 were unspecific. GPDH was used as an internal

control.

PV GAPDH

Figure 3. Detection of viral mRNA Isoforms using different sets of primers in

Nested-RT-PCR.

Ex3= unspliced, expected size of 2.PCR is 180bp, No.5 positive; Ex2/3= double spliced, expected

size of 1.PCR is 241bp, No. 1, 8, 9, 10, 11, 12, 17, 18, 19, 20, 22, 27 showing smaller band size

corresponding to mRNA for MAD1-like protein; Ex1/3= single spliced, expected size of 2.PCR are

fragments of 328, 213, 138bp in size, No. 26 and 27 positive (although not sequenced yet), No.2

showed smaller product size sequence corresponding to human pyridoxal (pyridoxine, vitamin B6)

kinase (PDXK); HBZ expected size of 2.PCR for is 203bp, No. 25 positive. GAPDH was used as

internal control.

Ex3 Ex2/3 Ex1/3 HBZ GAPDH

4. Discussion

An estimated 10-20 million people worldwide are infected by HTLV-1. Endemic

regions with more then 1% of population infected are South America, Japan, Africa

Sub-Saharan and the Caribbean Islands [9, 10]. The association of HTLV-1 in

pediatric T-cell leukemia is rarely described and usually focuses on PB samples or

clinical features [11-17]. HTLV-1 infection of BM was reported to be a mechanism for

stable viral infection within a host with intact immune system and thought to be a

source for constant viral delivery to peripheral blood and lymphatic organs [5].

Furthermore, complete elimination of proviral load in PB was reported after treatment

with chemotherapy and allogenic BM transplantation [18]. In our study 25% of BM

samples from T-ALL diagnosed children were tested positive for proviral load.

Primers for this study were located in the pX region of the viral genome where have

been shown deletions or mutations [19] and therefore the chance of even higher

rates of BM samples infected by HTLV-1, can not be excluded.

A study which determined the seroprevalence in over 1300 individuals in a high

endemic region in the Northeast of Brazil was not able to detect antibodies in humans

younger than 13 years old [20]. Also considering the hypothesis made by Grant et al.,

that cells in BM of HAM/TSP patients are getting saturated by HTLV-1 infection over

a longer period of time [6], would indicate loss of detection in younger patients, due

to a small amount of proviral template in the sample. In our study, 4 out of 6 patients

positive for proviral load belonged to an elderly population (12-15 years old), which

would corroborate to this idea mainly if the viral transmission was due to breast

feeding. Vertical transmission of virus via breast milk was also reported to be time

dependent, showing infection rates of 5.1% for <3 month and 38.5% ≥ 12 month of

breastfeeding [3]. Unfortunately, we were not able to confirm the HTLV-1 exposure to

the patient’s mother.

Due to the choice of technical procedure, discrimination between cell-types present in

the BM compartment was not possible and therefore it cannot be postulated that

CD34+ cells were infected. However, cell to cell contact between uninfected and

infected cells and a cellular receptor ubiquitinately expressed on a variety of cell

types was thought to be necessary for infection with HTLV-1 [21]. This would suggest

the possibility of CD34+ stem cell infection on later time points, transmitted through

other cell types already infected with HTLV-1 and also present in the BM.

Acute Leukemia is characterized by increasing blast numbers in the BM

compartment. In order to investigate the possibility of involvement of viral proteins on

regulating the increase of blast cell, it was studied viral gene expression in our patient

samples. Interestingly, four samples showed viral gene expression, although proviral

load was not detectable in these samples. Single and Multiple insertion of provirus

into one genome have been reported and showed correlation with manifestation of

disease in 30% of patients. Single copy integration was shown in 50.6% whereas

multiple insertions were observed in only 20.6% of those patients [21]. The lack of

detection of provirus in samples showing viral gene expression could, as mentioned

above, be due to limitations in sensitivity of the technique used or failed primer

binding. Moreover, the high expression level of viral mRNA in cells with undetectable

integration of HTLV-1 genome suggests an active infection. Also defective provirus

were observed in 25-40% of all provirus integrated in lymphocytes, which could

explain why no expression level was observed in those 6 samples positive for proviral

load (22,23).

Gag and env are structural proteins, necessary for packaging of viral nucleocapsid

and made out of unspliced or single spliced mRNA transcript, respectively [24].

cDNA of sample No.5 has been shown to be positive using primers located in intron

and exon3 regions of the virus. These primers enable detection of those transcripts

and viral genomic RNA, suggesting active virus particle in patient sample No. 5.

Proviral DNA contamination could be excluded, since RNA samples were digested

with DNase I prior to c-DNA synthesis.

Recent studies focus on the importance of a new viral protein HBZ, coded on the

minus strand of the HTLV-1 genome. Although protein levels were not determined in

this study, our finding of mRNA expression in sample No. 25 can be of importance,

since HBZ was shown to have bimodal function. The HBZ protein was first reported

to suppress transactivation of viral genes [25]. Satou et al., using the same set of

primers, reported HBZ mRNA expression in fresh ATL cells as well as in peripheral

blood mononuclear cells of asymptomatic carriers and showed a decrease of cell

proliferation when HBZ transcripts were suppressed [26]. The patient harboring the

HBZ-expressing bone marrow cells showed high leucocytes counts (more then

300,000 cells) as do samples without HBZ expression and the lowest (56%) number

of blastic cells in bone marrow, however, what this might mean is unclear.

The detection of MAD-1-like protein sequence in our samples using exon 2 and exon

3 primers was unexpected mainly because it happened in about half of the samples.

It might be possible that this product was formed due to primer homology within the

gene sequence in the 1.PCR, since the Nested primers were not able to reamplify the

product. Further studies using primers designed specifically for MAD1-like protein

sequence would be necessary to determine the real expression pattern in those

patient samples.

Since Shuh et al. [27] was using the same set of primers we used in the 1.PCR, for

detection of single spliced viral transcripts, the finding of PDXK sequence in sample

No. 2 was unexplainable. One possibility is primer homology to that sequence, albeit

due to the same biological material used in all patient samples, a PCR product would

than be expected in more samples.

Although predicted band sizes obtained in sample No. 26 and 27, corresponding to

p13II, p21Rex and TAX/REX mRNA transcripts, we tried to reassure sequence

specificity of those bands. Due to technical limitations, we were not able to determine

the splice sites, which are specific for each mRNA isoform. Sequencing showed

mixture of DNA sequences which was due to isolation problems of small PCR

products with similar length, out of the agarose gel. Splice site specific primers could

be used in an extended study to overcome this problem.

The viral protein TAX is known to be responsible for immortalization and cellular

transformation processes in infected cells. CD4+ cells were shown to be infected in

up to 99 % in peripheral blood of ATL patients [28], although associated to a low or

no expression level of TAX. This is caused by a variety of mechanisms, like genetic

or epigenetic modifications [29] which protect the infected cell from destruction

through CTLs [30]. In the present study there was not found any difference on the

percentage of CD4+ or CD34+ cell population between the positive and negative

proviral load bone marrow cells. It is known, however, that TAX can be secreted from

an infected cell population inducing a proinflammatory cytokine response on

surrounding cells [31], suggesting possible effects on CD34+ hematopoetic stem

cells. However, significant lower leucocytes counts were observed in patients

grouped as HTLV-1 positive. This could be interesting, since T-ALL is a malignancy

with reserved prognostic and usually shows leukocyte counts higher than

100.000/mm3 . If the lower count occurred due to immune response against virally

infected leucocytes, could explain one possibility, but must be investigated in future

studies.

Viral protein TAX was also shown to upregulate c-myc and c-fos expression, due to

interaction with NFκB/IκB and Serum Response Factor (SRF), respectively. The

mechanism which underlies the lower expression level of c-fos observed in our study

would need further investigation. However this observation seems to be interesting,

since c-fos is known to act as a transcriptional factor on a variety of cellular genes.

Overall, our study could clearly demonstrate early infiltration of BM in pediatric

patients with T-ALL and the transcription of viral genes in that cellular compartment,

so far not reported to our knowledge. Since the mechanism of long clinical latency of

ATL and the transformation process of infected cells, which is thought to involve a

variety of transformational steps [32], is not clearly understood, our data could

indicate an early onset of viral activity in life. If our observation of proviral load and

viral mRNAs expression is involved in leukemogenesis of T-ALL in children can not

be clearly stated yet, but should keep in consideration. Furthermore, if HTLV-1

causes pediatric T-ALL it would be through a different biological mechanism of viral

infectivity due to its short latency and therefore need further investigation.

Acknowledgments

We are thankful to Gilvan Mariano da Silva for the photographic assistance. Financial

support: Oswaldo Cruz Foundation. The authors declare that there is not any conflict

of interest.

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SEGUNDO ARTIGO:

baseado nas normas da

Revista Brasileira de Hemato logia e Hemoterapia

Conteúdo equal da introdução da tese

Leucemia de Células T

T-Cell Leukemia

Autores

Heike Brand1

João Guilherme Bezerra Alves1

Francisco de Paula Ramos Pedrosa1

Norma Lucena-Silva1,2

1Serviço de Oncologia Pediátrica/IMIP, Rua dos Coelhos, n.300, Quinto andar, Boa

Vista, cep:50070-550, Recife, Pernambuco, Brasil.

2Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães/Fiocruz, Av. Moraes Rego, s/n, campus da

UFPE, Cidade Universitária, cep:50670-420, Recife, Pernambuco, Brasil.

Autor de Correspondência: Dr. Norma Lucena-Silva, Serviço de Oncologia

Pediátrica/IMIP; Rua dos Coelhos, n.300, Quinto andar, Boa Vista, cep:50070-550,

Recife, Pernambuco, Brazil.

Tel.: 55 81 21224764.

e-mail: norma.lucena@hotmail.com

ANEXOS E APÊNDICES

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Nome da Pesquisa: Banco de Tumores do Recife

Coordenadores responsáveis:

Norma Lucena Cavalcanti Licínio da Silva (Fundação Oswaldo Cruz / Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães)

Francisco de Paula Ramos Pedrosa (Serviço de Oncologia Pediátrica do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira)

Prezado Sr(a).

O câncer é uma doença onde as células crescem sem controle podendo ocorrer em diferentes locais no nosso corpo. Alguns tipos de câncer já têm cura, outros são possíveis prevenir. Precisamos conhecer mais sobre esta doença, saber o que causa a doença para podermos nos proteger e melhor tratar. Para isso estamos: 1) criando um arquivo eletrônico (no computador) com informações importantes sobre a doença e fatores que possivelmente podem ter ajudado ao tumor desenvolver, além dos resultados de laboratório, o tratamento e evolução da doença. As informações obtidas serão analisadas com o objetivo de encontrar fatores que predispõem a tipos específicos de câncer. 2) Pretendemos coletar e armazenar amostras biológicas, incluindo sangue, secreção, produtos de excreção, exsudatos e fragmento do tumor, para podermos estudar quando possível as alterações genéticas e bioquímicas dos tumores para compreendermos a origem e evolução deste crescimento alterado. 3) Pretendemos também coletar amostras de sangue periférico para investigar o risco (a predisposição genética) do indivíduo ao câncer e estudo das alterações bioquímicas e imunes do tumor em busca de marcadores moleculares de diagnóstico e prognóstico.

As informações clínico-epidemiológicas obtidas na entrevista, ou do seu prontuário eletrônico terão caráter confidencial. O fragmento do tumor será coletado durante biópsia e/ou cirurgia quando houver indicação médica restrita, a punção venosa será feita por profissional experiente, com seringas e agulhas descartáveis. Estudos técnico-científicos, utilizando o fragmento de tumor e sangue armazenados no banco de tumores, só serão realizados após a aprovação do estudo no Comitê de Ética em Pesquisa.

Caso todas as dúvidas tenham sido esclarecidas e tendo entendido o conteúdo deste consentimento informado, declaro que concordo de livre e espontânea vontade em participar neste estudo.

________________________________ Data: ___/___/___

Assinatura do paciente

________________________________ Data: ___/___/___

Testemunha

________________________________ Data: ___/___/___

Assinatura de representante

da equipe médica responsável

--------------------------- Mensagem Original ---------------------------- Assunto: Parecer CEP-IMIP Proj. 725 De: comitedeetica@imip.org.br Data: Qua, Maio 21, 2008 8:00 am Para: nlucena@cpqam.fiocruz.br -------------------------------------------------------------------------- De: Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do IMIP Para: Dra. Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva Nº de Entrada no CEP-IMIP: 725 Ref: Projeto intitulado "Freqüência do vírus linfotrópico de célula T humana-1 (HTLV-1) em medula óssea de pacientes infanto-juvenis diagnosticados com leucemia e linfoma de célula T no período de 2003-2007, no serviço de oncologia do Instituto Materno Infantil Prof. Fernando Figueira" Prezado(a) Pesquisador(a), O Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do IMIP reunido em 08/05/2008 decidiu por aprovar com recomendação o protocolo de pesquisa acima mencionado. O parecer sobre o protocolo faz a seguinte solicitação: · Apresentar um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) para ser utilizado com os participantes da pesquisa de acordo com a Resolução 196/96 e 347/05 CNS. (Ver parecer em anexo) O pesquisador deverá atender as solicitações através de carta assinada, juntamente com as devidas alterações. OBS: A declaração de aprovação só será liberada depois de atendidas as solicitações. Atenciosamente, Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Instituto Materno Infantil Professor Fernando Figueira Rua dos Coelhos, 300 Boa Vista - Recife-PE - Brasil Cep: 50070-550 Fone/Fax: (81) 2122-4756

From: rbhh@sgponline.com.br

To: norma.lucena@hotmail.com

Subject: Artigo Submetido SGP/ RBHH

Date: Thu, 2 Oct 2008 16:18:08 -0300

Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia

Av. Nossa Sra. de Copacabana, 1.059 sala 1.201 -

Copacabana

Rio de Janeiro - RJ - Brazil

CEP 22060-001

Tel/Fax: (21) 2521-6905

email: brazilbloodjournal@yahoo.com.br

Rio de Janeiro, quinta-feira, 2 de outubro de 2008

Ilmo(a) Sr.(a)

Prof(a), Dr(a) Norma Lucena Cavalcanti Licinio da Silva

Referente ao código de fluxo: 263

Classificação: Artigo de Revisão

Informamos que recebemos o manuscrito Leucemia de Células T será enviado para apreciação dos

revisores para possível publicação/participação na(o) Revista Brasileira de Hematologia e

Hemoterapia. Por favor, para qualquer comunicação futura sobre o referido manuscrito cite o número

de referência apresentado acima.

Obrigado por submeter seu trabalho a(o) Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia.

Atenciosamente,

Milton Artur Ruiz

Editor