INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA EN SOPORTE DE...

INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA EN SOPORTE DE QUITOSANO

ALI DAVID CIFUENTES

DIANA MARITZA ROJAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES

FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA INGENIERIA QUIMICA

Manizales, Enero de 2005

INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA EN SOPORTE DE QUITOSANO

ALI DAVID CIFUENTES Código 399514

[email protected] Cel: 311-3069377 Linea de profundización en alimentos

DIANA MARITZA ROJAS Código 399052

[email protected] Cel: 300-7791390 Línea de profundización en alimentos

Trabajo para optar el título de Ingeniero Químico MODALIDAD

Participación en proyecto de investigación: Producción De Biodiesel A Partir De Aceite De Palma Y De Higuerilla Por Un

Proceso De Reacción-Separación Por Enzimas Inmovilizadas.

DIR ECTOR CARLOS EDUARDO ORREGO

Ingeniero Químico, Esp en Tecnología de alimentos

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

INGENIERÍA QUÍMICA Manizales, Enero de 2005

Nota de aceptación ________________________________

________________________________ ________________________________

________________________________ Presidente del Jurado

________________________________ Jurado

________________________________ Jurado

Manizales, día____mes___año___

Ali David Cifuentes A mis padres por el esfuerzo hecho, a Dios,

y a los que en una u otra forma me aportaron

algún granito de arena en mi carrera.

Diana Maritza Rojas A DIOS, a mi madre y a mi hijo

por tantos esfuerzos compartidos.

AGRADECIMIENTOS Los autores expresan sus agradecimientos a:

• Colciencias y Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales por la financiación de éste proyecto.

• Carlos Eduardo Orrego, director del trabajo de grado por su valioso apoyo

humano e intelectual.

• Al talento humano pertenecientes a los “laboratorios de Química y Análisis instrumental de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales.

• Los profesores: Gloria Inés Giraldo, Carlos Ariel Cardona, Héctor Jairo

Osorio por su orientación pedagógica. • Al personal administrativo de la Dirección de Investigaciones de Manizales,

Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. • El ingeniero Adamo Alexander Cardona, por su disposición y colaboración

oportuna.

• Jorge Ariel Guapacha por su colaboración incondicional. • Demás personal asociado al proyecto por aportar conocimientos pertinentes

al desarrollo del mismo.

RESUMEN Se llevó a cabo la producción de un sistema biocatalítico con características físico químicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrólisis y esterificación. El soporte de inmovilización fue fabricado a partir de un hidrogel macroporoso de quitosano con concentración de 3 % el cual se sometió a un proceso de criogelificación-crioconcentración por un tiempo de 4-5 días, produciéndose en diferentes geometrías. Finalmente se escogió la forma cilíndrica ya que los pellets resultaron de fácil producción, resistentes a la abrasión y a la agitación. La humedad final de los soportes cilíndricos fue de alrededor del 17% . Una solución de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando el método de brazo espaciador. El valor óptimo de carga enzimática la produjo un tratamiento de activación con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilización de lipasa cándida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersión del soporte activado en una solución de la proteína durante 15h. Así se obtuvo una carga de 1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio. La caracterización del soporte se llevó a cabo por medio de espectroscopia de infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilación de 68.86%. La morfología externa fue estudiada por microscopia de fuerza atómica en modo de contacto encontrándose un tamaño medio de poro de 195 ± 560 nm y rugosidades medias de 229 ± 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solución del 3% de quitosano. La resistencia a la agitación y la solubilidad-degradabilidad fue estudiada, encontrándose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble solo en soluciones de ácido acético. El grado de hinchamiento se evaluó para la hidrólisis encontrándose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h. La caracterización del sistema biocatalítico se llevó a cabo por hidrólisis de aceite de oliva y mediante la esterificación de ácido oleico con n-butanol, presentándose una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” adscrito a Colciencias.

ABSTRACT The aim of this work was the production and characterization of an adequate catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20ºC, crioconcentrated at -20ºC and thawed at 20ºC. Easy way of production, good abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders as the final shape of the pellet. Candida Rugosa Lipase – CRL- was immobilized on the chitosan support after immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets (average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support). Support characterization included infrared spectroscopy – FTIR- for deacetylation degree (68.86%) and atomic force microscopy – contact mode- for roughness (between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with aqueous hydrolysis reaction media solutions Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69 U/mg forr hydrolysis and esterification respectively). This work is a part of a major research project called “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” with finantial support of Colciencias and Universidad Nacional Sede Manizales.

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

INTRODUCCIÓN 13

1. OBJETIVOS 14 1.1 GENERALES 14 1.2 ESPECÍFICOS 14

2. MARCO TEORICO 15 2.1 ANTECEDENTES 15 2.2 INMOVILIZACION 16

2.2.1 Clases De Inmovilización 18 2.2.1.1 Inmovilización por retención física 18

2.2.1.1.1 Atrapamiento 19 2.2.1.1.2 Inclusión en membranas 19

2.2.1.2 Inmovilización por unión química 20 2.2.1.2.1 Unión a soportes 20 2.2.1.2.2 Adsorción iónica 21 2.2.1.2.3 Unión covalente 22 2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación. 23

2.2.2 Efectos de la Inmovilización 25 2.3 LIPASAS EN REACCIONES 27

2.3.1 Clasificación 27 2.3.2 Propiedades 27 2.3.3 Reacción de transesterificación 29

2.3.3.1 Producción de biodiesel 29 2.4 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 30 2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION 31

2.5.1 Características de los soportes para inmovilización 31 2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN 33 2.7 HIDROGELACION 37 2.8 CRIOGELIFICACION- CRIOCONCENTRACIÓN 38

3. MATERIALES Y METODOS 40 3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 40

3.1.1 Materiales y reactivos 40 3.1.2 Equipos de análisis y proceso 40 3.1.3 Procedimiento de gelificación 40 3.1.4 Procedimiento de secado convectivo 41 3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación 41

3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 41 3.2.1 Materiales y reactivos 42 3.2.2 Enzima Utilizada 42 3.2.3 Equipos de análisis y proceso 42 3.2.4 Procedimiento de activacion 43

3.2.5 Procedimiento de inmovilización 43 3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína 43

3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 43 3.3.1 Materiales y reactivos 44 3.3.2 Equipos de análisis y proceso 44 3.3.3 Medida de grado de D- acetilación 44 3.3.4 Medida de la resistencia 45 3.3.5 Medida de la solubilidad y la degradabilidad 45 3.3.6 Medida del hinchamiento (swelling) 45 3.3.7 Procedimiento de medición de rango de poro 46 3.3.8 Medida de la actividad enzimática del biocatalizador 46

3.3.8.1 Hidrólisis 46 3.3.8.2 Esterificación 47

4. RESULTADOS Y DISCUSION 48 4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 48 4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 58

4.2.1 Carga enzimática 58 4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 61

4.3.1 Grado de D- acetilación 61 4.3.2 Resistencia 64 4.3.3 Solubilidad y degradabilidad 65 4.3.4 Swelling 66 4.3.5 Medición de rango de poro 67 4.3.6 Actividad enzimática del biocatalizador 70

4.3.6.1 Hidrólisis 70 4.3.6.2 Esterificación 72

5. CONCLUSIONES 76 6. RECOMENDACIONES 79 BIBLIOGRAFIA 81 ANEXOS 87

LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS Ac Ácido AFM Microscopia de fuerza atómica. °C Grado Centígrado CRL Lipasa Candida Rugosa D-Ac Grado de D-acetilación EtOH Etanol FTIR Espectrofotometría de infrarrojo por transformada de Fourier. GA Glutaraldehido G Grado de hinchamiento nm Nanómetro N-Ac Grado de N-acetilación SPM Microscopia de barrido por sonda TPP Tripolifosfato U [µmol/min] ó [µmol/h] µm Micro metro UV Ultravioleta Wd Peso de muestra seca Ws(t) Peso de la muestra hinchada en función del tiempo Wef Peso de soporte hinchado en el equilibrio.

LISTA DE TABLAS TABLA DE CONTENIDOS Pág. Tabla 1. Tipos de Soporte y enzimas utilizadas. 15 Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización. 24 Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas Inmovilizadas. 32 Tabla 4. Tamaño Inicial y Final de esferas (Diámetro efectivo promedio). 49 Tabla 5. Tamaño inicial de láminas (longitudes en cm). 49 Tabla 6. Tamaño Final de láminas (longitudes en cm). 50 Tabla 7. Tamaño inicial y final de cilindros (Diámetro y longitud media). 50 Tabla 8. Perdida de tamaño para esferas (%). 50 Tabla 9. Perdida de tamaño para laminas (%). 51 Tabla 10. Pérdida de tamaño para cilindros (%) 51 Tabla 11. Porcentaje de pérdida de peso debido al proceso de secado 52 Tabla 12. Humedad final de esferas (%). 53 Tabla 13. Humedad final de Laminas (%) 53 Tabla 14. Humedad final de Cilindros (%) 53 Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 días (%) 55 Tabla 16. Análisis de proteína. 58 Tabla 17. Curva patrón 59 Tabla 18 Carga de proteína 59 Tabla 19. Tiempos de carga de enzima 60 Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac 63 Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida. 63 Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilización 64 Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes 65 Tabla 24. Rugosidad Media. 68 Tabla 25. Porosidad media. 68 Tabla 26. Gramos de ácido oleico producido con el tiempo. 70 Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrólisis. 71 Tabla 28. Gramos de ácido que reaccionan con el tiempo. 72 Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificación 73

LISTA DE FIGURAS TABLA DE CONTENIDOS Pág. Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física 18 Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química. 20 Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifilica. 28 Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase 28 Figura 5. Estructura química del quitosano 34 Figura 6. Estructura química de la quitina 34 Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina 35 Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano. 37 Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8% 48 Figura 10. Hidrogel de Láminas de 3% 48 Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3% 49 Figura 12. Proceso combinado de secado. 52 Figura 13. Esferas secas 54 Figura 14. Laminas secas 54 Figura 15. Cilindros secos. 54 Figura 16. Comparación del soporte convencional con biológico. 56 Figura 17. Soporte biológico 56 Figura 18. Soportes por hidrogelación en frió 57 Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP. 58 Figura 20. Espectros de quitosano puro pastilla de KCl 61 Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lámina. 62 Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrólisis a 25ºC 66 Figura 23 Swelling a cada intervalo de tiempo 66 Figura 24. Concentración de quitosano de 1.8 % 67 Figura 25. Concentración de quitosano de 2.4 % 67 Figura 26. Concentración de quitosano de 3 % 68 Figura 27. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.003 % 69 Figura 28. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.01 % 69 Figura 29. Hidrólisis del aceite de oliva (producción del ácido oleico). 70 Figura 30. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de hidrólisis. 71 Figura 31. Esterificación del ácido oleico y n-butanol. 72 Figura 32. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de Esterificación. 73 Figura 33. Reutilización del sistema biocatalítico (actividad) en hidrólisis 74 Figura 34. Reutilización del sistema biocatalítico en hidrólisis 75

(porcentaje)

LISTA DE ANEXOS Anexo 1. Procedimiento de gelificación Anexo 2. Procedimiento de secado Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente Anexo 4. Método de biuret Anexo 5. Hidrogeles de quitosano Anexo 6. Métodos de secado Anexo 7. Espectros de infrarojo Anexo 8. Espectro de lipasa Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM Anexo 10. Datos Experimentales

Julian

TABLA DE CONTENIDOS

INTRODUCCIÓN

Hoy por hoy las transformaciones químicas de materias primas en productos elaborados no son una simple idea de años atrás; la generación de productos con alto valor agregado a bajos costos, pero al mismo tiempo atractivos ambientalmente, es la idea de muchas industrias que le apuntan a las reacciones en síntesis orgánica, siendo esta una de las áreas que aporta elementos para mejorar la calidad de vida de este último siglo y para la cual se usan crecientemente los catalizadores enzimáticos como un aporte al mejoramiento de diferentes procesos industriales de síntesis. Es así como en algunas reacciones tales como esterificación, transesterificación, interesterificación, alcoholisis, acidólisis, hidrólisis y glicerolisis aparecen las lipasas como catalizadores “limpios y biológicos” que aumentan la productividad debido a su alta especificidad por el sustrato y por su actividad, si se compara con catalizadores orgánicos e inorgánicos. Las lipasas se utilizan en diversos campos que van desde la industria de detergentes, la de alimentos, la farmacéutica, la cosmética, la oleoquímica, la industria del papel, la síntesis orgánica, pesticidas, fungicidas y aplicaciones biomédicas, hasta la industria energética; participando en esta ultima en la producción de biodiesel por transesterificación para contrarrestar el hecho del agotamiento del petróleo a nivel mundial. Las lipasas pueden ser obtenidas comercialmente de diferentes microorganismos tales como levaduras, mohos y de bacterias; se pueden utilizar tanto libres como inmovilizadas. Dentro de una gran gama de materiales de soportes de inmovilización una buena opción es el quitosano (obtenido a partir de la deacetilación de la quitina, el segundo polímero más abundante en la tierra). Este material es biocompatible, no-tóxico y de remarcada afinidad con las proteínas.

1. OBJETIVOS

1.1 GENERALES

Inmovilizar una lipasa en quitosano

1.2 ESPECÍFICOS

Producir el soporte de quitosano para la inmovilización.

Obtener un protocolo de inmovilización de la lipasa sobre el soporte

Caracterizar el soporte y el sistema biocatalítico.

2. MARCO TEORICO

2.1 ANTECEDENTES Desde una perspectiva biotecnológica existen muchas ventajas del empleo de enzimas en medios orgánicos: La facilidad de lograr alta solubilidad del sustrato y de modificar la selectividad propia de la enzima por el simple diseño del medio de reacción, la mejora sustancial de la termoestabilidad de las enzimas y la posibilidad de recuperación del producto por evaporación del solvente de reacción. La baja actividad de las enzimas generalmente observada en los solventes orgánicos se debe a que las enzimas son insolubles en tales medios y forman agregados en los cuales aproximadamente el 30%±60% de sus sitios activos son inaccesibles para los sustratos [31, 65].

La inmovilización de enzimas sobre soportes artificiales se remonta hacia los años 50’s. Se han utilizado técnicas de inclusión de enzimas en matrices poliméricas, conexión por enlaces sobre materiales de soporte y la adsorción sobre materiales inertes. Muchos métodos han sido usados para inmovilizar lipasas, incluyendo la adsorción o la precipitación sobre materiales hidrofóbicos [68], enlace covalente con grupos funcionales [53], atrapamiento en geles de polímeros [57], adsorción en resinas de intercambio iónico [52], microencapsulación [4], y atrapamiento en sol–gel [29, 34]. La lipasa de C. cylindracea fue inmovilizada sobre un copolimero de divinil metil acrilato y sus derivados [69]. La lipasa inmovilizada tiene una resistencia mejorada a la desnaturalización térmica que la enzima nativa [50, 69]. Algunos estudios han llegado a la conclusión que el proceso de inmovilización incrementa la actividad enzimática comparada con la que presentan las enzimas libres [42]. Con ello se contribuye al desarrollo de procesos continuos y adaptabilidad a una variedad de configuraciones y procesos específicos llevados en reactores. Un resumen de los diferentes tipos de soportes y lipasas utilizadas en algunos estudios anteriores se presenta en la tabla 1. Tabla 1. Tipos de soporte y enzimas utilizadas reportadas en la literatura

TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA

1. Inmobilized lipase-catalyzed

production of alkyl esters of restaurant grease as biodiesel.

26 macro poros de

resina acrílica y sílice granulado

cándida antártica

2. Imaging the distribution and secondary structure of inmobilized enzymes using infrared microespectroscopy.

38 Macro poros de

polimetilmetacrilato. cándida antártica

TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA 3. Inmobilization of pseudomonas

cepacia lipase in a phyllosilicate sol-gel matrix effectiveness as a biocatalyst

27 Matriz de sol gel de

silicato pseudomonas

cepacia

4. Preparation of porous polyurethane particles and their use in enzyme immobilitation

64 Particulas porosas de

poliuretano cándida rugosa

5. Designer hydrogels for lipase immobilitation

25

Hidrogeles poliméricos de poliacrilamida

porcine pancreas

6. Catalytic membrane preparation for enzymatic Hydrolysis reactions carried out in the membrane phase contactor

61

Membrana de polipropileno, nitrocelulosa,

celulosa y poliamidas

cándida antarctica y pancreatic porcine

7. Immobilization, stability and esterification studies of a lipase from a Bacillus sp

13 silica (Merck), pellets

HP-20 . Bacillus sp.

8. Lipase Immobilization into Porous Chitoxan Beads: Activities in Aqueous and Organic Media and Lipase Localization

15

Complejo de quitosano.

candida rugosa

9. Waste edible oils and fats for biodiesel production by lipase-catalyzed transesterification

8

Silicona, Materiales sol-gel de

silicato.

10. Production of biodiesel fuel from triglycerides and alcohol using immobilized lipase

6

Caolita porosa. Pseudomonas

fluorescens

11. Preparation, characterization and application of immobilized

carboxypeptidase

62

Poliacrilamida. Carboxipeptidasa y

silica

12. Effect of chemical modification on the activity of lipases in organic solvent

32

- Rhizomucor Miehei, cándida antarctica

14. Immobilization of a-L-arabinofuranosidase on chitin and chitosan

55

quitosano

α-L-arabinofuranoxidase

2.2 INMOVILIZACION A partir de las observaciones de Berzelius en el año de 1835 se detectó la necesidad de utilizar “sustancias” que modificaran el proceso de elaboración de vino, queso o pan positivamente, es así como aproximadamente 150 años atrás se

llamo a dichas sustancias como “fuerza catalítica”. Los catalizadores son sustancias que afectan la velocidad de una reacción, sin sufrir cambios, promoviendo un mecanismo diferente para la reacción sin afectar el equilibrio. [17]. Los biocatalizadores son un ejemplo simple de lo anterior, también conocidos como catalizadores biológicos –enzimas, ribositas y anticuerpos catalíticos-, han invadido el mercado mundial con variadas aplicaciones industriales. Las enzimas son biocatalizadores con actividad biológica que en su mayoría son de origen microbiano o pertenecen a enzimas extracelulares con excelentes propiedades en diferentes aspectos como: a) altamente catalíticas frecuentemente de 108 -1011 veces mas rápidas que los catalizadores no enzimáticos, manejando temperaturas suaves y presiones atmosféricas b) poseen un amplio rango de aplicaciones industriales c) son muchos mas específicos en cuanto al tipo de reacción que catalizan (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); por ello en aplicaciones industriales de las que hacen parte las enzimas han contribuido significativas transformaciones industriales [67]. En las reacciones catalizadas por enzimas la separación de los sustratos y productos es difícil. Las enzimas no se pueden reutilizar y como son estructuras lábiles e inestables frente a factores físicos como (calor, radiación), químicos (oxidación, reducción, disolventes orgánicos, iones metálicos, fuerza iónica y pH) o biológicos (proteólisis, modificación y degradación enzimática) disminuyen su actividad catalítica y solubilidad a medida que transcurre el tiempo [5]. Para garantizar la estabilidad termodinámica y/o cinética se han elaborado diversos métodos. Uno de ellos corresponde a la selección de microorganismos extremófilos, que intervienen en intervalos de temperatura, acidez, basicidad, presión o salinidad únicos; adicionalmente se ha encontrado que la inmovilización es de gran utilidad para brindar estabilidad a las enzimas [5] La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento de las enzimas, células, organelas u y otras especies se ve restringido total o parcialmente, dando lugar a una forma insoluble en el medio de reacción, en donde se presenta una mayor estabilidad como resultado de este acoplamiento. La inmovilización de enzimas se refiere a enzimas unidas, insolubilizadas, soportadas o ligadas a una matriz, que se caracterizan por aspectos positivos tales como:

Aumento en estabilidad de la enzima. Posible reutilización del sistema inmovilizado, por lo que disminuyen los

costos del proceso. Posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,

adaptado a la aplicación de enzimas inmovilizadas donde se permiten cargas elevadas de enzima y uso de procesos continuos. Estos sistemas

pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con mayor pureza.

Pero también implica factores que contrarrestan lo anterior, tales como:

La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo. La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir

distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferente número de uniones al soporte.

Pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización. El sistema biocatalitico es más caro que la enzima nativa [2]

2.2.1 Clases De Inmovilización 2.2.1.1 Inmovilización por retención física Este método representa modificaciones físicas del microentorno de la enzima tal y como su atrapamiento en la red espacial de una matriz polimérica o su inclusión en membranas. Un diagrama típico de esta clase de técnicas es mostrado en la figura 1. Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física.

(Fuente: [2])

2.2.1.1.1 Atrapamiento Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros entrecruzables o polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero. Posteriormente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en geles (poliacrilamida) o en fibras (acetato de celulosa), que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética. El atrapamiento, es simple desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración en su estructura ya que la enzima no esta unida de ninguna forma y además se pueden obtener sistemas multienzimaticos. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [2] 2.2.1.1.2 Inclusión en membranas Se destacan dos técnicas tales como: el microencapsulado que consiste en atrapar la enzima en membranas poliméricas semipermeables esféricas y el reactor de membrana que consiste en confinar la enzima en una membrana que sirve de pared permeable selectiva al interior de un reactor. En la microencapsulación las enzimas están rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro. Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos. Presentan una gran superficie de contacto entre la enzima y el sustrato para un volumen relativamente pequeño y la posibilidad de inmovilizar enzimas en una sola etapa [2].

2.2.1.2 Inmovilización por unión química Las técnicas a las que hacen mención la inmovilización por unión química se basan en las interacciones que puedan generarse entre el soporte y la enzima, ya sea por interacciones iónicas, por adsorción física, enlace covalente, quelación o unión metálica o los enlaces que se pueden generar entre enzimas como el reticulado (entrecruzamiento) [2,67]. Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química.

(Fuente: [2]) 2.2.1.2.1 Unión a soportes Esta técnica implica la unión de una enzima a un soporte insoluble; siendo esta técnica la más antigua de todas y de la que se dispone de más información. La elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del sistema biocatalitico. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado [67]. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilización de numerosas enzimas. Estos difieren en tamaño, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente los encontramos en forma de cilindro,

hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas, una ampliación del tema se puede ver en el aparte 2.5. 2.2.1.2.2 Adsorción iónica Muchos autores encuentran dentro de esta calificación subdivisiones debido a las variantes que se pueden presentar, otros solo se limitan a unir las interacciones de tipo iónico entre la enzima y el soporte en una sola clasificación. En la adsorción, la enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas de tipo fuerzas de Van de Waals, por puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas y otras. El contacto de la solución acuosa de la enzima se puede realizar por procedimientos estáticos, electrodeposición, procesos en reactor o baño con agitación, siendo en esta última en la que se obtiene una deposición uniforme de la enzima. Los principales factores que influyen en la adsorción implican el pH del medio ya que controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la proteína y del sólido, si la fuerza iónica aumenta se produce la desorción de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la proteína, el diámetro de poro juega un papel importante ya que debe ser aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima, la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima incrementa la carga enzimática del derivado. Como principales ventajas implican

Preparación sencilla. su bajo costo. No hay cambios de especificidad enzimática. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en

agua. Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:

La optimización de las variables que controlan la adsorción. Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista

mecánico. La unión al soporte es débil.

Dentro de las variantes que algunos autores reportan consiste en emplear resinas de intercambio iónico (método de enlace iónico), las cuales contienen grupos funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble. La fuerza de unión entre la enzima y el soporte es mucho

más alta, los cambios conformacionales solo se producen en pequeña extensión [67]. 2.2.1.2.3 Unión covalente La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico, el resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica y no pueden intervenir en la unión covalente. Los más involucrados son los del grupo amino (NH2) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (CO2H) del ácido aspártico o el ácido glutámico, el grupo hidroxilo (OH) de la serina o treonina, y el grupo sulfhidrilo (SH) de la cisteína, estos aminoácidos no deben de ser esenciales en la acción catalítica, con respecto a esto último se han diseñado varios métodos que previenen la inactivación enzimática por reacción con los residuos de aminoácidos esenciales en los que se encuentran enlaces covalentes de enzima en presencia de un substrato o un inhibidor competitivo, por enlace de un complejo enzima-inhibidor formado mediante un enlace covalente reversible, uso de enzima soluble modificada químicamente de forma que el enlace covalente a la matriz se lleve a cabo mediante los residuos nuevos incorporados o el uso del zimógeno precursor [67]. El enlace normalmente se forma entre el grupo funcional presente sobre la superficie del soporte y el grupo funcional perteneciente al aminoácido residual sobre la superficie de la enzima, pero la mayoría de los soportes no poseen grupos funcionales que reaccionen directamente con las enzimas, sino que tienen grupos hidroxilo, amino, amido o carboxilo que necesitan ser activados para poder proceder a el proceso de inmovilización. El bromo cianuro (BrCN) ha sido ampliamente utilizado como activante del grupo funcional hidroxilo en soportes de materiales polisacáridos. En este método, la enzima y el soporte están unidos por medio de un enlace isourea. En el caso de la activación de la carbodiimida, el material de soporte puede tener un grupo funcional carboxilo (CO2H), y la enzima y el soporte están unidos por medio de un enlace peptídico. Si el material de soporte contiene un grupo funcional amino aromático, puede ser diazotizado usando ácido nítrico. Seguidamente, la adición de pequeñas cantidades de enzima conducen a la formación del enlace diazo entre el grupo reactivo diazo sobre el soporte y el anillo de la estructura de un aminoácido aromático, como la tirosina [51].

Las reacciones de acoplamiento entre los grupos reactivos del soporte y los grupos reactivos de la enzima han sido ampliamente difundidas, entre ellos se encuentran la diatozotizacion como los ocurridos entre la celulosa y la tripsina, papaina o pepsina, la formación de enlaces amida mediante inmovilización de agarosa con triacilglecerol lipasa, la alquilación o arilación sucedida entre metacrilato de polihidroxialquilo y la tripsina, la formación de bases de Schiff entre quitosano y pepsina A, reacciones ugi, reacciones de amidinación, intercambio tiol disulfuro, interacciones mercurio enzima, acoplamiento inducido por irradiación gamma, para una amplia consulta de antecedentes se remite al lector a [67]. Este método presenta las siguientes ventajas:

La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla. La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados,

de lecho fluidizado o tanque agitado. Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de

los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.

En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de inconvenientes:

Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.

El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.

La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.

2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación. También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas, el método consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales (homobifuncionales o heteromultifuncionales) se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado como una subdivisión alterna permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional. Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehido (Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos (20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se ha utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos [3]. Un resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de Inmovilización pueden verse en la tabla 2, en la cual se diferencian varias características entre distintas técnicas de inmovilización. Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización

Propiedad Enlace Cruzado

Adsorción Física

Enlace Iónico Quelación Enlace

Covalente Atrapamiento

Preparación Intermedio Simple Simple Simple Difícil Difícil

Fuerza del Enlace Fuerte Débil Intermedio Intermedio Fuerte Intermedia

Actividad Enzimática

Bajo Intermedio Alto Alto Alta Bajo

Regeneración del Soporte

Imposible Posible Posible Intermedio Alta Intermedio

Costo de la Inmovilización

Intermedio Bajo Bajo Intermedio Alta Intermedia

Estabilidad Alto Bajo Intermedio Intermedio Alta Alto Protección de la enzima contra

ataque microbiano

Algunas Veces

No

No

No

No

Si

Fuente: [67]

2.2.2 Efectos de la Inmovilización La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas, es así como la actividad de la preparación es siempre diferente a la de la forma natural, es así como efectos de índole conformacional, de partición o difusionales son los culpables de estos cambios que pueden afectar la estabilidad y la actividad enzimática[3]. Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después de su inmovilización ya que la existencia de uniones multipuntuales enzima-soporte, hacen que la estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se haga más resistente a la desactivación térmica o química; la protección frente a las proteasas cuando se unen al soporte elimina su capacidad proteolítica, y evita su autólisis; se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio y por ultimo la alteración del microentorno ayuda a diferentes enzimas debida a la interacción de la enzima con el soporte, es por ello , si una enzima sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en esa zona que en el medio de reacción, en otros casos el soporte tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgánicos, el agua ligada al soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima, Cuanto mayor es el comportamiento hidrófilo del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación activa[3]. Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones; la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo está impedido, los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad catalítica de la enzima, la inmovilización puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva o las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la enzima[3]. Otros cambios que pueden originarse pueden ser debidos a efectos difusionales, electroestáticos o de microentorno que originarían un aumento o disminución de la actividad enzimática. Los efectos difusionales se originan debido a la difusión de los sustratos hacia el centro activo de la enzima, los cuales pueden estar impedida por resistencias de tipo externo como la película líquida estacionaria (capa de Nernst o de difusión) que rodea el soporte que origina un gradiente de concentración a través de la zona de difusión y resistencias de tipo interno ya que

los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada, esto ultimo se contrarresta en algunos casos disminuyendo el tamaño del sistema biocatalítico, aumentando la concentración de sustrato, incrementando la agitación o el flujo en el reactor[3]. Los efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, son importantes a tener en cuenta, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsión mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. El Impedimento estérico o de tamaño de sustrato es otra de las variables importantes ya que en un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida apreciable de su actividad, este hecho suele ser válido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drásticamente. Este “efecto estérico” se puede evitar mediante una inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más largo[3]. Por ultimo los efectos en el microentorno tienen su efecto sobre la actividad enzimática ya que la enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar, es así como una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendrá en su microentorno una concentración mayor de hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente [3]. Como tal las enzimas pertenecen a diferentes clases, pero son las hidrolasas las que han sido utilizadas en mas de un 80 % de los proceso industriales que a su vez son el 42 % de los usos que se les dan a las enzimas, se destacan las proteasas, las isomerasas, carbohidratasas y lipasas que catalizan reacciones de hidrólisis y que actúan sobre enlaces ester, peptídicos, éter y otros [5]. El estudio de lipasas ha sido de gran estudio y las técnicas de inmovilización donde se usan polímeros hidrofílicos han causado gran revolución debido a sus innumerables aplicaciones de las cuales han sido objeto, dentro de ellas se encuentran: Síntesis orgánicas, aplicaciones farmacéuticas, químicas y biotecnológicas. La microencapsulación de enzimas es una técnica que ha sido usada continuamente para la inmovilización, lo cual no solo se puede conjugar con el atrapamiento al interior del soporte, si no, que da facilidad para crear soportes en los cuales se puede atrapar exteriormente las enzimas conjugándolas con enlaces covalentes usando activantes de grupos reactivos determinados o mediante el uso de brazos espaciadores [58]. Al hablar de lipasas es de primordial importancia reconocer sus propiedades funcionales tales y como se mencionaron anteriormente, estas clases de enzimas

diferentes autores las han reportado como precursora de muchas síntesis a nivel orgánico y acuoso [45]. 2.3 LIPASAS EN REACCIONES 2.3.1 Clasificación La clasificación de enzimas según la Enzyme Commission se basa en 4 dígitos que caracterizan las enzimas, para la triaciglicerol lipasa como comúnmente es llamada las lipasas se asigno la clasificación con numero 3.1.1.3 que pertenecen a la clase de hidrolasas y subclase de enlaces ester que catalizan reacciones de hidrólisis donde los triagliceroles se convierten en glicerol y ácidos grasos libres:

OHRRCOOHHOHRRCOO ′+↔+′

(TRIGLICERIDO) (AGUA) (ACIDO GRASO) (GLICEROL) Su nombre sistémico corresponde a triaciglicerol acilhidrolasa [5] 2.3.2 Propiedades Las lipasas son catalizadores versátiles que se aplican dentro de un amplio rango de bioconversiones tales como hidrólisis, interesterifiación, esterificación, alcoholisis, acidolisis y aminolisis aplicándose en tecnología de alimentos, aplicaciones biomédicas e industria química. Son de naturaleza amfifilica, es decir que se caracterizan por la presencia de una parte tanto hidrofílica como hidrofóbica en sus moléculas (Figura 3); estas enzimas en una emulsión de aceite y agua, migran a la interfase en donde la parte de sus moléculas hidrofóbicas permanecen en contacto con la fase hidrofóbica u oleosa y la parte hidrofílica permanece en contacto con la fase acuosa (Figura 4).

Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifílica (Fuente: [54])

(Fuente: [54]) Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase (Fuente: [54])

(Fuente: [54]). Las lipasas han sido estudiadas por muchos años y se han producido de muchos microorganismos por el crecimiento vía fermentativa. Son mucho mas abundantes en la flora microbiana comprendida entre bacterias y algunos hongos, además de encontrarse en el páncreas de mamíferos como cerdos y humanos y además en plantas muy grandes del tipo Ricinus communis. Los principales microorganismos de los que se han producido son aspergillius, bacilus, cándida y Chromobacterium. Las lipasas se han utilizado en diferentes industrias tales como la de detergentes, por su capacidad para hidrolizar grasas; en la industria de alimentos en la cual las lipasas permiten alterar las propiedades de lípidos, jugos de frutas, en fermentación vegetal y para el desarrollo de sabores de quesos; en la industria de pulpa y papel para remover el residuo hidrofóbico de esta industria. Se utilizan además en síntesis orgánica tal como en procesos de esterificación y transesterificación en la industria óleo-química. En aplicaciones biomédicas ya que

poseen una excelente capacidad parar reacciones de regioselectividad especifica, en síntesis de agentes antitumorantes, alcaloides, antibióticos y vitaminas, en biosensores como diagnostico clínico. También se usan en pesticidas, insecticidas, herbicidas y fungicidas[45]. Las reacciones típicas en donde intervienen las lipasas corresponden a la hidrólisis del tipo de reacción de triglicéridos para formar glicerol y ácidos libres, y la esterificación de ácidos y alcoholes para formar esteres; la reacción de transesterificación es también catalizada por las lipasas. 2.3.3 Reacción de transesterificación En la reacción de transesterificación un triglicérido y un alcohol forman un tri-ester y glicerol mediante uso de un catalizador. Es de importancia que en la reacción haya cantidades limitadas de agua ya que se pueden presentar reacciones colaterales de formación de jabón. [9]. 2.3.3.1 Producción de biodiesel [9,37]. La nueva tendencia mundial apunta hacia la generación de los denominados productos “limpios” con lo cual aparecen los biocombustibles basados en la transformación de la biomasa, que, para el caso de la producción de uno de los biocombustibles biológicos mas importantes a nivel mundial como es el biodiesel corresponde a los aceites de origen animal o vegetal. La producción de biodiesel se basa en la reacción de transesterificación de triglicéridos. La idea de usar aceites y grasas de origen vegetal y animal no es algo nuevo. Desde 1900, cuando Rudolf Diesel hizo funcionar el prototipo de su motor diesel utilizando aceite de maní, el concepto de usar aceites y grasas como una fuente renovable de combustibles ha sido reintroducido periódicamente. Pero la idea de usar un combustible biológico se debe a los problemas que han generado los combustibles derivados del petróleo son muchos entre los que se encuentran las emisiones contaminantes. Actualmente la mayoría de los procesos para producir Biodiesel son catalizados por bases. Se estudian también procesos catalizados por enzimas, siendo estas últimas del tipo lipasas. Este último proceso, las lipasas se usan como catalizador en la transesterificación para la preparación de monogliceridos. El proceso tiene diferentes ventajas, incluyendo la baja formación de coproductos, la fácil separación de los productos, las condiciones de reacción moderadas y la formación de esteres de ácidos grasos como el segundo mayor producto.

Existen varias ventajas que conlleva el uso de lipasas como catalizador de la reacción de transesterificación. Entre ellas se encuentran la disminución selectiva de las energías de activación, la fácil recuperación del glicerol formado, la mejora considerable de las velocidades de reacción, la posibilidad de recirculación del catalizador, la transesterificación de triglicéridos con un alto contenido de ácidos grasos libres (insaturados), las bajas temperaturas de reacción, los altos niveles de conversión a alquil ésteres, y la posibilidad de uso de alcoholes ramificados para la síntesis de ésteres con mejores propiedades de ignición, entre otras. 2.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por mililitro de disolución (U/ml), en el caso de enzimas inmovilizadas diferentes autores reportan como (U/g-soporte). Cuando se usan enzimas en la industria, su actividad siempre debe ser expresada en una forma dada, y calculada en condiciones tales que se relacionen lo mas estrechamente posible con su aplicación, en algunos casos es mas útil expresar la actividad enzimática en función de la velocidad de cambio de la velocidad u otro, en vez de en términos mas convencionales como µmol de producto formado por mg de enzima por segundo. Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat) [67]. Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el número de centros activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten calcular el número o frecuencia de recambio de la enzima, o sea, el número de reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.[67]. La actividad de las lipasas puede ser medida por diferentes métodos entre los que se reportan la hidrólisis de aceite de oliva, p-Nitrofenil Palmitato medida por espectrofotometría o titulación; además puede usarse la esterificación de ácido butírico con diferentes alcoholes alifáticos (C2 – C10) y n-butanol con diferentes ácidos carboxílicos (C2-C12) por los mismos métodos [1,12, 15, 23, 24, 42].

2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION Dentro de la tecnología de la inmovilización y según la síntesis biológica que se desee realizar juegan un papel primordial, el soporte, la enzima y el método de inmovilización. Al considerar un soporte para un enzima se deberá pensar en factores tales como el pH, la temperatura, la fuerza iónica, la presión, agitación, la conjugación de cofactores y el proceso de separación del sustrato del producto [22]. Como se mencionó anteriormente los soportes pueden variar de forma (láminas, tubos, cilindros, esferas), tamaño, propiedades físicas o químicas, encontrándose una gran variedad de compuestos naturales o sintéticos, orgánicos o inorgánicos clasificándose según [3]:

Soportes inorgánicos:

Naturales: (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.). Manufacturados: (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)

Soportes orgánicos:

Polímeros naturales: Polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, quitosano, etc.); proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc). Polímeros sintéticos: Poliolefinas (como el poliestireno); polímeros acrílicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.); Otros tipos (alcohol polivinílico, poliamidas, etc).

Los polisacáridos que se han utilizados como soportes varían desde micro esferas a lechos de alginato, dextrano, carrragenatos, agarosa, celulosa, quitosano, entre otros; todos ellos han sido utilizados con el fin de minimizar los problemas presentados en otras técnicas de atrapamiento como: a) baja eficiencia b) uso de solventes orgánicos volátiles que contribuyen a problemas ambientales c) uso de solventes orgánicos que pueden alterar la estructura y funcionalidad de las proteínas [67]. 2.5.1 Características de los soportes para inmovilización Aunque no existen soportes universales, hay algunos principios para su selección; dentro del proceso de aplicación a gran escala se encuentran: (a) El material debe de estar disponible en abundancia y a un bajo precio, (b) el proceso de inmovilización tiene que ser simple y efectivo con la consideración de retención de

la actividad enzimática, (c) la capacidad y eficiencia de las enzimas inmovilizadas tiene que ser alta y, (d) el diseño del reactor con respecto al mecanismo manejado del biocatalizador tiene que ser simple [11]. Además de lo anterior un soporte ideal para una aplicación dada es aquel que aumente la interacción con el sustrato, disminuya la inhibición por el producto, cambie el pH aparente óptimo hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fácilmente recuperable para poder volverlo a utilizar . El soporte debe de ser estable en solución y no debe de deteriorarse en las condiciones de reacción, debe ser rígido mecánicamente y tener un grado de compactación bajo en operaciones continuas a velocidades de flujo altas cuando se adapte a un diseño en reactores; en conclusión se deben de definir necesidades técnicas y económicas (costo, calidad, funcionalidad, y seguridad) para definir un buen catalizador en términos de eficiencia e integración del costo efectivo [10]. Muchos factores tienen influencia en la selección de un soporte particular. Los grupos hidroxilos del soporte juegan un papel muy importante ya que forman puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, por eso se crea un ambiente acuoso (hidrofílico) con el soporte. Los soportes de polisacáridos son susceptibles de desintegración microbiana o fúngica, y solventes orgánicos pueden causar un encogimiento del gel en los soportes usualmente utilizados para formar estos lechos [51]. Dentro de la manipulación que se logra observar en el contexto enzima-soporte deberán de manejarse características como algunos fenómenos de transporte (efectos de transferencia de masa), estabilidad operacional relacionada con el numero de ciclos si se hace referencia a un tanque agitado y un método de inmovilización que se expresará en términos de rendimiento; todo ello apuntando hacia unos datos de funcionamiento el cual se puede expresar como productividad (producto producido por unidad de enzima) o consumo de enzima por unidad de producto producido. Un resumen de los parámetros de importancia que se deben considerar en la inmovilización de enzimas se puede observar en la Tabla 3 [60].

Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas inmovilizadas CARACTERISTICAS PARÁMETROS DE IMPORTANCIA

ENZIMA

Propiedades bioquímicas: Masa molecular, grupos funcionales en superficie de proteína, pureza. Parámetros cinéticos: Actividad específica, perfiles de pH y temperatura, parámetros cinético de actividad e inhibición, Perfiles de estabilidad vs. pH y temperatura, solventes, contaminantes, impurezas.

SOPORTE ENZIMA INMOVILIZADA

Características químicas: bases químicas y composición, grupos funcionales, posibles cambios en su comportamiento, volumen accesibles de matriz, tamaño de poro, estabilidad química del soporte. Propiedades mecánicas: diámetro particular, comportamiento de partículas a la compresión, resistencia al flujo, (para aplicaciones en lechos fijos), velocidad de sedimentación (para lechos fluidizados), abrasión (para tanques agitados). Método de inmovilización: Rendimiento de la enzima activa, atrapamiento de proteína, parámetros cinéticos intrínsicos, (Ej.: propiedades y efectos de transferencia de masa). Efectos de transferencia de masa: Diferentes concentraciones de soluto al interior y afuera de las partículas catalíticas, difusión interna y externa (poros), con ello se obtiene la efectividad con relación a la enzima libre, bajo condiciones de reacción determinadas. Estabilidad: Estabilidad operacional (expresada como actividad que disminuye bajo ciertas Condiciones durante el proceso), estabilidad de almacenamiento. ‘Rendimiento’: Productividad (cantidad de producto formado por unidad de actividad o masa de enzima), consumo de la enzima(Ej.: unidades por Kg. de producto)

2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACION El quitosano esta siendo reportado para la inmovilización de enzimas, y en particular lipasas no solo porque su método de obtención como soporte es simple, y no toxico, sino porque brinda propiedades físicas y químicas de interacción enzimas-soporte interesantes para llevar a cabo reacciones biológicas con alto grado de eficiencia, actividad enzimática y bajo costo [3].

El quitosano (Figura 5) es un amino polisacárido (1-4)-2-amino-2-deoxi-β-D-glucano obtenido por D-acetilación alcalina de la quitina (Figura 6) (1-4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucano, polisacárido duro, inelástico y nitrogenado que se encuentra en las paredes de algunos hongos y en el exoesqueleto de artrópodos tales como insectos, escarabajos y crustáceos. La producción mundial de quitina es calculada en 150.000 toneladas provenientes de la industria de la fermentación que emplea hongos y el resto de la industria pesquera. El quitosano es producido por D-acetilación de la quitina al someterla a una solución de NaOH al 40% a 120 °C por 1-3 horas, produciendo quitosano D-acetilado (Figura 7). [24] Figura 5. Estructura química del quitosano

(Fuente: [35]) Figura 6. Estructura química de la quitina.

(Fuente [35]).

Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina

(Quitina)

(Quitosano) (Fuente: [35]) El quitosano es un biopolímero biodegradable, biocompatible y muco adhesivo, el cual juega papel importante como material en muchos propósitos en la industria farmacéutica, medica, alimentaría, de síntesis orgánica y biológica [4,5]. Este soporte proporciona ventajas como: su versatilidad y disponibilidad en diferentes formas (hojuelas, lechos porosos, geles, fibras y membranas), posee baja biodegradabilidad, bajo costo, fácil manejo, alta afinidad con proteínas y no toxicidad [6], además presenta propiedades físicas, químicas y biológicas muy particulares debido a sus iones catiónicos. Esta carga positiva atrae todo elemento cercano que tenga iones de carga negativa. Esta condición singular permite aplicarla en un extenso abanico de aplicaciones [45]. Dentro de las aplicaciones de la quitina y el quitosano se encuentran la formación de fibras (sistemas amida-LiCl, oxido de amina-agua), cosméticos (cremas, lociones), fotografía, piel artificial (neoformación de órganos), comida y nutrición, oftalmología (lentes de contacto), ingeniería ambiental (captura de metales a partir de corrientes de agua), industria del papel, baterías, farmacéutica (liberación de drogas), hidrogeles tales como quitosano–polieter, poli (etilen glicol) macromero-β quitosano, quitosano-gelatina, tabletas de quitosano (adición de lactosa), microencapsulados y microesferas de quitosano-oxido de polietileno, quitosano-alginato de calcio, estimulación celular de plantas y animales, agente antibacterial y como atrapador de grasa [35]. El quitosano es insoluble en agua y diversos solventes orgánicos, soluble en diferentes ácidos como ácido acético, fórmico y otros, los cuales protonan los grupos amino. Produce reacciones típicas de aminas como las N-acetilaciones por

reacciones de Schiff, sus derivados son fácilmente obtenidos bajo condiciones suaves y pueden ser considerados como sustitutos de glucanos. A temperatura ambiente el quitosano forma aldiminas y cetiminas con aldehídos y cetonas, respectivamente. El N-carboximetil quitosano es obtenido a partir de ácido glioxilico [35]. La degradación del quitosano esta inversamente relacionada con el grado de cristalinidad el cual es controlado principalmente por el grado de D-acetilación , es de notar que una alta D-acetilación exhibe una velocidad de degradación mas pequeña [35], además es de notar que el quitosano con D-Ac bajo 40-60 % permanece en solución arriba de pH cerca de 9. Entre las propiedades físicas y químicas de este heteropolimero se destacan su distribución de pesos moleculares entre 50 kDa a 2000 kDa caracterizados por HPLC y diferentes grados de D-acetilación (DDA) entre 40 y 98 %, el cual se puede caracterizar por FTIR, RMN o Cromatografía de permeación en gel, entre otros [17]. Diferentes autores reportan el uso de quitosano para membranas de gel con propiedades que pueden ser controladas por el grado de entrecruzamiento con el glutaraldehido [7,40] y para la inmovilización de proteínas [9]. Los hidrogeles de quitosano han sido reportados como adecuados para la inmovilización de lipasas por enlaces iónicos intermoleculares estables [7,36, 40,42, 49, 58]. De la información recolectada inicialmente (tabla 1) que reporta una amplia bibliografía, por las propiedades y condiciones del quitosano según la literatura antes mencionada y experiencias sobre éste mismo material en la Universidad Nacional sede Manizales de la carrera de Ingeniería Química [51] indican que el quitosano es un material adecuado como soporte de inmovilización para enzimas. La inmovilización de enzimas sobre soporte de quitosano es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Con éste fin existen diversos métodos que a lo largo de los años se han utilizado y perfeccionado como los son entrecruzamiento (cross-linking) que se ha utilizado en inmovilizaciones de diversos tipos de lipasas para aplicaciones en medio no acuoso [39]. La adsorción es comúnmente utilizada por ser un procedimiento sencillo, teniendo como desventaja una unión débil, por lo que en algunos casos se utiliza como complemento con otro método [13]; la unión covalente de una enzima a un soporte como el quitosano es quizá el método de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas [12] (Figura 8). Otros métodos de inmovilización que se reportan mencionan que los hidrogeles de quitosano son un medio eficiente de encapsulación de proteínas en forma esféricas y rugosas [1].

Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano.

(Fuente: [45]) Los diferentes soportes de inmovilización para llevar a cabo distintas reacciones pueden tener variadas presentaciones, tanto húmedas como secas, donde las segundas son principalmente utilizadas, donde los contenidos de humedad bajos son deseables para el almacenaje y la estabilidad reactiva [18]. Los métodos de secado que se reportan van desde técnicas convectivas en las cuales los soportes en húmedo se secan a temperatura ambiente durante un largo periodo de tiempo [32], o se someten a temperaturas superiores a 97 °C mediante flujos de vapor [18], hasta técnicas de criogelificación y liofilización en las cuales se manejan temperaturas de congelación; estas últimas son técnicas eficientes que no destruyen la estructura y evidencian una baja degradación de lipasa [12], Otros estudios también confirman la utilización de criogeles en esferas de polivinil alcohol por el método de congelación-descongelación en un sistema de dos fases. Por la porosidad de los criogeles los biocatalizadores de alto peso molecular pueden penetrar las esferas, mostrando así un incremento en la estabilidad térmica de la lipasa al usarse repetidamente en síntesis de ésteres [56].

2.7 HIDROGELACION Un hidrogel es definido como redes de macromoléculas hinchadas en agua o fluidos biológicos. Estos se subdividen en tres clases dependiendo de la naturaleza de la red: a) redes entrecruzadas entre si b) redes entrecruzadas covalentemente c) redes formadas por interacciones secundarias, para el caso de quitosano algunos autores dividen la clasificación en hidrogeles químicos formados por enlaces covalentes irreversibles como las hidrogeles de quitosano

entrecruzados covalentemente e hidrogeles físicos formados por enlaces reversibles como el tipo de interacciones iónicas [7]. Los hidrogeles de quitosano entrecruzados covalentemente se dividen en tres tipo s dependiendo de su estructura: a) entrecruzados entre si b) redes poliméricas híbridas (HPN) c) Redes poliméricas semi – totalmente interpenetradas (IPN). Dentro de las tres subdivisiones el principio general se basa en interacciones por enlace covalente, pero además se encuentran otras que no se pueden excluir como puentes de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas, el principio físico de estos se basa en tener el quitosano y un entrecruzador en un solvente apropiado que usualmente es agua. Se pueden adicionar otros polímeros para formar HPN o IPN. Se pueden usar otras moléculas auxiliares para catalizar o iniciar la reacción durante la preparación de la red. Los entrecruzadores más importantes son dialdehídos como glyoxal y en particular, el glutaraldehido.[7] Los hidrogeles de quitosano entrecruzados ionicamente se basan en el hecho de formar una estructura reversible entre el quitosano, que es un polímero policationico, y compuestos cargados negativamente formándose una red a través de enlaces iónicos entre cadenas poliméricas. Las interacciones hidrofóbicas se favorecen al disminuir el grado de DD del quitosano o los enlaces de hidrogeno entre las cadenas debido a una repulsión electrostática después de la neutralización del quitosano con el entrecruzador [7]. En concordancia con lo anterior las dispersiones de quitosano pueden ser obtenidas en medio acuoso ácido, el cual protona los grupos amino, el polímero se carga positivamente. En el caso de adición de base fuerte (NaOH) a tal dispersión se superan las fuerzas asociativas entre cadenas. El quitosano permanece en solución hasta cuando el pH llega a 6.2 (quitosano con DD bajo permanece en solución por arriba de pH cerca de 9). Superado ése valor, se empieza la formación de un tipo de gel hidratado como precipitado, esta precipitación o formación de hidrogel es debido a la neutralización de los grupos amino del quitosano y una consecuente remoción de fuerza electrostáticas repulsivas entre cadenas, lo cual permite agrupar por puentes de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas entre cadenas 2.8 CRIOGELIFICACION (crioconcentración) Los criogeles son matrices de geles formados como resultado de tratamientos criogénicos (enfriamiento, almacenamiento en frío por un tiempo definido y posterior descongelamiento), los cuales son soportes eficientes para la inmovilización de biomoléculas y células. Su estructura única de criogeles, en combinación con su estabilidad osmótica, química y mecánica, los hacen matrices atractivas para cromatografía de nanoparticulas biológicas.

El uso de criogeles como matrices para la inmovilización de biopolímeros (enzimas, polisacáridos y ácidos nucleicos) implica en su producción la producción de macroporos que permiten una adecuado difusión del sustrato. Los supermacroporos en camas continuas, tales como las columnas de criogeles desarrollados para la separación de biopartículas, son perfectamente adecuados para birreactores de flujo pistón [36].

3. MATERIALES Y METODOS

3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE

Uno de los objetivos del presente trabajo consiste en producir un soporte con características adecuadas para los sistemas reaccionantes (hidrólisis y esterificación).

3.1.1 Materiales y reactivos

Quitosano Sigma grado reactivo

Ácido acético glacial Merck- Grado Reactivo

Etanol Grado técnico 96%

Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo

Tripolifosfato Grado técnico - Disproalquimicos

3.1.2 Equipos de análisis y proceso

PH metro Schoot Handy Lab 1 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg) Congelador Icasa Vidriería en general Calibrador Digital

3.1.3 Procedimiento de gelificación

Para producir los hidrogeles de quitosano se recurrió a una técnica modificada de la literatura [42] que utiliza como solución gelificante hidróxido de sodio-etanol a un pH adecuado que brinde una fuerza iónica para la formación del hidrogel.

La dispersión de quitosano se evaluó en tres concentraciones 1.8, 2.4, y 3 %(w/v) en solución de 1%(v/v) de ácido acético. Las diferentes geometrías evaluadas fueron esferas, láminas y cilindros, los cuales se prepararan depositando la mezcla anterior en la solución gelificante, dejándolas en este por un tiempo prudencial hasta que el gel sea formado por completo, posteriormente se remueven las geometrías y se acondicionan adecuadamente neutralizando el hidrogel con agua destilada hasta pH neutro (anexo 1). También se evaluó la adición de glutaraldehido a concentraciones de 0.003 y 0.1 % (w/w) en soluciones de quitosano. Las esferas se produjeron por extrusión del quitosano por una aguja de calibre 21 G (0.8 mm), produciendo una gota que al caer en la solución gelificante formó la geometría esperada. En el caso de las láminas se produjeron añadiendo el gel en una rejilla metálica. Después de gelificación se hicieron cortes a tamaños adecuados. Los cilindros se elaboraron al extruír la solución por una boquilla de forma circular (4.5 mm) produciendose así unos cilindros continuos (fideos). Posterior a la gelificación se cortaron a las dimensiones adecuadas (anexo 1)

3.1.4 Procedimiento de secado convectivo

Después de producir el soporte y neutralizarlo, las geometrías de diferentes concentraciones se sometieron a temperatura ambiente por más de 24 horas y se evaluó las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital (anexo 2).

3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación (crioconcentración) El término se generó por el uso de procedimientos criogénicos en el cual se expone el hidrogel a un almacenamiento en frío y posterior descongelamiento, proceso en el cual se elimina el agua y se concentra la estructura del biopolímero. El soporte se obtuvo por exposiciones sucesivas a -20°C seguidas de descongelamiento a temperatura ambiente por más de 24 horas (anexo 2). Evaluándose las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital.

3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION La producción del sistema biocatalítico correspondió a la inmovilización de la lipasa por enlace covalente a un soporte de quitosano.



Ácido acético glacial Merck


Aceite de Oliva Tipo comercial – 0.4° acidez

Glutaraldehido BASF grado técnico 50.8 %

Tripolifosfato Grado técnico 95.5 %

Trizma – base Sigma Aldrich- Grado reactivo

Solución Buffer de fosfato

Iso-octano Carlo Erba- Grado Reactivo

Lipasa XX Split- Candida rugosa Proenzimas.

3.2.2 Enzima Utilizada

Se usó la enzima ENZECO® LIPASE XX distribuida por proenzimas® y producida por Enzyme Development Corporation EDC, a partir del microorganismo de Candida rugosa, que según especificaciones técnicas puede hidrolizar el 90 % o mas de triglicéridos en ácidos grasos. Actividad nominal: 15.000 unidades de lipasa Forma: Sólido con sal finamente pulverizada como diluyente y un

contenido mínimo de lactosa como vehículo. Solubilidad: Completamente soluble en agua


Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 20 (rango 200-1100nm)

Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH

PH metro Schoot Handy Lab 1 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg)

Vidriería en general

Micropipeta 5-50 microlitros

3.2.4 Procedimiento de activación Para la inmovilización de la lipasa en el soporte de quitosano se recurrió a un enlace covalente establecido entre el glutaraldehido y los grupos amino del quitosano el cual es uno de los grupos funcionales presente sobre la superficie del soporte y un aminoácido residual en la estructura enzimática.

Inicialmente se preparó la solución acuosa de glutaraldehido (0.003; 0.01; 0.1 % w/w) en la cual se depositó el soporte por aproximadamente 1.5 horas bajo agitación suave (400 rpm T = 25°C). 3.2.5 Procedimiento de Inmovilización

El soporte activado se lavó con agua desionizada y se sumergió en la solución enzimática 0.5% (w/v) (disuelta en fosfato de sodio pH 7.3) a temperatura ambiente. La enzima inicialmente se diluyó y se centrifugó por 2h, obteniéndose un sobrenadante rico en proteína tonel cual se hicieron los ensayos. Posteriormente se realizaron dos lavados con fosfato de sodio a pH 7.3 por dos minutos cada uno, luego se lavó con 0.1 M tris HCl pH 8 por 2 h para bloquear los grupos remanentes de CHO. Finalmente el biocatalizador es almacenado en fosfato de sodio Buffer a 4°C (anexo 3). Las soluciones residua

3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína

les de fosfato se reciclaron para análisis de carga de proteína.

Para medir la cantidad de enzima atrapada por el soporte se uso las soluciones residuales del proceso de inmovilización por enlace covalente a las cuales se les adicionó el reactivo de Biuret [66] formando una coloración violácea debido a la reacción entre sales de cobre y el nitrógeno de la enzima, la solución se analizó por espectrofotometría UV a 540 nm (anexo 4).

3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALÍTICO

Producir un soporte de inmovilización o un sistema biocatalítico implica el análisis de las características físicas y/o químicas. A partir de estas propiedades se

puede conocer la interrelación que se genera entre el medio adyacente tal como las mezclas reaccionantes de hidrólisis y/o esterificación y el soporte catalítico.



Ácido acético glacial Merck


Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo

Tripolifosfato Grado técnico - 95.5%

Hexano Grado Reactivo

Isooctano Carlo Erba – Grado Reactivo

Glicerina Carlo Erba – Grado Reactivo


Espectrofotómetro FTIR

Microscopio de barrido por sonda (SPM)

Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH

PH metro Schoot Handy Lab 1 Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg)

Vidriería en general

3.3.3 Medida de grado de D- acetilación El análisis de espectroscopia de infrarrojo se basó en la relación que existe entre los grupos hidroxilo y amida del quitosano (derivado N-desacetilado de la quitina) los cuales absorben energía a determinadas longitudes de onda. Para el análisis del grado de acetilación del quitosano se usó el método propuesto por García y Canella [20] en el cual se prepara la muestra a analizar en láminas transparentes. Estas se realizan con una solución de quitosano de 1.8 % en una solución al 2% de ácido acético y se filtró. Se evaporó el solvente a 45°C durante aproximadamente 20h, luego se neutralizó las láminas por inmersión en solución

acuosa de NaOH al 5% por 16h, y se retiró el exceso de base con agua destilada. El otro método de análisis manipulado trabajó con quitosano en polvo (3 mg) mezclándolo con 2 g de KCl, para formar una pastilla. Muestras con adición de glutaraldehido (0.003, 0.01 y 0.1% w/w) y enzima de 0.5 %w/v también fueron analizadas. Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer BX II, analizando en el rango entre 4000-400 cm-1), resolución de 4 cm -1, intervalo de 2 cm-1 en modo de transmitancia /absorbancia. El grado de D-acetilación se encuentra por

%DD = 100 - 100*33.1/3450

1650

AA Ec. (1)

3.3.4 Medida de resistencia Se determinó por inmersión del soporte seco a las tres concentraciones del quitosano en agua destilada, dejándolo en una placa agitadora a altas y bajas revoluciones (1110 rpm - 500 rpm –250 rpm) por 10 h, se determinó la pérdida de peso del soporte residual en forma cualitativa comparando el soporte al inicio y al final del proceso.

3.3.5 Medida de solubilidad y degradabilidad Se estableció por inmersión del soporte en diferentes solventes orgánicos por 72 horas, al final se cualificó la solubilidad y degradabilidad. Igualmente se evaluó la solubilidad en las mezclas de reacción de transesterificación, hidrólisis y esterificación. Los diferentes medios fueron: n-hexano, Isooctano, etanol, agua, ácido oleico, ácido acético glacial y acuoso, hidróxido de sodio y glicerina.

3.3.6 Medida del swelling (hinchamiento) Se determinó por inmersión del soporte de inmovilización en la mezcla de hidrólisis a 25°C, analizando los pesos del soporte después de tres días, el valor de swelling fue calculado a partir de[ 70]:

e

ds

WWtfW

G −

=)(

Ec. ( 2).

Donde dW es el peso del soporte seco, sW es el peso del soporte hinchado como función del tiempo y eW corresponde al valor del peso del soporte hinchado en el equilibrio, los cambios del grado de swelling contra el tiempo fueron estudiados.

3.3.7 Procedimiento de medición de rango de poro Se preparan láminas de quitosano que se asemejan a la morfología externa del soporte bajo las mismas condiciones del aparte 3.1 con el fin de obtener superficies lo mas planas posibles (diferencias entre pico y valle no mas grande de 3 µm). [16, 46, 47] El tamaño de poro se cuantificó, en forma aproximada por la técnica de microscopía de fuerza atómica (AFM) en modo de contacto a condiciones normales de temperatura (25°C) usando un microscopio de barrido por sonda Park Scientific Instrument, Moel Autoprobe CP, para analizar la topografía generada en el proceso de criogelificación (Crioconcentración) con cantilevers (ultralever) y con punta de nitruro de silicio de constante de resorte 0.25 N/m y con un escáner de capacidad de traslación x,y,z de 100x100x3 µm,. Se obtuvieron datos cuantitativos tales como rugosidad media, poro medio, poros detectados y poros por área cuadrada a partir del uso del software (Imagemetrology SPIP Versión 3.3.3.0, Nov 25 2004). Se consideran microporos si el tamaño de poro corresponde a <1.4 nm, mesoporos si 1.4 nm <poro<50 nm y macroporos si se habla de >50 nm.

3.3.8 Medida de la actividad enzimática del biocatalizador La actividad enzimática del sistema biocatalítico se realizó mediante el seguimiento de una reacción tipo ya sea hidrólisis de aceite de oliva y/o esterificación de ácido oleico con n-butanol.

3.3.8.1 Hidrólisis Para este caso se utilizó la hidrólisis del aceite de oliva con bajo grado de acidez de marca comercial. Se monitoreó la aparición del ácido oleico bajo agitación a una temperatura de 40° C y pH 7. El método a seguir tiene una exactitud aproximada y se encuentra en la referencia [59].

Se preparó la mezcla de reacción (Emulsión de aceite de oliva en Isooctano y mezcla tampón de pH 7); se somete a agitación a 40°C por un tiempo de 30 minutos. Al final de la reacción se tituló con una solución de hidróxido de sodio 0.05 N utilizando como indicador fenolftaleina al 1%. La hidrólisis se repitió sin lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada. Una unidad (U) de actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 µmol de ácidos grasos libres por minuto bajo las condiciones de prueba (40°C, pH 7.4, 150 rpm).

3.3.8.2 Esterificación La enzima se acondiciona al igual que en la reacción de hidrólisis por un periodo de 1 hora. El sistema reaccionante consistió en una mezcla equimolar de ácido oleico (0.1 M) con n-butanol (0.1M) bajo agitación y a 40°C durante 8 horas, tiempo durante el cual se tituló para conocer el consumo del ácido oleico (Método AOCS Cd 3d-63). La esterificación se repitió sin lipasa, con lipasa libre e inmovilizada. La actividad de la enzima fue calculada a partir de la pendiente de una grafica de desaparición de ácido oleico contra el tiempo y es definida como µmol de ácido oleico consumido/ hora. por mg de enzima inmovilizada. El solvente utilizado en el sistema es el Isooctano, el método se reporta en [23, 27].

4. RESULTADOS Y DISCUSIONES

4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE

La producción del soporte de inmovilización se llevó a cabo usando tres concentraciones diferentes de quitosano (1.8, 2.4 y 3%w/v); experimentalmente se encontró un comportamiento reológico diferente, proporcionando mayor viscosidad a mayor concentración, a su vez se produjeron tres tipos de geometrías (láminas, esferas y cilindros). El método de inyección utilizado para producir esferas requirió soluciones menos viscosas para mejorar la forma (Figura 9) ya que a medida que se aumentó la concentración se obstruyó el paso de la solución por la aguja utilizada modificando la morfología y producción de las mismas. Las láminas y los cilindros producidos necesitarón una solución mucho más firme y compacta de quitosano por lo que fueron utilizadas las soluciones de mayor concentración (Figura 10 y 11) para darle la forma adecuada y estabilidad a estas geometrías. Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8%

Figura 10. Hidrogel de Láminas de 3%

Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3%

Para una mejor ilustración de los resultados anteriores se recomienda al lector dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 5), donde se comparan los hidrogeles producidos entre concentración de quitosano y su geometría. Los hidrogeles producidos fueron sometidos a dos métodos de secado en el cual sus longitudes características variaron con respecto a su longitud inicial; en el caso de esferas se analizó su diámetro efectivo promedio, para las láminas se analizó los tres lados y para el caso de los cilindros el diámetro y la longitud. Los resultados promedio de los diámetros inicial y final se muestran el las tablas 4 a 7. Tabla 4. Tamaño Inicial y Final de esferas (Diámetro efectivo promedio).

Diámetro Inicial (mm) Diámetro Final (mm)♣ Esferas % w/v % w/v Método de

secado 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3 Criogelificación 2.91 3.92 4.36 2.49 2.88 3.27

Convección 2.91 3.92 4.36 1.35 1.16 2.03 Tabla 5. Tamaño inicial de laminas (longitudes en cm)

Longitud Inicial Laminas % w/v 1.8 2.4 3 Método de

secado L1 L2 H L1 L2 H L1 L2 H Criogelificación 9,10 9,46 4,70 9,94 10,25 7,84 9,64 10,02 8,26

Convección 9,83 9,68 4,72 10,12 9,97 7,59 9,81 10,06 8,21

♣ Referido a la dimensión circular de la esfera. Las esferas quedaron con dos dimensiones características después de secar por criogelificación (crioconcentración) , una de ellas (dimensión plana) se generó debido a que una porción de su superficie reposa durante un tiempo prolongado sobre la superficie (caja de Petri).

Tabla 6. Tamaño Final de laminas (longitudes en cm).

Longitud Final Laminas % w/v 1.8 2.4 3 Método de

secado L1 L2 H L1 L2 H L1 L2 H Criogelificación 7,551 8,311 2,357 8,326 8,398 4,877 8,301 8,316 6,053

Convección 3,892 4,377 1,113 3,613 3,800 2,059 3,806 4,075 2,977 Tabla 7. Tamaño inicial y final de cilindros (Diámetro y longitud media)

Tamaño Inicial (mm) Tamaño Final (mm) Cilindros

% W/V %W/V 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3 Método de

secado Diam. Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon.

Criogelificación 3.28 4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.95 4.51 2.85 4.01 3.11 4.58 Convección 3.28 4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.12 2.53 1.31 2.32 1.57 2.49

La pérdida de tamaño se atribuyó a la eliminación de agua de los hidrogeles y esta pérdida se compara entre los métodos de secado con respecto a la disminución de la longitud característica, como se puede analizar para las tres geometrías el método de criogelificación conservó mucho más las dimensiones características que por el método de secado por convección, lo cual no sólo convierte el soporte en un material de forma regular sino que mejora su estructura interna volviéndola porosa, siendo conveniente para los propósitos de éste trabajo. El porcentaje de pérdida se calculó como la razón entre la diferencia de longitud inicial y final, y la dimensión inicial. Los resultados se muestran en las tablas 8 a 10 para las diferentes geometrías. Tabla 8. Perdida de tamaño para esferas (%).

Geometría Esferas* Método de

secado 1.8% w/v 2.4%w/v 3%w/v

Criogelificación 17.13 23.78 25.21 Convección 53.74 68.9 53.89

*Referido al diámetro efectivo promedio

Tabla 9. Perdida de tamaño para laminas (%).

Geometría Láminas* Método de

secado 1.8% w/v 2.4% w/v 3% w/v

Criogelificación 49,85 37,76 26,77 Convección 76,41 72,87 63,73

*Referido a la altura promedio de la lamina. Tabla 10. Pérdida de tamaño para cilindros (%)

Geometría Cilindros 1.8% w/v 2.4%w/v 3%w/v Método de

secado Diam. Long. Diam. Long. Diam. Long Criogelificación 40.55 8.51 37.08 29.15 32.1 19.08

Convección 65.85 48.68 71.08 59.01 65.72 56 Los porcentajes de pérdida de tamaño reflejan que el método de secado convectivo disminuyó en mayor proporción las longitudes más importantes de cada geometría que el método de secado por criogelificación (crioconcentración). Al analizar cada geometría se encuentra que en el caso de las esferas un aumento de concentración de quitosano aumentó la perdida de tamaño para el caso de la criogelificación (crioconcentración). Las láminas presentaron una relación contraria, a mayor porcentaje menor perdida de tamaño para los dos métodos de secado. El diámetro del los cilindros disminuyó más que su longitud sin tener en cuenta las concentraciones de quitosano y el método de secado. La criogelificación (crioconcentración) conservó mejor la forma debido a que durante el enfriamiento se forman cristales de hielo que nuclean a partir de la solución y crecen a lo largo de la dirección de los gradientes térmicos conservando la estructura, la lixiviación del agua y la concentración de la estructura del biopolímero se genera en el proceso de descongelamiento, el proceso de secado convectivo es un proceso de transferencia de masa con el medio, en el que el agua se evapora generando cambios en las estructuras y modificando la gelificación inicial. El proceso combinado de criogelificación (crioconcentración) por 48h y posterior secado ambiente fue probado (Figura 12).

Figura 12. Proceso combinado de secado.

El proceso de secado además de generar estructuras de tamaños diferentes produce perdidas de peso durante el proceso de secado y humedades diferentes a las iniciales. El porcentaje de pérdida de peso se cuantificó al cabo de 48 horas para el caso de criogelificación (crioconcentración) y de 5 días para el caso de secado convectivo (Tabla 11). Tabla 11. Porcentaje de pérdida de peso debido al proceso de secado

Geometría Esferas Láminas Cilindros % w/v % w/v % w/v

Método de secado 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3

Criogelificación 92.3 91.9 85.05 83.68 79.50 61.87 94.7 88.4 87.6 Convección 94.1 93.4 92.1 97.31 96.75 94.51 96 95.6 92

La pérdida de peso posee una relación entre las humedades y la concentración de quitosano, una mayor perdida de peso se generó al disminuir la concentración. Los métodos de secado generaron una pérdida de peso superior al 50% lo que sugiere una alta velocidad de eliminación de masa con el medio al que esta expuesto el soporte (-20°C y 25°C). El proceso de criogelificación (crioconcentración) es dependiente de la geometría, las láminas que poseen un mayor volumen en comparación con las otras geometrías presentaron menor perdida de peso. Las humedades finales al cabo de 48 h para el método de secado por criogelificación (crioconcentración) y 5 días para el convectivo se reportan como pérdida por desecación en estufa corriente [21] a 100°C (tabla 12 a 14). Aunque no se reporta la temperatura de desnaturalización para este material se hicieron ensayos de los soportes a diferentes temperaturas (100°C, 120°C y 150). La

resistencia térmica del soporte se estimó en 100ºC debido a que a temperaturas superiores cambió de color. Tabla 12. Humedad finales de esferas (%).

% w/v Método de

secado 1.8 2.4 3

Criogelificación 12.90 15 16 Convección 10.92 14.41 14.51

Tabla 13. Humedad finales de Laminas (%)

% w/v Método de

secado 1.8 2.4 3

Criogelificación 80.8 82.3 86.125 Convección 12.05 8.67 7.87

Tabla 14. Humedad finales de Cilindros (%)

% w/v Método de

secado 1.8 2.4 3

Criogelificación 38.76 66.45 79 Convección 17.39 10.9 10.19

Nota: Las humedades de las tablas 12, 13 y 14 corresponden a las humedades finales de equilibrio correspondientes a cada procedimiento. Las láminas secas por criogelificación (crioconcentración) presentaron mayor humedad final con respecto a las demás geometrías, puesto que tenían mucha mas agua en su estructura en comparación con las esferas y cilindros. A iguales condiciones se retuvo en las tres geometrías mayor cantidad de agua en el soporte seco por criogelificación (crioconcentración) al utilizar una mayor concentración de quitosano. El método de secado convectivo redujo en mayor proporción el tamaño de los pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25ºC en contraste con la criogelificación (crioconcentración) que al cabo de 48 horas genera un soporte con un tamaño similar al inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades que varían entre 15 % y 80% con actividades de agua entre 0.5-0.95. Se sugiere que el proceso de secado por criogelificación (crioconcentración) debe ser prolongado variando de 48 Horas a 5-6 días con periodos iguales de

congelamiento-descongelamiento. Los resultados anteriores se muestran en las figuras 13 a15. Figura 13. Esferas secas.

Figura 14. Laminas secas.

Figura 15. Cilindros secos.

Hidrogel

Criogelificación (Crioconcentración) Secado Convectivo

Hidrogel Criogelificación (Crioconcentración) Secado Convectivo

Al variar el tiempo de exposición de los soportes de 48 horas a 5-6 días por el método de criogelificación (crioconcentración) se encontró que disminuyeron las humedades finales entre 10-20 %. Los resultados se muestran en la tabla 15. Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 días (%)

% w/v Geometría 1.8 2.4 3

Láminas 10-20 10-20 10-20 Cilindros 14.68 20.38 17

Para una mejor ilustración de los resultados anteriores se recomienda al lector dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 6), donde se compara cada geometría a diferentes niveles de quitosano y métodos de secado. El método de secado convectivo conservó mucho mejor la forma del soporte con respecto al inicial, pero el tamaño fué mejor conservado por criogelificación (crioconcentración). En el caso de las esferas secadas a -20°C se destruyó la forma debido a que los cristales de hielo generados deformaron las estructuras esféricas, para el caso de las láminas y cilindros no se deformaron. Los métodos de secado probados generaron estructuras muy diferentes entre si; el propósito del secado es obtener un soporte seco con estructuras porosas para inmovilizar lipasas por enlace covalente. El método de criogelificación proporcionó este tipo de soporte, por lo cual se eligió para reproducir soportes en la inmovilización de lipasas. Con el método de secado convectivo se generaron estructuras fuertes de color amarillo que no demuestran a simple vista una porosidad adecuada para los propósitos de inmovilización. Es de gran importancia un soporte poroso con características físicas apropiadas en reacciones donde la agitación es un parámetro significativo al igual que los fenómenos de transferencia de masa. Las esferas producidas por criogelificación sufrieron una deformación resultando inapropiadas para la inmovilización, puesto que se requerían formas regulares del sistema biocatalítico. Los catalizadores buscados deben de proveer un tamaño y dimensiones características para promover una buena actividad catalítica, resistencia a la abrasión, disminución de la caída de presión (reactores de flujo pistón) y una distribución de masa en el sistema reaccionante (sistemas agitados). Las láminas tuvieron una estructura fuerte y un tamaño ideal, pero en la agitación sufrieron fragilidad tal y como se comprobó en ensayos preliminares desprendiéndose fragmentos de quitosano y formándose superficies redondas en sus aristas, algunos autores reportan iguales resultados [18].

Los cilindros proporcionaron un soporte ideal, fueron fáciles de reproducir, tuvieron forma regular de tal manera que para estudios posteriores como procesos de simulación son de gran utilidad, fueron resistentes a la abrasión y fuertes en sistemas agitados. Los tamaños generados (diámetro de 2-3 mm y altura de 4-4.5 mm) son similares a los catalizadores convencionales tipo zeolita sintéticas [63] (diámetro de 3 mm y altura de 5 mm) (figura 16); en el proceso de descongelamiento se generaron cavidades en su interior en forma de capas que pueden aportar condiciones favorables para la transferencia de masa de los sistemas reaccionantes (figura 17). Figura 16. Comparación del soporte convencional con biológico.

Figura 17. Soporte biológico.

Los cilindros de quitosano a las tres concentraciones se les determinaron las humedades finales por el método de Karl Fischer para verificar la exactitud del método de secado por estufa (temperatura de 100ºC). La diferencia entre los

Quitosano Zeolita

métodos es de aproximadamente 5%, lo cual indica que la humedad eliminada por el secado en estufa se debe fundamentalmente a eliminación de agua y no de otros compuestos. Para la elaboración del soporte se ensayaron otras técnicas de elaboración que consistieron en hidrogelación en frío, entrecruzamiento con glutaraldehido y gelificación con Tripolifosfato (TPP) Los soportes por hidrogelación en frío se generaron al congelar la solución gelificante a -20°C inmediatamente después de introducir la solución de quitosano en NaOH-etanol, el tratamiento de secado por criogelificación (crioconcentración) se realizó de igual forma. Los cilindros obtenidos poseen una estructura uniforme, una geometría de cilindro definida y un color blanco más intenso (Figura 18). Figura 18. Soportes por hidrogelación en frío

Los soportes por entrecruzamiento se generaron al adicionar 5 ml de glutaraldehido de concentración (0.003 y 0.1%w/w) a una solución de quitosano al 3%, la solución estuvo en reposo por 30 minutos, según algunos autores [33] al adicionar glutaraldehido se reduce el contenido de agua y consecuentemente el tamaño de poro, modificando la superficie porosa. Los resultados cualitativos demostraron una estructura mucho mas firme al adicionar el glutaraldehido, ya que al adicionar un entrecruzador aumentó la rigidez y fragilidad del soporte. Los resultados de porosidad se muestran en el capitulo correspondiente a la caracterización del soporte (Numeral 4.3.5). Los soportes gelificados por Tripolifosfato implicaron el uso de una solución iónica distinta a la que se usó (NaOH-EtOH), la técnica reportada [42] implicó la preparación de una solución de TPP en tris HCl a un pH de 7.2. Láminas y cilindros se probaron, generando estructuras que no gelificaron en su interior pero si en su exterior, además el proceso de secado generó un soporte sólido muy compacto y duro, pero arenoso, que no ofrece ninguna porosidad visual (Figura 19). Los hidrogeles de esferas generadas no presentaron estos problemas. El

uso de esta técnica sugiere la inmovilización por retención física bajo atrapamiento. Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP (cilindros)

4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION

4.2.1 Carga enzimática

Como se mencionó en el capitulo de producción del soporte la geometría apropiada para la inmovilización correspondió a los cilindros secados por criogelificación (crioconcentración) los cuales se escogieron según los argumentos mencionados anteriormente, el porcentaje de quitosano escogido fue de 3 % debido a que ofrece una estructura mas fuerte. Los porcentajes de dilución (sal y lactosa) de la enzima XX Split proveída por proenzimas no son reportados, para el caso. Se realizó un análisis de proteína para la enzima adquirida, por el método de Kjeldah (Nitrógeno Total) y el método del ácido Bisinconílico (método colorimétrico), los resultados se reportan en la tabla 15. Tabla 16. Análisis de proteína.

Análisis % proteínaKjeldah (Nitrógeno Total) 1.2

Método Colorimetrico 2.15 La enzima se centrifugó para eliminar la mayor parte de la sal en la que se encontraba, eliminar residuos insolubles.

Para conocer la carga de proteína en los soportes de quitosano se elaboró una curva patrón siguiendo el método colorimétrico de Biuret (anexo 4). Los resultados se muestran en la Tabla 16. Tabla 17. Curva patrón

Longitud de Onda (nm)

Concentración (mg/L)

Absorbancia

0 0 0.1 0.0347 0.25 0.1253 0.5 0.2289 0.75 0.3508

550

1.0 0.4486 La curva de concentración contra absorbancia es C = 5.6360e-2+3.9561e-2*A con R2= 0.9967. Tres concentraciones de glutaraldehido como activador del quitosano fueron probados para determinar la mayor carga de proteína inicial por unidad de soporte dando los siguientes resultados. Tabla 18. Carga de proteína

Concentración de glutaraldehido

%w/w

Cantidad de proteína* cargada inicialmente

(mg/g quitosano**) 0,003% 6.8935 0,01% 5.4573 0,10% 4.6065

* Valores iniciales de carga sin restar los lavados del soporte. **Soporte de Quitosano con humedad de equilibrio entre 15-20% Para el trabajo dentro del laboratorio se escogió la activación con GA de concentración de 0.003%, ya que generó una mayor cantidad de enzima cargada, además se sugirió el trabajo con la misma debido a que resultados similares (óptimo de baja concentración) fueron reportados por otros autores [58]. El tiempo de contacto inicialmente sugerido correspondió a 1 hora entre el soporte y la enzima, tiempo que no generó carga final de proteína ya que toda la enzima cargada se perdió en los lavados. Un aumento del tiempo de contacto generó mejores resultados (Tabla 18) para que la enzima se uniera covalentemente al soporte. Se usó una solución buffer para conseguir una estabilidad adecuada de la enzima (estable entre pH de 4.0 a 7.5).

Tabla 19. tiempos de carga de enzima

Tiempo (h)

Cantidad de proteina*cargada finalmente (mg/g quitosano)*

1 0 5 0.951 15 1.057

*g quitosano reportados en base seca Un aumento del tiempo de contacto aumentó la carga de proteína dentro del proceso de inmovilización. El proceso de inmovilización sugerido al utilizar la lipasa XX Split del microorganismo Candida rugosa y cilindros de quitosano seco por criogelificación (crioconcentración) es como sigue:

1. Tomar una cantidad de quitosano seco (3g) producido por los métodos anteriormente mencionados.

2. Sumergir en 50 ml de solución de glutaraldehido (0.003%) hasta que

cubran totalmente los soportes. Agitar a una velocidad de 400 rpm por 1.5 h.

3. Filtrar la solución anterior con un papel de filtro de poro grande y lavar con

abundante agua desionizada. Retirar el exceso de humedad con papel absorbente.

4. Acondicionar la enzima en solución buffer para obtener una solución

concentrada de enzima. En el caso de la enzima XX Split se diluyó la enzima en una relación enzima – solvente (Na- Fosfato Buffer) de 3:5 y se agita por 10 minutos hasta solubilizar la mayor cantidad de sustrato, se centrifuga por dos horas a altas revoluciones y se retira la solución sobrenadante, esta solución se centrifuga nuevamente por 30 minutos hasta obtener una solución transparente.

5. Sumergir los cilindros del paso 3 en 50 ml de la solución enzimática o más

hasta que los cilindros queden completamente cubiertos. Agitar a 400 rpm por 16 horas.

6. Hacer pasar la solución por un papel de filtro de poro grande y almacenar

la solución residual para análisis de proteína.

7. Lavar dos veces los soportes con 50 ml de fosfato de sodio buffer o con igual volumen de enzima utilizada por 5 minutos y filtre. Almacene la solución residual para análisis de proteína.

8. Sumerja los soportes en solución de tris Hcl pH 8 y deje en reposo por 2

horas.

9. Lave los soporte con solución de Na-fosfato buffer y déjelos en esta para almacenarlos. Refrigere a 4°C.

Para una mejor ilustración se muestra en un diagrama el procedimiento de inmovilización por enlace covalente sugerido (anexo 3).

4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALÍTICO 4.3.1 Grado de D- acetilación

El grado de D-acetilación del quitosano con el que se construyen los sistemas biocatalíticos indica algunas propiedades del soporte tales como: biodegradabilidad, características de formación del gel y posibles tratamientos anteriores del quitosano. Un alto grado de D-acetilación es favorable al entrecruzamiento ya que necesita principalmente unidades reactivas desacetiladas [33]. Figura 20. Espectros de quitosano puro

El espectro en modo de absorbancia se realizó a una muestra de quitosano puro (hojuelas en bruto), muestra que fue macerada y pulverizada. La zona de identificación de grupos funcionales ubicada entre 4000-1600 cm-1 en la cual se observan los grupos hidroxilo, el enlace característico del quitosano; con un pico a 3415.65 cm-1, y con una absorbancia de 0.99. La absorbancia de otros grupos como los alargamientos y tensiones del grupo N-H que aparecen en la zona característica del hidroxilo no se observan debido a lo ancho del pico del hidroxilo. El segundo grupo característico del quitosano parcialmente desacetilado es la amida I que se presenta entre 1620 - 1700 cm-1, este grupo se muestra en el espectro a un pico en 1651.91 cm-1 con una absorbancia de 0.41. Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lámina.

La interacción entre el ácido y el quitosano en el momento de elaboración de la lámina para el análisis formó un acetato de quitosano [43, 48], esta reacción aporta un cambio de los picos de los grupos funcionales tal y como se observó en el espectro. Los grupos característicos como son el grupo hidroxilo y amida I se encontraron a 3302.94 cm-1 y 1652.42 cm-1 respectivamente, la presencia de enlaces N-H propios a 1590cm-1 que en éste caso se observó en un pico de 1588.20, se debió al grupo amina característico del quitosano ya que este es proveniente de la quitina y se diferencian en éstos grupos.

El análisis del espectro de quitosano fue contrapuesto con el espectro de quitina; la comparación hecha por el equipo es adecuada debido a que el quitosano proviene de la quitina. Se evaluó el grado de D-acetilación del quitosano con las dos técnicas mencionadas, encontrando que por el método de preparación de muestra con lámina se presenta un % de D-acetilación ( ecuación 1) de 53% y utilizando el método de pastilla con KCl es 68.86% (N-acetilación de 31.14%) (Tabla 19). El valor reportado por el proveedor (Sigma Aldrich) correspondió a un grado de D-acetilación superior al 75%, la diferencia encontrada supone la influencia de la molécula de agua que afectó en algún nivel los espectros, enmascarando los grupos hidroxilo y amida; la muestra no tuvo ningún tratamiento de secado riguroso para el posterior análisis. El grado de D-acetilación del quitosano utilizado tuvo un valor alto que supone que el soporte producido tendrá velocidades de degradación bajas y será favorable al entrecruzamiento con glutaraldehido ya que presenta una buena proporción de unidades reactivas desacetiladas. Se sugiere el uso de espectroscopia Raman para evitar la interferencia del agua, en caso contrario el uso de FTIR sugiere que la muestra deberá de ser tratada eliminando el agua presente. El método de producción de muestras por pastillas de KCl sugiere un procedimiento con menor contaminación de la muestra y menor tratamiento físico que interfieran en el proceso de análisis ya que el producto es tomado en bruto. Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac

Técnica

A (1650) valor A

(3450) valor N-Ac D-Ac

Lamina 1651.63 0.62 3336.54 0.99 0.47 0.53 Pastilla 1680.88 0.41 3414.65 0.99 0.31 0.69

Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida.

Característica

Técnica

Quitosano Glutaraldehido Enzima

A (~1650)

A (~3450)

Lamina 1.8 % 0.003 % W/W 0.5 % p/v 0.6 0.99 Lamina 1.8 % 0.003 % W/W - 0.53 0.98 Lamina 1.8 % 0.01 % W/W 0.5 % p/v 0.58 0.98 Lamina 1.8 % 0.01 % W/W - 0.48 1 Pastilla 1.8 % 0.1 % W/W 0.5 % p/v 0.44 1 Pastilla 1.8 % 0.1 % W/W - 0.40 1

Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afectó la absorbancia de los grupos amida I (~1650) (tabla 20), una alta concentración de glutaraldehido (0.1%) mostró un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un hombro característico debido a la interacción entre el glutaraldehido y los grupos amino disponibles del quitosano (anexo 7). Los espectros de FTIR (anexos 7) con diferentes concentraciones de glutaraldehido muestran los grupos propios del quitosano sin sufrir una deformación pronunciada, tales como: Grupos hidroxilo -OH (3450-3200) Grupos amida I (1700-1620) en la región de huellas digitales Grupos amino -NH2 (~1590) Enlaces glucosidicos -C-O-C (~1150) Estiramiento y alargamientos de C-H (2900 -2700) Estos grupos varíaron en poca proporción al igual que en su absorbancia, los cambios generados en los espectros hacia la derecha se deben a la interacción entre el quitosano y parte de los componentes que se añaden, así como la influencia de la concentración de los mismos. En el espectro de la lipasa se ven las bandas características del hidroxilo (3450-3200 cm-1), los grupos carbonilos a 1645.85 cm-1 y enlaces glucosidicos a 1153.32 cm-1 (Anexo 9).

4.3.2 Resistencia

Se determinó una resistencia observada a la inmersión del soporte en agua destilada (100 ml) con agitación. Adicionalmente las muestras se pesan para encontrar si existen pérdidas de peso muy considerables. Cinco muestras del soporte seco fueron sumergidas, encontrándose lo siguientes resultados. Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilización

Revoluciones (rpm) 1.8 % 2.4 % 3%

1100 resistente resistente resistente 500 resistente resistente resistente 250 resistente resistente resistente

El soporte fué resistente a altas agitaciones ya que conservó todo su peso original, inicialmente se sometió a un hinchamiento por un día y posterior agitación, también a una agitación directa sin hinchamiento previo, en los dos casos se

produjo un aumento del peso debido a la absorción del agua, no se observó ningún desprendimiento de partículas. La utilización de este soporte en sistemas altamente agitados es favorable, se piensa que el soporte ayudará a aumentar la transferencia de masa y por consiguiente mejorar la reacción.

4.3.3 Solubilidad y degradabilidad

La quitina es un polisacárido altamente hidrofóbico, insoluble en agua y en diferentes solventes orgánicos, el quitosano es el producto D-acetilado de la quitina es soluble en ácidos diluidos tales como ácido acético y fórmico [35]. Tres cilindros secos de quitosano con glutaraldehido fueron sumergidos sin agitación en diferentes solventes por un tiempo de 3 días observando cualitativamente su comportamiento. Los resultados se observan en la tabla 22. Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes

Pruebas: solubilidad Hinchamiento Mezcla de reacción de transesterificación

Insoluble No

Mezcla de reacción de hidrólisis Insoluble Si Mezcla de reacción de esterificación Insoluble No Hexano Insoluble No Ácido acético glacial* soluble - Ácido acético acuoso soluble - Hidróxido de sodio acuoso Insoluble Si Glicerina Insoluble No Isooctano Insoluble No Agua Insoluble Si

* A un tiempo de 24h se disolvió parcialmente, al cabo de48 h se disolvió totalmente. El soporte catalítico es soluble en soluciones de ácido acético e insoluble en los demás solventes. El soporte presentó un hinchamiento al sumergirlo en soluciones acuosas, comprobándose el estado hidrofílico del soporte al absorber moléculas de agua. La utilización del soporte en sistemas reaccionantes es favorable debido a su insolubilidad en mezclas tipo hidrólisis, esterificación y transesterificación lo cual es conveniente para esta clase de sistemas biocatalíticos.

4.3.4 Swelling El swelling o hinchamiento es en un aumento del tamaño de la malla de la red polimérica [70]. Cuatro muestras fueron sumergidas en la mezcla de reaccionante de hidrólisis a 25 °C, el proceso de swelling se analizó durante 4 días encontrándose un aumento del peso contra el tiempo (Figura 22). Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrólisis a 25ºC

Se tomó un promedio de las cuatro muestras de quitosano, encontrándose un factor de swelling a cada tiempo Figura 23. Figura 23. Swelling a cada intervalo de tiempo

0102030405060708090

0 20 40 60 80 100 120

Tiempo (h)

G (%

)

El grado de hinchamiento para los cilindros a concentración de 3% de quitosano fue considerable, encontrándose que el soporte se hinchó en un 77,16 % al cabo de 96 horas en la reacción de hidrólisis bajo agitación a 25 °C.

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0,03

0 20 40 60 80 100 120Tiempo (h)

Peso

de

la m

uest

ra (g

r)

Hidrólisis 1Hidrólisis1Hidrólisis2Hidrólisis2

4.3.5 Medición de rango de poro La morfología observada para las tres concentraciones de quitosano secadas por criogelificación (crioconcentración) cualitativamente fue distinta (Figura 24 a 26). Las micrografías tomadas a las películas de quitosano corresponden a un tamaño de 5µm, y se muestran en escala de grises. Las zonas mas oscuras corresponden a superficies más profundas, donde se encuentran los poros formados. Algunos perfiles lineales de las micrografías se observan en el grafico de la derecha. Figura 24. Concentración de quitosano de 1.8 %

Figura 25. Concentración de quitosano de 2.4 %

Las rugosidades reportadas para las anteriores micrografías correspondieron a valores medios entre 229 y 308 nm (tabla 23). Se puede tener una relación entre la concentración de quitosano y la rugosidad; la estructura de concentración de quitosano de 1.8 % corresponde a una estructura mas rugosa y una de 3 % a una superficie menos rugosa. La rugosidad media muestra que el aumento de la concentración de quitosano generó superficies más homogéneas en la cual el tamaño de los poros muestran una tendencia a disminuir cuando se aumenta la concentración, dicha relación concuerda con la teoría. Tabla 24. Rugosidad Media.

Rugosidad Media (nm) 1.8 % 2.4 % 3 % 308 245 229

Los poros hallados en promedio correspondieron a valores entre 0.226 y 0.195 µm (226 y 195 nm) lo cual supone macroporos dentro de las estructuras analizadas (tabla 24), el tamaño de micro y mesoporos que puedan existir dentro de la superficie del soporte deberá de ser analizada por estudios de porosimetría. Tabla 25. Porosidad media.

Concentración (%)

Poro medio (nm)

Desviación estándar

Poros detectados Poros/µm2

1.8 195 805 37 1.48 2.4 149 535 95 3.80 3 226 560 81 3.24

Para una mejor visualización de la morfología superficial, algunos perfiles lineales mostrados por el software del equipo se muestran como anexos (Anexo 9).

Julian

Figura 26. Concentración de quitosano de 3 %

Entre las modificaciones que se realizaron en la producción del soporte se halla la adición de un entrecruzador como lo es el glutaraldehido que disminuyó el contenido de agua en la película y consecuentemente el tamaño de poro y modificó la superficie porosa, otros autores reportan iguales resultados [33], la figuras 27 y 28 muestran los resultados de la morfología obtenida al adicionar el glutaraldehido en las dos concentraciones (0.003% - 0.1%) en una relación (25:5 en volumen) de quitosano – glutaraldehido. Figura 27. Micrografía de Quitosano con Glutaraldehido de 0.003 %

Figura 28. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.1 %

Al aumentar el contenido de glutaraldehido la rugosidad del soporte se ve afectada disminuyendo de un valor de 410 nm (Figura 27) a un valor de 180 nm (Figura 28. ) lo cual supone un cambio en la morfología de las superficies, debido al efecto del entrecruzador, formando estructuras mucho mas fuertes y uniformes al aumentar la concentración de glutaraldehido. El tamaño de los poros reportados fueron del orden de 471 ± 1834 y 367±756 respectivamente. El aumento de la concentración de GA mostró una relación con la disminución de la rugosidad y el tamaño de poro, generando estructuras mucho mas uniformes.

4.3.6 Actividad enzimática del biocatalizador

4.3.6.1 Hidrólisis La actividad del biocatalizador se determinó en la reacción de hidrólisis de aceite de oliva; se realizaron tres ensayos de la reacción: 1) Reacción sin lipasa (blanco), con el fin de verificar si la reacción es espontánea bajo las condiciones de ensayo 2) Reacción con lipasa libre y 3) Reacción con lipasa inmovilizada. El método de seguimiento se llevó a cabo por 30 minutos, titulando los ácidos grasos libres generados (como ácido oleico) con fenoftaleína al 1 % (tabla 25). Tabla 26. Gramos de ácido oleico producido con el tiempo

Tiempo Acido oleico (gr)

(lipasa inmovilizada)Acido oleico(gr)

(lipasa libre) Acido oleico (gr)

(rxn sóla) 0 0,0113 0,0113 0,0113 10 0,041 0,0141 0,0113 20 0,0424 0,01695 0,0113 30 0,0466 0,028 0,0113

Figura 29. Hidrólisis del aceite de oliva (producción del ácido oleico).

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 10 20 30 40Tiempo (min)

Aci

do o

leic

o (g

r)

Lipasa inmovilizada

lipasa libre

sin lipasa

La reacción de hidrólisis no se llevó a cabo espontáneamente durante un tiempo de 30 minutos, es decir que cualquier cambio se atribuye a la acción de la enzima (Figura 29). La producción de ácido oleico (ácido graso monoinsaturado que se encuentra en mayor proporción en el aceite de oliva [44, 59]) con lipasa inmovilizada es mayor que la producida por la Candida rugosa en estado nativo

después de los 30 minutos de la reacción, se observó una producción más rápida del ácido en los primeros minutos de la reacción; El uso de lipasas inmovilizadas aumentó la velocidad de reacción para la hidrólisis bajo las condiciones de ensayo (40°C y 400 rpm) resultados similares fueron encontrados por Shao y Weng [12]. El comportamiento de la actividad catalítica muestra la relación entre la cantidad de sustrato producido (µmol) y la cantidad de enzima presente (tabla 26). Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrólisis

TIEMPO (h)

Actividad (L. Inmovilizada)U/mg enzima

Actividad (L.libre) U/mg enzima

0 0 0 10 14,79 12,5 20 7,75 12,5 30 5,87 25

Figura 30. Actividad de Candida rugosa en la reacción de hidrólisis.

05

1015202530

0 10 20 30 40TIEMPO (min)

AC

TIVI

DA

D (U

/mg)

Lipasa inmovilizadaLipasa libre

El comportamiento para cada enzima fue diferente; la enzima inmovilizada presentó un máximo de 14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reacción, siendo 1.2 veces mayor que la libre para este período, al cabo de los 30 minutos se presentó una pérdida de actividad del sistema biocatalítico. El comportamiento presentado es posible que se deba al proceso de hinchamiento que se generó en la reacción de hidrólisis, presentando una subsiguiente lixiviación enzimática lo cual generó a su vez una disminución de la actividad. Se sugiere que un hinchamiento previo en el sistema reaccionante debe ser realizado antes del proceso de inmovilización.

La reacción de esterificación se llevó a cabo por titulación de los ácidos grasos libres que desaparecen y siguiendo el método señalado en [23, 27], dentro de un lapso de 8 horas, el procedimiento al igual que la hidrólisis se monitoreó por titulación en las reacciones sin lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada. Los resultados de ácido oleico que reaccionó a través del tiempo se pueden ver en la tabla 27. Tabla 28. Gramos de ácido oleico en el tiempo

Tiempo (h)

Acido oleico (gr (rxn espontanea)

Ácido Oleico (lipasa libre))

Acido oleico (gr) (lipasa inmovilizada)

0 0,254 0,254 0,254 2 h 0,254 0,254 0,254 4 h 0,251 0,252 0,245 6 h 0,250 0,250 0,236 8h 0,247 0,244 0,229

Figura 31. Esterificación del ácido oleico y n-butanol

Las enzimas inmovilizadas generaron una mayor contribución a la reacción de esterificación en el que el ácido oleico desaparece. El proceso de esterificación sin catalizador se llevó a cabo espontáneamente bajo las condiciones de ensayo (40° y 400 rpm). La lipasa inmovilizada produjo una mayor reacción del ácido oleico que la reacción sin catalizador al cabo de 8 horas, obteniéndose una mayor conversión del ester.

0,220

0,230

0,240

0,250

0,260

0 2 4 6 8 10Tiempo (h)

Aci

do o

léic

o (g

r)

Rxn espontaneaLipasa libreLipasa inmovilizada

Julian

4.3.6.2 Esterificación

Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificación

TIEMPO (h)

Actividad (L. Inmovilizada)U/mg enzima

Actividad (L.libre) U/mg enzima

0 0 0 2 0 0 4 6.89 3.86 6 9.22 5.04 8 9.69 9.6

Figura 32. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de Esterificación.

0

2

4

6

8

10

12

0 2 4 6 8 10Tiempo (h)

Act

ivid

ad (U

/mg)

LIBREINMOVILIZADA

La actividad enzimática del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo. El biocatalizador y la enzima libre se encuentran cercanos al cabo de 8 horas, la enzima inmovilizada aumentó la velocidad de reacción en la esterificación de ácido oleico y n-butanol bajo las condiciones de ensayo. El sistema biocatalítico producido fue eficiente y activo para reacciones de hidrólisis y esterificación, tal y como fue planteado en la hipótesis de la propuesta. Se cree que las condiciones favorables obtenidas por parte del sistema biocatalítico fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte: (i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activación) generó la introducción de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogió significativamente en solventes como isooctano). (ii) El soporte sirve como una reserva de moléculas de agua, por lo que la adición de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante.

(iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema reaccionante hasta con agitación intensa sin daño de su estructura. El soporte producido muestra una favorable tendencia a ser utilizado en procesos continuos, como reactores PFR. Ensayos de reutilización del soporte bajo condiciones continuas fueron probados para contrastar los resultados encontrados (Figura 33 y 34). Figura 33. Reutilización del biocatalizador (actividad) en hidrólisis

0

1

2

3

4

5

6

7

0 2 4 6 8Número de reciclos

Act

ivid

ad (U

/mg)

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8Número de reciclos

Porc

enta

je d

e ac

tivid

ad

El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de almacenamiento y la reutilización. El sistema biocatalítico se reciclo ocho días después de participar por primera vez en la reacción de hidrólisis las figuras 33 y 34 se encuentran influenciadas por el almacenamiento y al mismo tiempo por el número de reciclos. Los primeros reciclos disminuyeron en mayor proporción la actividad (más del 50%), después del cuarto reciclo la enzima no mostró ninguna actividad. La influencia del tiempo de almacenamiento fue notoria en el primer reciclo. Se cree que el factor que influenció la perdida de actividad fue debido al hinchamiento del soporte que pudo generarse en la reacción de hidrólisis y una subsecuente lixiviación así como también una posible desactivación enzimática. Los resultados de pérdida de actividad con el número de reciclos y el swelling fueron reportados por Shao y Wen [12].

Julian

Figura 34. Reutilización del biocatalizador (porcentaje) en hidrólisis

5. CONCLUSIONES

El método de secado convectivo redujo en mayor proporción el tamaño de los pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25ºC. La criogelificación (crioconcentración) generó un soporte de tamaño similar al inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades entre 15 % y 80% y actividades de agua entre 0.5-0.95. La resistencia térmica del soporte se estimó en 100ºC debido a que a temperaturas superiores cambió de color, posiblemente se atribuyó a la eliminación de otros compuestos distintos del agua. Los valores de humedad final del método de secado por estufa (a 100°C) presentan una diferencia del 5% en promedio con respecto al método del Kart Fischer. El método de secado convectivo no generó una porosidad adecuada para los fines que se estaban buscando. La criogelificación (crioconcentración) no permitió obtener una geometría esférica, mientras que fue viable para producir láminas y cilindros. El tiempo adecuado para obtener soportes con actividades de agua de 0.4-0.45 a 25ºC y humedades del 10-20 % fue de 5-6 días. Los cilindros de quitosano proporcionaron un buen soporte para la inmovilización de lipasas; por ser fáciles de reproducir, tienen forma regular útil en procesos de simulación, son resistentes a la abrasión y fuertes en sistemas agitados. Las láminas bajo agitación fuerte desprendieron fragmentos de quitosano formando superficies redondas en sus aristas. La enzima XX Split posee una concentración 1.2 % de proteína (Método de Kjeldah) y 2.15 % (método del ácido bisinconilico), para la utilización de esta enzima en la inmovilización enzimática se debe de concentrarla utilizando centrifugación. Se encontró que de los tres niveles de glutaraldehido probados, la concentración de 0.003 % generó los mejores resultados para la inmovilización de lipasa Cándida Rugosa (CRL) por un tiempo de 15 horas. La enzima XX Split presentó una posible solución tampón en su estado nativo, ya que al solubilizarla en buffer de fosfato de sodio a 7.3 el pH bajó hasta pH 5.63.

El grado de D-acetilación del quitosano utilizado fue del 68.86% (método de pastilla) y del 53 % (método lámina) el cual exhibe propiedades características de este valor, tales como gelificación a pH cercanos a la neutralidad y velocidades de degradación más pequeñas. Se presume que hubo una interferencia de la humedad en las muestras. Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afectó la absorbancia de los grupos amida I (~1650). Una alta concentración de glutaraldehido (0.1%) mostró un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un hombro característico debido a la interacción entre el glutaraldehido y los grupos amino disponibles del quitosano. El soporte de inmovilización (cilindros) fue resistente a la agitación a revoluciones de 1100 rpm sin importar la concentración de quitosano utilizada, la agitación incrementa el hinchamiento del soporte en soluciones acuosas. El soporte catalítico es soluble en soluciones de ácido acético e insoluble en los demás solventes probados. El grado de hinchamiento para los cilindros a concentración de 3% de quitosano es considerable, encontrando que el soporte se hincha en un 77,16 % al cabo de 96 horas en la reacción de hidrólisis bajo agitación a 25 °C. Las micrografias de AFM mostraron que la morfología superficial observada para las tres concentraciones de quitosano secadas por criogelificación (crioconcentración) cualitativamente es distinta. Puede haber una relación entre la concentración de quitosano y la rugosidad; la estructura de 1.8 % corresponde a una estructura mas rugosa y la de 3 % a una superficie menos rugosa. El tamaño de poro determinado por AFM utilizando software SPIP correspondió a valores entre 0.226 y 0.195 µm (226 y 195 nm) en promedio, lo cual supone macroporos en promedio dentro de las estructuras analizadas. El aumento de la concentración de GA muestra una relación con la disminución de la rugosidad y el tamaño de poro, generando estructuras más uniformes y fuertes. La reacción de hidrólisis de aceite de oliva no se llevó a cabo espontáneamente durante un tiempo de 30 minutos. La enzima inmovilizada presentó un máximo de 14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reacción, siendo 1.2 veces mayor que la libre para este periodo, al cabo de los 30 minutos se presento una pérdida de actividad del biocatalizador. El comportamiento presentado es posible que se deba al proceso de hinchamiento que se generó en la reacción de hidrólisis, presentando una subsiguiente lixiviación enzimática lo cual generó la disminución de la actividad. El proceso de esterificación de ácido oleico y n-butanol sin catalizador se llevó a cabo espontáneamente bajo las condiciones de ensayo (40° y 400 rpm). La

Actividad enzimática del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo. El sistema biocatalítico producido fue eficiente y activo para reacciones de hidrólisis y esterificación. Se cree que las condiciones favorables obtenidas por parte del biocatalizador fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte: (i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activación) generó la introducción de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogió significativamente en solventes como isooctano). (ii) El soporte sirve como una reserva de moléculas de agua, por lo que la adición de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante. (iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema reaccionante hasta con agitación intensa sin daño de su estructura. El soporte producido se adapta a las condiciones necesarias para ser utilizadas en procesos continuos (reactor PFR) y en medios orgánicos. Los primeros reciclos en la reacción de hidrólisis disminuyen en mayor proporción la actividad (más del 50%), después del cuarto reciclo la enzima no mostró ninguna actividad. El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de almacenamiento y la reutilización. Se cree que el factor que influenció la perdida de actividad se debió al hinchamiento del soporte que pudo generarse en la reacción de hidrólisis y una posible desactivación enzimática. Según los resultados de estabilidad del soporte y la actividad del sistema biocatalitico en medio orgánico se espera que este sea apropiado para la catálisis de sistemas orgánicos como la transesterificación, especialmente para la producción de Biodiesel.

6. RECOMENDACIONES

Para la formación de esferas como hidrogeles el uso de soluciones menos viscosas (concentración de 1.8%) genera menos problemas; en el caso de laminas y cilindros las soluciones mas concentradas son ideales para ser utilizadas. Estudiar el efecto del tamaño del pellet sobre la actividad enzimática, ya que un soporte más pequeño incrementa su área superficial y aumenta la efectividad. El procedimiento de la gelificación debe ser extendido trabajando a temperaturas mas bajas con el propósito de incrementar su capacidad de absorción de enzima. Se recomienda para posteriores estudios utilizar el método de secado por liofilización para compararlo con los resultados obtenidos por el método de criogelificación (crioconcentración). Se propone utilizar un adecuado almacenamiento libre de humedad ya que el quitosano es biodegradable y puede generarse algún tipo de riesgo a la contaminación por microorganismos. Medir la actividad del sistema biocatalítico a diferentes tiempos de almacenamiento que impliquen varios meses para determinar el grado de actividad residual.

Para utilizar adecuadamente la enzima XX Split se deberá encontrar un método de purificación más efectivo para que los componentes de la misma no influyan en posteriores análisis. El uso de otras enzimas podrá seguir el mismo protocolo generado siempre y cuando la enzima tenga alto grado de pureza y los grupos funcionales adecuados para ser ligada al soporte. En el caso de utilizar enzimas soportadas se recomienda la disolución seguida de la centrifugación para eliminar cualquier material insoluble y ser utilizada en la inmovilización por enlace covalente. Se sugiere que para un posterior trabajo se manejen blancos y se genere un análisis mas profundo para escoger la concentración de GA, en el cual se determine la real adición por enlace covalente de la enzima, ya que el soporte podría llegar a absorber parte de la enzima según los tratamiento generados por absorción iónica. Las muestras para FTIR deberán de ser sometidas a un secado riguroso de tal manera que se pueda eliminar el agua que interfiere en la medida del grado de D-acetilación. Algunos autores recomiendan secados de 16 h a 80 °C [14].

Para encontrar valores mas confiables del grado de D-acetilación se propone realizar varias muestras (diferentes replicas) y realizar un análisis estadístico, debido a que los resultados para una misma muestra pueden variar entre si. Un estudio del grado de hinchamiento en medio orgánico y su comportamiento a diferentes temperaturas es necesario para definir en concreto el potencial de reutilización del sistema biocatalítico. Se aconseja obtener micrografías por SEM y XPS con el objeto de comparar el cambio de la superficie del soporte cuando se inmoviliza la enzima en el quitosano. Se recomienda estudios de porosimetría para analizar el tamaño de micro y mesoporos que puedan existir dentro de la superficie del soporte. Se recomienda que en trabajos futuros se analicen variables como: la temperatura, pH, concentración de solución enzimática a inmovilizar, medio de activación de la enzima y el tiempo de acondicionamiento que permitan el adecuado desempeño de la enzima. Se aconseja realizar el análisis de actividad de agua del soporte para el mejor desempeño de la enzima, y con ella equilibrar el sistema biocatalítico que hará parte del sistema reaccionante orgánico. Se aconseja realizar el estudio cinético del sistema reaccionante con el propósito de utilizar estos resultados en posteriores simulaciones. Es necesario encontrar un método de reactivación enzimática, una vez se presente la desactivación enzimática. Se sugiere un hinchamiento previo en el sistema reaccionante antes del proceso de inmovilización. El uso de éste sistema biocatalítico se recomienda para la producción de Biodiesel, debido a que presenta buenas características para ser utilizado como catalizador, mostrando una favorable tendencia en procesos continuos como en reactores PFR. Se recomienda un análisis más preciso en los reciclos para sistemas orgánicos ya que se cree que el catalizador conservará más la actividad puesto que en éstos sistemas no ocurre un hinchamiento considerable.

Anexo 1. Procedimiento de gelificación

Solución Inicial (disolución

Método de Inyección

Ac. Acético 1 % Quitosano 3 %

Solución Iónica(3 horas)

NaoH (0.5 N) EtOh (26 %)

Lavado (ph Neutro)

Agua destilada

Secado

Julian

TABLA DE CONTENIDOS

Anexo 2. Procedimiento de secado

Hidrogel

Secado Convectivo Secado criogelificación (Crioconcentración)

Temperatura 25 °C Exposición ambiente 5 días Temperatura -17 °C

Exposición 24 h

Temperatura 25°C Exposición 1 h

Temperatura -17°C Exposición 24 h

Temperatura 25°C Exposición 1 h

Temperatura -17°C Exposición 3-5dias

Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente

Hidrogel seco

Enlace Con Entrecruzador(tiempo 1.5 h)

Glutaraldehido 0.003 % w/w

Enlace covalente con lipasa(Tiempo 15 h)

Lipasa 0.5 %p/v Na- Fosfato buffer pH 7.3

Lavado 1

Filtración

Na- Fosfato buffer pH 7.4

Lavado 2 Na- Fosfato buffer pH 7.4

Bloqueo de CHO (Tiempo 2h)

Tris Hcl pH 8

Lavado y almacenamiento (T = 4 °C)

Na- Fosfato buffer pH 7.4

Anexo 4. Método de biuret A continuación se menciona el procedimiento de carga de proteína analizado por método calorimétrico en espectrofotómetro UV a 550 nm. Paso 1. Preparación de solución de Biuret. Se disuelven 1.5 g de CuSO4.5H2O y 6 gramos de NaKC4H4O6 en 500 ml de agua destilada. Luego se adiciona 300 ml al 10 % de NaOH con agitación constante. Diluya 1 a 1 con agua destilada y deje en reposo en lugar oscuro en una botella de polietileno. Paso 2. Curva de calibración. La curva de calibración se realiza con un patrón de proteína (solución de albúmina conocido x mg /ml) a diferentes concentraciones con agua destilada que totalicen 2 ml, a lo anterior adicionar 4 ml de solución de biuret. Se rotulan y se dejan en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o por 10 minutos a 30° C para el desarrollo del color. Paso 3. Análisis de muestras. A una muestra de 2 ml adicionar 4 ml de solución de biuret y se lee el porcentaje de transmitancia a 550 nm. Tener en cuenta que la curva de calibración le permite construir una gráfica que es una recta con pendiente K con lo que la concentración de muestras desconocidas es fácilmente identificable a partir de la ecuación 2

C=A/K Ecuación 1 Donde A es la absorbancia de la muestra problema y K la pendiente de la recta originada a partir de la curva de calibración.

Anexo 5. Hidrogeles de quitosano

Hidrogeles de esferas a diferentes concentraciones (2.4 % y 3%)

Hidrogeles de laminas a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)

Hidrogeles de cilindros a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)

ANEXO 6. Métodos de secado

Esferas secas a 2.4% (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)

Esferas secas a 3% (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)

Laminas secas a 2.4% (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)

Laminas secas a 1.8 % (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)

Cilindros secos a 2.4% (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)

Cilindros secos a 1.8% (Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo).

Anexo 7. Espectros de infrarojo

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/w y 0.5 % p/v.

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/w

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y

0.5 % p/v.

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y 0.5 % p/v.

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/w

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/w y 0.5 %p/v

Anexo 8. Espectro de lipasa

Espectro de lipasa en transmitancia

Espectro de lipasa en absorbancia

Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM

Laminas de concentracion de quitosano de 1.8 %

Laminas de concentracion de quitosano 2.4 %

Laminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 5 µm

Laminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 2 µm

Anexo 10. Datos Experimentales

Dimensiones iniciales y finales de las laminas

LC1 Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales

L1 L2 H L1 L2 H 8,51 9,25 8,71 9,1 7,7 3,58

11,07 9,66 4,59 7,25 8,86 1,51 9,79 10,33 6,64 7,36 9,66 1,81 8,64 9,27 5,78 8,37 8,03 3,15

10,53 9,26 4,28 9,51 9,81 1,18 9,59 9,86 4,41 9,14 8,13 1,46 7,45 9,04 6,68 8,25 9,19 1,94

10,18 11,2 4,93 8,45 9,24 1,58 10 11,67 3,31 6,63 8,81 2,74


10,8 11,92 6,93 8,49 8,03 5,38 10,08 10,69 8,14 7,36 7,71 4,37 9,87 10,64 7,61 7,73 9,63 5,02 9,72 11,43 8,12 7,9 7,93 4,67

10,79 10,76 7,81 7,76 8,27 5,45 8,7 9,06 8,66 5,99 9 6,1

10,12 10,56 7,59 7,64 7,32 4,7 10,84 10,7 8,64 7,95 8,3 5,33 10,36 10,01 7,53 9,04 8,23 4,28 10,87 9,36 8,33 6,96 8,58 4,23 8,67 10,34 8,22 8,77 6,78 5,21 8,39 9,55 7,77 8,64 8,17 5,19

10,61 9,7 7,68 8,65 8,19 4,79 10,54 11,23 7,89 7,73 6,95 4,33 10,36 11,3 8 8,69 7,54 5,68


8,55 9,72 8,17 8,58 7,35 7,14 8,55 11,75 10,51 8,7 9,42 6,81 9,23 10 9,54 10,81 9,69 6,39 8,96 12,17 9,28 9,32 8,59 5,86

9,9 12,03 9,81 9,16 7,83 5,94 8,49 9,53 9,04 6,49 7,86 9 9,45 9,04 10,45 10,47 8,14 7,54 9,01 8,45 9,11 9,59 7,52 5,96 9,32 8,69 7,85 7,13 7,42 5,78 9,04 7,33 10,01 7,79 8,87 8,22 8,15 10,47 10,98 8,84 7,52 7,46 9,29 7,97 7,78 8,2 9,91 6,84 8,66 9,67 10,15 7,42 7,91 6,38 7,56 8,94 8,52 7,34 8,14 7,11 7,86 8,19 7,14 7,25 7,42 5,79 7,33 9,65 9,44 8,73 8,1 6,06 8,47 8,15 8,01 9,21 8,25 6,72

LA1 Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales

9,96 11,52 6,37 3,4 3,98 0,89 12,34 10,07 4,12 3,93 3,6 1,74 9,88 9,15 3,45 3,78 3,9 2,12 9,09 10,59 6,13 3,55 3,64 1,95 9,19 9,9 7,45 3,04 3,55 1,79 9,97 9,17 4,53 2,67 3,75 1,61 9,33 8,11 5,21 11,81 4,96 0,13 9,33 13,26 3,07 3,65 4,37 1,38 9,88 11,12 6,71 3,87 3,96 0,89

LA2 Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales

7,67 9,4 7,3 4,1 3,52 2,37 11,23 8,42 7,86 3,43 2,76 2,71 9,96 9,46 7,23 5,01 4,28 2,21 11,7 10,56 7,48 3,64 4,05 2,41 9,82 9,88 8,68 3,42 4,06 1,91 9,34 9,79 7,59 2,78 3,13 2,55 8,97 10,12 7,77 3,58 3,55 2,26 9,46 9,96 7 3,23 3,67 2,45 9,43 10,02 8,92 3,26 2,95 2,59 9,33 9,59 6,56 3,71 2,99 2,18 9,92 8,82 6,97 3,08 3,47 2,07

10,18 9,67 7,57 3,4 3,27 1,91 11,5 9,48 8,15 3,02 3,06 1,8

10,92 9,46 8,28 3,07 3,13 2,51 8,61 10,44 7,94 2,82 4,14 3,07

LA3

Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales 9,3 8,58 9,44 3,76 3,05 3,55 8,64 10,5 9,77 3,07 3,43 3,18

10 8,39 3,17 4,37 2,87 9,02 11,74 8,93 4,12 4,54 2,55

10,83 10,34 6,74 3,06 2,95 3,69 8,86 8,29 9,49 2,82 3,09 3,56

11,54 8,76 8,51 4,08 3,22 3,15 8,54 10,24 8,54 3,02 2,94 3,86 8,92 10,97 8,28 3,75 3,14 3,04

10,13 8,44 7,52 3,01 3,5 3 10,56 8,91 8,11 3,53 4,17 3,12 10,07 10,2 8,76 3,14 4,32 2,56 8,9 9,56 8,82 3,28 3,56 2,74 8,32 11,95 7,75 4,71 3,84 2,39 8,35 8,5 8,29 3,11 5,01 2,24 8,3 8,6 8,15 3,7 3,68 2,79 8,59 9,71 7,3 4,35 3,78 2,75

LC1 Láminas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación

(crioconcentración). LC2 Láminas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación

(crioconcentración). LC3 Láminas de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación

(crioconcentración). LA1 Láminas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente. LA2 Láminas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente LA3 Láminas de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamente

Dimensiones iniciales y finales de las esferas

DIMENSIONES INICIALES 1,80% 2,40% 3% 2,96 4 4,41 2,84 3,7 4,52 2,98 3,98 4,44 2,88 3,96 4,5 2,83 4,1 4,1 2,94 3,99 4,3

3,99 4,49 3,7 4,1 3,99 4,48 4,12 4,45 3,71 4,4 3,97 4,49 3,7 4,4 3,99 4,51 4,1 3,97 4,44

3,98 4,44 3,95 4,2 3,96 4,1 3,88 4,31 3,6 4,5

EC1 10%=40

EC2 10%=22

EC3 10% =10

Dim.delgada Diametro Dim.delgada Diametro Dim.corta Diametro 0,52 3,54 1,63 3,87 2,41 2,87 0,39 2,08 1,3 3,25 2,66 3,09 1,18 2,18 1,48 2,95 2,18 3,61 1,42 2,89 1,42 2,94 1,75 3,12 1,8 2,52 1,86 2,82 2,73 3,28 1,28 2,15 1,67 2,56 2,22 3,1 1,26 2,94 1,9 3,24 2,27 3,6 0,74 2,78 1,43 3,27 1,48 3,3 1,64 2,52 1,47 2,87 1,49 2,78 0,9 2,91 1,47 3,35 2,92 3,9 0,63 2,15 1,79 3,21 0,97 2,56 2,08 3,05 1,31 2,36 1,77 2,42 1,63 2,51 1,41 3,01 1,14 2,73 1,87 2,4 1,65 2,37 1,78 2,91 1,35 2,19 1,65 2,8 1,37 1,92 1,36 3,08 0,63 2,1 2,05 2,44 1,29 2,13 1,4 2,83 1,35 2,55 1,3 2,57 1,6 2,53 1,79 3,8 1,85 2,67 1,36 2,39 1,39 2,36 1,44 2,03 2,25 2,17 1,63 2,71 1,66 2,51 1,3 2,34 0,84 3,46 1,6 3,6 1,36 2,33 1,74 2,33 0,65 3,14 1,55 2,13 1,73 2,24 0,93 2,01 1,39 2,39

1,49 1,96

EA1 EA2 EA3 Dim.

pequeña Diámetro

Dim. corta

Diámetro

Dim. larga

Dim. corta

Diámetro

Dim. larga

0,54 1,41 1,1 1,11 1,36 1,77 1,81 3,36 0,79 1,34 1,26 1,4 2,9 1,61 1,81 3,87 0,58 1,33 1,24 1,3 2,81 1,44 1,93 3,77 0,68 1,45 1,12 1,26 4,43 1,54 1,94 4,84 0,51 1,48 0,95 1,6 1,6 1,47 2,2 4,75 0,8 1,19 0,71 1 1,8 1,54 2,13 5,62 0,59 1,23 0,88 1,13 1,12 1,48 1,9 4,53 0,41 1,49 0,92 1,12 1,8 1,43 2,03 5,21 0,69 1,47 0,93 1,03 1,73 1,64 2,53 4,59 0,6 1,49 1,2 1,27 2,52 1,36 1,85 4,67 0,58 1,48 1,48 1,63 3,08 0,73 1,4 0,82 0,84 2,29 0,6 1,2 0,89 0,95 2,66 0,8 1,34 0,88 1,02 1,28 0,58 1,9 0,67 0,96 1,86 0,68 1,55 0,89 1,03 2,54 0,51 1,51 0,75 1,02 2,17 0,74 1,41 0,89 1,34 2,16 0,54 1,54 0,95 1,16 1,59 0,47 1,23 1,52 1,65 2,61 0,65 1,29 1,08 1,43 3,95 0,77 1,33 0,69 1,06 2,26 0,87 1,09 0,87 1,4 1,4 0,65 1,19 1,5 1,51 3,21 0,89 1,22 0,73 1,27 0,72 1,26 0,77 1,31 0,37 1,28 0,31 1,52 0,65 1,25 0,74 1,08 0,46 1,44 0,69 1,39 0,8 1,16 0,61 1,56 0,69 1,38 0,64 1,16 0,7 1,14 0,67 1,14 0,74 1,3

EC1 Esferas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación (crioconcentración).

EC2 Esferas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación (crioconcentración).

EC3 Esferas de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación (crioconcentración).

EA1 Esferas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente. EA2 Esferas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente EA3 Esferas de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamente

Dimensiones iniciales y finales de los cilindros

1,80% 2,40% 3% Diámetro Longitud Diámetro Longitud Diámetro Longitud

3,21 4,88 5,29 5,04 4,54 5,62 3,75 4,48 4,08 4,96 4,64 5,97 3,28 5,07 4,28 6,2 5,16 5,73 3,12 4,84 4,73 5,78 4,6 6,12 3,19 5,37 4,26 6,35 3,97 4,89 3,37 4,99 3,36 5,22 3,04 4,36 3,19 5,14

CA1 CA2 CA3 Diámetro longitud Diámetro longitud Diámetro longitud

1 2,59 1,23 2,62 1,6 1,86 1,28 2,77 1,25 3,16 1,54 1,66 1,2 2,43 1,21 2,45 1,42 2,91

1,119 2,35 1,23 2,44 1,1 3,16 0,95 3,35 1,37 2,6 1,71 2,25 1,18 2,42 1,31 2,45 1,39 2,91 1,24 2,11 1,6 2,56 1,55 2,61 0,97 2,4 1,24 2,34 1,97 2,84 1,06 2,8 1,56 2,28 1,92 2,34 1,22 2,58 1,35 2,13 1,48 2,17 1,2 2,59 1,4 1,88 1,57 2,74 1,37 2,67 1,43 2,44 1,1 3,07 1,19 2,2 1,26 2,24 1,5 1,92 1,1 2,21 1,12 2,42 1,02 2,48 1,27 1,92 1,09 2,51 1,21 2,36 0,95 2,6 1,15 1,96 1,24 2,44 1,17 2,07 0,93 2,06 1,35 2,2 1,15 2,25 1,4 2,3

1 2,95 1,13 2,34 0,92 2,79 1,27 2,06 1,16 2,62

CC1 CC2 CC3 Diámetro longitud Diámetro longitud Diámetro longitud

2,27 4,55 3,1 3,43 2,72 4,48 2,18 4,08 1,88 4,5 2,7 5,32 1,8 4,77 1,8 3,47 3,35 4,49 1,84 4,79 3,1 3,72 2,75 5,73 2,12 4,73 2,46 3,37 2,85 4,18 1,93 4,82 3,17 3,26 3,74 4,71

2 4,9 2,9 3,85 3,16 3,94 1,81 5,39 3,03 3,33 3,31 4,2 1,82 3,84 3,26 4,13 3,16 5,43 2,3 4,9 2,36 4,52 3,59 4,58 1,6 3,77 2,36 3,96 3,12 4,09 1,63 3,39 3,31 3,33 3,23 4,69 2,4 3,69 2,23 4,83 2,85 5,02 2,26 4,41 3,22 4,58 3,06 4,89 2,02 3,76 2,88 4,7 2,82 5,15 1,75 3,4 3,04 5,16 3,11 3,77 2,2 4,07 3,16 4,83 3,08 3,74 2,1 4,06 2,76 4,39 3,27 4,18 1,72 4,98 2,98 3,79 3,86 4,57 2,3 4,81 2,79 3,28 3,08 4,17 1,38 4,37 2,93 5,37 3,23 4,233 1,37 3,61 2,78 4,44 2,8 5,2 2,21 4,03 1,98 5,37 2,86 5,13

2 4,61 3,25 1,8 1,53 4,46 3,45 3,85 1,94 4,15 3,05 4,79 1,94 3,78 3,72 4,11

2 4,33 3,06 3,52 2,1 4,96 2,74 3,55 2,06 4,56 2,88 3,47 2,02 4,37 2,65 3,2 1,18 5,52 2,79 4,08 2,08 4,73 2,62 4,88 1,83 5,38 1,74 3,96 1,79 5 1,8 5,83

CC1 Cilindros de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación (crioconcentración). CC2 Cilindros de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación

(crioconcentración). CC3 Cilindros de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación

(crioconcentración). CA1 Cilindros de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente. CA2 Cilindros de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente CA3 Cilindros de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamente

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