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Importance du préanalytique dans

l’étude de l’hémostase primaire

NTHC – 28 avril 2016

Phn Marc Chatelain

Dr Amandine Magnette

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Plan

� Point de vue clinique

�Anamnèse

� Examen clinique

� Recommandations GFHT

� Point de vue diagnostic

� Tests de dépistage de première intention

� Tests de dépistage de deuxième intention

� Tests spécialisés

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Anamnèse

� Premier test de dépistage du risque hémorragique

� Mise en évidence de pathologies susceptibles d'entraîner une

anomalie de l'hémostase primaire

� Antécédents

� Familiaux

� Personnels

� Chirurgicaux et obstétricaux

� Anémie, supplémentation martiale

� Hospitalisation ou transfusion sanguine

� Prises médicamenteuses

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Examen clinique

� Rechercher des hémorragies de type cutanéo-muqueux

� Purpura

� Saignements prolongés à la coupure

� Epistaxis, gingivorragies

� Ménométrorragies

� Hémorragies digestives

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Recommandations pré-analytiques du GFHT

Prélèvement

� Hémoconcentration

� Activation de la fibrinolyse

� Fibrinogène, facteurs VII, VIII, XII ↑

Paramètres Recommandé

Garrot<1min

Peu serré

*Cattaneo M et al. J Thromb Haemost 2013; 11: 1183–9

**Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2005; 16 : 453-9

***Lippi et al., Clin Lab Haematol 2006; 28 : 332-7

***Töpfer et al., J Lab Med 2000; 24 : 514-20

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Prélèvement

� Traiter l'échantillon dans les plus brefs délais

� Il est indispensable que le prélèvement soit réalisé au sein

du laboratoire effectuant les analyses

� Contact avec le patient


Site de ponction Veineux

Calibre de l'aiguille 19 à 22 gauge

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Prélèvement

Remplissage incomplet et hémolyse

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Prélèvement


Place du tube

2ème tube après un tube de

« purge » (neutre sans additif) ou un

tube sec (sans gel et sans activateur

de l'hémostase) ou après des

hémocultures

Lors des prélèvements avec une

aiguille épicrânienne, le tube de

purge est recommandé

� ! Numéroter les tubes lors d’un bilan

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Prélèvement

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Remplissage ≥ 90%

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Homogéinisation du tube

après le prélèvement

Dès la fin du remplissage du tube,

par retournements lents et complets

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Hémolyse

� Causes

� Diamètre de l’aiguille

� Veines difficiles

� Unités à ailettes, KT

� Pose du garrot prolongée et garrot trop serré

� Mauvaise homogénéisation du tube

� Centrifugation > 1500 g …

� Conséquences

� Activation des autres lignées sanguines (leucocytes, PLT)

� Release des phospholipides membranaires, de nombreuses enzymes

intra-cellulaires, d’ADP

� Activation ou inhibition des composantes de l’hémostase primaire et

de la coagulation

� Perturbation de la majorité des tests d’hémostase

Loeffen R. et al, J Thromb Haemost. 2012 Dec;10(12):2544-54

Lippi G. et al, Quality standards for sample collection in coagulation testing. Semin Thromb Hemost. 2012 Sep;38(6):565-75

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Tube


Tube

Tube sous « vide », stérile

Tube citrate : PET étanche

Tube CTAD : PET ou verre siliconé

Volume d'air résiduel ≤ 20%

! dates de péremption

Anticoagulant

Citrate (109 mmol/L)

CTAD : dont citrate (109 mmol/L)

Le GFHT recommande une concentration de

citrate unique pour un LBM compte tenu des

possibles variations des valeurs de référence

des tests globaux en particulier (TQ/TCA)

pH plasma anticoagulé 7,3 à 7,45

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Transport sang total

Non réfrigéré

15 à 25°C

! Minimiser les chocs + vibrations

pour éviter de dénaturer les

protéines et limiter l'activation

plaquettaire

(CLSI 5ème édition)

Conservation et Délai avant

l'examenDonnées en cours de révision

� Transport des tubes en position verticale* et pas par télétube

� Transport sur glace ou conservation au frigo avant centrifugation**

� Activation plaquettaire + du facteur VII

� ↓ facteurs VIII et von Willebrand

*Dempfle C-E, Töpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281

**Bohm M. et al, Blood Coagul Fibrinolysis, 2006;17:39-45

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Hématocrite


Hématocrite 0,20 (20%) à 0,55 (55%)

Ou formule pour ajuster le volume d'anticoagulant

:

Vcit = (1,85 x 10e-3)(100-Hct)(Vsang)

Vcit : volume de citrate à conserver dans le tube

Vsang : Volume de sang à ajouter

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Centrifugation


Double centrifugation

L'objectif est d'obtenir un taux de

plaquettes résiduelles

dans le plasma < 10000/µL

Deux centrifugations standards

successives

(avec décantation entre les 2

centrifugations)

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Décantation

� La technique qui permet de décanter le surnageant

impacte le taux de PLT résiduelles

� Ex: Utilisation de pipette pasteur et automatique

�Pipette automatique après 1 centrifugation : 29.000/µL

�Pipette pasteur après 1 centrifugation : 98.000/µL

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Décantation

Décantation avec pipette en verre Décantation avec pipette automatique

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Décantation

�Un exemple dans notre laboratoire

�Réalisation d’un PPP

�Vérification du taux de PLT résiduelles

� PPP = PRP sans plaquettes

� Pour les milieux sans GR et GB : discordance entre les méthodes

de mesures :

� Pour les utilisateurs Sysmex, l’utilisation de PLT-F est suggérée

Hématimètre (Sysmex XN séries) Cytomètre en flux

Méthode Optique Méthode Impédance Méthode FluorescenceImmunocomptage

adapté

10.000 13.000 14.000 14.200� ��

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Centrifugation


Conditions standards

1500 à 2000g ET au moins 15 min

ou

2000 à 2500g ET au moins 10 min

Centrifugation rapide

(Limitée aux TQ, TCA, fibrinogène

et D-dimères)*

3000g ET au moins 5 min

ou

4440g ET au moins 2 min

TempératureCentrifugeuse à température contrôlée

15 à 25°C

*Suchsland J., Friedrich N., Grotevendt A., Kallner A., Lüdemann J., Nauck M., Petersmann A., Optimizing centrifugation of coagulation

samples in laboratory automation. Clin Chem Lab Med 2014 Aug;52(8):1187-91

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Centrifugation


Rotor Rotor à godets mobiles

Frein Frein désactivé

Contrôles des centrifugeuses

1x/an

Critères de contrôle des plasmas:

plaquettes < 10000/µL sur au

moins 6 échantillons consécutifs

analysés

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Centrifugation

Pipette automatique

PLT-F

Avec frein Sans frein

30000 29000

29000 25000

15000 9000

18000 14000

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Centrifugation

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Congélation


Congélation Rapide à au moins -70°C

Conservation des échantillons

congelés

Au moins -70°C

Tube non mouillable avec

bouchon à vis

Capacité adaptée au volume du

plasma

Transport d'échantillon congelé

Carboglace. Il est recommandé de

s'assurer de la conformité du

transport et du matériel à la

réception.

Décongélation

Rapide à 37°C au bain-marie avec

immersion complète de l'aliquot et un

temps de décongélation adapté au

volume de plasma de l'aliquot

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Etapes diagnostiques des anomalies de

l’hémostase primaire

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Numération plaquettaire

� Sur tube EDTA K2 (recommandations ICSH)

� EDTA provoque une déformation des plaquettes

� Modification du volume plaquettaire moyen (VPM/MPV)

� Détermination du MPV à temps bien déterminé après prélèvement pour

permettre comparaison

� Problème MPV : interprétation difficile (manque de standardisation entre

les automates, évolution dans le temps)

� Citrate en cas de pseudo-thrombopénie à l’EDTA

� Attention au facteur de dilution

� Valeurs de référence : 150 – 400 G/L

� Stabilité : 4 jours (EDTA, T° ambiante)*

*Banfi G. et al, Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281

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Numération plaquettaire

par cytométrie en flux

� = Technique de référence

� Obtention du taux de PLT en fonction du rapport entre le nombre de GR

et le nombre de PLT détectées par CMF et le taux de GR mesurés par

l’automate de numération

� L’analyse doit être effectuée sur échantillon sanguin EDTA K2

� PLT détectées par le CD41 (AC spécifique)

� Test utile si automate en difficulté lors de la mesure de la thrombocytose

� PLT géantes, schizocytes, débris de GR ou de GB

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Evaluation des fonctions plaquettaires

� Conservation à t° ambiante

� Repos de 30 minutes après prélèvement

�Analyse dans les 3-4 heures

�Attention à la présence

�D’un caillot

�D’une hémolyse

�D’un précipité

Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, Wiley-Blackwell.

Dempfle C-E., Töpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281.

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Temps d'occlusion plaquettaire

� PFA (Platelet Function Analyzer)

� Sang total citraté 109 mM/L (1 vol citrate/9 vol sang)

� S’assurer que le taux de PLT > 100000/µL

� S’assurer que l’Hct du patient se situe entre 35 et 50%

� S’assurer que le délai entre PRV et analyse est bien respecté (<4H)

� ! Transport (pas de télétube)

� Utiliser le 1er tube citraté prélevé après l’amorce

� Influence de la méthode de PRV

� Temps EPI et ADP significativement plus courts par aspiration manuelle par rapport

au vide

→ établissement de valeurs de référence selon méthode de PRV*

� Influence de l’hémolyse

� « Obstruction du flux » ou allongement significatif des temps d’occlusion suite à

activation et fragmentation des PLTs**

*Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2013; 24(6) : 666-9

** Lippi et al., Blood Coagul Fibrinolysis 2012; 23(1) : 82-6

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Exploration du facteur von Willebrand

� Effectuer Ag et activité cofacteur ristocétine à frais pour confirmer le

diagnostic (CBA, multimères réalisés sur plasma congelé)

� Décanter et envoyer le plasma sans congélation

� Si température ou temps de décongélation trop importants

� ↓ des taux d'antigène et d'activité vW*

� Attention à la présence d'un éventuel cryoprécipité

� Si présent : sous-estimation du FvW, FVIII et fibrinogène

� Ag et activité cofacteur ristocétine restent stables 48 H**

*Kitchen S, D. Olson J., Eric Preston G., Quality in Laboratory Hemostasis and Thrombosis, 2nd Edition, April 2013, Wiley-

Blackwell

**Dempfle C-E., Töpfer G., Pre-examination procedures in laboratory diagnostics, De Gruyter, 2015, 273-281

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Plaquettes

� Extrêmement réactives

�Preuve : microscopie électronique en transmission

�→ Prélèvement à l’aiguille libre directement dans un

fixateur (glutaraldéhyde)

�Mesure de l’activation in vivo: prélèvement à

l’aiguille libre

�PF4 et β-TG (β-thromboglobuline) *

� PF4 : durée de vie courte

� Si � +++ PF4 et β-TG : activation in vitro

� Si � +++ β-TG : activation in vivo

*Kaplan KL et Owen J, Blood, 1981; 57 : 199 - 202

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L’agrégométrie plaquettaire

Femia EA et al, Platelets 2012;23:7-10

Cattaneo M et al. J Thromb Haemost 2013; 11: 1183–9

Emmanuel J. Favaloro et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(5):579–598

Anna M. Dyszkiewicz-Korpanty et al. Clin Appl Thrombosis/Hemostasis 11(1):25–35, 2005

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Test de consommation de la prothrombine

� = mesure de la prothrombine résiduelle dans le sérum obtenu après coagulation du sang prélevé dans un tube sec

� Préanalytique� Piquer à l’aiguille libre

� Récolter le sang dans un tube en verre sans gel ni accélérateur de coagulation

� Témoin normal

� Conservation pendant 4 H exactement à 37°C (bain marie)

� Pas d’agitation !

� Cause d’erreur : agitation excessive du sang coagulé au cours du transport

� Test perturbé en cas de thrombopénie, de déficit en facteur ou d'anomalies plaquettaires � Anomalie quantitative : déficit en phospholipides plaquettaires

� Anomalie qualitative : Syndrome de Bernard Soulier et Syndrome de Scott

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Cytométrie en flux

� Plusieurs études (Yuana et al, Lacroix et al, ...) ont été réalisées concernant les ≠ étapes pré-analytiques

� Protocole standardisé (ISTH) pour les microparticules� Prélèvement à jeun

� Ponction réalisée avec une aiguille de calibre > 21 gauge (ou +)

� Restreindre l’utilisation du garrot

� Eliminer les 2-3 premiers mL prélevés

� Tubes citratés (109 mM/L)

� Les échantillons sont apportés directement au laboratoire� Si transport : pas d’agitation et transport en position verticale

� Garder les tubes à température ambiante

� Centrifugation� Délai avant centrifugation : < 1h

� 1ère centrifugation : 2500 g 15min (t° ambiante, pas de frein)

� Récupérer le surnageant avec une pipette, en laissant 1cm de plasma au-dessus de la couche leucocytaire

� 2ème centrifugation : 2500 g 15 min (t° ambiante, pas de frein)

� Congélation dans de l’azote liquide

� Idéalement, analyse réalisée dans le laboratoire effectuant les prélèvements

Mullier F. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11: 1–4

Lacroix R. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015

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Cytométrie en flux

� Anticoagulants� ACD: Acid Citrate Dextrose

� CTAD: Citrate Theophylline Adenosine Dipyrimidole

� Héparine

� Hirudine

� Citrate

� EDTA� Conservation à t° ambiante

� Si 4°C : internalisation/perte de marqueurs cellulaires, moins de risque d'agrégation plaquettaire mais impossible pour étude fonctions PLT

Mullier F. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2013, 11: 1–4

Lacroix R. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 2015

LA Krueger et al. In: Current Protocols in Cytometry (2002) Unit 6.10

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Cytométrie en flux

Lacroix R. Impact of pre-analytical parameters on the measurement of circulating microparticles : towards standardization of

protocol. J Thromb Haemost. 2012 Mar;10(3):437-46

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Cytométrie en flux

Test à la mépacrine

� Décrit pour la 1ère fois en 1995 par� Wall et al.

� Gordon et al

� Mépacrine (ou quinacrine)� Molécule fluorescente dérivée d’acridine

� Forte affinité pour les nucléotides d’adénine (ATP, ADP)

� S’accumule rapidement et sélectivement dans les granules denses plaquettaires

� Permet de mettre en évidence � Absence ou la ↓ des granules denses plaquettaires (delta storage pool

disease)

� Déficit en granules denses plaquettaires qui peut être congénital (ex : Hermansky-Pudlak, Chediak-Higashi) ou + souvent acquis (SMD, SMP,…) ainsi qu’un défaut de libération du contenu des granules denses suite à l’activation plaquettaire

Latger-Cannard et al. Seminars in Thrombosis and Hemostasis 2016

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Cytométrie en flux

Test à la mépacrine

� Test de capture� Capture de la mépacrine par les granules denses plaquettaires

� Mesure de la fluorescence verte émise par les plaquettes incubées avec mépacrine à 37° C pendant 30 minutes

� Test de libération

� Activation des plaquettes avec le TRAP-6

� Mesurer la diminution de flurorescence et donc

la quantité de mépacrine relâchée

� Reflète la capacité des plaquettes à libérer le contenu

de leurs granules denses

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Cytométrie en flux

Diagnostic des anomalies quantitatives des

glycoprotéines plaquettaires

� Une perte d’expression ou un défaut fonctionnel d’un des complexes

glycoprotéines majeurs, GpIIb/IIIa ou GpIb/IX/V, peut conduire à des

syndromes hémorragiques sévères

� Thrombasthénie de Glanzmann

� Syndrome de Bernard-Soulier

� L’expression de la GMP140 (P-sélectine, PADGEM) traduit quant à elle

l’état d’activation plaquettaire

� Peu exprimée par les plaquettes quiescentes et sécrétée suite à une activation

� Le niveau d’expression de cette glycoprotéine, après activation in vitro, est un bon

indicateur de la réactivité plaquettaire

� Lors de certaines déficiences des granules α plaquettaires, l’expression de la GMP140

suite à une activation est réduite

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Cytométrie en flux

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Conclusions

� Le préanalytique en hémostase primaire

� Commence dès la prescription de l’analyse et comprend la

préparation du patient, la qualité du prélèvement et les conditions de

transport, de centrifugation et de conservation jusqu’au moment de

l’analyse et la mise en route de l’examen

� Constitue un volet majeur d’assurance de la fiabilité et de la validité

des résultats en hémostase

� Constitue les sources les + importantes des résultats erronés ou

ininterprétables

� La maîtrise et les efforts de standardisation des conditions

préanalytiques sont primordiaux afin d’assurer la qualité de

l’exploration en hémostase

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Conclusions

� Si mise au point de nouvelles techniques / approches dans

l’étude plaquettaire et afin d’être sensible � être rigoureux :

plaquettes = TNT !

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Remerciements

� Pr Bernard Chatelain

� Pr François Mullier

� Anaïs Bothy

� Nicolas Bailly

� Maïté Guldenpfennig

� Justine Baudar

� Maryline Fagnaux

� Benjamin Leyder

MERCI POUR VOTRE ATTENTION

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