'Implicancias de la farmacogenética en la infección ... · Resumen I mplicancias de la...

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Tesis Doctoral

Implicancias de la farmacogenéticaImplicancias de la farmacogenéticaen la infección pediátrica por HIV-1en la infección pediátrica por HIV-1

Bellusci, Carolina Paula

2011

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Bellusci, Carolina Paula. (2011). Implicancias de la farmacogenética en la infección pediátricapor HIV-1. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Bellusci, Carolina Paula. "Implicancias de la farmacogenética en la infección pediátrica porHIV-1". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.

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mailto:[email protected]

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y Natura les

Depar tam ento de Quím ica Biológica

I m plicancias de la farm ac ogenét ica en la infección

pediát r ica por HI V- 1

Tesis presentada para optar por e l t ítu lo de Doctor de la

Universidad de Buenos Aires en e l área de Quím ica Biológica

Carolina Paula Bellusci

Directores de tesis: Dra. Andrea Mangano

Dra. Luisa Sen

Consejero de estudios: Dra. Laura Alché

Lugar de t raba jo: Laborator io de Biología Celular y Ret rovirus,

Hospita l de Pedia t r ía “Pro f. Dr . Juan P. Garrahan”

Buenos Aires, 2 0 1 1

Resum en

I m plicancias de la farm acogenét ica en la infección pediá t r ica por HI V- 1

El gen de resistencia a m últ iples drogas (MDR1) codifica para la Glicoproteína P

(P-gp) , que bom bea diversos sust ratos hacia el exter ior de la célula, ent re ellos

los ant irret rovirales: inhibidores de proteasa (PI ) . Adem ás, el nivel de expresión

de MDR1 está regulado por el receptor nuclear PXR. En el presente t rabajo de

Tesis Doctoral evaluam os la influencia de los polimorfism os de nucleót ido

sim ple (SNP) de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la

infección pediát r ica por HI V-1, la respuesta al t ratam iento ant irret roviral y la

expresión de P-gp. Los SNPs C1236T y C3435T cum plir ían un rol protector

ret rasando la progresión a SI DA pediát r ico, pero no afectarían la t ransm isión

vert ical por HI V-1. Adem ás, evaluam os el efecto de los SNPs en la respuesta

ant irret roviral al PI lopinavir, dem ost rando que el SNP C1236T se asocia con

una m enor concent ración plasm át ica de la droga y una m ayor carga viral. Por

ot ra parte, analizam os si los niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se

asocian con los SNPs de MDR1 o PXR, sin hallar diferencias ent re los dist intos

genot ipos. Sin em bargo, observam os que el nivel de expresión de P-gp en

linfocitos CD4+ aum enta con la edad y la infección pediát r ica por HI V-1. En

conjunto, nuest ros resultados sugieren que P-gp es un factor clave tanto en la

m odulación de la infección por HI V-1, independientem ente de su función en el

t ransporte de drogas, com o en la respuesta a la terapia ant irret roviral.

Pa labras claves: glicoproteína P, MDR1, PXR, polim orfism o de nucleót ido

sim ple, HI V-1, SI DA pediát r ico, farm acogenét ica

Abst ract

I m plicat ion of the pharm acogenet ic in the HI V- 1 ped ia t r ic infect ion

The m ult idrug resistant gene (MDR1) encodes for P-glycoprotein (P-gp) , which

pum ps several subst rates out of the cell, such as the ant iret roviral protease

inhibitors (PI ) . I n addit ion, the MDR1 expression level is regulated by the

nuclear receptor PXR. I n the present PhD Thesis we evaluated the influence of

the single nucleot ide polym orphism s (SNP) T-129C, C1236T y C3435T of MDR1

and C63396T of PXR in HI V-1 pediat r ic infect ion, response to ant iret roviral

therapy and P-gp expression. The SNPs C1236T and C3435T m ay play a

protect ive role delaying progression to pediat r ic AI DS, but we did not observe

an effect HI V-1 vert ical t ransm ission. I n addit ion, we evaluated the effect of

SNPs on ant iret roviral response to the PI lopinavir , dem onst rat ing that the SNP

C1236T is associated with a lower drug plasm a concent rat ion and a higher viral

load. We analyzed whether P-gp expression levels in CD4+ lym phocytes are

associated with the SNPs of MDR1 or PXR, but no differences between the

genotypes were found. However, we observed that P-gp expression levels in

CD4+ lym phocytes increase with the age and the HI V-1 pediat r ic infect ion. Our

results suggest that P-gp is a key factor either in the m odulat ion of the HI V-1

infect ion, independent ly of its funct ion in drug t ransport , or in the response to

ant iret roviral therapy.

Key w ords: P-glycoprotein, MDR1, PXR, single nucleot ide polym orphism , HI V-

1, pediat r ic AI DS, pharm acogenet ic

AGRADECI MI ENTOS:

A Fede, gracias por todo el am or que m e das. Por estar a m i lado, por hacerm e

feliz y por ser m i cable a t ierra.

A m i m am á, por tanta dulzura. Gracias por darm e la libertad y alentarme

siem pre ante cada nuevo proyecto.

A m i papá, por creer en m í. Por estar siem pre al pie del cañón y enseñarm e a

luchar por lo que siento.

A m i hermana Laura, por com part ir los buenos y m alos m om entos de m i vida.

Gracias por hacerm e saber que puedo contar con vos.

A m i directora, Andrea Mangano por guiarm e, br indándom e su experiencia y

dedicación durante todos estos años.

A la Dra. Sen, por darm e la posibilidad de t rabajar en su laborator io.

A m is com pañeros del laborator io, Nat i B., Cint ia, Guille, Sily y Cárm en, por

com part ir el día a día y hacer que todo sea m ás divert ido. Gracias por el cariño,

por escucharm e y contenerm e en los m om entos difíciles.

A Carlitos, gracias por tantas horas de charlas y r isas, pero tam bién por tu

com prom iso y por siem pre estar dispuesto a darm e una m ano.

A CONI CET, por otorgarm e las becas de postgrado t ipo I y t ipo I I que hicieron

posible la realización de este t rabajo de tesis.

A m i querida Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de

Buenos Aires, por el orgullo que siento de pertenecer a ella.

Nuevam ente, a todos...

¡Gracias!

Parte de los resultados presentados en esta Tesis Doctoral han sido

publicados en:

MDR1 3 4 3 5 T and 1 2 3 6 T a lle les delay disease progression to pediat r ic

AI DS but have no effect on HI V- 1 ver t ica l t ransm iss ion

Bellusci CP , Rocco CA, Aulicino P, Mecikovsky D, Bologna R, Sen L, Mangano A

AI DS. 2010; 24(6) : 833-40.

El siguiente t rabajo se encuent ra actualm ente en revisión:

I nf luence of MDR1 C1 2 3 6 T polym orphism on lopinavir plasm a

concent rat ion and virologica l response in HI V- 1 inf ected children

Bellusci CP , Rocco CA, Aulicino PC, Mecikovsky D, Curras V, Hegoburu S,

Bram uglia GF, Bologna R, Sen L, Mangano A

Esta Tesis Doctoral pudo llevarse a cabo gracias a los subsidios otorgados

por:

Fondo Nacional para Ciencia y Tecnología (FONCYT) , PI CT N° 25830

Consejo Nacional de I nvest igación Cient ífica y Tecnológica (CONI CET) , PI P

N° 11220090100188

Í ndice

Í NDI CE

ABREVI ATURAS........ ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . .. .v

LI STADO DE FI GURAS Y TABLAS............ ...... ..... . ... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ..v iii

I . I NTRODUCCI ÓN.......... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...1

I .1. Generalidades de la infección por el v irus de la inm unodeficiencia

hum ana.... .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. .1

I .2. La terapia ant irret roviral.. . . . . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. . . .. .6

I .3. Superfam ilia Casset te de unión de ATP.... . ... . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . . . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .7

I .4. Glicoproteína P.... .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . .8

I .4.1. Funciones de P-gp.... . .. .. . .. . ... . . .. .. . .. . . . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .10

I .4.2. Rol de P-gp en la quim ioterapia cont ra el cáncer.... . .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .11

I .4.3. I nfluencia de P-gp en la concent ración de drogas ant irret rovirales..... .. . .. . ..12

I .5. Gen de resistencia a m últ iples drogas 1... .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .13

I .5.1. Polim orfism os de nucleót ido simple en MDR1. .. . .. .. . ... . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. ..14

I .5.1.1. Efecto de los SNPs de MDR1 en el nivel de expresión y act ividad de

P-gp.... . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..15

I .5.1.2. I nfluencia de los SNPs de MDR1 en la respuesta a la terapia

ant irret roviral.. . . . .. .. . .. . .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. . . . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . . . . .. .. .16

I .6. P-gp en la infección por HI V-1.... . .. .. . .. . .. . . .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. ..20

I .7. Receptor X de pregnano..... .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. .20

I I . OBJETI VOS......... . ...... ..... .... . ...... ..... . ... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . .2 3

I I .1. Objet ivo general... . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. . . ..23

I I .2. Objet ivos específicos.... . .. .. . ... . . .. .. . .. . . . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..23

i

Í ndice

I I I . MATERI ALES Y MÉTODOS....... ..... .... . ...... ... .. .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ..2 4

I I I .1. Grupos de estudio.... . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . .24

I I I .1.1. Niños expuestos al HI V-1 por t ransm isión vert ical... . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .24

I I I .1.1.1. Subgrupo ut ilizado para el estudio de t ransm isión vert ical y progresión a

SI DA (CAPÍ TULO 1) .... .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. . .24

I I I .1.1.2. Subgrupo ut ilizado para el estudio de la determ inación de la

concent ración de lopinavir en plasm a y la respuesta a HAART (CAPÍ TULO

2) .... .. . .. . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . . . .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..25

I I I .1.1.3. Subgrupo ut ilizado para el estudio de la expresión de P-gp en linfocitos

CD4+ (CAPÍTULO 3) .... .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..26

I I I .1.2. Población general argent ina.... . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .26

I I I .1.3. Consideraciones ét icas.... . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . .27

I I I .2. Métodos.... . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .28

I I I .2.1. Obtención y preparación de m uest ras clínicas.... . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . .28

I I I .2.1.1. Obtención de células m ononucleares a part ir de sangre perifér ica.... . . . . .28

I I I .2.1.2. Preparación de lisados celulares a part ir de PBMC....... . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .28

I I I .2.1.3. Obtención de ADN genóm ico.... . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . .29

I I I .2.1.3.1. Ext racción de ADN genóm ico a part ir de PBMC...... . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .29

I I I .2.1.3.2. Ext racción de ADN genóm ico a part ir de sangre perifér ica.... . . .. . . . . . . . . .30

I I I .2.1.3.3. Cuant ificación de ADN..... . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .30

I I I .2.2. Genot ipificación de las variantes polimórficas de MDR1 y PXR.... . .. .. . .. . .. ..31

I I I .2.2.1. Amplif icación de ADN mediante la reacción en cadena de la

polim erasa.... .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..31

I I I .2.2.2. Digest ión de los productos de amplif icación con enzimas de

rest r icción.... . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. . . . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . . . . .. .. ..35

I I I .2.2.3. Elect roforesis en gel de agarosa.... . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .37

I I I .2.3. Genot ipificación de las variantes polimórficas de CCR5 y SDF1……...... . . . . .39

I I I .2.4. Medición de la concent ración plasmát ica de lopinavir.. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .39

ii

Í ndice

I I I .2.5. Marcadores bioquím icos de seguim iento.... . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . .40

I I I .2.5.1. Marcadores virológicos.... . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . .40

I I I .2.5.2. Marcadores inmunológicos.... . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . .41

I I I .2.6. Marcadores clínicos de la infección.... . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . .. . . . . . . . . . .. . . . . .41

I I I .2.7. Determ inación de la expresión de P-gp en linfocitos CD4+ por citom et ría de

flujo... .. . .. . .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . . . .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..41

I I I .2.8. Análisis estadíst ico.... . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .. . . . . .42

I V. RESULTADOS……………………………..……………………………...……………….4 5

CAPI TULO 1 - Efecto de los polim orf ism os de MDR1 y PXR en la t ransm isión

ver t ica l de l HI V- 1 y en la progresión a SI DA pediát r ico…………………….....4 5

I V.1. Dist r ibución de los SNPs de MDR1 y PXR en la población general

argent ina.... . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..45

I V.1.1. Desequilibr io de ligam iento ent re los SNPs C1236T y C3435T de

MDR1.. .. . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. . . ..47

I V.2. Rol de los genot ipos de MDR1 y PXR en la t ransm isión vert ical del

HI V-1.... . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. . . . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . . . . .. .. ..47

I V.3. I nfluencia de los genot ipos de MDR1 y PXR en la progresión a SI DA

pediát r ico.... . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . .………………………………………………………….…………50

I V.3.1. Efecto de los pares de haplot ipos de MDR1 en la evolución a SI DA

infant il. . . . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . . . .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .52

CAPI TULO 2 - I nf luencia de los polim orf ism os de MDR1 y PXR en la

concent ración plasm át ica de lopinavi r y en la respuesta virológica e

inm unológica a HAART........ ..... .. ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ... .. ....5 8

I V.4. Característ icas de los pacientes.... . .. .. . .. . ... . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . . . ..58

I V.5. I nfluencia de los SNPs de MDR1 y PXR en la concent ración plasm át ica de

lopinavir.. .…………………………………………………………………………………………………….……………59

iii

Í ndice

I V.6. Efecto de los SNPs de MDR1 y PXR en la respuesta virológica e inmunológica a

HAART.... .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .61

CAPI TULO 3 - N ivel de expresión de P- gp en linfocit os CD4 + .......... ..... .... . .6 5

I V.7. Puesta a punto del ensayo de citom et ría de flujo... . .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..65

I V.8. Efecto de los SNPs de MDR1 y PXR en el nivel de expresión de P-gp.... .. . .. . ..68

I V.9. I nfluencia de la edad en el nivel de expresión de P-gp.... .. . .. . .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. .71

I V.10. I mpacto de la infección pediát r ica por HI V-1 en el nivel de expresión de

P-gp.... . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. .. . . .. .. . .. . .. .. ..72

V. DI SCUSI ÓN....... ... ...... ..... .... . ...... ..... .. .. . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . .7 5

VI . CONCLUSI ONES........ ..... .... . ...... ..... .... . . ..... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . .8 9

VI I . REFERENCI AS........... ..... .... . ...... ..... ... . . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... ....9 0

ANEXO...... ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... .. ... .... . ...... ..... .... . ...... ..... .... . ...... ..... ...1 1 1

iv

Abrevia turas

ABREVI ATURAS:

ABC: Casset te de unión de ATP (ATP b inding casset te)

ADN: Á cido d esoxirr ibon ucleico

ADP: Adenocina difosfato (Adenosine d ip hosphate)

ARN: Á cido r ibon ucleico

ARNm : ARN m ensajero

ATP: Adenocina t r ifosfato (Adenosine t r ip hosphate)

AZT: Zidovudina (Az idot hym idine)

BSA: Seroalbúm ina bovina (Bovine seruma lbum in)

CAV- 1 : Caveolina-1 (Cav eoline- 1 )

CDC: Cent ros de cont rol y prevención de enferm edades (Centers for d isease

cont rol and prevent ion)

Cpost - dosis : Concent ración post -dosis de la droga

Cvalle : Concent ración valle de la droga

CYP3 A4 : Citocrom o P450 3A4 (Cy tochrom e P 4 5 0 3 A4 )

CYP4 5 0 : Citocrom o P450 (Cy tochrom e P 4 5 0 )

dNTP: Desoxinucleót idos t r ifosfato (Deoxyribon ucleot ide t r ip hosphate)

DO: Densidad ópt ica

EDTA: Acido et ilendiam inotet raacét ico (e thylened iam inet et raacet ic acid)

ELI SA: Ensayo por inm unoabsorción ligado a enzim as (Enzym e l inked

im m unosorbent assay)

FI TC: I sot iocianato de fluoresceína (Fluorescein isot hiocyanate)

FSC: Forward sc at ter

HAART: Terapia ant irret roviral de alta eficacia (H ighly act ive ant iret roviral

t herapy)

v

Abrevia turas

HI V: Virus de la inm unodeficiencia hum ana (Hum an immunodefiency v irus)

HPLC: Crom atografía líquida de alta resolución (H igh p erform ance l iquid

chrom atography)

I FM: I ntensidad de f luorescencia m edia

LPV: Lop inav ir

LPV/ r : Lop inav ir en com binación con r itonavir

MDR1 : Gen de resistencia a m últ iples drogas 1 (Mult id rug r esistant gene 1)

NNRTI : I nhibidores de la t ranscriptasa reversa no nucleosídicos (Non

n ucleoside r everse t ranscriptase inhibitors)

NRTI : I nhibidores de la t ranscriptasa reversa nucleosídicos (Nucleoside r everse

t ranscriptase inhibitors)

PACTG: Grupo de Estudios Clínicos Pediát r icos en SI DA (Pediat r ic A I DS c linical

t r ials g roup)

PBMC: Células m ononucleares de sangre perifér ica (Peripheral b lood

m ononuclear cells)

PBS: Buffer fosfato salino (Phosphate b uffer saline)

PCR: Reacción en cadena de la polim erasa (Polym erase chain r eact ion)

PE: Ficoerit r ina (Phycoe rythr in)

P- gp: Glicoproteína P (P-g lycop rotein)

PI : I nhibidores de proteasa (Protease inhibitors)

PXR: Receptor X de pregnano (Pregnane X r eceptor)

RFLP: Polim orfism o de longitud de fragm entos de rest r icción (Rest r ict ion

length f ragment p olym orphism )

SI DA: Síndrom e de inm unod eficiencia adquir ida

SLC: Transportadores de solutos (Solutes carr iers)

SNP: Polim orfism o de nucleót ido sim ple (Single n ucleot ide p olym orphism )

vi

Abrevia turas

SSC: Side sc at ter

TAE: Tr is acetato EDTA

W CLB: Buffer de lisis de glóbulos blancos (W hite cell lysis b uffer)

vii

Listado de f iguras y tablas

LI STADO DE FI GURAS Y TABLAS:

FI GURAS

Capítu lo I

Figura I 1 . Esquem a de la est ructura de la Glicoproteína P

Figura I 2 . Modelo t r idim ensional de la Glicoproteína P y la interacción con sus

sust ratos

Figura I 3 . Esquem a del gen MDR1 y ubicación de los SNPs m ás estudiados

Figura I 4 . Hipótesis de la expresión diferencial de P-gp y su consecuencia en la

concent ración de sust ratos

Capítu lo I I I

Figura M1 . Secuencia nucleot ídica de la región genóm ica am plificada para cada

polim orfism o

Figura M2 . Perfiles de PCR-RFLP de los polim orfism os MDR1 T-129C (A ) , MDR1

C1236T (B) , MDR1 C3435T (C) y PXR C63396T (D )

Capítulo I V

Figura R1 . Frecuencia de los pares de haplot ipos de MDR1 (C3435T, C1236T)

en donantes de sangre con serología negat iva para HI V-1 y en niños

perinatalm ente expuestos al HI V-1

Figura R2 . Curvas de sobrevida para t iem po a SI DA en niños infectados por

HI V-1

Figura R3 . Efecto del SNP C1236T de MDR1 en la concent ración post -dosis de

lopinavir y en el cam bio de la carga viral

viii

Listado de f iguras y tablas

Figura R4 . Muest ra representat iva del proceso de análisis

Figura R5 . Curva de calibración para la determ inación de la concent ración de

ant icuerpo ant i-P-gp a ut ilizar para los ensayos de citom et ría de flujo

Figura R6 . Efecto de los SNPs de MDR1 y PXR en el nivel de expresión de P-gp

Figura R7 . Correlación ent re el nivel de expresión de P-gp y la edad en

individuos norm ales

Figura R8 . Efecto de la infección pediát r ica por HI V-1 en el nivel de expresión

de P-gp

TABLAS

Capítu lo I I I

Tabla M1 . Enzim as de rest r icción y los sit ios blanco correspondientes

Capítulo I V

Tabla R1 . Frecuencias genot ípicas y alélicas de los SNPs T-129C, C1236T y

C3435T de MDR1 y C63396T de PXR en donantes con serología negat iva para

HI V-1 y en niños perinatalm ente expuestos al HI V-1

Tabla R2 . Progresión a SI DA ajustada por la edad al inicio de HAART y la

duración de HAART

Tabla R3 . Característ icas clínicas de los pacientes al m om ento de la

determ inación del nivel plasm át ico de lopinavir

Tabla R4 . Nivel plasm át ico de lopinavir respecto de los genot ipos de MDR1 y

PXR

Tabla R5 . Respuesta virológica e inm unológica a HAART con lopinavir respecto

de los genot ipos de MDR1 y PXR

ix

I - I NTRODUCCI ÓN

I - I nt roducción

I .1 . Genera lidades de la infección por e l v irus de la

inm unodeficiencia hum ana

El virus de la inm unodeficiencia hum ana (HI V) pertenece a la fam ilia

Ret rovir idae, género Lent ivirus. Fue aislado por pr im era vez en el año 1983 y

fue reconocido com o el agente causal del síndrom e de inm unodeficiencia

adquir ida (SI DA) . Los prim eros casos fueron reportados en el año 1981 en

jóvenes hom osexuales de la cuidad de Los Ángeles y Nueva York (EEUU) que se

caracter izaban por presentar infecciones oportunistas, pr incipalm ente neum onía

por Pneumocyst is car inni ( j irovesi) o tum ores sólidos com o el sarcom a de

Kaposi [ CDC, 1981 a; CDC, 1981 b] . Poco después, tam bién se verificaron

casos de inm unodeficiencia en heterosexuales y en grupos part iculares com o

usuarios de drogas int ravenosas, hem ofílicos, hem ot ransfundidos y finalm ente

en niños nacidos de m adres portadoras del virus [ CDC, 1982 a - d; CDC, 1983] .

Actualm ente, se reconocen dos t ipos virales, HI V-1 y HI V-2, que difieren en un

30% de su secuencia genét ica. El pr im ero de ellos es el responsable de la

disem inación m undial del SI DA, m ient ras que el HI V-2 es endém ico en el

cont inente afr icano [ Clavel F et al. , 1986] .

Desde su aparición, esta enferm edad ha const ituido uno de los problem as de

salud m ás preocupantes y la creación de una vacuna para prevenir la infección

cont inúa siendo un desafío cient ífico difícil de resolver. Hasta la fecha, m ás de

25 m illones de personas han m uerto por esta infección desde la aparición de la

enferm edad [ UNAI DS, 2010] .

1

I - I nt roducción

Según las últ im as est im aciones del Program a Conjunto de las Naciones Unidas

sobre HI V/ SI DA, el núm ero de personas viviendo con HI V-1 en el m undo llega a

los 33,3 m illones, de los cuales 2,5 m illones son niños [ UNAI DS, 2010] . Solo en

el 2009 han cont raído la infección 2,6 m illones de individuos y 1,8 m illones de

personas fallecieron por causas asociadas a SI DA [ UNAI DS, 2010] . Si bien el

núm ero anual de nuevas infecciones ha ido dism inuyendo en form a sostenida

desde finales de la década de los ´ 90, esto no se ve reflejado en una reducción

del núm ero total de infectados, ya que la cant idad de m uertes por SI DA

tam bién dism inuyó gracias al m ayor núm ero de pacientes recibiendo terapia

ant irret roviral.

Los pr im eros casos de SI DA en Argent ina fueron not ificados en 1982 y

correspondían en su m ayoría a individuos que habían adquir ido la infección en

Estados Unidos [ Estevez ME et al. , 1983] . El núm ero acum ulado de

not ificaciones de SI DA en nuest ro país durante el periodo 1982 - 2009 fue de

aproxim adam ente 40.000 individuos [ MSAL, 2010] .

La t ransm isión del HI V-1 se produce principalm ente por contacto sexual, uso de

drogas inyectables y t ransm isión del virus de la m adre infectada al hijo

( t ransm isión vert ical) . La t ransm isión vert ical es la pr incipal causa de la

infección pediát r ica y puede ocurr ir en t res m om entos: durante la gestación, al

m om ento del parto o a t ravés de la leche m aterna. La t ransm isión int raútero

ocurre por el pasaje del virus a t ravés de placenta (vía t ransplacentaria) , m ás

frecuentem ente a part ir del segundo t r im est re de em barazo. No obstante, la

m ayor parte de las infecciones ocurre durante el parto, por vía sanguínea [ Gibb

DM et al. , 1999] y/ o secreciones cérvico-vaginales [ The European Collaborat ive

2

I - I nt roducción

Study, 1999] . Ciertos factores podrían aum entar el r iesgo de t ransm isión

vert ical, com o factores m aternos, factores obstét r icos, factores virales e

inm unológicos y factores fetales. Ent re los factores m aternos se encuent ran un

bajo recuento de linfocitos CD4+ , una alta carga viral plasm át ica al m om ento

del parto, un estadio de enferm edad clínica avanzado y la presencia de ot ras

enferm edades de t ransm isión sexual, ent re ot ros [ Lynne M et al. , 1999] . La

tasa de t ransm isión perinatal presenta un rango m uy am plio que va desde el 13

al 39% [ European Collaborat ive Study, 1991] . Sin embargo, la im plem entación

de la profilaxis ant irret roviral con zidovudina (AZT) a part ir de 1994 y de la

cesárea program ada [ European Mode of Delivery Collaborat ion, 1999] ha

logrado dism inuir significat ivam ente esta tasa de t ransm isión m aterno- infant il a

valores cercanos al 1% [ Cooper ER et al. , 2002; European Collaborat ive Study,

2005] . La adm inist ración de AZT según el protocolo ACTG 076 se realiza en

Argent ina desde el año 1995 y consiste en t res partes: adm inist ración de AZT a

la m adre a part ir del segundo t r im est re de gestación, una dosis endovenosa

durante el parto y al niño durante las pr im eras seis sem anas de vida. Durante

el año 2009, se est im ó un núm ero de 370.000 nuevas infecciones en niños en

el m undo, lo cual significa una caída del 24% respecto a cinco años anteriores

[ UNAI DS, 2010] . El Minister io de Salud [ MSAL, 2010] inform ó que en nuest ro

país, la tasa de niños infectados por t ransm isión vert ical tam bién se ha

reducido. De los 4.093 casos de t ransm isión vert ical ident ificados en Argent ina

desde el com ienzo de la epidem ia, 230 casos fueron diagnost icados ent re los

años 2008 y 2009.

En el contexto pediát r ico existen algunos aspectos part iculares de la

patogénesis de la infección por HI V-1 que son diferentes respecto de los

3

I - I nt roducción

adultos, com o la adquisición perinatal del virus, la exposición a los

ant irret rovirales desde la gestación, diferencias en los m arcadores virológicos e

inm unológicos, cam bios en los parám etros farm acocinét icos con el desarrollo y

la difícil adherencia a los t ratam ientos, ent re ot ros. La edad de aparición de

síntom as asociados a SI DA es muy variable y depende, en parte, del m odo de

adquisición de la infección, siendo de 17 m eses en niños infectados por

t ransm isión vert ical y 24 m eses en aquellos que adquir ieron la infección a

t ravés de t ransfusiones [Auger I et al. , 1988]. La infección perinatal conduce

usualm ente a un desarrollo m ás rápido de la enferm edad que en los adultos,

con un pat rón bim odal [Blanche S et al. , 1989; Duliege AM et al. , 1992; Tovo

PA et al. , 1992; Barnhart HX et al. , 1996]. Aproxim adam ente de un cuarto a un

tercio de los niños infectados por t ransm isión vert ical presentan

m anifestaciones sintomát icas asociadas a SI DA tem pranam ente (dent ro de los

2 pr im eros años de vida) y una tasa de m ortalidad que llega casi al 100% ent re

los 4 a 5 años de edad, en ausencia de t ratam iento ant irret roviral. El resto de

los niños (70 a 75% ) presentan una progresión clínica m ás lenta, pudiendo

perm anecer asintom át icos durante varios años [Wilfert CM et al. , 1994]. El

m om ento en el que se produce la t ransmisión vert ical podría determ inar el

curso de la infección pediát r ica. Cuando la infección es int rauter ina, el deter ioro

clínico sería m ás rápido, debido a la m ayor inm adurez del sistem a inm une fetal;

m ient ras que cuando la infección se produce durante el parto o por la lactancia,

la evolución clínica sería m ás lenta reflejando un m ayor grado de m adurez del

sistem a inm une. Aunque los m ot ivos para estas diferencias no están aun del

todo claros, las característ icas genét icas tanto del virus com o del hospedador

tam bién jugarían un rol clave [Mangano A et al. , 2001; Kopka J et al. , 2002]. La

im plem entación de la terapia ant irret roviral de alta eficacia (HAART) ha

4

I - I nt roducción

m ejorado significat ivam ente la calidad de vida del paciente pediát r ico, logrando

perm anecer algunos niños asintom át icos hasta por 5 años.

El recuento de linfocitos T CD4+ y la m edición de la carga viral plasm át ica,

m edida com o copias de ARN viral/ m l de plasm a, son considerados los

m arcadores de laborator io m ás confiables y ut ilizados en form a conjunta para

el seguim iento de la evolución de la infección y para el inicio y cont rol

terapéut ico específico. La reducción del recuento de linfocitos T CD4+ refleja el

grado de inm unodeficiencia del paciente infectado, m ient ras que el aum ento de

la carga viral plasm át ica el nivel de replicación del HI V-1. Sin em bargo, en

pediat ría se debe tener en cuenta que los niveles de células CD4+ varían con la

edad, siendo considerablem ente m ás elevados en los niños de pocos m eses de

vida y declinando lentam ente hasta los seis años cuando se alcanzan los niveles

observados en adultos [Wilfert CM et al. , 1995; Com ans-Bit ter WM et al. ,

1997]. De acuerdo con el sistem a de clasificación desarrollado por los Cent ros

de cont rol y prevención de enferm edades (CDC) en 1994 para caracter izar el

grado de inm unosupresión del paciente, el núm ero total de células CD4+ que

ident ifica una categoría inm unológica cam bia con la edad, m ient ras que el

porcentaje de células CD4+ es constante. Por ello, el porcentaje de células CD4+

es considerado un m arcador m ás confiable de la progresión de la enferm edad

que el núm ero total de células CD4+ [CDC, 1994]. Adem ás, esta clasificación

reconoce 4 categorías clínicas: N (sin síntom as) , A (síntom as leves) , B

(síntom as m oderados) y C (síntom as severos m arcadores de SI DA) .

5

I - I nt roducción

I .2 . La terapia ant ir re t rovira l

En los últ im os años, se han logrado avances im portantes en el t ratam iento de

la infección por el HI V-1. A m ediados de los años ´ 90, la int roducción del

HAART ha logrado reducir significat ivam ente la carga viral y elevar el recuento

de linfocitos CD4+ , pero pr incipalm ente dism inuir la incidencia de SI DA y la

m ortalidad por HI V-1. Estos beneficios se producen tanto en niños com o en

adultos, en pacientes que no recibieron t ratam iento (pacientes naive) como en

aquellos con enferm edad avanzada [Dreim ane D et al. , 2001; Gortm aker SL et

al. , 2001]. Este t ipo de terapia ut iliza la com binación de al m enos t res clases de

drogas ant irret rovirales, asociando el uso de inhibidores de la t ranscriptasa

reversa nucleosídicos (NRTI ) con inhibidores de la t ranscriptasa reversa no

nucleosídicos (NNRTI ) o con inhibidores de proteasa (PI ) . No obstante, hasta el

presente, la adherencia al t ratam iento, la falla virológica y los efectos adversos

asociados a la terapia son todavía t res de los m ot ivos m ás frecuentes del

fracaso terapéut ico.

En los niños m enores de 1 año se recom ienda iniciar el t ratam iento

independientem ente del estadio clínico, inm unológico o virológico, debido a que

la infección progresa m ás rápidam ente en lactantes que en niños m ayores o

adultos [CDC, 2006]. En la actualidad, las drogas m ás ut ilizadas actúan sobre la

t ranscriptasa reversa y la proteasa viral. Ent re los PI , la com binación m ás

fuertem ente recom endada es la de lopinavir (LPV) con r itonavir.

La efect ividad de la terapia depende del m antenim iento de una concent ración

de drogas en plasm a ópt im a y constante para así evitar el surgim iento de

6

I - I nt roducción

variantes virales con m utaciones de resistencia. La m ayoría de las drogas

ant irret rovirales m uest ran una farm acocinét ica con alta variabilidad

inter individual y un rango terapéut ico est recho, lo cual conduciría a

concent raciones plasm át icas subópt im as o tóxicas. Una escasa potencia del

régim en ant irret roviral puede asociarse con lim itaciones en la penet ración a

determ inados órganos (por ejem plo cerebro, test ículos, etc.) , diferencias en el

m etabolism o celular, interacciones farm acológicas que interfieren con la

absorción o increm entan la elim inación y efectos adversos, pero tam bién con

las característ icas genét icas del paciente. La com binación e interacción de todos

estos factores puede llevar a la m odificación, interrupción o suspensión

definit iva del t ratam iento, lo cual ha alentado a los estudios farm acogenét icos a

entender las fuentes de variabilidad de las drogas, pr incipalm ente con respecto

a la relación dosis- respuesta, pero tam bién en relación a las proteínas

involucradas en la farm acodinam ia de los ant irret rovirales.

I .3 . Superfam ilia Casset te de unión de ATP

Los t ransportadores de drogas se clasifican en dos grupos de proteínas:

Casset te de unión de ATP (ABC) y Transportadores de solutos (SLC) . La

superfam ilia ABC se encuent ra divida en subfam ilias y cuat ro de ellas están

presentes en hum anos (m ás de 40 m iem bros) : ABC1, MDR/ TAP, MRP/ CFTR y

ALD. El gen MDR1 (ABCB1) codifica para el t ransportador Glicoproteína P y

form a parte de la subfam ilia MDR/ TAP, involucrada, junto con algunos

m iem bros de la subfam ilia MRP/ CFTR, en el t ransporte de drogas

ant irret rovirales [ Owen A et al. , 2005 a] .

7

I - I nt roducción

I .4 . Glicoproteína P

La glicoproteína P (P-gp) es una proteína t ransportadora, integral de

m em brana, glicosilada y fosfor ilada de 170 kDa y 1280 am inoácidos. P-gp es

m iem bro de la superfam ilia de t ransportadores ABC. Consiste en dos dom inios

hom ólogos y cada uno de ellos cont iene seis segm entos t ransm em brana y un

sit io int racelular de unión a ATP [ Owen A et al. , 2005 a] ( f igura I 1 ) . Estos dos

dom inios se encuent ran separados por un polipépt ido flexible que actúa com o

linker e interactúan para cum plir la función de t ransportador. Los fragm entos

que interaccionan con los sust ratos residen en, o cerca, de los segm entos

t ransm em brana 5, 6, 11 y 12. P-gp presenta una est ructura t r idim ensional en

form a de cilindro, con aproxim adam ente la m itad de la m olécula inm ersa en la

m em brana plasm át ica y una cám ara hidrofílica abierta hacia la cara ext racelular

y cerrada hacia la cara citoplasm át ica ( f igura I 2 ) .

En 1976, Juliano RL et al. ident ificaron a P-gp en células de ovario de hám ster

chino resistentes a colchicina. Dos años m ás tarde, I naba M et al. (1978)

observaron una dism inución significat iva en la incorporación y retención de

daunorrubicina y adriam icina (agentes ant icancerígenos del t ipo ant raciclinas)

en líneas celulares de leucem ia de ratón resistentes a estas drogas. La

expresión de esta proteína se creía exclusiva de líneas celulares que

presentaban una alteración en la perm eabilidad, confir iendo resistencia a

ciertas drogas. Sin em bargo, hoy se sabe que P-gp tam bién se expresa

const itut ivam ente en órganos claves com o yeyuno, colon, hígado, r iñón,

páncreas y glándulas adrenales, donde cont r ibuye a la elim inación de

xenobiót icos o lim ita la absorción de drogas desde el t racto gast rointest inal

8

I - I nt roducción

[ Siegsm und M et al. , 2002; Alberm ann N et al. , 2005; Owen A et al. , 2005 b] .

P-gp tam bién se expresa en una variedad de células norm ales, incluyendo

células endoteliales de cerebro, test ículos y placenta, así com o en células

progenitoras hem atopoyét icas, m acrófagos, células natural killer , linfocitos B y

linfocitos T. Ent re los linfocitos T, P-gp part icularm ente se expresa en células

CD8+ y CD4+ - el receptor pr im ario de HI V - [ Kim RB et al. , 1998; Choo EF et

al. , 2000; Ford J et al. , 2003; Marzolini C et al. , 2004; Cam us M et al. , 2006] .

EXTRACELULAR

MEMBRANA

CI TOPLASMA

DOMI NI O HOMÓLOGO 1 DOMI NI O HOMÓLOGO 2

SEGMENTO TRANSMEMBRANA

LI NKER

ST1 ST2 ST3 ST4 ST5 ST6 ST7 ST8 ST9 ST10 ST11 ST12

FI GURA I 1 . Esquem a de la est ructura de la Glicoproteína P ( imagen adaptada

de Owen A et al. , 2005 a) . SP: segmento t ransmembrana.

9

I - I nt roducción

MEMBRANA PLASMÁTI CA

RESI DUOS GLI COSI LADOS

XENOBI ÓTI CO EXTRACELULAR

FI GURA I 2 . Modelo t r idim ensional de la Glicoproteína P y la in teracción con

sus sust ra tos ( imagen adaptada de Marzolini C et al. , 2004) .El xenobiót ico

ext racelular at raviesa la membrana plasmát ica, es reconocido por P-gp y bom beado

hacia el exterior de la célula.

I .4 .1 . Funciones de P- gp

La expresión de P-gp cum ple un rol m uy im portante, ya que colabora con la

defensa natural del organism o. Esta proteína confiere una resistencia int r ínseca

en los tej idos donde se expresa, ya que bom bea sustancias exógenas o

m etabolitos tóxicos (xenobiót icos) fuera de la célula, así com o tam bién una

am plia variedad de drogas. P-gp realiza la ext rusión de sus sust ratos en form a

act iva y por lo tanto la hidrólisis de ATP resulta indispensable para el proceso

de bom beo.

10

I - I nt roducción

Una gran diversidad de sustancias son sust ratos de esta proteína, incluyendo

m oléculas hidrofóbicas con carga neut ra o posit iva com o por ejem plo agentes

ant icancerígenos, agentes ant ihipertensivos, ant iarrítm icos, esteroides,

ant ibiót icos, ant im icót icos, ant iácidos, inm unosupresores, ant idepresivos,

neurolépt icos, ant iepilépt icos, opioides, ant iem ét icos y drogas ant irret rovirales

[ Marzolini C et al. , 2004] . En el anexo se m uest ra una lista detallada de la

m ayoría de los com puestos que son sust ratos, inductores y/ o inhibidores de P-

gp. Ent re los ant irret rovirales, el nuevo grupo de inhibidores de integrasa y los

clásicos inhibidores de proteasa (ej . am prenavir, atazanavir, indinavir ,

lopinavir , nelfinavir , r itonavir y saquinavir) tam bién son sust ratos de P-gp [ Lee

CG et al. , 1998; Cianfr iglia M et al. , 2007] .

I .4 .2 . Rol de P- gp en la quim io terapia cont ra e l cáncer

La quim ioterapia es uno de los t ratam ientos m ás efect ivos cont ra los tum ores

m etastát icos. Sin em bargo, la habilidad de las células cancerígenas de ser

resistentes a diferentes drogas sigue siendo un gran im pedim ento en el éxito

terapéut ico. Se han invest igado num erosos factores biológicos com o posibles

causantes de esta falla, incluyendo inhibición o est im ulación de sistem as de

eflujo (por ejem plo P-gp) , inducción o inact ivación de enzim as, alteración de los

blancos enzim át icos, cam bios en los procesos de reparación de ADN y

alteración en las vías de señalización que llevan a apoptosis, ent re ot ros. De

estos, el nivel de expresión de P-gp es uno de los m ecanism os m ejor

caracter izados. De hecho, algunos estudios han dem ost rado que la m agnitud de

la resistencia estaría fuertem ente influenciada por la sobreexpresión de P-gp en

la m em brana de células cancerígenas, la cual es regulada posit ivam ente por la

11

I - I nt roducción

m ism a quim ioterapia [ Got tesm an MM et al. , 2002] . La idea de encont rar

m oduladores que inhiban la act ividad del t ransportador ha crecido junto con el

núm ero de invest igaciones bioquím icas y clínicas sobre el m ecanism o m olecular

y la regulación de la expresión de P-gp [ Ford JM, 1996; Sarkadi B et al. , 1997;

Bradshaw DM et al. , 1998; Persidis A, 1999; Ram achandran C et al. , 1999;

Ueda I et al. , 1999; Szabo D et al., 2000] .

I .4 .3 . I nf luencia de P- gp en la concent ración de drogas

ant ir re t rovira les

P-gp localiza en la m em brana apical de los enterocitos, donde bom bea hacia el

exter ior de la célula las drogas, sust ratos de la proteína, que fueron

prim eram ente adm inist rados en form a oral y absorbidos a nivel intest inal. Esto

provoca una reducción de la concent ración int racelular de la droga en células

epiteliales intest inales y consecuentem ente una baja concent ración de la droga

en plasm a. El ingreso de las drogas hacia cerebro o test ículos tam bién esta

lim itada por P-gp, ya que se expresa en las células endoteliales de los capilares

que irr igan estos órganos. Ensayos in vivo m ost raron un aum ento de la

concent ración de dist intos PI (am prenavir, indinavir , nelfinavir , saquinavir) en

cerebro y test ículos de ratones a los cuales se les adm inist ró un potente

inhibidor de P-gp (LY335979) [ Choo EF et al. , 2000] . Asim ism o, ratones knock

out para P-gp presentaron un aum ento en los niveles de acum ulación de

indinavir , nelfinavir y saquinavir en cerebro en com paración con los ratones

wild type [ Kim RB et al. , 1998; Washington CB et al. , 2000] . La presencia de P-

gp lim itaría la penet ración de los PI en cerebro o test ículos, protegiendo a estos

órganos cont ra los efectos citotóxicos que producen las altas concent raciones

12

I - I nt roducción

de las drogas y a su vez favoreciendo la generación de los llam ados “santuarios

virales” , fuente de la replicación residual del HI V-1.

Por ot ra parte, los PI ut ilizados en la terapia cont ra el HI V-1, una vez en sangre

t ienen com o principal blanco a los linfocitos T CD4+ . La presencia de P-gp en

estas células podría producir la expulsión de dichas drogas, dism inuyendo la

eficacia de la terapia ant irret roviral. Owen A et al. (2004 a) han dem ost rado

una correlación posit iva ent re la expresión de P-gp en linfocitos y la

concent ración inhibitor ia 50 de saquinavir (PI ) ensayada in vit ro, sugir iendo que

la variación de los niveles de P-gp podría tener impacto en el éxito terapéut ico.

Respecto a los NRTI y los NNRTI , la escasa inform ación disponible en la

literatura indica que la afinidad de la proteína por este t ipo de drogas es m uy

baja. Sin em bargo, se ha observado que células CEM VBL100 que

sobreexpresan P-gp presentan una dism inución de la acum ulación y acción

ant iviral del NRTI AZT [ Antonelli G et al. , 1992] . Por ot ra parte, un estudio

hecho en células Caco-2 no m ost ró evidencias de un t ransporte diferencial (en

la dirección basolateral-apical o apical-basolateral) de los NNRTI (nevirapina,

efavirenz) a t ravés de P-gp [ Störm er E et al. , 2002] .

I .5 . Gen de resistencia a m últ iples drogas 1

P-gp es codificada por el gen de resistencia a m últ iples drogas 1 (MDR1) que en

hum anos se localiza en el crom osom a 7 (7p21–21.1, NC_000007.13) . Su

tam año es de 600 kb y m enos del 5% del total representa la región codificante

del gen, con un ARNm de aproxim adam ente 4,7 kDa. La est ructura de MDR1

13

I - I nt roducción

consiste en 28 exones y 28 int rones, 26 de los cuales interrum pen la secuencia

am inoacídica ( f igura I 3 ) [ Fojo A et al. , 1986] .

I .5 .1 . Polim orf ism os de nucleót ido sim ple en MDR1

I nicialm ente, la variabilidad del gen MDR1 fue estudiada por Hoffm eyer S et al.

(2000) . A part ir de ADN genóm ico de individuos sanos de origen caucásico, se

secuenciaron la región prom otora (cubriendo los exones codificantes) y las

regiones involucradas en la unión int rón-exón ( im portantes para el splicing del

ARNm ) y se ident ificaron quince polim orfism os de nucleót ido sim ple (SNP) , de

los cuales, cinco localizaban en la región codificante y t res eran polim orfism os

no sinónim os. Hasta el m om ento, fueron reportados en la base de datos NCBI

m ás de 50 SNPs en la región codificante de MDR1 y la lista se encuent ra en

expansión [ Owen A et al. , 2005 a; Fung KL et al. , 2009] . La m ayoría de ellos

son polim orfism os de sent ido erróneo (60% ) , seguidos de polim orfism os

sinónim os (25% ) y polim orfism os no codificantes (15% ) , m ient ras que no han

sido encont radas m utaciones sin sent ido hasta el m om ento.

MDR1 G1 1 9 9 A

MDR1 C1 2 3 6 T

MDR1 G2 6 7 7 T/ A MDR1 C3 4 3 5 TMDR1 T- 1 2 9 C

REGI ÓN REGULATORI A

MDR1 G1 1 9 9 A

MDR1 C1 2 3 6 T

MDR1 G2 6 7 7 T/ A MDR1 C3 4 3 5 TMDR1 T- 1 2 9 C

REGI ÓN REGULATORI A

FI GURA I 3 . Esquem a del gen MDR1 y ubicación de los SNPs m ás es tudiados

( im agen adaptada de Owen A et al. , 2005 a) . Se m uest ran los 28 exones y la

región regulatoria del gen.

14

I - I nt roducción

I .5 .1 .1 . Efecto de los SNPs de MDR1 en e l n ive l de expresión y

act iv idad de P- gp

Ent re los polim orfism os sinónim os, el SNP MDR1 C3435T ( rs1045642) en el

exón 26 es el m ás extensam ente estudiado y ha sido asociado con una m enor

expresión de P-gp en enterocitos [ Hoffm eyer S et al. , 2000] y en células

m ononucleares de sangre perifér ica (PBMC) [ Owen A et al. , 2004 a] . Los

portadores del genot ipo hom ocigota MDR1 3435TT m ost raron niveles de

expresión de P-gp en duodeno [ Hoffm eyer S et al. , 2000] y PBMC [ Owen A et

al. , 2004 a] significat ivam ente m enores y una m ayor concent ración plasm át ica

de digoxina respecto a los hom ocigotas MDR1 3435CC [ Hoffm eyer S et al. ,

2000] . Estos resultados fueron apoyados por el estudio de Hitzl M et al. (2001) ,

en el cual, individuos hom ocigotas MDR1 3435TT de origen caucásico

presentaron m enores niveles de expresión de ARNm de MDR1 en leucocitos en

com paración con los individuos con genot ipo MDR1 3435CC. Por ot ra parte,

existen estudios que se cont raponen a estos resultados, com o lo encont rado en

una población japonesa, en donde los individuos con genot ipo MDR1 3435TT

m ost raron los m ayores niveles de ARNm de MDR1 en biopsias de duodeno

[ Nakam ura T et al. , 2002] . Cabe destacar que las discrepancias ent re los

reportes podrían explicarse por diferencias interétnicas (caucásicos vs

japoneses) o diferencias del t ipo celular analizado ( leucocitos vs duodeno) .

15

I - I nt roducción

I .5 .1 .2 . I nf luencia de los SNPs de MDR1 en la respuesta a la terapia

ant ir re t rovira l

Algunos polim orfism os en MDR1 podrían afectar la expresión y/ o act ividad de P-

gp y han sido asociados con una variabilidad en la concent ración plasm át ica de

las drogas ant irret rovirales y la respuesta a la terapia en pacientes infectados

por HI V-1. Una de las hipótesis propuestas por Saitoh A et al. (2005) plantea

que los pacientes hom ocigotas MDR1 3435CC presentarían un m ayor nivel de

expresión de P-gp en enterocitos, lo cual lim itaría la absorción de la droga y

consecuentem ente reduciría la concent ración de la m isma en linfocitos T CD4+ ,

desfavoreciendo la respuesta virológica ( reducción de la carga viral) e

inm unológica ( increm ento del recuento de células T CD4+ ) ( f igura I 4 ,

situación A ) . Por el cont rar io, los pacientes heterocigotas MDR1 3435CT u

hom ocigotas MDR1 3435TT presentarían un m enor nivel de expresión de P-gp

en células epiteliales de intest ino y por lo tanto una m enor elim inación de la

droga a t ravés de este t ransportador. Esto perm it ir ía alcanzar una m ayor

concent ración de la droga en plasm a y en linfocitos T CD4+ acom pañado de un

m ayor éxito terapéut ico ( f igura I 4 , situación B ) .

16

I - I nt roducción

ESPACI O I NTRAVASCULAR

CÉLULAS EPI TELI ALES

TRACTOGASTROI NTESTI NAL

SUSTRATO

LI NFOCI TOS T CD4 +

CÉLULAS EPI TELI ALES

ABSORCI ÓN

ELI MI NACI ÓN

P-GP

SI TUACI ÓN A

SI TUACI ÓN B

FI GURA I 4 . Hipótesis de la expresión diferencia l de P- gp y su consecuencia

en la concent ración de sust ra tos ( im agen adaptada de Saitoh A et al. , 2005) .

SI TUACI ÓN A. El sust rato es absorbido (A) a t ravés de las células epiteliales

intest inales y una gran proporción del m ism o es elim inada (E) por P-gp. La

proporción restante llega a plasm a y de allí a linfocitos T CD4+ , donde P-gp elim ina

una pequeña parte.

SI TUACI ÓN B. Un m enor nivel de expresión de P-gp en enterocitos perm ite que se

alcancen mayores concent raciones de sust rato en plasm a y en linfocitos T CD4+ .

En los últ im os años, m uchos estudios han evaluado la influencia del

polim orfism o MDR1 C3435T en respuesta al t ratam iento con drogas

ant irret rovirales de pacientes infectados por el HI V-1, hallando resultados

discordantes [ Fellay J et al. , 2002; Winzer R et al. , 2003; Saitoh A et al. , 2005;

Ma Q et al. , 2007; Curras V et al. , 2009; Est rela R de C et al. , 2009;

Rakhm anina NY et al. , 2011] . Algunos resultados sugieren que el SNP MDR1

C3435T juega un rol im portante en la respuesta inm unológica [ Fellay J et al. ,

17

I - I nt roducción

2002] o virológica [ Saitoh A et al. , 2005] a HAART. Fellay J et al. (2002) ,

estudiando adultos infectados por HI V-1, encont raron una asociación

significat iva ent re el genot ipo MDR1 3435TT y una alta recuperación de células

T CD4+ , j unto con m enores niveles de nelfinavir (PI ) y efavirenz (NNRTI ) en

plasm a luego de un periodo de 24 sem anas post inicio de HAART. Los autores

sugieren que los bajos niveles de P-gp asociados al genot ipo MDR1 3435TT

podrían estar com pensados por la sobreexpresión de m etabolizadores (com o el

citocrom o P450, CYP450) con afinidad por drogas ant irret rovirales, lo cual

produciría una reducción en las concent raciones de droga en plasm a. Por ot ra

parte, Saitoh A et al. (2005) hallaron m ayores niveles plasm át icos de nelfinavir

y efavirenz y una m ayor respuesta virológica en niños heterocigotas MDR1

3435CT infectados por HI V-1 a las 8 sem anas del inicio de HAART. Sin

em bargo, estos hallazgos no pudieron ser corroborados por ot ros estudios

[ Haas DW et al. , 2003; Nasi M et al. , 2003; Winzer R et al. , 2005] . Num erosos

reportes en la literatura han m ost rado resultados conflict ivos y es evidente que

existen m uchos factores, com o diferencias en la etnia, la edad, los regim enes

de HAART y el cr iter io aplicado para el análisis de la respuesta virológica e

inm unológica a la terapia (ej . t iem pos evaluados antes y después del

t ratam iento) , que dificultan la adecuada com paración ent re estudios de

farm acogenét ica.

Por ot ra parte, la presencia de ot ros SNPs en MDR1 con diferente desequilibr io

de ligam iento podrían explicar, en parte, las diferencias halladas. El

polim orfism o MDR1 C3435T en el exón 26 presenta un fuerte desequilibr io de

ligam iento con el SNP sinónim o MDR1 C1236T ( rs1128503) en el exón 12 [ Kim

RB et al. , 2001] . En adultos infectados por HI V-1, el alelo MDR1 1236T fue

18

I - I nt roducción

asociado con un m ayor aum ento del recuento de células T CD4+ post inicio de

HAART con PI , sin hallarse diferencias en la tasa de supresión virológica [ Zhu D

et al. , 2004] . No ha sido todavía reportado si el polim orfism o MDR1 C1236T

podría afectar el nivel de expresión y/ o act ividad de P-gp.

Lopinavir/ r itonavir (LPV/ r) es una coform ulación ampliam ente usada com o PI

de pr im era línea para el t ratam iento de pacientes pediát r icos. Los

polim orfism os de MDR1 no parecen m odificar la concent ración plasm át ica valle

en pacientes adultos [ Winzer R et al. , 2003; Ma Q et al. , 2007; de Cassia

Est rela R de C et al. , 2009] . Sin em bargo, en pacientes pediát r icos, el efecto

del SNP MDR1 C3435T es todavía cont roversial; Saitoh A et al. (2005) y Curras

V et al. (2009) reportaron un efecto en la respuesta a nelfinavir y r itonavir (PI ) ,

respect ivam ente. Por ot ra parte, un estudio reciente m ost ró que las variantes

de MDR1, C3435T y G2677T, no afectarían ni la farm acocinét ica de LPV/ r ni la

respuesta virológica en niños infectados por HI V-1 [ Rakhm anina NY et al. ,

2011] .

Por ot ra parte, el SNP MDR1 T-129C ( rs3213619) fue ident ificado en la región

5´ regulator ia de MDR1, part icularm ente en el exón 1b (no t raducido) . Tanabe

M et al. (2001) reportaron que las m ujeres japonesas heterocigotas -129TC

expresan niveles de P-gp significat ivam ente m enores en placenta respecto de

las m ujeres con genot ipo MDR1 -129TT. Este polim orfism o esta presente en

poblaciones de or igen italiana [ Furuno T et al. , 2002] , japonesa [ Tanabe M et

al. , 2001] y afr icana [ Parathyras J et al. , 2009] con frecuencias que no superan

el 25% y son m uy pocos los estudios que evaluaron su efecto en la respuesta a

la terapia ant irret roviral. Sin em bargo, Parathyras J et al. (2009) estudiaron la

19

I - I nt roducción

im plicancia de este SNP en la recuperación inm unológica a los 6 m eses del

inicio de la terapia ant irret roviral en individuos infectados por HI V-1 de origen

sudafr icano, hallando una asociación significat iva ent re el genot ipo MDR1 -

129CC y un m ayor aum ento del recuento de células T CD4+ .

I .6 . P- gp en la infección por HI V- 1

La replicación de virus envueltos com o el HI V-1 podría verse afectada por la

presencia de P-gp en m em brana. Ensayos in vit ro han sugerido una

dism inución de la infect ividad de HI V-1 en células que sobreexpresan P-gp al

afectar la fusión viral y posiblem ente la liberación de las part ículas virales [ Lee

CG et al. , 2000; Speck RR et al. , 2002; Hulgan T et al. , 2003] . Sin em bargo, no

se observó una asociación ent re el nivel de expresión t ranscripcional de MDR1 y

la perm isividad a la infección por HI V-1 en células T CD4+ [ Bleiber G et al. ,

2004] . Los estudios clínicos tam bién m ost raron resultados cont radictor ios

[ I fergan I et al. 2002; Kedm i M et al. , 2007] . Kedm i M et al. (2007)

encont raron que el alelo MDR1 3435T es m enos frecuente en adultos infectados

por HI V-1 que en donantes de sangre sanos. Sin embargo, I fergan I et al.

(2002) no observaron una correlación con el r iesgo de infección por HI V-1. Es

poco claro por el m om ento el efecto de la proteína sobre la replicación o

infect ividad viral.

I .7 . Receptor X de pregnano

La expresión de MDR1 esta regulada por el factor de t ranscripción nuclear

receptor X de pregnano (PXR, tam bién llam ado SXR, PAR, PRR) , codificado por

20

I - I nt roducción

el gen NR1I 2, en respuesta a endobiót icos y xenobiót icos [ Geick A et al. , 2001;

Synold TW et al. , 2001] . Owen A et al. (2004 b) m ost raron una correlación

posit iva ent re los niveles de ARNm de PXR y los niveles de ARNm MDR1 en

PBMC de donantes sanos. Asim ism o, PXR tam bién regula la expresión del

citocrom o P450 3A4 (CYP3A4) y ha sido descripta una asociación ent re los

niveles t ranscripcionales de am bos factores en hígado de hum anos [ Goodwin B

et al. , 2002] .

Hasta el m om ento, han sido ident ificados 89 polim orfism os en la región

prom otora y el int rón 1 de NR1I 2 [ Lamba J et al. , 2008] . Entre ellos, los SNPs

T44477C (73% ) , C63396T (62% ) y A69789G (36% ) están presentes con alta

frecuencia en población caucásica y han sido asociados con alteraciones tanto

en la act ividad de CYP3A4 en hepatocitos pr im ar ios com o en el nivel

t ranscripcional de PXR, CYP3A4 y MDR1 en hígado. El SNP C63396T

( rs2472677) se encuent ra en el int rón 1b de NR1I 2 e increm enta la unión de

factores de t ranscripción com o HNF3β que regula la act ividad del prom otor de

PXR. El alelo PXR 63396T t iene una frecuencia de m ás del 50% en poblaciones

caucásicas (España e I talia) [ Siccardi M et al. , 2008; Schipani A et al. , 2010] y

de aproxim adam ente el 40% en poblaciones de origen afr icano (Gana y Kenia)

[ Schipani A et al. , 2010] . Este alelo ha sido asociado con una m ayor act ividad

de CYP3A4 en hepatocitos pr im arios y un m ayor nivel de ARNm PXR en hígado

de donantes adultos [ Lam ba J et al. , 2008] . Adem ás, pacientes infectados por

HI V-1 hom ocigotas PXR 63396TT presentaron una concent ración valle del PI

atazanavir en plasm a significat ivam ente m enor que la concent ración m ínim a

efect iva (150 ng/ m l) , sugir iendo que PXR podría ser un factor im portante en la

21

I - I nt roducción

regulación de la disposición de las drogas ant irret rovirales [ Siccardi M et al. ,

2008] .

22

I I - OBJETI VOS

I I - Objet ivos

I I .1 . Objet ivo genera l

El objet ivo general es evaluar la influencia de polim orfism os en los genes MDR1

y PXR en la infección pediát r ica por HI V-1, la respuesta al t ratam iento

ant irret roviral y la expresión de P-gp.

I I .2 . Objet ivos específ icos

Est im ar la frecuencia de los polim orfism os T-129C, C1236T y C3435T de

MDR1 y C63396T de PXR en población general argent ina y en niños

infectados por t ransm isión vert ical.

Analizar el efecto de los polim orfism os T-129C, C1236T y C3435T de MDR1

y C63396T de PXR en:

i) la t ransm isión vert ical del HI V-1

ii) la progresión a SI DA pediát r ico

iii) la concent ración plasm át ica de drogas ant irret rovirales

iv) la respuesta virológica a HAART

v) la respuesta inm unológica a HAART

vi) la expresión de P-gp en linfocitos CD4+

Estudiar el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ en relación con la

edad y el estatus de infección por HI V-1.

23

I I I - MATERI ALES Y MÉTODOS

I I I - Mater ia les y Métodos

I I I .1 . Grupos de estudio

I I I .1 .1 . Niños expuestos a l HI V- 1 por t ransm isión ver t ica l

Se estudiaron niños nacidos de m adres con serología posit iva para HI V-1 ent re

1986 y 2006 que asist ieron al Hospital de Pediat ría “Juan P. Garrahan” para el

diagnóst ico y seguim iento clínico de la infección.

I I I .1 .1 .1 . Subgrupo ut ilizado para e l estud io de t ransm isión ver t ica l

y progresión a SI DA ( CAPÍ TULO 1 )

La cohorte pediát r ica incluyó 128 niños expuestos no infectados (64 niñas y 64

niños) y 219 niños infectados por HI V-1 (114 niños y 105 niñas) . La m ayor

proporción de niños infectados respecto a los niños expuestos no infectados no

es indicat iva de la tasa de t ransm isión, ya que esta diferencia se debe a que el

Hospital Garrahan no cuenta con servicio de m aternidad y los pacientes son

refer idos al m ism o, en algunos casos, ya con sintomatología asociada a SI DA.

Del total de pacientes, 53 pares m adre-hijo (39 expuestos no infectados y 14

infectados por HI V-1) recibieron las t res partes (prenatal, int raparto y postnatal

en el neonato) del régim en de zidovudina del Protocolo 076 del Grupo de

Estudios Clínicos Pediát r icos en SI DA (PACTG) [ Connor EM et al. , 1994] ,

m ient ras que a 34 pares (6 expuestos no infectados y 28 infectados por HI V-1)

se les adm inist ró AZT a la m adre durante el parto y al recién nacido. Un total

de 221 niños (55 expuestos no infectados y 166 infectados por HI V-1) no

recibieron profilaxis con AZT y en 39 niños (28 expuestos no infectados y 11

infectados por HI V-1) la inform ación no estaba disponible. Para el análisis

24


estadíst ico, se seleccionaron los pares m adre-hijo que no recibieron profilaxis

ant irret roviral. La m ediana de t iem po de seguim iento de la cohorte fue de 108

m eses (4 - 232 m eses) , 65% de los niños infectados por HI V-1 progresaron a

SI DA y solo 6 m urieron durante el periodo de estudio, el cual finalizó en m ayo

del 2006. Todos del niños recibieron terapia HAART durante el periodo de

estudio, que incluyó una com binación de: 1 a 4 NRTI m ás 1 o 2 NNRTI (16 y 1

pacientes, respect ivam ente) o 1 a 4 NRTI m ás 1 o 2 PI (152 y 4 pacientes,

respect ivam ente) . De ellos, 84 niños progresaron a SI DA antes de iniciar el

t ratam iento HAART. El análisis de t iem po libre de evento (SI DA) fue realizado

en 171 pacientes de los cuales se disponía de datos clínicos.

I I I .1 .1 .2 . Subgrupo ut ilizado para e l estud io de la determ inación de

la concent ración de lopinavir en plasm a y la respuesta a HAART

( CAPÍ TULO 2 )

De la cohorte pediát r ica descripta en el punto I I I .1.1.1 de esta sección, 38

niños (21 niños y 17 niñas) fueron incluidos en el estudio farm acogenét ico y se

les realizó el m onitoreo de LPV. Al m om ento de la determ inación de LPV, todos

los niños recibían un régim en de HAART con LPV en com binación con r itonavir

com o únicos PI , excepto por 2 pacientes quienes recibieron adem ás

am prenavir. La dosis oral de LPV fue 230 y 300 m g/ m 2/ 12hs para niños

m ayores y m enores de 6 m eses, respect ivam ente. El recuento de células T

CD4+ y la carga viral fueron analizados antes y después del inicio de

t ratam iento con LPV/ r.

25


I I I .1 .1 .3 . Subgrupo ut ilizado para e l es tudio del n ive l de expresión

de P- gp en linfocitos CD4 + ( CAPÍ TULO 3 )

A part ir del año 2010 se estudió un grupo de 7 niños vert icalm ente infectados

por HI V-1 (2 niños y 5 niñas) con reciente diagnóst ico realizado en el Hospital

Garrahan. A cada uno de estos pacientes se le realizó una prim era

determ inación de la expresión de P-gp en linfocitos CD4+ por citom et ría de flujo

en el periodo com prendido ent re la confirm ación del diagnóst ico y el inicio del

t ratam iento HAART.

I I I .1 .2 . Población genera l argent ina

Para el estudio de la dist r ibución de las frecuencias genot ípicas y alélicas de los

SNPs, se incluyeron 231 donantes de sangre con serología negat iva para HI V-1,

que concurr ieron al Banco de Sangre del Hospital Garrahan. Las m uest ras de

sangre se obtuvieron al azar y fueron reclutadas, a razón de t res tubos, una

vez por sem ana, en form a anónim a no rast reable (m uest ra disociada) . Esta

m etodología consiste en la enumeración de los tubos, con la indicación de la

edad, sexo y fecha de ext racción. En el Servicio de Hem oterapia se realiza

diar iam ente la determ inación de la serología para el HI V-1 m ediante el test de

tam izaje de ELI SA (ensayo por inm unoabsorción ligado a enzim as) . Si en ese

día todas las m uest ras testeadas en el Servicio presentaban serología negat iva

para HI V-1, se procedió a procesar las m ism as. En caso cont rar io, se

descartaron las m uest ras. Esta m etodología fue aprobada por el Com ité de

Ét ica del Hospital Garrahan.

26


Por ot ra parte, para el estudio de la expresión de P-gp en linfocitos CD4+ se

obtuvieron m uest ras de sangre de 20 individuos (grupo de norm ales

pediát r icos) con un rango de edad de 10 m eses a 18 años, que concurren al

Hospital Garrahan para la realización de intervenciones quirúrgicas (ejem plo:

labio leporino, hernia um bilical, pie equinovaro, mam elones, cálculos

vesiculares, ent re ot ros) . Los cr iter ios de inclusión de estos norm ales

pediát r icos en el estudio fueron la ausencia de infecciones durante el últ im o año

y la no ingesta de m edicación durante la sem ana previa a la tom a de la

m uest ra. Estos cr iter ios fueron evaluados m ediante un cuest ionario

específicam ente diseñado para este estudio.

I I I .1 .3 . Consideraciones ét icas

El Com ité de Ét ica y el Com ité de Revisión de Proyectos de I nvest igación del

Hospital Garrahan aprobaron el estudio, el cual se encuent ra regist rado bajo el

núm ero 640. Se obtuvieron los consent im ientos inform ados de los donantes de

sangre adultos y de los padres o tutores de los niños.

27


I I I .2 . Métodos

I I I .2 .1 . Obtención y preparación de m uest ras clín icas

I I I .2 .1 .1 . Obtención de cé lulas m ononucleares a par t ir de sang re

per ifér ica

A part ir de sangre perifér ica (aproxim adam ente 5 m l) ant icoagulada con EDTA

(acido et ilendiam inotet raacét ico) 10% se realizó una dilución al m edio con

solución fisiológica y se aislaron PBMC m ediante gradiente de Ficoll-Tr iyosom

(GE Healthcare, 50 M, am idot r izoato sódico 50% , densidad= 1,077 gr/ m l,

m edida a 4º C) luego de una cent r ifugación a 1500 rpm , durante 30 m inutos a

4º C. Poster iorm ente, se descartó el plasm a y se realizaron dos lavados de las

células con solución fisiológica (cent r ifugación a 1800 rpm , durante 10

m inutos) . En caso de ser necesario, se realizó una lisis de glóbulos rojos con

agua dest ilada estér il durante un m inuto, ya que la presencia de hem oglobina

puede inhibir la poster ior reacción de am plificación de ADN. Finalm ente, se

realizó el recuento de las PBMC obtenidas m ediante contador hem atológico o

cám ara de Neubauer y se les realizó un lavado con solución fisiológica.

I I I .2 .1 .2 . Preparación de lisados ce lulares a par t ir de PBMC

A part ir de las PBMC conservadas a una tem peratura de –20°C en alícuotas de

2x106 células, se prepararon los lisados con solución C (200 μl, Tr is-Cl 5 m M

pH= 8,3, Tween 20 0,5% , Tritón X100 0,5% ) y proteinasa K en una

concent ración final de 20 μg/ m l. El t iem po y la tem peratura de act ividad de la

28


enzim a fueron de 60 m inutos y 56°C, respect ivam ente . Poster iorm ente, la

enzim a se inact ivó durante 15 m inutos a 95°C y los lisados celulares se

conservaron a –20°C.

I I I .2 .1 .3 . Obtención de ADN genóm ico

Se ext rajo el ADN genóm ico a part ir de PBMC o sangre perifér ica ut ilizando

precipitación salina o un m étodo com ercial, respect ivam ente; de acuerdo con la

disponibilidad en la inst itución a lo largo del t iem po.

I I I .2 .1 .3 .1 . Ext racción de ADN genóm ico a par t ir de PBMC

A part ir de las PBMC conservadas a –20º C, se procedió a realizar la lisis de

glóbulos blancos con buffer de WCLB (Tris-Cl 2 M, EDTA 0,5 M pH= 8, NaCl 5 M,

SDS 10% ) y proteinasa K (20,85 m g/ m l) . Se realizó una incubación durante

toda la noche a 55°C y posteriorm ente se efectuó un lavado con NaCl 5 M y

cent r ifugación a 13000 rpm , durante 30 m inutos. Se descartó el sobrenadante

y se precipitó el ADN con etanol 100% . Posteriorm ente, se realizaron dos

lavados con dos volúm enes de etanol 70% y se dejó secar en estufa a 37°C.

Finalm ente, se resuspendió el ADN en buffer TE (Tris 1 M pH= 8, EDTA 0,5 M) y

se conservó a una tem peratura de –20°C.

29


I I I .2 .1 .3 .2 . Ext racción de ADN genóm ico a par t ir de sangre

per ifér ica

Se ut ilizó el kit com ercial QI Am p DNA Mini Kit (QI AGEN) para la ext racción de

ADN genóm ico a part ir de 200 μl sangre perifér ica conservada a –80°C o 200 μl

de una suspensión de PBMC conservada a –20°C siguie ndo las indicaciones del

fabricante. El ADN obtenido se conservó a una tem peratura de –20°C.

I I I .2 .1 .3 .3 . Cuant if icación de ADN

El ADN ext raído se cuant ificó por espect rofotom etría, m idiendo la absorbancia a

260 nm ( longitud de onda de absorción de ADN) y 280 nm ( longitud de onda de

absorción de proteínas) . Se obtuvo la concent ración de ADN considerando que

un valor de absorbancia a 260 nm de una densidad ópt ica (DO) corresponde

aproxim adam ente a 50 μg/ m l, para el caso de ADN doble hebra y usando la

fórm ula:

Concent ración = absorbancia a 260 nm X 50 μg/ m l X factor de dilución

La pureza del ADN ext raído se calculó en base a la relación ent re la absorbancia

a 260 nm y la absorbancia a 280 nm . La pureza esperada corresponde a una

relación ent re 1,7 y 2,0.

30


I I I .2 .2 . Genot ipif icación de las var ian tes polim órf icas de MDR1 y

PXR

Los genot ipos de MDR1 y PXR fueron ident ificados por ensayos de reacción en

cadena de la polim erasa (PCR) y poster ior em pleo de ensayos de polim orfism o

de longitud de fragm entos de rest r icción (RFLP) . Los SNPs C1236T ( rs1128503)

y C3435T ( rs1045642) de MDR1 fueron genot ipificados en base al reporte

previo de Cascorbi I et al. (2001) y el SNP T-129C ( rs3213619) de MDR1 fue

genot ipificado en base al reporte de Furuno T et al. (2002) . Usando las

secuencias de prim ers gent ilm ente provistas por Siccardi M et al. (2008) fue

diseñado un ensayo de PCR-RFLP para el SNP C63396T ( rs2472677) de PXR.

I I I .2 .2 .1 . Am plif icación de ADN m ediante la reacción en cadena de

la polim erasa

Los ensayos de PCR se realizaron a part ir de lisados de PBMC o m uest ras de

ADN genóm ico. Se ut ilizó una m ezcla de reacción que incluyó buffer de reacción

(MgCl2 1,5 m M) , dNTPs, prim ers, Cl2Mg, enzim a Taq polim erasa (Go Taq,

Prom ega) , 200 a 500 ng de ADN o 5 a 10 μl de lisado celular y agua ( libre de

DNAsa) en un volum en final de 50 μl. El cont rol negat ivo de la reacción de PCR

se preparó con la m ezcla de reacción, en ausencia de m uest ra y con el

agregado agua para com pletar el volum en final.

Los program as consisten en un prim er paso de desnaturalización de la doble

hélice de ADN a 94°C, luego un segundo paso de annealing (hibr idación) del

prim er con el tem plado de ADN a una tem peratura que depende

31


específicam ente de cada par de prim ers y se calcula en base a la siguiente

fórm ula:

T m elt ing ( fusión) = 4º C X (G + C) + 2º C X (A + T)

G, C, A, T es el núm ero de los correspondientes nucleót idos en el prim er

La tem peratura de annealing seleccionada suele ser aproxim adam ente 5º C

m enor que la tem peratura de fusión. Finalm ente, se realizó un tercer paso de

extensión de la doble cadena de ADN a 72°C. Este ci clo de am plificación se

repite 35 veces. Cada reacción de am plificación se encuent ra precedida por una

desnaturalización inicial a 94°C y seguida de una e longación final a 72°C.

En la f igura M1 se m uest ran los productos de PCR de 215 pb (MDR1 T-129C) ,

366 pb (MDR1 C1236T) , 197 pb (MDR1 C3435T) y 134 pb (PXR C63396T) .

32


SNP MDR1 T- 1 2 9 C:

5´ -

AGTCATCTGTGGTGAGGCTG ATTGGCTGGGCAGGAACAGCGCCGGGGCGTGGGCTGA

GCACAGCCGCTTCGCTCTCTTTGCCACAGGAAGCCTGAGCTCATTCGAG( T/ C) AGCGGC

TCTTCCAAGCTCAAAGAAGCAGAGGCCGCTGTTCGTTTCCTTTAGGTCTTTCCACTAAAGT

CGGAGTATCTTCTTCCAAAATTTCACGTCTTGGTGGCCGTT

Prim er MDR1 2 9 ( fow ard ) : 5´ - AGTCATCTGTGGTGAGGCTG

Prim er MDR1 2 9 ( reverse ) : 5´ - AACGGCCACCAAGACGTGA

Tam año del am plicón: 215 pb

Enzim a de rest r icción: MspA1I

SNP MDR1 C1 2 3 6 T:

5´ -

TATCCTGTGTCTGTGAATTGCC TTGAAGTTTTTTTCTCACGGTCCTGGTAGATCTTGAAG

GG( C/ T) CTGAACCTGAAGGTGCAGAGTGGGCAGACGGTGGCCCTGGTTGGAAACAGTG

GCTGTGGGAAGAGCACAACAGTCCAGCTGATGCAGAGGCTCTATGACCCCACAGAGGGG

ATGGTGAGATGACCCATGCGAGCTAGACTGCGGTGATCAGCAGTCACATTCACATCTTTCT

GATGTTGCCCTTTCAATTACAAATGTATGAAAGTCACACTTACTTTTTATTCCAGGTCAGTG

TTGATGGACAGGATATTAGGACCATAAATGTAAGGTTTCTACGGGAAATCATTGGTGTGG

TGAGTCAGG

Prim er MDR1 5 ( fow ard ) : 5´ - TATCCTGTGTCTGTGAATTGC

Prim er MDR1 6 ( reverse ) : 5´ - CCTGACTCACCACACCAATG


Enzim a de rest r icción: HaeI I I

33


SNP MDR1 C3 4 3 5 T:

5´ -

TGTTTTCAGCTGCTTGATGGCAAAGAAATAAAGCGACTGAATGTTCAGTGGCTCCGGCA

CACCTGGGCATCGTGTCCCAGGAGCCCATCCTGTTTGACTGCAGCATTGCTGAGAACATTG

CCTATGGAGACAACAGCCGGGTGGTGTCACAGGAAGAGAT( C/ T) GTGAGGGCAGCAAA

GGAGGCCAACATACATGCCTT

Prim er MDR1 1 ( fow ard ) : 5´ - TGTTTTCAGCTGCTTGATGG

Prim er MDR1 2 ( reverse ) : 5´ - AAGGCATGTATGTTGGCCTC


Enzim a de rest r icción: Mbo1

SNP PXR C6 3 3 9 6 T:

5´ -

GCACAAACATTTTCAATTTCAATGAAGTTCA ATTTATCAACTTTTTTGTGCCATATTTTTT

( C/ T) TGATTAAAAAACAAACAAACACAAACAAAAAAAAACTTTTAAAAGACAGGAATAG

AATAAGTCTTCCGAATG

Prim er PXR6 3 3 9 6 ( fow ard ) : 5´ - GCACAAACATTTTCAATTTCAATGAAGTTCA

Prim er PXR6 3 3 9 6 ( reverse ) : 5´ - CATTCGGAAGACTTATTCTATTCCTGTCT


Enzim a de rest r icción: Hpy188I

FI GURA M1 . Secuencia nucleot ídica de la región genóm ica am plif icada para

cada polim orf ism o. En negrita y subrayado se muest ra el sit io de annealing con

los prim ers. En negrita y som breado se m uest ra el polim orfismo y el sit io de corte

de la enzima de rest r icción.

34


I I I .2 .2 .2 . Digest ión de los productos de am plif icación con enz im as

de rest r icción

Los am plicones de PCR fueron digeridos durante 3 hs (MDR1 C1236T y MDR1

C3435T) o toda la noche (MDR1 T-129C y PXR C63396T) a 37°C con las

enzim as de rest r icción HaeI I I (Ferm entas) , MboI (Ferm entas) , MspA1I (New

England Biolabs) y Hpy188I (New England Biolabs) , respect ivam ente.

Ü SNP MDR1 T- 1 2 9 C: MspA1I t iene dos sit ios de rest r icción en el

am plicón, uno de ellos correspondiente al polim orfism o MDR1 T-129C.

Esta enzim a cliva el producto am plificado en t res fragm entos de 109, 74

y 32 pb en presencia del alelo MDR1 -129C y en dos fragm entos de 141

y 74 pb en presencia del alelo MDR1 -129T.

Ü SNP MDR1 C1 2 3 6 T: HaeI I I t iene dos sit ios de rest r icción en el

am plicón, uno de ellos correspondiente al polim orfism o MDR1 C1236T.

Esta enzima corta al amplicón en t res fragm entos de 269, 62 y 35 pb en

presencia del alelo MDR1 1236C y en dos fragm entos de 269 y 97 pb en

presencia del alelo MDR1 1236T.

Ü SNP MDR1 C3 4 3 5 T: MboI t iene solo un sit io de rest r icción en el

am plicón. Esta enzim a corta el producto de PCR en dos fragm entos de

158 y 39 pb en presencia del alelo MDR1 3435C pero no lo corta en

presencia del alelo MDR1 3435T.

35


Ü SNP PXR C6 3 3 9 6 T: Hpy188I t iene dos sit ios de rest r icción en el

am plicón, uno de ellos correspondiente al polim orfism o PXR C63396T.

Esta enzim a cliva el producto am plificado en t res fragm entos de 66, 63 y

5 pb en presencia del alelo PXR 63396C y en dos fragm entos de 129 y 5

pb en presencia del alelo PXR 63396T.

Una alícuota del producto de am plificación (5 a 30 μl) se digir ió con una m ezcla

de reacción que contenía buffer de reacción, seroalbúm ina bovina (BSA) y el

núm ero de unidades enzim át icas correspondiente a cada ensayo. El volum en

final de reacción fue de 15 a 50 μl; este parámetro, además de la temperatura

y los t iem pos de incubación, se determ inó en form a experim ental. En la tabla

M1 se m uest ran las enzim as de rest r icción ut ilizadas en los ensayos de

digest ión y la secuencia reconocida por las m ism as.

Enzim a de re st ricción Sit io de corte

5´ …CMG* CKG…3´

3´ …GMC* GKC…5´

5´ …GG* CC…3

3´ …CC* GG…5´

5´ …* GATC …3´

3´ … CTAG* …5´

5´ …TC N* GA…3´

3´ …CG* N CT…5´

TABLA M1 . Enzim as de re st ricción y lossit ios blanco correspondientes

Con un ast erisco se muest ra el sit io exact ode cort e de la enzima. En negrit a ysubrayado se muest ra la base polimórf ica.

MspA1 I

Hae I I I

MboI

Hpy1 88 I

36


I I I .2 .2 .3 . Elect roforesis en gel de agarosa

A fin de testear la correcta am plificación de los dist intos fragm entos en la

reacción de PCR, se realizó un gel de agarosa 2,5% (Ult ra pure TM agarose,

I nvit rogen en buffer TAE 1X) teñido con brom uro de et idio 1X (0,5 μg/ m l, 1 μl

por cada 10 m l de gel) , en el cual se sem braron 10 μl del producto de

am plificación con aproxim adam ente 1 μl de buffer de siem bra (glicerol 50% ,

azul de brom ofenol 0,2% , xylene cyanol 0,2% , pH= 8,3) . Luego de la corr ida

elect roforét ica efectuada a voltaje constante (90 m V) en la que se ut ilizó com o

buffer de corr ida TAE 1X (TAE: t r izm a base 4,85 gr/ l, ácido acét ico 1,15 m l,

EDTA disódico 0,37 gr/ l) , se procedió a visualizar las bandas de ADN bajo luz

UV con el sistem a de im agen El Logic (Kodak) . Para determ inar el tam año de

las bandas, se sem bró adem ás en los geles un m arcador de peso m olecular de

ADN (50 pb) .

Los productos de digest ión fueron separados en gel de agarosa 4,5% (MDR1

C1236T y PXR C63396T) o 3,5% (MDR1 C3435T y MDR1 T-129C) con buffer

TAE 1X, teñido con el m arcador de ADN (Gel Star Nucleic Acid Gel Stain) en 1X

(1 μl por cada 10 m l de gel) que perm ite visualizar fragm entos de bajo peso

m olecular. En el gel se sem bró el volum en final de digest ión. En la f igura M2

se m uest ran ejem plos de los perfiles de PCR-RFLP para los genot ipos de T-

129C, C1236T y C3435T de MDR1 y C63396T de PXR.

37


FI GURA M2 A FI GURA M2 B

269 pb

97 pb62 pb

35 pb

1236

CT

1236

CC

1236

TT

-129

TC

-129

TT

-129

CC

141 pb109 pb74 pb

269 pb

97 pb62 pb

35 pb

1236

CT

1236

CC

1236

TT

269 pb

97 pb62 pb

35 pb

1236

CT

1236

CC

1236

TT

-129

TC

-129

TT

-129

CC

141 pb109 pb74 pb

-129

TC

-129

TT

-129

CC

141 pb109 pb74 pb

FI GURA M2 C FI GURA M2 D

197 pb158 pb

3435

CT

3435

TT

3435

CC

129/134 pb63/66 pb

6339

6CT

6339

6CC

6339

6TT

197 pb158 pb

3435

CT

3435

TT

3435

CC

197 pb158 pb

3435

CT

3435

TT

3435

CC

129/134 pb63/66 pb

6339

6CT

6339

6CC

6339

6TT

129/134 pb63/66 pb

6339

6CT

6339

6CC

6339

6TT

FI GURA M2 . Perf iles de PCR- RFLP de los polim orf ism os MDR1 T- 1 2 9 C ( A) ,

MDR1 C1 2 3 6 T ( B) , MDR1 C3 4 3 5 T ( C) y PXR C6 3 3 9 6 T ( D) . Para cada uno de

los SNPs se m uest ran los t res genot ipos.

38


I I I .2 .3 . Genot ipif icación de las var i antes polim ór f icas de CCR5 y

SDF1

Los alelos CCR5-wild type y CCR5-Δ32 fueron am plificados por PCR usando

prim ers específicos [ Mangano A et al. , 1998] a part ir de lisados de PBMC o

m uest ras de ADN genóm ico. Los productos de PCR de 182 pb correspondiente

al alelo CCR5-wild type y 150 pb correspondiente al alelo CCR5-Δ32 fueron

separados en geles de agarosa 2,5% . El polim orfism o SDF1-3´ A fue

determ inado m ediante un ensayo de PCR-RFLP am plificando un fragm ento del

3´ UTR del gen usando los prim ers reportados por Winkler C et al. (1998) . El

producto de PCR fue digerido con la enzim a MspI (New England Biolabs) y los

fragm entos resultantes de 302 pb para el alelo SDF1-3´ A y dos fragm entos de

202 y 100 pb para el alelo SDF1-wild type fueron ident ificados en gel de

agarosa 2,5% .

I I I .2 .4 . Medición de la concent ración plasm át ica de lopinav ir

El nivel plasm át ico de LPV fue determ inado a part ir de sangre ext raída

inm ediatam ente antes de la adm inist ración de la siguiente dosis de droga

(Cvalle) y ent re 1 a 2 hs luego de la adm inist ración de la dosis de la m añana

(Cpost -dosis) en el Hospital Garrahan. Se realizó solo una determ inación de Cvalle y

una determ inación de Cpost -dosis por paciente. Se obtuvo el regist ro de datos de

dosificación y m om ento de m uest reo. La adherencia al t ratam iento

ant irret roviral en la semana previa al m onitoreo de droga fue evaluada

ut ilizando un cuest ionario específicam ente diseñado para este estudio y

realizado al paciente al m om ento de la adm inist ración de la droga. La

39


inform ación adicional incluyó inform ación dem ográfica y ant ropom étr ica,

parám etros clínicos, virológicos e inm unológicos, exposición previa a PI y

duración del t ratam iento ant irret roviral. La m edición de la concent ración

plasm át ica de la droga fue realizada por la Cátedra de Farm acología de la

Facultad de Farm acia y Bioquím ica de la UBA (Dr. Guillerm o F. Bram uglia y

colaboradores) m ediante la técnica de crom atografía líquida de alta resolución

(HPLC) con detección ult ravioleta com o fue descrito por Curras V et al. (2009) .

El m enor lím ite de cuant ificación para LPV fue de 50 ng.

I I I .2 .5 . Marcadores bioquím icos de seguim iento

La respuesta virológica e inm unológica fue evaluada ret rospect ivam ente. El

recuento de células T CD4+ y la carga viral fueron analizados antes y después

del inicio de HAART con LPV/ r. Los datos basales correspondieron a la

determ inación hecha dent ro de un periodo de hasta 24 sem anas previo a la

exposición de LPV/ r. La carga viral fue analizada alrededor de la sem ana 18 (2 -

46) y 36 (10 - 94) y el recuento de células T CD4+ alrededor de la sem ana 21

(2 - 57) y 41 (8 - 93) luego del inicio de t ratam iento.

I I I .2 .5 .1 . Marcadores virológicos

La virem ia plasm át ica se determ inó m ediante la cuant ificación de la carga viral

( log10 copias de ARN de HI V-1/ m l de plasm a) ut ilizando métodos com erciales

de acuerdo con su disponibilidad en la inst itución a lo largo del t iem po. Se

em pleó HI V-1 RNA QT Nuclisens (Organon Teknika) desde m ayo 1998 a junio

2005, Am plicor HI V-1 Monitor test v 1.5 (Roche Diagnost ics System s) desde

40


j unio 2005 a octubre 2007 y HI V-1 RNA Cobas® TaqMan 48 (Roche Diagnost ic

System s) desde octubre 2007 al presente.

I I I .2 .5 .2 . Marcadores inm unológicos

El recuento de células T CD4+ (% de células T CD4+ ) se realizó a part ir de

sangre entera por citom et ría de flujo (FACS sorter, Becton Dickinson) . Esta

m edición fue realizada por el Laborator io de I nm unología del Hospital Garrahan,

a cargo del Dr. Jorge Rossi.

I I I .2 .6 . Marcadores clín icos de la infección

El estadío de la infección por HI V-1 y la definición de SI DA fueron establecidos

de acuerdo con el cr iter io de clasificación para niños del Cent ro de cont rol y

prevención de enferm edades [ CDC, 1994] . Estos datos fueron recolectados

m ediante la revisión de histor ias clínicas del Hospital Garrahan.

I I I .2 .7 . Determ inación de la expresión de P- gp en linfocitos CD4 +

por citom et r ía de f lu jo

Se realizó la puesta a punto del ensayo de citom et ría de flujo en base al reporte

de Ford J et al. (2003) . La detección de P-gp se realizó ut ilizando un ant icuerpo

m onoclonal de ratón ( I gG2a) conjugado a ficoerit r ina (PE) que reconoce un

epítope de P-gp hum ana (UI C2, I m m unotech) y un ant icuerpo cont rol de isot ipo

de rata ( I gG2a) conjugado a PE (Serotech) . La m arcación de células CD4+ se

realizó usando un ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a isot iocianato de fluoresceína

41


(FI TC) (Becton Dickinson) . A part ir de 8x105 PBMC aisladas de sangre perifér ica

m ediante gradiente de densidad (com o se detalla en el punto I I I .2.1.1 de esta

sección) , se obtuvo un pellet de estas células realizando un lavado (1 m l de

buffer fosfato salino (PBS) 1X fr ío, cent r ifugación a 1500 rpm , durante 6

m inutos a 4°C y descarte del sobrenadante) y se agr egó 100 μl de fij ador

celular (Caltag Laborator ies) incubando durante 15 m inutos a tem peratura

am biente. Luego, se realizó un lavado de las células y se resuspendieron en

PBS 1X fr ío. Se agregaron 35 μl de ant icuerpo ant i-P-gp, 5 μl de ant icuerpo

ant i-CD4 y 4x105 PBMC y por ot ra parte se m arcaron 4x105 PBMC con 5 μl de la

dilución 1/ 30 de ant icuerpo cont rol de isot ipo y 5 μl de ant icuerpo ant i-CD4.

Am bos tubos se incubaron durante 90 m inutos a 4°C e n oscuridad.

Posteriorm ente se realizaron dos lavados y las células se resuspendieron en

200 μl de PBS 1X fr ío y guardadas en heladera hasta ser pasadas por el

citóm et ro (FACS sorter, Becton Dickinson) , equipado con un láser de argón con

longitud de onda de excitación de 488 nm . Se detectaron las señales de

forward scat ter (FSC) y side scat ter (SSC) en una escala lineal y la

fluorescencia en una escala logarítm ica. Para cada m uest ra analizada se

determ inó un núm ero de aproxim adam ente 10.000 eventos de linfocitos CD4+ .

El análisis de los datos se realizó ut ilizando el program a FlowJo versión 5.7.3.

I I I .2 .8 . Análisis estadíst ico

Las frecuencias genot ípicas fueron est im adas por conteo directo de alelos. El

ajuste al equilibr io de Hardy-Weinberg fue testeado con la prueba de χ2 de

Pearson. La prueba de Fisher-Freeman-Halton fue usada para evaluar la

independencia m arginal en tablas de cont ingencia y el valor p fue est im ado con

42


el m étodo de Montecarlo. Se optó por una sim ulación de Montecarlo debido a

que algunos valores m arginales elevados no perm it ieron el cálculo exacto del p

valor. Las frecuencias haplot ípicas fueron est im adas usando el Algoritm o de

Maxim ización de la Esperanza (www.bioinfo.iconcologia.net / snpstats) . El

desequilibr io de ligam iento fue evaluado con el estadíst ico D´ y testeado con la

prueba de χ2 de Pearson. Se ut ilizó el m étodo de Kaplan-Meier para est im ar la

progresión a la enferm edad y las curvas de sobrevida. Los r iesgos relat ivos

fueron calculados para un m odelo de Riesgos Proporcionales de Cox. Se incluyó

alternat ivamente la exposición o no a HAART com o un est rato dependiente del

t iem po (ajuste de HAART) . Tam bién analizam os los alelos CCR5-Δ32 y SDF1-

3´ A com o potenciales confundentes en un m odelo est rat ificado. Se aplicó la

form ulación de Andersen-Gill del m odelo de Riesgos Proporcionales com o un

proceso de conteo [ Andersen PK y Gill RD et al. , 1982] . Esta form ulación no

asum e que el paciente es seguido desde el t iem po cero, y es út il, en form a

general, para int roducir un ajuste por una covariable dependiente del t iem po

(en nuest ro caso: el t ratam iento) . La intención fue cont rolar una diferencia en

el r iesgo de SI DA dent ro de cada paciente debido a diferencias en la edad al

inicio de HAART y la duración de HAART. Se evaluó el ajuste general con la

prueba de Razón de Verosim ilitud, m ient ras que los cont rastes ent re genot ipos

para un m odelo genét ico codom inante fueron analizados con la prueba de Wald.

El t iem po de seguim iento para los niños que no progresaron a SI DA fue la edad

al m om ento de corte del estudio. Hasta este t iem po no se regist raron pacientes

con pérdidas de seguim iento. Las diferencias ent re genot ipos de MDR1 y PXR

en relación a las concent raciones valle y post -dosis de LPV, los niveles basales

y los cam bios en la carga viral y en el recuento de células T CD4+ y los niveles

de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ fueron analizadas con la prueba de

43


Kruskal-Wallis aplicando la corrección por Bonferroni para pruebas m últ iples

cuando fue necesario. La relación ent re el porcentaje de células P-gp+ en la

población de linfocitos CD4+ y la edad al m om ento de la determ inación se

evaluó m ediante la prueba de correlación de rangos de Spearman. Se ut ilizó la

prueba de Mann-Whitney para evaluar diferencias ent re los niños infectados por

HI V-1 y los norm ales pediát r icos en relación a los niveles de expresión de P-gp

en linfocitos CD4+ . Las pruebas estadíst icas fueron realizadas ut ilizando los

program as Graphpad Prism versión 2.01 y Stat ist ix versión 7. Todas las

pruebas fueron de dos colas con un nivel de significancia de 0,05.

44

I V - RESULTADOS

I V - Resultados - Capítu lo 1

CAPÍ TULO 1 - EFECTO DE LOS POLI MORFI SMOS DE MDR1 Y PXR EN

LA TRANSMI SI ÓN VERTI CAL DEL HI V- 1 Y EN LA PROGRESI Ó N A

SI DA PEDI ÁTRI CO

I V.1 . Dist r ibución de los SNPs de MDR1 y PXR en la poblac ión

genera l argent ina

Con el objet ivo de evaluar la dist r ibución de los genot ipos T-129C, C1236T y

C3435T de MDR1 y C63396T de PXR en población argent ina, se realizó la

genot ipificación de un grupo de adultos con serología negat iva para HI V-1

( tabla R1 ) . Los alelos, 1236T y 3435T de MDR1, fueron altam ente frecuentes

en la población argent ina, con una frecuencia del 44% . Las frecuencias

genot ípicas halladas para el SNP MDR1 C1236T fueron de 31,17% hom ocigotas

1236CC, 49,78% heterocigotas 1236CT y 19,05% hom ocigotas 1236TT. Las

frecuencias genot ípicas para SNP MDR1 C3435T fueron: 34,63% hom ocigotas

3435CC, 43,29% heterocigotas 3435CT y 22,08% hom ocigotas 3435TT. Para el

alelo MDR1 -129C la frecuencia observada fue baja (5% ) , con una dist r ibución

de genot ipos de 90% hom ocigotas -129TT y 10% heterocigotas -129TC, sin

hallarse hom ocigotas -129CC. El alelo PXR 63396T tam bién fue m uy frecuente

(46% ) en nuest ra población, m ost rando frecuencias genot ípicas de 29%

hom ocigotas 63396CC, 50% heterocigotas 63396CT y 21% hom ocigotas

63396TT. Las frecuencias alélicas y genot ípicas halladas en el grupo de niños

infectados por HI V-1 no difir ieron significat ivam ente de las observadas en la

población general argent ina (p>0,05) . Todos los genot ipos estudiados ajustaron

al equilibr io de Hardy-Weinberg, indicando que no existe un desvío poblacional

en los grupos de estudio.

45

IV - R

esu

ltad

os - C

ap

ítulo

1

4

6

I nfectados por HI V- 1 Expuestos no infectados I nfecta dos por HI V- 1 Expuestos no infectadosMDR1 - 1 2 9 TT 200 (91,32) - 152 (91,57) 53 (96,36) 90 (90,00)MDR1 - 1 2 9 TC 18 (8,22) - 14 (8,43) 2 (3,64) 10 (10,00)MDR1 - 1 2 9 CC 1 (0,46) - 0 (00,00) 0 (00,00) 0 (00,00)

Frecuencia de l a le lo C 0,05 - 0,04 0,02 0,05

MDR1 1 2 3 6 CC 47 (21,46) 35 (27,34) 30 (18,07) 11 (20,00) 72 (31,17) MDR1 1 2 3 6 CT 109 (49,77) 61 (47,66) 84 (50,60) 30 (54,54) 115 (49,78) MDR1 1 2 3 6 TT 63 (28,77) 32 (25,00) 52 (31,32) 14 (25,45) 44 (19,05)

Frecuencia de l a le lo T 0,54 0,49 0,57 0,53 0,44

MDR1 3 4 3 5 CC 50 (22,83) 29 (22,66) 33 (19,88) 10 (18,18) 80 (34,63) MDR1 3 4 3 5 CT 118 (53,88) 65 (50,78) 90 (54,22) 28 (50,91) 100 (43,29)MDR1 3 4 3 5 TT 51 (23,29) 34 (26,56) 43 (25,90) 17 (30,91) 51 (22,08)

Frecuencia de l a le lo T 0,50 0,52 0,53 0,56 0,44

PXR 6 3 3 9 6 CC 59 (26,94) - 48 (28,92) 19 (34,55) 29 (29,00)

PXR 6 3 3 9 6 CT 100 (45,66) - 74 (44,58) 24 (43,64) 50 (50,00)

PXR 6 3 3 9 6 TT 60 (27,40) - 44 (26,61) 12 (21,82) 21 (21,00)

Frecuencia de l a le lo T 0,50 - 0,46 0,44 0,46

n 219 128 166 55 100/ 231

Todas las frecuencias genot ípicas ajustaron al equilibr io de Hardy-Weinberg. * Est im ación de Montecarlo para la dist r ibución m ult inom ial en tablas de cont ingencia est rat if icadas,* * Est imación de Montecar lo para la dist r ibución mult inom ial en tablas de cont ingencia (prueba de Fisher-Freeman-Halton) .

Donantes de sangre adultos

n ( % )

0,205 0,785

0,715 0,742

Ale los y genot ipos Cohor te pediá t r ica ( a justado po r prof ilax is con zidovudina)

n ( % )

0,659

0,369-

-

TABLA R1 . Frecuencias genot ípicas y alé licas de los SNPs T- 1 2 9 C, C1 2 3 6 T y C3 4 3 5 T de MDR1 y C6 3 3 9 6 T de PXR en donantes con serología n egat iva para HI V- 1 yen niños per inata lm ente expuestos a l HI V- 1

p*Sin prof ilax is con z idovudina

n ( % ) p* *


I V.1 .1 . Desequilibr io de ligam iento ent re los SNPs C1 2 3 6 T y C3 4 3 5 T

de MDR1

Posteriorm ente, se analizó la relación de ligam iento ent re los SNPs C1236T y

C3435T de MDR1 y, com o fue descrito previam ente, encont ram os en nuest ra

población un fuerte desequilibr io de ligam iento ent re los polim orfism os C1236T

y C3435T de MDR1 (D= 0,155, D´ = 0,633, r= 0,630, p< 0,05) . El alelo MDR1

3435T se encuent ra ligado al alelo MDR1 1236T, definiendo nueve pares de

haplot ipos. En la f igura R1 se m uest ran las frecuencias haplot ípicas de los t res

grupos estudiados (donantes de sangre adultos, niños infectados y niños

expuestos no infectados) . Los pares de haplot ipos doble heterocigota (MDR1

3435CT/ 1236CT) y doble hom ocigota (MDR1 3435CC/ 1236CC y MDR1

3435TT/ 1236TT) fueron los de m ayor ocurrencia con frecuencias m ayores al

12% . Adem ás, no se observaron diferencias significat ivas ent re las frecuencias

haplot ípicas de los grupos estudiados.

I V.2 . Rol de los genot ipos de MDR1 y PXR en la t ransm isión ver t ica l

de l HI V- 1

Una vez establecida la dist r ibución de las frecuencias alélicas y genot ípicas en

población general, invest igam os si los polim orfism os de MDR1 y PXR están

asociados con la t ransm isión perinatal del HI V-1. Se analizó la dist r ibución de

los genot ipos T-129C, C1236T y C3435T de MDR1 y C63396T de PXR en 219

niños infectados por HI V-1 y 128 niños expuestos no infectados (EU) nacidos de

m adres con serología posit iva para HI V, que representó el grupo cont rol de alto

r iesgo ( tabla R1 ) . La dist r ibución de genot ipos de MDR1 y PXR fue sim ilar

47


ent re los dos grupos cuando el análisis fue ajustado por la profilaxis con

zidovudina y cuando el análisis fue rest r ingido a niños que no recibieron

profilaxis con zidovudina para prevenir la t ransm isión m adre-hijo en los

subgrupos de infectados (n= 166) y expuestos no infectados (n= 55) . Estos

hallazgos sugieren que los SNPs T-129C, C1236T y C3435T de MDR1 y

C63396T de PXR no afectarían la infección natural por HI V-1 a t ravés de la

t ransm isión vert ical en la cohorte pediát r ica estudiada.

48

IV - R

esu

ltad

os - C

ap

ítulo

1

4

9

FI GURA R1 . Frecuencia de los pares de haplot ipos de MDR1 ( C3 4 3 5 T, C1 2 3 6 T) en donantes de sangre con serología negat iva para HI V- 1 y en niños per inata lm ente expue stos a l H I V- 1 . EU: niños expuestos no infectados por HI V-1.

0 %

5 %

1 0 %

1 5 %

2 0 %

2 5 %

3 0 %

3 5 %

4 0 %

3435CC/1236CC 3435CC/1236CT 3435CC/1236TT 3435CT/1236CC 3435CT/1236CT 3435CT/1236TT 3435TT/1236CC 3435TT/1236CT 3435TT/1236TT

donantes de sangre adultos ( n= 2 3 1 )

niños infectados ( n= 2 1 9 )

EU ( n= 1 2 8 )

FI GURA R1 . Frecuencia de los pares de haplot ipos de MDR1 ( C3 4 3 5 T, C1 2 3 6 T) en donantes de sangre con serología negat iva para HI V- 1 y en niños per inata lm ente expue stos a l H I V- 1 . EU: niños expuestos no infectados por HI V-1.

0 %

5 %

1 0 %

1 5 %

2 0 %

2 5 %

3 0 %

3 5 %

4 0 %

3435CC/1236CC 3435CC/1236CT 3435CC/1236TT 3435CT/1236CC 3435CT/1236CT 3435CT/1236TT 3435TT/1236CC 3435TT/1236CT 3435TT/1236TT

donantes de sangre adultos ( n= 2 3 1 )

niños infectados ( n= 2 1 9 )

EU ( n= 1 2 8 )


I V.3 . I nf luencia de los genot ipos de MDR1 y PXR en la progresión a

SI DA pediá t r ico

Ot ro de los objet ivos fue exam inar la influencia de los genot ipos de MDR1 y PXR

en la progresión a SI DA pediát r ico. Para ello, del total de 219 niños infectados

por HI V-1, se pudieron evaluar 171 niños de los cuales se disponía de datos

clínicos. La m ediana de t iem po de seguim iento fue de 108 m eses (4 – 232

m eses) y 111 niños infectados por HI V-1 progresaron a SI DA durante el

periodo de estudio. Se realizó un estudio ret rospect ivo con curvas de Kaplan-

Meier para t iem po a SI DA y el m odelado por Regresión de Riesgos

Proporcionales de Cox. Los niños heterocigotas MDR1 3435CT presentaron un

ret raso significat ivo en el t iem po de desarrollo de SI DA de aproxim adam ente

40 m eses respecto de los niños hom ocigotas MDR1 3435CC (p= 0,005; f igura

R2 A ) . Esta diferencia se evidencia al com parar las m edianas de t iem po libre de

SI DA de 63 m eses y 23 m eses, respect ivam ente. Asim ism o, los niños

heterocigotas MDR1 1236CT y hom ocigotas MDR1 1236TT m ost raron un ret raso

en el t iem po de progresión a SI DA de aproxim adam ente 36 y 23 m eses,

respect ivam ente, en com paración a los niños hom ocigotas MDR1 1236CC

(p= 0,024 y p= 0,026, respect ivam ente; f igura R2 B ) . Las m edianas de t iem po

libre de SI DA fueron de 52, 39 y 16 m eses para los niños heterocigotas MDR1

1236CT, hom ocigotas MDR1 1236TT y hom ocigotas MDR1 1236CC,

respect ivam ente. Adem ás, se evaluó el efecto del SNP MDR1 T-129C en la

progresión a la enferm edad, no hallando diferencias significat ivas ent re los

niños hom ocigotas MDR1 -129TT y los niños MDR1 -129TC (p= 0,124; f igura

R2 C) .

50


Cuando el análisis se rest r ingió al periodo previo al inicio de HAART (eventos de

SI DA previo al inicio de HAART= 84) , se observaron las m ismas tendencias para

MDR1 3435CT (p= 0,011, RR= 0,529, I C= 0,324–0,865) , MDR1 1236CT

(p= 0,063, RR= 0,617, I C= 0,372–1,103) y MDR1 1236TT (p= 0,069, RR= 0,574,

I C= 0,316–1,040) (datos no m ost rados) . Sin em bargo, el núm ero de eventos de

SI DA fue m uy bajo para realizar el análisis del efecto de los SNPs de MDR1 en

el periodo post inicio de HAART (eventos de SI DA durante HAART= 26) .

Por ot ra parte, evaluam os el potencial efecto confundente de los alelos CCR5-

Δ32 y SDF1-3´ A, debido a que ha sido previam ente descripta la influencia de

estas variantes en la progresión a SI DA. La frecuencia del alelo CCR5-Δ32 en el

grupo de niños infectados por HI V-1 fue del 4% y las frecuencias genot ípicas:

92,13% hom ocigotas CCR5-wild type/ wild type y 7,87% heterocigotas CCR5-

wild type/Δ32. El alelo SDF1-3´ A presentó una frecuencia de 21% en el grupo

de niños infectados y las frecuencias genot ípicas fueron: 62,56% hom ocigotas

SDF1-wild type/ wild type, 33,65% heterocigotas SDF1-wild type/ 3´ A y 3,79%

SDF1-3´ A/ 3´ A. No se observaron cam bios significat ivos para el rol protector de

los polim orfism os C1236T y C3435T de MDR1 en un m odelo est rat ificado de

Riesgos Proporcionales de Cox (datos no m ost rados) .

Dado que PXR es un factor de regulación de la expresión de P-gp y de

m etabolizadores de drogas ant irret rovirales com o CYP3A4, evaluam os el

im pacto del SNP PXR C63396T en la evolución de la enferm edad. Sin em bargo,

no hallam os una diferencia significat iva en el t iempo de progresión a SI DA

ent re los niños PXR 63396CC, PXR 63396CT y PXR 63396TT (p= 0,282; f igura

51


R2 D ) aun cuando el análisis fue rest r ingido al periodo previo al inicio de HAART

(p= 0,147; datos no m ost rados) .

No se pudo evaluar la influencia de las variantes de MDR1 y PXR en térm inos

del t iem po de sobrevida debido a que solo seis pacientes fallecieron durante el

periodo de seguim iento y el núm ero de eventos no fue suficiente para realizar

el análisis.

I V.3 .1 . Efecto de los pares de haplot ip os de MDR1 en la evolución a

SI DA infant il

Dado el fuerte ligam iento ent re los SNPs C1236T y C3435T de MDR1,

exam inam os el efecto de los pares de haplot ipos en la progresión a la

enferm edad. Los niños portadores de los pares de haplot ipos MDR1

3435CT/ 1236TT y MDR1 3435CT/ 1236CT m ost raron un ret raso significat ivo en

el t iem po de progresión a SI DA de aproxim adam ente 172 y 48 m eses,

respect ivam ente respecto de los niños MDR1 3435CC/ 1236CC (p= 0,007 y

p= 0,019, respect ivam ente; f igura R2 E ) . Las m edianas de t iem po libre de

SI DA fueron de 188 m eses para los niños MDR1 3435CT/ 1236TT, 64 m eses

para los niños MDR1 3435CT/ 1236CT y 16 m eses para los niños MDR1

3435CC/ 1236CC. Estos resultados sugieren que solo en el contexto de los

haplot ipos que cont ienen el genot ipo MDR1 3435CT, el alelo MDR1 1236T

presenta una cont r ibución independiente de m anera dosis-dependiente. Esto se

evidencia en el hecho de que el efecto protector del SNP MDR1 C1236T

adquiere m ayor m agnitud a m edida que aum enta la dosis del alelo MDR1

1236T. No se observaron diferencias estadíst icam ente significat ivas para los

52


pares de haplot ipos MDR1 3435CC/ 1236CT (n= 13) , MDR1 3435CC/ 1236TT

(n= 3) y MDR1 3435TT/ 1236CT (n= 10) en la progresión a SI DA (datos no

m ost rados) .

Debido al conocido impacto de HAART en el curso de la enferm edad, el rol

potencial de la edad al inicio de HAART y durante HAART debió ser ajustado

com o factores confundentes. Por ello, el análisis de Kaplan-Meier fue

alternat ivamente ajustado incluyendo la duración de HAART com o una

covariable dicotóm ica dependiente del t iem po. La tabla R2 m uest ra el análisis

ajustado para el m odelo de Riesgos Proporcionales de Cox. En am bos m odelos,

ajustado ( tabla R2 ) y no ajustado ( f igura R2 ) , se observaron tendencias

sim ilares, confirm ando un efecto protector independiente de los pares de

haplot ipos MDR1 3435CT/ 1236CT y MDR1 3435CT/ 1236TT en la progresión a

SI DA pediát r ico.

53


54

FI GURA R2 A

FI GURA R2 B

0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Edad ( m eses)

Fra

cció

n li

bre

de

SID

A

MDR1 C3435T

3 4 3 5 CC 40 33 23 1*

3 4 3 5 CT 93 55 63 0,537 0,348 - 0,829 0,005

3 4 3 5 TT 38 23 28 0,719 0,422 - 1,225 0,230Tota l 171

RR

0,023

Cont raste ent re genot ipos ( p )

Ajuste globa l ( p )

9 5 % I CGenot ipo n SI DAMediana a SI DA

0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Edad ( m eses)

Fra

cció

n li

bre

de

SID

A

MDR1 C1236T

1 2 3 6 CC 40 31 16 1*

1 2 3 6 CT 84 54 52 0,599 0,385 - 0,934 0,024

1 2 3 6 TT 47 26 39 0,553 0,328 - 0,933 0,026Tota l 171

Mediana a SI DA

0,049

Cont raste ent re genot ipos ( p )


RR 9 5 % I CGenot ipo n SI DA


55

FI GURA R2 C

FI GURA R2 D

0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Edad ( m eses)

Fra

cció

n li

bre

de

SID

A

MDR1 T- 129C

- 1 2 9 TT 156 99 43 1*

- 1 2 9 TC 15 12 41 1,650 0,907 - 3,020 0,100Tota l 171

0,124

Genot ipo n SI DAMediana a SI DA

RR 9 5 % I CCont raste ent re genot ipos ( p )


0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Edad ( m eses)

Fra

cció

n li

bre

de

SID

A

PXR C63396T

6 3 3 9 6 CC 45 32 36 1*

6 3 3 9 6 CT 79 51 23 0,881 0,565 - 1,370 0,570

6 3 3 9 6 TT 47 28 74 0,672 0,404 - 1,120 0,120Tota l 171

Genot ipo

0,282

n SI DAMediana a SI DA

RR 9 5 % I CCont raste ent re genot ipos ( p )



56

FI GURA R2 E

FI GURA R2 . Curvas de sobrevida para t iem po a SI DA en niños inf ectados

por HI V- 1

Se ut ilizó el método de Kaplan-Meier para est imar la fracción libre de SI DA y las

curvas de sobrevida. El ajuste global fue evaluado con la prueba de Razón de

Verosim ilitud y los cont rastes ent re genot ipos/ pares de haplot ipos fueron

analizados con la prueba de Wald. Los valores p y RR fueron calculados para un

modelo de Riesgos Proporcionales de Cox. RR: r iesgo relat ivo, I C: intervalo de

confianza, * grupo de referencia.

A. MDR1 3435CC ( rojo) , MDR1 3435CT (verde) , MDR1 3435TT (azul)

B. MDR1 1236CC ( rojo) , MDR1 1236CT (verde) , MDR1 1236TT (azul)

C. MDR1 -129TT ( rojo) , MDR1 -129TC (verde)

D. PXR 63396CC ( rojo) , PXR 63396CT (verde) , PXR 63396TT (azul)

E. MDR1 3435CC/ 1236CC ( rojo) , MDR1 3435CT/ 1236CC (gris) , MDR1

3435CT/ 1236CT (verde) , MDR1 3435CT/ 1236TT ( rosa) , MDR1 3435TT/ 1236TT

(azul)

0 50 100 150 200 2500.00

0.25

0.50

0.75

1.00

Fra

cció

n li

bre

de

SID

A

Eda d ( m ese s)

MDR1 C3435T/ C1236T

3 4 3 5 CC/ 1 2 3 6 CC 24 18 16 1*

3 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 CC 16 13 19 0,948 0,464 - 1,940 0,880

3 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 CT 61 36 64 0,507 0,287 - 0,895 0,0193 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 TT 16 6 188 0,282 0,111 - 0,714 0,007

3 4 3 5 TT/ 1 2 3 6 TT 28 17 28 0,707 0,364 - 1,373 0,310

Ajuste global ( p )

0,048

Mediana a SI DA

RR 9 5 % I CCont raste ent re pares

de haplot ipos ( p )SI DA

Pares de haplot ipos

n


MDR1 3 4 3 5 CC 1*MDR1 3 4 3 5 CT 0,532 0,342 - 0,827 0,005MDR1 3 4 3 5 TT 0,713 0,414 - 1,229 0,210

MDR1 1 2 3 6 CC 1*MDR1 1 2 3 6 CT 0,608 0,388 - 0,952 0,029MDR1 1 2 3 6 TT 0,545 0,320 - 0,927 0,025

MDR1 3 4 3 5 CC/ 1 2 3 6 CC 1*MDR1 3 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 CC 0,941 0,455 - 1,942 0,870MDR1 3 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 CT 0,515 0,288 - 0,919 0,025MDR1 3 4 3 5 CT/ 1 2 3 6 TT 0,249 0,092 - 0,673 0,006MDR1 3 4 3 5 TT/ 1 2 3 6 TT 0,706 0,358 - 1,394 0,320

TABLA R2 . Progresión a SI DA ajustada por la edad al inicio de HAART y la d uración deHAART

El ajuste global fue evaluado con la prueba de Razón de Verosim ilit ud y los cont rastes ent regenot ipos/ pares de haplot ipos fueron analizados con la prueba de Wald. Los valores p y RR fueroncalculados para un m odelo de Riesgos Proporcionales de Cox. RR: riesgo relat ivo, I C: intervalo deconfianza, * grupo de referencia.

0,052

0,037

9 5 % I CContraste ent re

genot ipos/ pares de haplot ipos ( p )

Genot ipos y pares de haplot ipos

RRAjuste global

( p )

0,023

57


CAPÍ TULO 2 - I NFLUENCI A DE LOS POLI MORFI SMOS DE MDR1 Y

PXR EN LA CONCENTRACI ÓN PLASMÁTI CA DE LOPI NAVI R Y E N LA

RESPUESTA VI ROLÓGI CA E I NMUNOLÓGI CA A HAART

I V.4 . Caracter íst icas de los pacientes

El objet ivo fue evaluar si los SNPs de MDR1 y PXR t ienen un efecto en los

niveles plasm át icos de LPV y la respuesta virológica e inm unológica a HAART en

niños infectados por HI V-1. Para ello, se analizó un subgrupo de 38 pacientes

de la cohorte pediát r ica, a los que se les realizó un estudio de m onitoreo de

LPV. Todos los pacientes recibieron régim en de HAART con LPV/ r. La dosis oral

de LPV fue 230 y 300 m g/ m 2/ 12hs para niños m ayores y m enores de 6 m eses,

respect ivam ente. Las característ icas del grupo de estudio al m om ento de la

determ inación de la concent ración plasm át ica de LPV se resum en en la t abla

R3 . Los pacientes estuvieron igualm ente dist r ibuidos ent re niños y niñas. La

m ediana de edad fue de 109,7 m eses, a pesar de que el rango fue m uy am plio

incluyendo niños de 7 m eses hasta 19 años. La m ediana de t iem po de

exposición de LPV/ r fue de aproxim adam ente 24 m eses. Al m om ento de la

determ inación de la concent ración plasm át ica de la droga, la m ediana de carga

viral plasm át ica fue de 3,62 log10 copias/ m l, la m ediana del recuento de células

T CD4+ fue del 23% y el 76% de los pacientes había desarrollado SI DA (estadío

C) . Tres pacientes recibieron HAART con LPV/ r por pr imera vez, m ient ras que la

m ayoría había tenido experiencia previa de HAART con ot ros PI diferentes de

LPV (pr incipalm ente r itonavir y nelfinavir) . Al m omento de la cuant ificación de

LPV, los regim enes de base consist ieron en: 2 o 3 NRTI en 35 pacientes (92% ) ,

2 o 3 NRTI m ás 1 PI (am prenavir) en 2 pacientes (5% ) y 4 NRTI m ás 1 NNRTI

(efavirenz) en un paciente (3% ) .

58


Niñas - n ( % ) 17 (45% )

Edad - m ediana, m eses [ rango] 109,70 [ 7,83 - 233,47]

Peso corpora l - m ediana, kg [ rango] 23 [ 9 - 60]

Duración de l t ra tam iento - m ediana, m eses [ rango] 24,68 [ 2,03 - 62,33]

Estadío clín ico, n ( % ) A 2 (5% )

B 5 (13% )

C 29 (76% )CV plasm át ica - m ediana, log 1 0 copias/ m l [ rango] 3,62 [ 1,70 - 5,90]

Recuento de célu las T CD4 + - m ediana, % [ rango] 23 [ 1 - 43]

TABLA R3 . Caracter íst icas clín icas de los pacientes al m om ento de ladeterm inación del n ive l plasm át ico de lopinavir

Caracter íst icas

Duración del t ratam iento: t iem po desde el inicio del t ratam iento hasta ladeterm inación del nivel plasm át ico de la droga. CV: carga viral.

I V.5 . I nf luencia de los SNPs de MDR1 y PXR en la concent r ación

plasm át ica de lopinavir

I nvest igam os si los polim orfism os de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y de

PXR (C63396T) pueden afectar la concent ración valle (Cvalle) y post -dosis (Cpost -

dosis) de LPV en niños infectados por HI V-1. La dist r ibución de las frecuencias de

los SNPs de MDR1 y PXR fue sim ilar a la descripta previam ente en la cohorte

pediát r ica, con frecuencias cercanas al 50% para los alelos MDR1 1236T, MDR1

3435T y PXR 63396T y de 5% para el alelo MDR1 -129T. Para el SNP MDR1

C1236T, las frecuencias genot ípicas halladas fueron 28,95% hom ocigotas

1236CC, 47,37% heterocigotas 1236CT y 23,68% hom ocigotas 1236TT.

Encont ramos que el SNP MDR1 C1236T t iene un efecto significat ivo en la

concent ración post -dosis de LPV (p= 0,016; tabla R4 ) . La concent ración post -

dosis de LPV fue m enor en los niños heterocigotas MDR1 1236CT respecto de

los niños hom ocigotas MDR1 1236TT, con una m ediana de Cpost -dosis de 3,04

µg/ m l y 6,50 µg/ m l, respect ivam ente (f igura R3 A ) . Adem ás, la concent ración

valle de LPV fue tam bién m enor en los pacientes con el genot ipo MDR1 1236CT

59


(m ediana de Cvalle= 2,29 µg/ m l) respecto de los pacientes con el genotipo MDR1

1236TT (m ediana de Cvalle= 6,30 µg/ m l) , a pesar de que la diferencia no fue

estadíst icamente significat iva (p= 0,152; tabla R4 ) . No se observó una

asociación significat iva ent re las concent raciones valle y post -dosis de LPV y los

genot ipos de los SNPs MDR1 T-129C, MDR1 C3435T y PXR C63396T. Tam poco

hallam os diferencias significat ivas ent re los genot ipos de MDR1 o PXR y las

característ icas clínicas de los niños infectados por HI V-1 que se m uest ran en la

tabla R3 .

n Cva lle n Cpost -dosis

MDR1 - 1 2 9 TT 34 5,12 [ 0,02 - 15,00] 30 5,26 [ 0,63 - 15,00]

MDR1 - 1 2 9 TC 4 2,96 [ 0,60 - 10,20] 4 4,15 [ 0,50 - 11,80]

MDR1 - 1 2 9 CC 0 - 0 -

p 1 1

MDR1 1 2 3 6 CC 11 7,90 [ 0,33 - 15,00] 11 9,70 [ 2,35 - 15,00]

MDR1 1 2 3 6 CT 18 2,29 [ 0,02 - 10,70] 15 3,04 [ 0,50 - 14,22]

MDR1 1 2 3 6 TT 9 6,30 [ 1,45 - 11,02] 8 6,50 [ 4,75 - 12,77]

p 0,152 0 ,0 1 6

MDR1 3 4 3 5 CC 7 3,57 [ 0,33 - 10,20] 7 3,04 [ 1,54 - 11,80]

MDR1 3 4 3 5 CT 24 3,22 [ 0,02 - 15,00] 21 5,00 [ 0,50 - 15,00]

MDR1 3 4 3 5 TT 7 6,30 [ 1,45 - 11,02] 6 6,32 [ 4,75 - 12,77]

p 0,988 0,656

PXR 6 3 3 9 6 CC 8 4,58 [ 0,33 - 15,00] 7 5,00 [ 2,35 - 11,90]

PXR 6 3 3 9 6 CT 23 3,57 [ 0,29 - 11,90] 20 4,93 [ 0,50 - 15,00]

PXR 6 3 3 9 6 TT 7 8,20 [ 0,02 - 10,70] 7 6,50 [ 1,12 - 14,22]

p 1 1

Concent ración plasm át ica de lopinavir , ug/ m l [ rango ]

TABLA R4 . Nivel plasm át ico de lopinavir respecto de los genot ipos deMDR1 y PXR

Las diferencias ent re genot ipos de MDR1 y PXR en relación a lasconcent raciones valle (Cval le) y post -dosis (Cpost -dosis) de lopinavir fueron

evaluadas con la prueba de Kruskal-Wallis aplicando la corrección deBonferroni.

Genot ipos

60


I V.6 . Efecto de los SNPs de MDR1 y PX R en la respuesta virológica e

inm unológica a HAART

Adem ás, exploram os si los polim orfism os de MDR1 y PXR afectan la respuesta

virológica e inm unológica al régim en HAART con LPV/ r. Se analizaron el

recuento de células T CD4+ y la carga viral antes (basal) y después de la

exposición a LPV/ r ( tabla R5 ) . La m ediana de carga viral basal fue sim ilar

ent re los genot ipos de los cuat ro polim orfism os evaluados. Sin em bargo,

observam os que el polim orfism o MDR1 C1236T afecta significat ivam ente la

respuesta virológica a HAART con LPV/ r (p= 0,047; tabla R5 ) . Los niños

heterocigotas MDR1 1236CT presentaron una m enor dism inución de la carga

viral a la sem ana 36 respecto de los niños hom ocigotas MDR1 1236CC, con una

m ediana de carga viral de -0,50 log10 copias/ m l y -2,08 log10 copias/ m l,

respect ivam ente ( f igura R3 B ) . Esta diferencia tam bién fue observada a la

sem ana 18, pero no alcanzó significancia estadíst ica ( t abla R5 ) . Un total de 13

niños (34% ) m ost raron supresión virológica (CV ≤ 2,6 log10 copias/ m l) a la

sem ana 18. De ellos, 5 pacientes fueron hom ocigotas MDR1 1236CC, 4

heterocigotas MDR1 1236CT y 4 hom ocigotas MDR1 1236TT. Los SNPs MDR1 T-

129C, MDR1 C3435T y PXR C63396T no se asociaron con la respuesta

virológica a HAART con LPV/ r. Ninguno de los polim orfism os de MDR1 y PXR

estudiados m ost ró asociación significat iva con la respuesta inm unológica ni a la

sem ana 21 ni a la sem ana 41 post inicio del régim en de LPV/ r.

En conjunto, estos hallazgos sugieren que solo el SNP MDR1 C1236T afecta

significat ivam ente los niveles plasm át icos de LPV con un consecuente im pacto

en la eficiencia de la droga en reducir la replicación viral.

61

IV - R

esu

ltad

os - C

ap

ítulo

2

6

2

MDR1 - 1 2 9 TT 25a 5,17 [ 2,93 - 6,92] -1,16 [ -3,44 - 0,78] -1,38 [ -3,44 - 0,88] 19 14,00 [ 1,00 - 31,00] 2,00 [ -4,00 - 30,00] 4,00 [ -5,00 - 30,00]

MDR1 - 1 2 9 TC 2 5,17 [ 4,89 - 5,45] -2,63 [ -3,56 - ( -1,70) ] -3,02 [ -3,19 - ( -2,85) ] 3 38,00 [ 15,00 - 39,00] 0,00 [ -5,00 - 8,00] 7,00 [ 2,00 - 8,00]

MDR1 - 1 2 9 CC 0 - - - - - -p 1 0,316 0,182 0,208 1 1

MDR1 1 2 3 6 CC 10a 5,36 [ 3,04 - 6,92] -1,47 [ -3,56 - ( -0,04) ] -2,08 [ -3,19 - ( -0,90) ] 6 18,50 [ 7,00 - 38,00] 5,50 [ 0,00 - 30,00] 7,50 [ 0,00 - 30,00]

MDR1 1 2 3 6 CT 10 5,14 [ 4,60 - 5,84] -0,64 [ -1,72 - 0,78] -0,50 [ -1,57 - 0,31] 9 22,00 [ 10,00 - 39,00] 0,00 [ -5,00 - 13,00] 3,00 [ -5,00 - 10,00]

MDR1 1 2 3 6 TT 7 5,14 [ 2,93 -5,99] -1,91 [ -3,44 - ( -0,65) ] -1,56 [ -3,44 - 0,88] 7 2,00 [ 1,00 - 28,00] 2,00 [ -2,00 - 15,00] 4,00 [ -1,00 - 7,00]

p 1 0,120 0 ,0 4 7 0,365 0,627 0,725

MDR1 3 4 3 5 CC 5 5,45 [ 4,84 - 6,92] -0,74 [ -3,56 - 0,20] -1,45 [ -2,85 - ( -0,24) ] 5 23,00 [ 10,00 - 39,00] 0,00 [ -5,00 - 5,00] 2,00 [ -5,00 - 8,00]

MDR1 3 4 3 5 CT 17a 5,14 [ 3,04 - 6,38] -1,26 [ -3,44 - 0,78] -1,51 [ -3,44 - 0,31] 11 19,00 [ 7,00 - 31,00] 5,00 [ -4,00 - 30,00] 7,00 [ -4,00 - 30,00]

MDR1 3 4 3 5 TT 5 5,62 [ 2,93 - 5,99] -1,16 [ -3,01 - ( -0,65) ] -0,95 [ -3,02 - 0,88] 6 2,00 [ 1,00 - 28,00] 3,50 [ -2,00 - 15,00] 4,00 [ 0,00 - 7,00]

p 1 1 1 0,077 1 0,767

PXR 6 3 3 9 6 CC 7a 5,59 [ 3,04 - 6,92] -0,74 [ -1,70 - ( -0,19) ] -1,10 [ -3,19 - 0,31] 3 18,00 [ 15,00 - 26,00] 5,00 [ 0,00 - 8,00] 7,00 [ 0,00 - 8,00]

PXR 6 3 3 9 6 CT 15 5,14 [ 2,93 - 6,38] -1,19 [ -3,44 - 0,78] -1,53 [ -3,44 - 0,88] 14 12,50 [ 1,00 - 39,00] 3,50 [ -5,00 - 30,00] 4,00 [ -5,00 - 30,00]PXR 6 3 3 9 6 TT 5 5,17 [ 5,00 -5,45] -1,72 [ -3,56 - ( -0,09) ] -1,50 [ -3,18 - 0,10] 5 24,00 [ 10,00 - 38,00] 0,00 [ -4,00 - 5,00] 7,00 [ -4,00 - 8,00]

p 1 1 1 0,948 0,685 1

Basaln n

Las diferencias ent re los genot ipos de MDR1 y PXR en relación a la CV plasm át ica y al recuento de células T CD4+ (basal y a dist intos t iem pos) fueron evaluadas con la prueba deKruskal-Wallis aplicando la corrección de Bonferroni. CV: carga v iral. a: el total de los pacientes excepto uno fue evaluado para el cam bio de CV a las 36 sem anas.

Cam bio a las 2 1 sem anas

Cam bio a las 4 1 sem anas

TABLA R5 . Respuesta virológica e inm unológica a HAART con lo pinavir respecto de los genot ipos de MDR1 y PXR

CV plasm át ica - m ediana, log 1 0 copias/ m l [ rango] Recuento de cé lulas T CD4 + - m ediana, % [ rango]

BasalCam bio a las 1 8

sem anasCam bio a las 3 6

sem anasGenot ipos


FI GURA R3 A

1236CC 1236CT 1236TT0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0p < 0 ,0 5

Cp

ost

-do

sis

de

lo

pin

avi

r (μg

/m

l)

MDR1 C1 2 3 6 T

1236CC 1236CT 1236TT0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

15.0

17.5

20.0p < 0 ,0 5

Cp

ost

-do

sis

de

lo

pin

avi

r (μg

/m

l)

MDR1 C1 2 3 6 T

FI GURA R3 B

1236CC 1236CT 1236TT-4

-3

-2

-1

0

1p < 0 ,0 5

cam

bio

de

CV

a l

as

36

se

ma

na

s (l

og

10

co

pia

s/m

l)

MDR1 C1 2 3 6 T

1236CC 1236CT 1236TT-4

-3

-2

-1

0

1p < 0 ,0 5

cam

bio

de

CV

a l

as

36

se

ma

na

s (l

og

10

co

pia

s/m

l)

MDR1 C1 2 3 6 T

FI GURA R3 . Efecto del SNP C1 2 3 6 T de MDR1 en la concent ración post - dosis

de lopinavir y en e l cam bio de la carga vira l

A. Las diferencias ent re los genot ipos C1236T de MDR1 en relación a la

concent ración post -dosis de lopinavir (μg/ m l) fueron evaluados con la prueba de

Kruskal-Wallis aplicando la corrección de Bonferroni. Se muest ran la mediana de

Cpost -dosis para cada genot ipo y el valor de p significat ivo.

63


B. Las diferencias ent re genot ipos C1236T de MDR1 en relación al cambio de la

carga viral plasmát ica a las 36 semanas post inicio de t ratam iento fueron calculadas

con la prueba de Kruskal-Wallis aplicando la corrección de Bonferroni. Se muest ran

la mediana de cambio de carga viral para cada genot ipo y el valor de p significat ivo.

CV: carga viral.

64


CAPI TULO 3 - N I VEL DE EXPRESI ÓN DE P- GP EN LI NFOCI T OS CD4 +

I V.7 . Puesta a punto del ensayo de citom et r ía de f lu jo

Con el objet ivo de evaluar los niveles de P-gp en linfocitos CD4+ se realizó la

puesta a punto del ensayo de citom et ría de flujo en base al t rabajo de Ford J et

al. (2003) . En el punto I I I .2.7 de la sección de Materiales y Métodos se

describen en detalle los pasos del protocolo. Brevem ente, para la m arcación de

P-gp en m em brana se ut ilizó un ant icuerpo m onoclonal de ratón ant i-P-gp

hum ana conjugado a PE (UI C2-PE) y la m arcación de células CD4+ se realizó

usando un ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a FI TC. Adem ás se ut ilizó un

ant icuerpo cont rol de isot ipo de rata conjugado a PE para calcular y corregir la

unión inespecífica a los linfocitos. Se part ió de un pellet de 8x105 PBMC aisladas

de sangre perifér ica m ediante gradiente de densidad, a las cuales se les agregó

fij ador celular e incubó durante 15 m inutos a tem peratura am biente. Luego de

un lavado con PBS 1X, se m arcaron 4x105 PBMC con UI C2-PE y ant icuerpo ant i-

CD4 conjugado a FI TC y por ot ra parte 4x105 PBMC con ant icuerpo cont rol de

isot ipo conjugado a PE y ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a FI TC. Se incubó

durante 90 m inutos a 4°C en oscuridad. Posteriorm en te, se realizaron dos

lavados y las células se resuspendieron en PBS 1X. Una vez realizada la

adquisición de los datos en el citóm et ro de flujo se realizó un análisis de los

m ism os m ediante el program a FlowJo. En un gráfico de dot plot de SSC

(com plej idad celular) en función de FSC ( tam año celular) se seleccionó la

población de linfocitos del total de PBMC (gate G1) ( f igura R4 A ) . A part ir de

los linfocitos seleccionados en este gate se realizó un grafico de SSC en función

de la intensidad de fluorescencia del ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a FI TC

65


(gate G2) ( f igura R4 B ) . Una vez seleccionada la población de linfocitos CD4+

se realiza un gráfico de dot plot para la intensidad de fluorescencia del

ant icuerpo conjugado a FI TC (CD4) en función de la intensidad de

fluorescencia del ant icuerpo conjugado a PE (P-gp) , en el cual se definen cuat ro

cuadrantes m ediante la aplicación de los ejes previam ente fij ados con la

m uest ra m arcada con el ant icuerpo cont rol de isot ipo conjugado a PE ( f igura

R4 C) . En el m ism o se determ inó el porcentaje e intensidad de fluorescencia

m edia ( I FM) de las células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ ( f igura

R4 D ) .

Se testearon diferentes volúm enes de ant icuerpo ant i-P-gp y ant icuerpo cont rol

de isot ipo y dist intos fij adores celulares a fin de determ inar las condiciones

adecuadas que nos perm itan detectar diferencias inter individuales en la

expresión de P-gp. La concent ración ópt im a de UI C2-PE fue determ inada

m ediante la realización de una curva de calibración, en la cual se ensayaron por

duplicado t res volúm enes diferentes del ant icuerpo (20 μl, 30 μl y 40 μl) . En la

f igura R5 se m uest ra la curva de calibración resultante, en la cual se observa

que el nivel de expresión de P-gp aum enta en form a lineal con la cant idad de

ant icuerpo UI C2-PE hasta llegar a una m eseta o plateau. La m enor cant idad de

ant icuerpo con la cual se alcanza el m ayor nivel de expresión de P-gp (35 μl de

ant icuerpo UI C2-PE) fue determ inada com o ópt im a y a ut ilizar en los

subsiguientes ensayos.

66


FI GURA R4 A FI GURA R4 B

G1G2

G1G2

FI GURA R4 C FI GURA R4 D

FI GURA R4 . Muest ra representa t iva del proceso de análisis

A. Dot plot para los valores de SSC (ordenadas) y FSC (abscisas) ut ilizado para la

selección de la población de linfocitos en una m uest ra de PBMC circunscripta en el

polígono (gate G1) .

B. Dot plot de las linfocitos seleccionados en el gate G1 para los valores de SSC

(ordenadas) e intensidad de fluorescencia del ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a

FI TC (abscisas) ut ilizado para la selección de la población de linfocitos CD4+

circunscripta en el polígono (gate G2) .

C y D. Dot plot de los linfocitos seleccionadas en el gate G2 para los valores de

intensidad de fluorescencia del ant icuerpo ant i-CD4 conjugado a FI TC (abscisas) e

intensidad de fluorescencia del ant icuerpo cont rol de isot ipo conjugado a PE

(ordenadas) (C) o ant icuerpo ant i-P-gp conjugado a PE (ordenadas) (D ) . Los

valores en cada cuadrante indican el porcentaje de células.

67


volum en de ant icuerpo UI C2 - PE ( μl)

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

15 20 25 30 35 40 45

IFM

de

P-g

p e

n

linfo

cito

s C

D4

+

volum en de ant icuerpo UI C2 - PE ( μl)

200

210

220

230

240

250

260

270

280

290

300

310

320

330

340

350

15 20 25 30 35 40 45

IFM

de

P-g

p e

n

linfo

cito

s C

D4

+

FI GURA R5 . Curva de ca libración para la de term inación de la concent ración

de ant icuerpo ant i- P- gp a ut ilizar para los ensayos de citom et r ía de f lu jo

Para la realización de la curva de calibración se ensayaron t res concent raciones

crecientes de ant icuerpo ant i-P-gp conjugado a PE por duplicado. En el gráfico se

m uest ran los duplicados ( rom bos negros) y el prom edio (cuadrados negros) de la

I FM de las células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ .

I V.8 . Efecto de los SNPs de MDR1 y PXR en e l n ive l de exp resión de

P- gp

Nuest ro siguiente objet ivo fue evaluar el efecto de los SNPs de MDR1 (T-129C,

C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en los niveles de expresión de P-gp en

linfocitos CD4+ . Para ello, se analizó un grupo de 40 individuos norm ales (grupo

cont rol) , de los cuales 14 eran niñas o m ujeres. La m ediana de edad de este

grupo cont rol fue de 19 años con un am plio rango de edad que fue desde los 10

m eses a los 57 años. Para todos los individuos del grupo cont rol se realizó la

genot ipificación de los SNPs de MDR1 y PXR y la determ inación de la expresión

de P-gp en linfocitos CD4+ por citom et ría de flujo. En la f igura R6 se muest ran

los gráficos del porcentaje de células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+

para cada uno de los genot ipos de MDR1 o PXR. Observam os que los niveles de

expresión de P-gp presentan una am plia variabilidad desde el 9 al 76% . Sin

68


em bargo, no se encont raron diferencias estadíst icamente significat ivas ent re los

genot ipos de los SNPs MDR1 C1236T, MDR1 C3435T y PXR C63396T en el nivel

de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ . Las m edianas de porcentaje de células

P-gp+ para los individuos hom ocigotas MDR1 1236CC, heterocigotas MDR1

1236CT y hom ocigotas MDR1 1236TT fueron de: 39±18% , 47±19% y 45±9% ,

respect ivam ente (p= 0,956) ( f igura R6 A ) . Para el SNP MDR1 C3435T se

observa gráficam ente, aunque sin significancia estadíst ica, que los individuos

hom ocigotas MDR1 13435CC presentan m ayores niveles de expresión de P-gp

que los heterocigotas MDR1 3435CT y estos, a su vez, m ayores niveles que los

hom ocigotas MDR1 3435TT, con m edianas de porcentaje de células P-gp+ de

49±16% , 44±18% y 32±17% , respect ivam ente (p= 0,260) ( f igura R6 B ) .

Finalm ente, las m edianas de porcentaje de células P-gp+ para los individuos

hom ocigotas PXR 63396CC, heterocigotas PXR 63396CT y hom ocigotas PXR

63396TT fueron de 41±19% , 36±18% y 54±16% , respect ivam ente (p= 0,513)

( f igura R6 C ) . Tam poco hallam os diferencias significat ivas en relación a la I FM

de las células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ ent re los genot ipos de los

SNPs MDR1 C1236T, MDR1 C3435T y PXR C63396T.

No pudim os evaluar el efecto del SNP MDR1 T-129C debido a que solo dos

individuos del total resultaron portadores del genot ipo MDR1 -129TC y no se

encont ró ningún individuo hom ocigota MDR1 -129CC.

69


FI GURA R6 A

1236CC 1236CT 1236TT0

25

50

75

100

( n= 1 1 ) ( n= 25 ) ( n= 4 )

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

MDR1 C1236T

FI GURA R6 B

3435CC 3435CT 3435TT0

25

50

75

100

( n= 12 ) ( n= 18 ) ( n= 10 )

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

MDR1 C3435T

70


FI GURA R6 C

63396CC 63396CT 63396TT0

25

50

75

100

( n= 13 ) ( n= 13 )( n= 14 )

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

PXR C63396T

FI GURA R6 . Efecto de los SNPs de MDR1 y PX R en e l n ive l de expresión de

P- gp

Las diferencias ent re los genot ipos para los SNPs MDR1 C1236T (A ) , MDR1 C3435T

(B) y PXR C63396T (C) en relación a los niveles de expresión de P-gp en linfocitos

CD4+ fueron evaluados con la prueba de Kruskal-Wallis. En cada grafico se muest ra

la mediana del porcentaje de células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ y el

núm ero de individuos para cada uno de los genot ipos.

I V.9 . I nf luencia de la edad en e l n ive l de expresión de P- gp

Poster iorm ente, nos propusim os invest igar la influencia de la edad en la

expresión de P-gp. Para ello, realizam os un análisis de correlación ent re los

niveles de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ y la edad al m om ento de la

determ inación por citom et ría de flujo en el grupo de individuos norm ales. Este

grupo cont rol esta com puesto por 20 individuos con un rango de edad de 10

m eses a 18 años que concurr ieron al Hospital Garrahan para la realización de

intervenciones quirúrgicas (norm ales “pediát r icos” ) y 20 donantes de sangre

71


adultos con un rango de edad de 19 a 57 años (norm ales adultos) .

Encont ramos que el porcentaje de células P-gp+ en la población de linfocitos

CD4+ aum enta gradualm ente desde los pr imeros m eses de vida hasta la edad

adulta (p< 0,0005; f igura R7 ) , sugir iendo un efecto significat ivo de la edad en

el nivel de expresión de P-gp. Sin em bargo, no observam os una correlación

significat iva ent re la edad y la I FM de las células P-gp+ .

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

Edad ( años)

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

Edad ( años)

FI GURA R7 . Corre lación ent re e l n ive l de expresión de P- gp y l a edad en

individuos norm ales

Se ut ilizó la prueba de correlación de rangos de Spearman para evaluar la relación

ent re el porcentaje de células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ y la edad al

momento de la determ inación por citomet ría de flujo en individuos normales.

I V.1 0 . I m pacto de la infección pediá t r i ca por HI V- 1 en e l n ive l de

expresión de P- gp

Nuest ro siguiente objet ivo fue determ inar si la infección pediát r ica por HI V-1

podría afectar el nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ . Para cum plir

este objet ivo se recolectaron m uest ras de sangre de 7 niños (5 niñas y 2 niños)

72


nacidos de m adres con serología posit iva para HI V-1 ent re el 2005 y el 2011

que concurr ieron al Hospital Garrahan para el diagnóst ico de la infección. Una

vez confirm ado el resultado posit ivo para la infección por HI V-1, a cada uno de

los pacientes se le realizó una determ inación de la expresión de P-gp en

linfocitos CD4+ por citom et ría de flujo en el periodo previo al inicio de la terapia

HAART. Ninguno de estos niños recibió alguna de las t res partes del régim en de

AZT del Protocolo 076 y el rango de edades de este grupo al m om ento de la

determ inación fue de 2 m eses a 5 años. Teniendo en cuenta los resultados

obtenidos en el grupo cont rol en relación al efecto de la edad en el nivel de

expresión de P-gp, se incluyeron 9 norm ales pediát r icos con un rango de

edades sim ilar al del grupo de niños infectados (10 m eses a 4 años) . Los niños

infectados por HI V-1 presentaron un porcentaje de células P-gp+ en la

población de linfocitos CD4+ significat ivam ente m ayor que los norm ales

pediát r icos, con m edianas de porcentaje de células P-gp+ de 80±25% y

32±15% , respect ivam ente (p< 0,0005; f igura R8 ) . No observam os diferencias

ent re el grupo cont rol y el de niños infectados por HI V-1 en relación a la I FM de

las células P-gp+ .

73


INFECTADOS NORM PED0

25

50

75

100

( n= 7 ) ( n= 9 )

NI ÑOS I NFECTADOS POR HI V-1

NORMALES PEDI ÁTRI COS

% d

e c

élu

las

P-g

p+

en

la

p

ob

laci

ón

de

lin

foci

tos

CD

4+

FI GURA R8 . Efecto de la infección pediá t r ica por HI V- 1 en e l n ive l de

expresión de P- gp

Se ut ilizó la prueba de Mann-Whitney para evaluar diferencias ent re los niños

infectados por HI V-1 y los normales pediát r icos en relación a los niveles de

expresión de P-gp en linfocitos CD4+ . En el grafico se m uest ra la m ediana del

porcentaje de células P-gp+ en la población de linfocitos CD4+ y el número de

individuos para cada uno de los grupos.

74

V - DI SCUSI ÓN

V - Discusión

En este t rabajo de Tesis Doctoral se estudió el im pacto de SNPs de MDR1 y PXR

en la infección pediát r ica por HI V-1, analizando su efecto en la t ransm isión

vert ical, la evolución clínica y la respuesta al t ratam iento ant irret roviral.

Dado que no existen reportes de la frecuencia de los SNPs de MDR1 (T-129C,

C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en población argent ina, nuest ro pr im er

objet ivo fue describir la dist r ibución genot ípica y alélica de los dist intos

polim orfism os para un grupo de donantes de sangre adultos con serología

negat iva para HI V-1. Encont ramos que los SNPs C1236T y C3435T de MDR1 y

C63396T de PXR son altam ente frecuentes, alcanzando una frecuencia del

45% . Existe un fuerte desequilibr io de ligam iento ent re los SNPs de MDR1,

C1236T y C3435T, definiendo nueve pares de haplot ipos, de los cuales los

pares de haplot ipos MDR1 3435CC/ 1236CC, MDR1 3435CT/ 1236CT y MDR1

3435TT/ 1236TT fueron los de m ayor ocurrencia con frecuencias m ayores al

12% . Cont rar iam ente, el alelo MDR1 -129C es m uy poco frecuente en la

población argent ina (5% ) y no se hallaron individuos hom ocigotas MDR1 -

129CC.

Han sido descriptas m arcadas variaciones en las frecuencias alélicas de los

SNPs de MDR1 y PXR ent re poblaciones con dist into or igen étnico. El alelo

MDR1 3435T presenta frecuencias sim ilares ent re caucásicos (~ 47% )

[ Hoffm eyer S et al. , 2000; Furuno T et al. , 2002; Bernal ML et al. , 2003] y

asiát icos (~ 44% ) [ Am eyaw MM et al. , 2001; Kom oto C et al. , 2006] , m ient ras

que es m enos frecuente ent re descendientes de afr icanos (~ 19% ) [ Am eyaw

MM et al. , 2001] . La com posición étnica de la población argent ina es

considerada “hispano-caucásica” y esta pr incipalm ente com puesta por

75

V - Discusión

descendientes de caucásicos, con m uy poca de m ezcla con afr icanos y asiát icos.

En concordancia, las frecuencias del alelo MDR1 3435T en la población

argent ina (44% ) son sim ilares a las previam ente reportadas en poblaciones

caucásicas de Alem ania (48% ) , I talia (46% ) y España (48% ) [ Hoffm eyer S et

al. , 2000; Furuno T et al. , 2002; Bernal ML et al. , 2003] , pero fueron

significat ivam ente diferentes de las reportadas en poblaciones afr icanas

(afroam ericanos: 16% , Kenia: 17% , Ghana: 17% , Sudan: 27% ) (p< 0,05) .

Adem ás, no se observaron diferencias significat ivas en la dist r ibución de las

variantes génicas C3435T de MDR1 ent re nuest ra población y poblaciones de

Asia (Japón: 41% y China: 47% ) [ Ameyaw MM et al. , 2001; Kom oto C et al. ,

2006] . La frecuencia del SNP MDR1 C1236T solam ente fue reportada en

poblaciones alem ana (48% ) [ Hoffm eyer S et al. , 2000] y japonesa (66% )

[ Komoto C et al. , 2006] . Las frecuencias encont radas en la población argent ina

(44% ) fueron sim ilares a las del grupo caucásico pero significat ivam ente

diferentes de las encont radas en la población asiát ica (p< 0,05) . La frecuencia

alélica del SNP MDR1 T-129C varia am pliam ente ent re dist intas poblaciones,

siendo del 3% en italianos [ Furuno T et al. , 2002] , 8% en japoneses [ Tanabe M

et al. , 2001] y 21% en afr icanos [ Parathyras J et al. , 2009] . La frecuencia

hallada en la población argent ina (5% ) fue sim ilar a la reportada en los grupos

caucásico y asiát ico pero significat ivamente diferente de la frecuencia de

población afr icana (p< 0,05) . Finalm ente, el alelo PXR 63396T fue m enos

frecuente en la población argent ina (46% ) en com paración a las poblaciones de

origen español (57% ) e italiano (63% ) [ Schipani A et al. , 2010] . Adem ás, las

frecuencias del alelo PXR 63396T reportadas para grupos afr icanos de Ghana

(39% ) y Kenia (45% ) fueron sim ilares a la frecuencia encont rada en nuest ro

grupo [ Schipani A et al. , 2010] .

76

V - Discusión

Establecida la frecuencia de los SNPs de MDR1 y PXR en población argent ina,

evaluam os su rol en la infección por HI V-1. Pocos estudios analizaron el efecto

de las variantes genét icas de MDR1 en la suscept ibilidad al HI V-1 y la m ayoría

exploró cohortes adultas. En nuest ro estudio no encont ram os diferencias

significat ivas ni en la dist r ibución genot ípica ni en las frecuencias alélicas de los

polim orfism os T-129C, C1236T y C3435T de MDR1 o C63396T de PXR ent re los

niños infectados por HI V-1 y los niños expuestos no infectados, dem ost rando

que estos SNPs no influencian la suscept ibilidad a la infección natural por HI V-1

adquir ida por t ransm isión vert ical. Nuest ros hallazgos concuerdan con los de

I fergan I et al. (2002) , quienes no observaron diferencias significat ivas en las

frecuencias alélicas del SNP MDR1 C3435T ent re adultos infectados por HI V-1

(que adquir ieron la infección por contacto hom osexual o uso de drogas

inyectables) y adultos caucásicos altam ente expuestos (por t ransm isión sexual

o parenteral) no infectados. En cont raste, Kedm i M et al. (2007) encont raron

una m ayor frecuencia del alelo MDR1 3435C en una cohorte de adultos

infectados por HI V-1 (caucásicos y de Et iopía) en com paración con el grupo de

cont roles con serología negat iva para HI V-1. Sin embargo, el estudio no incluyó

individuos expuestos al HI V-1 no infectados y las vías de t ransm isión no fueron

especificadas.

Nuest ro próxim o objet ivo fue invest igar la im plicancia de las variantes

genét icas de MDR1 (T-129C, C1236T y C3435T) y PXR (C63396T) en la

progresión a la enferm edad en niños infectados por t ransm isión vert ical.

Dem ost ram os que la heterocigosidad para los polim orfism os MDR1 C1236T y

MDR1 C3435T y la hom ocigosidad MDR1 1236TT ret rasan significat ivam ente la

progresión a SI DA pediát r ico. No hay estudios realizados en población infant il

77

V - Discusión

en relación a la progresión a la enferm edad. Saitoh A et al. (2005) tam bién

reportaron un rol protector del genot ipo MDR1 3435CT, observando que los

niños heterocigotas presentan una respuesta virológica a HAART m ás rápida y

una m ayor concent ración de nelfinavir (PI ) com parado con los hom ocigotas

MDR1 3435CC. Nuest ros resultados sugieren que la heterocigosidad MDR1

3435CT predeciría una ventaja (heterosis) en relación al curso de la infección

por HI V-1. El fenóm eno de heterosis es frecuente en hum anos y podría ocurr ir

en m ás del 50% de todas las asociaciones de genes [ Com ings DE et al. , 2000] .

Recientem ente, fue propuesto un ejem plo de heterosis por Hellem ann D et al.

(2007) , m ost rando que la heterocigosidad de los alelos de la lect ina ligadora de

m anosa (MBL2) estaría significat ivam ente asociada con el aum ento de

sobrevida en pacientes en cuidado intensivo com parado con los individuos wild

type y hom ocigotas m utantes, en respuesta tanto a infecciones severas com o a

inflam ación aguda.

El efecto protector revelado por los heterocigotas MDR1 3435CT fue aun m ás

pronunciado en el contexto de los pares de haplot ipos que cont ienen el alelo

MDR1 1236T. Los niños portadores del par de haplot ipos MDR1 3435CT/ 1236TT

presentaron un m ayor ret raso en el t iem po de progresión a SI DA que los niños

portadores del par de haplot ipos MDR1 3435CT/ 1236CT. Adem ás, se

observaron tendencias sim ilares cuando se realizó el análisis en el periodo

previo al inicio de HAART o fue ajustado con la edad al inicio de HAART y la

duración de HAART, indicando que la terapia ant irret roviral no sería un factor

confundente del efecto de los SNPs C3435T y C1236T de MDR1 sobre el curso

de la infección por HI V-1. En cont raste con nuest ros hallazgos, dos estudios de

cohortes de adultos no encont raron ninguna asociación ent re el SNP MDR1

78

V - Discusión

C3435T y la progresión a la enferm edad [ Bleiber G et al. , 2004; Hendrickson SL

et al. , 2008] . No obstante, los puntos de corte clínico fueron diferentes a los

evaluados en este estudio. Uno de ellos m idió el t iem po necesario para que el

recuento de células T CD4+ dism inuya de 500 a 200 células/ m l previo al inicio

del t ratam iento [ Bleiber G et al. , 2004] y el ot ro estudio consideró la progresión

a SI DA post inicio de HAART [ Hendrickson SL et al. , 2008] . En nuest ro estudio

no nos fue posible analizar el efecto de los SNPs de MDR1 y PXR sobre la

progresión a SI DA post inicio de HAART debido al rest r ingido núm ero de

eventos durante el periodo de estudio (n= 26) . Resulta difícil com parar ent re los

dist intos reportes, dadas las discrepancias ent re las poblaciones estudiadas,

incluyendo origen étnico, tam año m uest ral y diseño del estudio en cohortes

pediát r icas y de adultos, así com o diferentes puntos de corte clínico de la

progresión a la enfermedad y regim enes ant irret rovirales.

Dado que los alelos CCR5-Δ32 y SDF1–3´ A pueden afectar la progresión a SI DA

pediát r ico [ Misrahi M et al. , 1998; Mangano A et al. , 2000; Tresoldi E et al. ,

2002] , testeam os la im plicancia de estos polim orfism os com o factores

genét icos confundentes del efecto de los SNPs de MDR1 en la progresión a

SI DA, sin hallar diferencias significat ivas.

Diferentes hipótesis han t ratado de explicar la posible relación ent re P-gp y

HI V-1, incluyendo la interacción ent re P-gp y ot ras proteínas de m em brana. Se

reportó una fuerte correlación posit iva ent re el nivel de expresión de CXCR4

(coreceptor del HI V-1) y P-gp y la colocalización de estas proteínas en

m em brana de linfocitos [ Owen A et al. , 2004 a] . El aum ento de la expresión de

CXCR4 fue asociada con una em ergencia de cepas de HI V m ás patogénicas, la

79

V - Discusión

cual, en com binación con una concom itante m ayor expresión de P-gp, podría

favorecer el surgim iento en estas células de virus m enos sensibles a drogas

ant irret rovirales específicas y de esta m anera cont r ibuir a la aceleración de la

progresión a la enferm edad. En form a sim ilar a CXCR4, ot ra proteína de

m em brana que colocaliza y coprecipita con P-gp es Caveolina 1 (CAV-1) , lo cual

podría indicar una interacción ent re estas dos proteínas [ Cai C et al. , 2004] .

CAV-1 es una proteína m uy pequeña (22 kDa) y uno de los com ponentes

pr incipales ( junto con CAV-2 y CAV-3) de las Caveolas, com únm ente llam adas

“parches lipídicos” ( lipid rafts) , que son regiones r icas en colesterol y

esfingolípidos que form an m icrodom inios en m em brana resistentes a

detergentes. Ent re las m últ iples funciones de CAV-1, una de las m ás

im portantes es su im plicancia en la t ransducción de señales, pero tam bién se la

ha asociado con procesos de t ranscitosis y endocitosis. Por ot ra parte, en

estudios con células 293T cot ransfectadas con HI V y CAV-1 se observó una

reducción de la replicación viral [ Llano M et al. , 2002] . Resulta difícil diferenciar

ent re los efectos de P-gp sobre la dinám ica viral y aquellos producidos por

proteínas asociadas a P-gp. La interacción directa ent re P-gp y CXCR4 o CAV-1

podría afectar la replicación del HI V-1, interfir iendo con los procesos de ent rada

y liberación de las part ículas virales, respect ivamente. Teniendo en cuenta esta

evidencia, podem os suponer que los portadores de los genot ipos protectores de

MDR1 podrían m odular el curso clínico de la infección por HI V-1 a t ravés de P-

gp. Sin em bargo, se necesitan m ás estudios para corroborar esta hipótesis.

Ot ro de los objet ivos de este t rabajo de Tesis fue evaluar el efecto de los

polim orfism os T-129C, C1236T y C3435T de MDR1 y C63396T de PXR en la

respuesta al t ratam iento ant irret roviral. Para ello, en un subgrupo de pacientes

80

V - Discusión

infectados por HI V-1 que recibían LPV/ r com o parte del régim en HAART se

realizó un estudio farm acogenét ico analizando los niveles plasm át icos de LPV y

la respuesta virológica e inm unológica. Encont ram os que solo la

heterocigosidad para el polim orfism o C1236T de MDR1 esta asociada

significat ivam ente con un m enor nivel de LPV y una m ayor carga viral,

sugir iendo que sería un factor genét ico de r iesgo en la respuesta a esta droga.

Diversos estudios analizaron la influencia del SNP MDR1 C3435T en la

respuesta ant irret roviral; sin em bargo, su rol sigue siendo poco claro. Nuest ros

resultados concuerdan con un estudio reciente de Rakhm anina NY et al. (2011) ,

quienes no encont raron diferencias significat ivas en el área bajo la curva y en el

clearance de LPV ent re los genot ipos de MDR1 C3435T y G2677T en una

cohorte de niños infectados por HI V-1 de or igen predom inantem ente

afroam ericano. Ot ros estudios realizados en adultos m ost raron resultados

sim ilares cuando se evaluó la concent ración valle de LPV [ Winzer R et al. , 2003;

Ma Q et al. , 2007; Est rela R de C et al. , 2009] .

I nicialm ente, Fellay J et al. (2002) hallaron que adultos infectados por HI V-1

hom ocigotas MDR1 3435TT presentan la m ejor recuperación del recuento de

células T CD4+ luego de un periodo de 24 sem anas post inicio de HAART.

Luego, Saitoh A et al. (2005) , estudiando un grupo de pacientes pediát r icos,

encont raron que los heterocigotas MDR1 3435CT presentan la m ayor reducción

de la carga viral a las 8 sem anas del inicio de HAART. Sin em bargo, varios

estudios en cohortes de adultos no pudieron corroborar estos hallazgos

[Brum m e ZL et al. , 2003; Haas DW et al. , 2003; Nasi M et al. , 2003; Zhu D et

al. , 2004; Verstuyft C et al. , 2005; Winzer R et al. , 2005; Hendrickson S et al. ,

81

V - Discusión

2008; Parathyras J et al. , 2009]. Nosot ros no hallam os una asociación del SNP

MDR1 C3435T con la respuesta inm unológica o virológica a HAART con LPV/ r.

Hasta el m om ento, la m ayor parte de la evidencia apoya la idea de que el SNP

MDR1 C3435T no parecería tener un efecto en la respuesta virológica o

inm unológica a la terapia ant irret roviral.

El SNP MDR1 C3435T presenta un fuerte desequilibr io de ligam iento con el SNP

MDR1 C1236T en el exón 12 [ Kim RB et al. , 2001] . Por eso, analizam os la

influencia de este SNP en los niveles plasm át icos de LPV y en la respuesta

virológica e inm unológica. Sorprendentem ente, encont ram os que los niños

heterocigotas MDR1 1236CT presentan una concent ración plasm át ica de LPV

(Cpost -dosis) significat ivam ente m enor en com paración con los homocigotas MDR1

1236TT, pudiendo ser un factor de r iesgo para la falla v irológica o el desarrollo

de resistencia ant irret roviral. Por ot ra parte, nosot ros no observam os una

asociación significat iva ent re los genot ipos del SNP MDR1 C1236T y la Cvalle de

LPV, de form a sim ilar a un estudio realizado por Est rela R de C et al. (2009) en

hom bres adultos brasileros infectados por HI V-1. Adem ás, la Porte CJ et al.

(2007) no encont raron una correlación significat iva ent re este polim orfism o y la

concent ración m áxim a de saquinavir (PI ) en voluntarios adultos sanos.

Tam bién observam os que los niños heterocigotas MDR1 1236CT t ienen una

m enor reducción de la carga viral a las 36 sem anas del inicio de t ratam iento

con LPV/ r en com paración con los hom ocigotas MDR1 1236CC. Sin em bargo, no

encont ram os un im pacto del SNP MDR1 C1236T en la respuesta inm unológica

com o fue reportado en el grupo de adultos estudiado por Parathyras J et al.

(2009) . Por el cont rar io, Zhu D et al. (2004) reportaron que los pacientes con el

82

V - Discusión

genot ipo MDR1 1236CC m uest ran un m enor aum ento del recuento de células T

CD4+ al m es y a los 9 m eses del inicio de HAART respecto de los pacientes con

el genot ipo MDR1 1236TT, sin hallar diferencias en las tasas de supresión viral.

La pr incipal diferencia con nuest ro estudio es que en el análisis llevado a cabo

por Zhu D et al. (2004) se incluyó un grupo de pacientes adultos que recibieron

diferentes com binaciones de t ratam ientos con PI como parte de HAART,

m ient ras que en nuest ra cohorte se usó LPV/ r com o únicos PI .

La expresión de MDR1 esta regulada por el factor de t ranscripción nuclear PXR,

en respuesta a endobiót icos y xenobiót icos. El polim orfism o C63396T de PXR

fue recientem ente ident ificado [Lam ba J et al. , 2008] y asociado con niveles de

atazanavir (PI ) por debajo de la concent ración m ínim a efect iva (150 ng/ m l) en

una cohorte de adultos caucásicos infectados por HI V-1 [Siccardi M et al. ,

2008]. Sin em bargo, nosot ros no observam os un efecto de este SNP en la

concent ración plasm át ica valle y post -dosis de LPV o la respuesta a la terapia

en niños infectados por HI V-1. Son necesarios m ás estudios para determ inar el

potencial impacto de PXR com o m odificador de la respuesta a la terapia

ant irret roviral.

Com o se m encionó anteriorm ente, se debe tener en cuenta que diversos

factores com o la etnia, la edad, los regim enes de HAART y el cr iter io aplicado

para el análisis de la respuesta inm unológica y virológica a la terapia (ejem plo:

puntos de t iem po evaluados antes y después del t ratam iento) dificultan la

realización de una com paración adecuada ent re los estudios farmacogenét icos.

83

V - Discusión

Nuest ros hallazgos sugieren que el SNP MDR1 C1236T puede m odificar los

niveles plasm át icos de LPV y la respuesta virológica a HAART. A pesar de que el

efecto de SNP MDR1 C1236T en la expresión y/ o act ividad de P-gp no ha sido

claram ente establecida, hipotet izam os que los portadores del genot ipo MDR1

1236CT podrían tener un nivel de expresión/ act ividad de P-gp alterado en

enterocitos que lim itaría la absorción de LPV y consecuentem ente reduciría su

concent ración en células T CD4+ , provocando una m enor dism inución de la

carga viral.

Finalm ente, evaluam os si los SNPs de MDR1 (C1236T y C3435T) y PXR

(C63396T) , la edad y la infección pediát r ica por HI V-1 afectan el nivel de

expresión de P-gp en linfocitos CD4+ . La asociación ent re el polim orfism o

C3435T de MDR1 y la expresión o act ividad de P-gp ha sido am pliam ente

invest igada. I nicialm ente, Hoffm eyer S et al. (2000) reportaron que los

individuos portadores del genot ipo hom ocigota MDR1 3435TT m uest ran

m enores niveles de expresión de P-gp en duodeno y m enor act ividad del

t ransportador (m ayor concent ración plasm át ica de digoxina) respecto de los

individuos hom ocigotas MDR1 3435CC. Adem ás, Hitzl M et al. (2001) m ost raron

que los individuos hom ocigotas MDR1 3435TT presentan niveles de expresión

de ARNm de MDR1 y act ividad de P-gp (m ayor eflujo de rodam ina 123) en

células natural killer CD56+ significat ivamente m enores que los individuos

hom ocigotas MDR1 3435CC. Estos resultados fueron confirm ados por Owen A

et al. (2004 a) al evaluar el nivel de expresión de P-gp en PBMC m ediante

ensayos de citom et ría de flujo. Sin em bargo, ot ros estudios realizados en

m uest ras de placenta e hígado no hallaron una asociación significat iva ent re el

SNP C3435T de MDR1 y la expresión de P-gp [Tanabe M et al. , 2001; Owen A et

84

V - Discusión

al. , 2005 b]. En este estudio no hallam os evidencia de un efecto significat ivo de

los polim orfism os sinónim os C1236T y C3435T de MDR1 en el nivel de

expresión de P-gp en linfocitos CD4+ en un grupo de individuos norm ales que

incluyó niños y adultos. Mas aún, Kim chi-Sarfaty C et al. (2007) realizaron

ensayos in vivo de expresión t ransiente de P-gp wild type o polim órfica en

células HeLa, a part ir de los cuales concluyeron que ni el SNP MDR1 C1236T ni

el SNP MDR1 C3435T alteran el nivel de expresión de ARNm MDR1 o de la

proteína P-gp. Sin em bargo, detectaron diferencias en la conform ación del

t ransportador, hipotet izando que la sust itución de codones “ frecuentes” por

codones “poco frecuentes” (com o ocurr ir ía en presencia de polim orfism os

sinónim os) podría afectar la cinét ica de los procesos cot raduccionales de

plegam iento e inserción en m em brana de P-gp, alterando la est ructura de los

sit ios de interacción con el sust rato.

Por ot ra parte, Owen A et al. (2004 b) m ost ró una correlación posit iva ent re los

niveles de expresión de ARNm de MDR1 y PXR, sugir iendo que el nivel de

expresión de genes blanco de PXR podría estar directam ente determ inado por

el nivel de expresión de este factor de t ranscripción. Adem ás, el alelo PXR

63396T ha sido asociado con un m ayor nivel de expresión de ARNm PXR en

hígado de donantes adultos [ Lam ba J et al. , 2008] . Sin em bargo, nuest ro

estudio no m ost ró un efecto significat ivo del SNP PXR C63396T en el nivel de

expresión de P-gp en linfocitos CD4+ de individuos norm ales.

I nvest igam os si la edad podría afectar el nivel de expresión de P-gp en

linfocitos CD4+ . Encont ram os una fuerte correlación posit iva ent re la edad y el

porcentaje de células P-gp+ en un grupo de individuos norm ales. La expresión

85

V - Discusión

de la proteína fue m enor en niños desde los 10 m eses de vida y aum entó

gradualm ente en adultos hasta los 57 años. Estos resultados son consistentes

con ot ros estudios [Aggarwal S et al. , 1997; Giraud C et al. , 2010]. Aggarwal S

et al. (1997) reportaron que los individuos jóvenes presentan un nivel de

expresión de ARNm de MDR1 y P-gp y act ividad del t ransportador en linfocitos

CD4+ significat ivam ente m enor que en los individuos adultos. Este hallazgo fue

confirm ado por un análisis reciente que incluyó niños recién nacidos hasta

adultos m ayores de 18 años [Giraud C et al. , 2010].

Ent re los estudios que analizaron el im pacto de la edad en la función de P-gp en

linfocitos CD4+ tam bién existen grandes discrepancias [Pilarski LM et al. , 1995;

Machado CG et al. , 2003; Giraud C et al. , 2009]. Mient ras que Machado CG et

al. (2003) m ost raron una dism inución progresiva de la act ividad del

t ransportador desde el nacim iento hasta la edad adulta, Giraud C et al. (2009)

dem ost ró una alta act ividad de P-gp en niños recién nacidos que dism inuye con

la edad hasta los 2 años para luego m antenerse constante hasta la adultez. La

falta de correlación ent re los reportes que analizaron la expresión de MDR1 o P-

gp y aquellos que evaluaron la act ividad de la proteína podría relacionarse con

m ecanism os de regulación post t ranscripcional que necesitan ser esclarecidos.

La asociación observada en este estudio t iene im plicancias en la eficacia del

t ratam iento ant irret roviral adm inist rado en niños, quienes, debido a su m enor

nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ , podrían experim entar los r iesgos

asociados a una sobreexposición a m oléculas terapéut icas que son sust rato de

este t ransportador. A pesar de presentar concent raciones plasm át icas sim ilares,

86

V - Discusión

la concent ración int racelular de la droga en linfocitos CD4+ podría ser m enor en

niños que en adolescentes y adultos.

En este estudio prelim inar dem ost ram os que los niños infectados por HI V-1

expresan m ayores niveles de P-gp en linfocitos CD4+ que los norm ales

pediát r icos con sim ilar rango de edad. Más aun, todos los pacientes evaluados

en nuest ro estudio fueron naive de t ratam iento al mom ento de la

determ inación por citom et ría de flujo, perm it iéndonos analizar más claram ente

el rol de la infección en la expresión de P-gp, sin el efecto confundente de la

terapia ant irret roviral. Sim ilarm ente, Gollapudi S et al. (1990) encont raron que

la infección de HI V-1 induce un aum ento en la expresión de P-gp en líneas de

células T y m onocitos. Adem ás, Malorni W et al. (1998) observó un aum ento de

la expresión de P-gp en linfocitos CD4+ de donantes sanos luego de 24 hs de

exposición de estas células a la glicoproteína gp120 de HI V. Estos resultados

fueron confirm ados por Andreana A et al. (1996) , en un estudio realizado en un

grupo de adultos infectados por HI V-1, quienes presentaron un m ayor nivel de

expresión de P-gp, pero m enor act ividad, en linfocitos CD4+ y CD8+ respecto de

los individuos cont rol. En cont raste, Meaden ER et al. (2001) encont raron que

los niveles de expresión de P-gp en PBMC de individuos infectados por HI V-1

son significat ivam ente m enores que en voluntarios sanos. Sin em bargo, a

diferencia de nuest ro estudio, ellos evaluaron un grupo de adultos infectados

bajo t ratam iento y los niveles de la proteína fueron expresados en I FM de las

células P-gp+ . Nosot ros no observam os diferencias en relación a la I FM, y sí en

el porcentaje de las células P-gp+ de la población de linfocitos CD4+ , sugir iendo

que es el núm ero de células expresando P-gp, y no el núm ero de m oléculas de

87

V - Discusión

proteína por célula, lo que podría estar siendo afectado tanto por la edad com o

por la infección por HI V-1.

En conjunto, nuest ros hallazgos sugieren que el polim orfism o C1236T de MDR1

ejercería efectos cont rapuestos en la infección pediát r ica por HI V-1, al cum plir ,

por un lado, un rol protector en la progresión a SI DA y, por el ot ro, reducir la

eficacia de la terapia ant irret roviral, asociándose con m enores niveles de droga

en plasm a y una m enor respuesta virológica.

88

VI - CONCLUSI ONES

VI - Conclusiones

1. Nuest ros resultados dem uest ran que los polim orfism os MDR1 C1236T y

MDR1 C3435T ret rasarían la progresión a SI DA pediát r ico, aun en el periodo

previo al inicio de HAART, sugir iendo que P-gp jugaría un rol im portante en la

infección por HI V-1 independientem ente de su función en el t ransporte de

drogas.

2. Ninguno de los SNPs de MDR1 o PXR analizados en este estudio parece

influenciar la t ransm isión perinatal del HI V-1.

3. El polimorfism o C1236T de MDR1 se asocia con una m enor la concent ración

plasm át ica de lopinavir y una m ayor carga viral, pudiendo ser un factor de

r iesgo para la falla virológica o el desarrollo de resistencia ant irret roviral.

4. Los SNPs de MDR1 o PXR no se asociaron con diferencias en los niveles de

expresión de P-gp en linfocitos CD4+ .

5. La edad y la infección pediát r ica por HI V-1 podrían ser dos factores claves de

la determ inación del nivel de expresión de P-gp en linfocitos CD4+ .

89

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Anexo

Droga Sust rato I nhibidor I nductorAgentes ant icancer ígenos

Act inom icina D x

Daunorubicina x

Docetaxel x

Doxorubicina x

Etopósido x

Im at inib x

I r inotecan x

Mitom icina C x

Mitoxant rona x

Paclitaxel x

Tenipósido x

Topotecán x

Vinblast ina x

Vincrist ina x

Agentes ant ih iper tensivosCarvedilol x

Celiprolol x

Dilt iazem x

Losartan x

Nicardipina x

Reserpina x

Talinolol x

Agentes ant ir r ítm icosAm iodarona x

Digoxina x

Propafenona x

Quinidina x x

Verapam ilo x x

EsteroidesAldosterona x

Cort isol x

Dexam etasona x x

Met ilprednisolona x

Ant ibiót icosClarit rom icina x

Erit rom icina x x

Levofloxacina x

Rifam pina x x

Sparfloxacina x

Tet raciclina x

Ant im icót icosI t raconazol x x

Ketoconazol x

Ant iácidosCim et idina xRanit idina x

TABLA A1 . Sust ratos, inhibidores e inductores de P- gp( tabla adaptada de Marzolini C et al ., 2004)

111

Anexo

Droga Sust rato I nhibidor I nductorI nm unosupresores

Ciclosporina x x

Sirolim us x x

Tacrolim us x x

Valspodar x x

Ant idepresivosAm it r ipt ilina x

Fluoxet ina x

Hierba de San Juan x

Paroxet ina x

Sert ralina x

Neurolépt icosClorprom azina x

Fenot iazina x

Flupent ixol x

Ant iepilépt icosFenobarbital x

Fenitoína x

OpioidesMetadona x

Morfina x x

Pentazocina x

Ant iem ét icosDom peridona x

Ondanset rón x

I nhibidores de proteasaAm prenavir x x

Atazanavir x x x

Indinavir x x x

Lopinavir x x

Nelfinavir x x x

Ritonavir x x x

Saquinavir x x x

OtrosAcido ret inóico x

Atorvastat ina x x

Brom ocript ina x

Colchicina x

Dipir idam ol x

Em et ina x

Fexofenadina x

I verm ect ina x

Loperam ida x

Mefloquina x x

Progesterona x

Rodam ina 123 x

Espironolactona x

Terfenadina xVecuronium x

Cont inuación de TABLA A1

112

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