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ImmuGlo ISLET CELLANTIBODY (ICAb) TEST SYSTEM

PRODUCT INSERT

Code 1123 40 Determinations

INTENDED USEAn indirect immunofluorescence test for the detection and semi-quantitation of islet cellantibodies in human serum to aid in the diagnosis of insulin dependent diabetes mellitus(IDDM).

SUMMARY AND EXPLANATIONDiabetes is a chronic and complex metabolic disease influenced by various hereditary andenvironmental factors that result in the inability of the body to maintain the use of carbohydrates,fats and proteins. The condition, characterized by high blood glucose levels, is caused by adeficiency in insulin production or an impairment of insulin utilization. Most cases of diabetesfall into two clinical categories: insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM or Type I diabetes)and non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM or Type II diabetes).Prognosis, treatment and disease management are different for each type. It is well acceptedthat IDDM is an autoimmune disease targeting -cells of the islets of Langerhans in thepancreas. The autoimmune response to islet cell antigens elicits antibody responses toantigens such as glutamic acid decarboxylase (GAD), ICA-512 and insulin. They have beenfound to be highly predictive markers, particularly if present in high titer1-15. Detection of theseICAb's by indirect immunofluorescence (IF) on pancreas substrate is considered the goldstandard for diagnosis of IDDM16,17. These cytoplasmic ICAb's are currently used for theprediction of type I diabetes18-20.ICAb's are detected in up to 90% of newly diagnosed diabetic patients. In the Bart's-Windsorfamily study, 100% of the first degree relatives of IDDM patients with ICAb's >80 JDF unitsprogressed to IDDM within 10 years. The level of ICAb's appears to be highest prior to the onsetof Type I diabetes and diminishes progressively thereafter12,18. ICAb's have several distinctspecificities and show two major patterns of reactivity4. The first pattern is restricted predominantlyto the -cells. The second stains all cells within the islet, and is the classical staining pattern forcytoplasmic ICAb's.

PRINCIPLES OF PROCEDURESIslet cell antibodies are detected by indirect immunofluorescence (IF). In this method, patientssera are incubated on sections of monkey pancreas to allow binding of antibodies to thetissue substrate. Any antibodies not bound are removed by rinsing. Bound antibodies of theIgG class are detected by incubation of these sections with fluorescein-labeled conjugates.Reactions are observed under a fluorescence microscope equipped with appropriate filters.The presence of islet cell antibodies is demonstrated by an apple green fluorescence ofthe cytoplasm of the islets of Langerhans. The titer (the reciprocal of the highest dilutiongiving a positive reaction) is then determined by testing serial dilutions of the positivecontrol21.

PRODUCT INFORMATION

Storage and PreparationStore all reagents at 2-8C. Reagents are ready for use after equilibration to room temperature.

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Materials Provided

ImmuGlo anti-Islet Cell IFA 1123

Kits contain sufficient reagents to perform 40 determinations each.

10 x SORB SLD 4 well Monkey Pancreas Substrate Slides

1 x 0.5 ml CONTROL + ICA * ICA Positive Control. Human serumcontaining islet cell antibodies, standardizedagainst the JDF (Juvenile Diabetes Founda-tion) positive reference serum. JDF unitsare stated on the vial label.

1 x 0.5 ml CONTROL - * Negative Control. Contains human serum.

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * Anti-human FITC Conjugate. Protectfrom light.

1 x 5.0 ml CONJ B * Conjugate B. Protect from light.

1 x 60 ml BUF * Sample Diluent.

2 vials BUF WASH Phosphate Buffered Saline (PBS). Dissolveeach vial to 1 liter.

1 x 5.0 ml MOUNTING MEDIUM * Mounting Medium. Do not freeze.

1 x 1.0 ml EVANS Evans Blue Counterstain.

1 x 12 COVER SLD Coverslips. Reconstitute to one liter each.

* Contains < 0.1% NaN3

Materials Required But Not ProvidedFluorescence microscopeMicropipette or Pasteur pipetteSerological pipettesStaining dish (e.g. Coplin jar)Small test tubes (e.g. 13 x 75 mm) and test tube rackDistilled or deionized water1 liter containerWash bottlePaper towelsIncubation chamber

WARNINGS AND PRECAUTIONSFor in vitro Diagnostic Use. All human derived components used have been tested for HbsAg,HCV, HIV-1 and 2 and HTLV-I and found negative by FDA required tests. All human serumspecimens and human derived products should be treated as potentially hazardous, regard-less of their origin. Follow good laboratory practices in storing, dispensing and disposing ofthese materials22.

WARNING - Sodium azide (NaN3) may react with lead and copper plumbing to form highlyexplosive metal azides. Upon disposal of liquids, flush with large volumes of water toprevent azide buildup. Sodium azide may be toxic if ingested. If ingested, report incidentimmediately to laboratory director or poison control center.

Instructions should be followed exactly as they appear in this insert to ensure valid results.Do not interchange kit components with those from other sources other than the samecatalog number from IMMCO. Do not use beyond expiration date.

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SPECIMEN COLLECTION AND HANDLING

Only serum specimens should be used for this procedure. Grossly hemolyzed, lipemic ormicrobially contaminated specimens may interfere with the performance of this test andshould not be used. Store specimens at 2-8C for no longer than one week. For longerstorage, serum should be frozen at -20C. Avoid repeated freezing and thawing of samples.

PROCEDURE

Test MethodA. Screening1. Dilute each patient serum 1:5 with the Sample Diluent provided (0.1 ml serum + 0.4 ml

Diluent). Do not dilute Positive or Negative Controls. Save the undiluted sera to deter-mine antibody titers if screening tests are found to be positive.

2. Allow pouches containing substrate slides to equilibrate to room temperature for 10-15minutes. Carefully remove the slides without touching the substrate.

3. Label the slides and place them in an incubation chamber lined with paper towelsmoistened with water to prevent drying.

4. Invert dropper vial and gently squeeze to apply 1 drop (approximately 50 l of theNegative Control to well #1. Similarly apply 1 drop of Positive Control to well #2. Avoidoverfilling the wells.

5. Using a micropipette or Pasteur Pipette, apply 1 drop of patients diluted serum (approxi-mately 50 l) to the other wells. Avoid overfilling the wells.

6. Place the lid on the incubation chamber and incubate slides 18 - 24 hours at roomtemperature.

7. Remove a slide from the incubation chamber. Hold slide at tab end and rinse gently withapproximately 10 ml PBS using a pipette, or rinse slide in beaker filled with PBS. Do notuse wash bottle. Transfer slide immediately into Coplin jar and wash 10 minutes.Repeat process with all remaining slides.

8. Remove slide(s) from Coplin jar. Blot the edge of the slide on a paper towel to removeexcess PBS. Place the slide in the incubation chamber. Immediately invert the IgG FITCConjugate dropper vial and gently squeeze to apply 1 drop (approximately 50 l) toeach well.

9. Place the lid on the incubation chamber and incubate slides 30 minutes at room tem-perature.

10. Repeat steps 7 through 9 for each slide, using Conjugate B in place of IgG FITCConjugate.

11. Remove a slide from incubator. Hold the slide at the tab end and dip the slide in a beakercontaining PBS to remove excess conjugate. Place slide(s) in a staining dish filled withPBS for 10 minutes. If desired, 2-3 drops of Evans blue counterstain may be added tothe final wash. Repeat for the remaining slides. NOTE: Improper washing may lead toincreased background fluorescence.

12. Remove a slide from the staining dish. Blot the edge of the slide on a paper towel toremove excess PBS. To prevent slide from drying, proceed immediately withnext step while slide is still wet.

13. Mount the coverslip by applying 3 drops of Mounting Medium evenly on the coverslipand place coverslip over slide. Avoid applying undue pressure and prevent lateralmovement of the coverslip.

14. Repeat steps 12 and 13 for each slide.

15. Examine for specific fluorescence under a fluorescence microscope at a magnifica-tion of 200x or greater.

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Slides may be read as soon as prepared. However, because of the presence of antifadingagent in the mounting medium, no significant loss of staining intensity occurs if reading isdelayed for up to 48 hours. Slides should be stored in the dark at 2-8C.

B. Endpoint Determination (titration)A serum positive in the screening test may be further tested following steps 5 through 13 todetermine the titer. Each test run should include the Positive and Negative Controls. Makeserial two-fold dilutions starting at 1:5. The reciprocal of the highest dilution producing apositive reaction is the titer.If the Positive Control titer is within the limits defined by the enclosed QC specifications, thelevels of the antibody in patient serum can then be reported in JDF units16. The JDF unit valueof the Positive Control is printed on the vial label. To calculate the JDF unit value of theunknown serum, simply divide the titer of the unknown by the titer of the Positive Control andmultiply this by the JDF units on the Positive Control label.

Example:Positive Control titer is 1:4. Unknown Sample titer 1:10. Positive Control label reads 160 JDFunits.Calculation:

10ICAb Concentration : ---- X 160 = 400 JDF Units

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Preparation of Serial DilutionsNumber four tubes 1 through 4. Add 0.4 ml of Sample Diluent to tube 1 and 0.2 ml to tubes 2through 4. Pipette 0.1 ml of undiluted serum to tube 1 and mix thoroughly. Transfer 0.2 ml fromtube 1 to tube 2 and mix thoroughly. Continue transferring 0.2 ml from one tube to the nextafter mixing to yield the dilutions depicted in the following table:

Tubes 1 2 3 4

Serum 0.1 ml+

BufferedDiluent 0.4 ml 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Transfer 0.2 ml 0.2 ml 0.2 ml

Final dilution 1:5 1:10 1:20 1:40 etc.

QUALITY CONTROLBoth a Positive and Negative Control should be included with each test run. The NegativeControl should show no specific fluorescence of the of the islet cells, whereas the PositiveControl should stain the cytoplasm of the islet cells.If expected results are not obtained, the run should be repeated. If inadequate resultscontinue to occur with the controls, these may be due to: Turbidity. Discard and use another control Problems with the optical system of the fluorescence microscope. These may include :

improper alignment, bulb beyond useful life expectancy, etc. Allowing the slide to dry during the procedure.

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RESULTS

The results of the tests for islet cell antibodies should be reported as negative (

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Test par immunofluorescence indirecte pour la recherche et la dtermination semi-quantita-tive des anticorps des cellules des lots de Langerhans (ICAb) dans le srum humain pour lediagnostic du diabte insulinodpendant (insulin-dependent diabetes mellitus, IDDM).

GENERALITES

Le diabte est une maladie mtabolique chronique et complexe influence par les diversfacteurs hrditaires et environnementaux qui ont comme consquence lincapacit ducorps de maintenir lutilisation des hydrates de carbone, des graisses et des protines. Lacondition, caractrise par les niveaux levs de glucose de sang, est provoque parune insuffisance dans la production dinsuline ou un affaiblissement dutilisation dinsuline.La plupart des cas de diabte entrent dans deux catgories cliniques : IDDM (diabte type1) et NIDDM (diabte type II).La gestion de pronostic, de traitement et de maladie sont diffrente pour chaque type. Onlaccepte bien quIDDM est une maladie autoimmune visant des -celules des lots deLangerhans dans le pancras. La rponse autoimmune aux antignes des celules deslots obtient des rponses danticorps aux antignes tels que le glutamic acid decarboxy-lase (GAD), lICA-512 et linsuline. Ils se sont avrs les marqueurs fortement prdictifs,en particulier si actuel dans le titre lev 1-15. La dtection de ces ICAb parlimmunofluorescence indirecte (IF) sur le substrat de pancras est considre le talonor or pour le diagnostic dIDDM 16.17. Ces ICAb cytoplasmiques sont actuellement employspour la prvision du diabte type I18-20.ICAb sont dtects dans jusqu 90% de patients diabtiques nouvellementdiagnostiqus. Dans ltude de famille de Bart, 100% des premiers parents de degrdes patients dIDDM avec ICAb > 80 units de JDF a progress IDDM dans un dlai de10 ans. Le niveau dICAb semble tre le plus lev avant le dbut du type diabte dI etdiminue progressivement ensuite 12.18. ICAb ont plusieurs spcificits distinctes etmontrent deux modles principaux de ractivit4. Le premier modle est limitprincipalement aux cellules. Le deuxime souille toutes les cellules dans llot, et est lemodle de souillure classique pour ICAb cytoplasmique.

PRINCIPE DE LA MTHODE

Avec la mthode dimmunofluorescence indirecte utilise dans ce coffret, le srum dupatient est incub sur des sections de pancras de primat, ce qui permet la fixation desautoanticorps avec le substrat. Un lavage de la lame limine tous les anticorps non fixs.Une incubation du substrat avec un conjugu, marqu la fluorescine, permet la dtectiondes anticorps fixs de classe IgG. Les ractivits sont observes sous un microscope fluorescence quip des filtres appropris. Une fluorescence vert-pomme du cytoplasmdes lots de Langerhans montre la prsence dICAb. Le titre du srum (la dernire dilutiondonnant une raction positive) est alors dtermin par dilutions sriques successives 14.

1123 40 Determinations

ImmuGlo

Anti-Cellule lot (ICAb) Systme

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INFORMATION PRODUIT

Conservation et prparation des ractifs

Conserver tous les ractifs entre 2et 8C. Tous les ractifs sont prts lemploi. Avantutilisation, attendre que les ractifs squilibrent la temprature ambiante du laboratoire.

Matriel fourni

ImmuGlo ICAb IFA 1123

Les kits contiennent les ractifs suffisants pour effectuer 40 dterminations chacune.

10x SORB SLD 4 Lames 4 puits de ICAb

1 x 0,5 ml CONTROL + ICA * Contrle positif ICAb, srumhumain. Contient ICAb, normalisdans des units de JDF.

1 x 0,5 ml CONTROL - * Contrle ngatif, srum humain

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * Conjugu FITC anti-IgG. Maintenir labri de la lumire

1 x 5.0 ml CONJ B * Conjugu B. Maintenir labri de lalumire

1 x 60 ml BUF * Diluant srum, avec de la BSA

2 vials BUF WASH Tampon phosphate salin (PBS).Dissoudre chaque flacon pour obtenir1 litre

1 x 5,0 ml MOUNTING MEDIUM * Milieu de montage. Ne pascongeler

1 x 1,0 ml EVANS Contre colorant Bleu dEvans

1 x 12 COVER SLD Lamelles couvre-lames

* Contient < 0.1% NaN3

Matriel ncessaire mais non fourni

Microscope fluorescenceMicropipette ou pipette PasteurPipette srologiqueBac coloration pour le lavage des lamesPetits tubes (ex 13X75 mm) et portoirEau distille ou dioniseEprouvette gradue 1lFlacon pour solution de lavageServiettes en papierChambre dincubation

MISES EN GARDE ET PRCAUTIONS

Utilisation comme test de diagnostic in vitro. Le matriel dorigine humaine utilis dans laprparation des ractifs a t test en respectant les recommandations de la FDA et trouvnon ractif en antigne de surface du virus de lhpatite B (Ag HBs), en anticorps dirigs

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contre le virus de lhpatite C (anti HCV) et en anticorps dirigs contre les virus delimmunodficience humaine (anti VIH1, anti VIH2 et HTLV-I). Du fait quaucune mthode detest connue ne peut offrir une garantie absolue de labsence dagents infectieux, considrerles ractifs ainsi que tous les chantillons de patients comme potentiellement infectieux etles manipuler avec les prcautions dusage14.Certains ractifs contiennent de lazide de sodium. Ce compos peut former avec descanalisations de plomb ou de cuivre des azotures mtalliques hautement explosifs. Afindviter la formation et laccumulation de tels azotures dans les canalisations, lors dellimination de ces ractifs dans un vier, rincer lvier grande eau.La qualit des rsultats est dpendante du respect des instructions figurant dans la prsentenotice. Ne pas changer des ractifs du coffret composants par dautres provenant dautresfabricants.

PRLVEMENT ET PRPARATION DES CHANTILLONS

Seuls les srums peuvent tre utiliss dans ce test. Il est recommand de ne pas lesutiliserles les srums fortement hmolyss, lipmiques ou sujets une contaminationbactrienne pouvant provoquer des interfrences avec les performances du test. Con-server les srums 2-8C pendant une semaine au maximum. Pour une conservation pluslongue, congeler les srums -20C. Eviter les conglations/dconglations successivesdes srums.

MODE OPRATOIRE

A. Dpistage1. Diluer chaque srum de patient au 1:5 dans le diluant chantillon fourni (0.1ml de srum

+ 0.4 ml de diluant). Ne pas diluer les contrles positifs ou ngatifs. Conserver le srumpur pour dterminer le titre des autoanticorps dans le cas o le dpistage sera trouvpositif.

2. Laisser revenir les lames la temprature du laboratoire pendant 10-15 minutes dansle sachet scell. Sortir les lames avec prcaution sans toucher le substrat.

3. Numroter les lames et les placer en chambre humide avec des serviettes papiermouilles pour viter lasschement.

4. Appuyer doucement sur le flacon pour dposer 1 goutte (environ 50l) de ContrleNgatif sur le puits #1. De la mme faon dposer 1 goutte de Contrle Positif sur lepuits #2. Eviter de dborder des puits.

5. Avec une micropipette ou une pipette Pasteur, dposer 1 goutte (environ 50l) desrum dilu dans les puits restants. Eviter de dborder les puits.

6. Recouvrir la chambre humide et incuber les lames 18 - 24 heures tempratureambiante.

7. Sortir une lame de la chambre humide. En la tenant par un bord, rincer doucement avecune pipette et environ 10 ml de PBS ou rincer la lame dans un bcher rempli de PBS. Nepas utiliser de pissette. Transfrer immdiatement la lame dans un bac coloration etlaver pendant 10 minutes. Rpter les oprations avec toutes les lames.

8. Retirer une lame du bac. Eliminer lexcs de PBS sur une serviette papier. Dposer lalame dans la chambre humide. Dposer immdiatement 1 goutte de conjugu FITC danschaque puits. Rpter les tapes 7 et 8 avec chaque lame.

9. Recouvrir la chambre humide et incuber 30 minutes temprature ambiante.10. Rptez les tapes 7 - 9 avec le conjugu B au lieu du conjugu FITC.11. Sortir une lame de la chambre humide. Plonger la lame dans un bcher rempli de PBS

pour liminer lexcs de conjugu. Transfrer dans un bac coloration et laver pendant10 minutes. Si une contre-coloration est souhaite, ajouter 2-3 gouttes de Bleu dEvansdans le dernier bain de lavage. Rpter les oprations avec toutes les lames.REM: Un lavage incorrect peut causer la fluorescence de fond lev.

12. Retirer une lame du bac. Eliminer lexcs de PBS sur une serviette papier. Pour viter demettre sec les puits, raliser immdiatement ltape 13 pendant que la lame est humide.

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13. Dposer doucement 3 gouttes de milieu de montage dans la lamelle couvre-lamegalement et appliquer la lamelle couvre-lame. Ne pas appliquer de pression excessiveet viter les mouvements latraux de la lamelle.

14. Rpter les tapes 12 et 13 avec chaque lame.15. Observer la fluorescence spcifique laide dun microscope au grossissement X200

ou plus.Les lames peuvent tre lues immdiatement. Cependant, grce la prsence dun agentanti-fading dans le milieu de montage, la lecture peut tre retarde jusqu 48 heures sansperte significative de lintensit de fluorescence. Dans ce cas les lames doivent treconserves lobscurit 2-8C.

B. Dtermination du titre par les dilutions en cascadeUn srum trouv positif au test de dpistage doit tre retest en suivant les tapes 5 13afin de dfinir son titre. Inclure dans chaque nouvelle srie un contrle positif et ngatif.Les dilutions en srie de 2 en 2 sont ralises partir du 1:5. Le titre du srum est dfinipar la dernire dilution donnant une fluorescence positive.Si le titre contrle positif est dans les limites dfinies par les caractristiques incluses deQC, les niveaux du srum danticorps peuvent alors tre rapports dans les units deJDF16. La valeur des units JDF du contrle positif est imprime sur ltiquette de fiole. Pourcalculer la valeur dunit de JDF du srum inconnu, diviser simplement le titre de linconnupar le titre du contrle positif et pour multiplier ceci par les units JDF sur ltiquette ducontrle positif.

Example:Contrle positif titre: 1:4, chantillon titre 1:10, ltiquette Positive Control: 160 JDF units.Calculation:

10Concentration ICAb: X 160 = 400 Units JDF

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Prparation des dilutions en srie.Numroter quatre tubes de 1 4. Ajouter 0,4ml de diluant chantillon dans le tube 1 et 0,2 mldans les tubes 2 4. Pipetter 0,1ml de srum pur dans le tube 1 et agiter soigneusement.Transfrer 0,2 ml du tube 1 dans le tube suivant et aprs agitation rpter la mmeopration pour les tubes suivants comme indiqu dans le tableau ci-dessous:

Tubes 1 2 3 4

Srum 0,1 ml+

DiluantEchantillon 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Transfert 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlDilution finale 1:5 1:10 1:20 1:40 etc.

CONTRLE DE QUALITUn contrle positif et un contrle ngatif doivent tre inclus dans chaque srie. Le contrlengatif ne donne pas dimage fluorescente sur les cellules lots, tandis quavec le contrlepositif on obtient une fluorescence de ces structures.Dans le cas o les contrles ne donnent pas les rsultats attendus, il est recommand derefaire le test. Si le problme persiste, cela peut tre li : La turbidit. Eliminer le contrle et en utiliser un nouveau. Au systme optique du microscope. Par exemple: mauvais alignement, lampe ayant dpass

sa dure de vie, etc. A un asschement des lames pendant la manipulation.

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INTERPRTATION DES RSULTATSLes rsultats des essais pour des anticorps de cellules dlot devraient tre rapports entant que ngatif (< 5) ou positif avec titre ou units de JDF 8.Lu pour la souillure spcifique du cytoplasme des cellules lots de Langerhans. On peutgalement observer de divers autres anticorps de tissu tels que les anticorps antinuclaires(ANA), les anticorps mitochondriques, et les anticorps de muscle lisse sur des sectionsde pancras. Des srums donnant nimporte laquelle de ces ractions devraient trerapports en tant que ngatif pour des anticorps aux cellules lots. Tous les srumsdonnant des ractions de souillure nuclaires peuvent tre examins sur les cellules HEp-2 ou les sections de foie de souris. Tous les srums donnant le muscle lisse ou lesractions de souillure mitochondriques peuvent tre examins sur des sections de lasouris rein/ estomac. Voir la raction positive dICAb en photo 1 la fin de ce document.NOTE : Les ractions dICAb sont, par leur nature, beaucoup plus faible que des ractionspour ANA ou la plupart des autres ractions danticorps dimmunofluorescence.

LIMITES DUTILISATIONDe temps en temps les srums peuvent montrer la souillure forte pour ANA ou dautresautoanticorps. Ceux-ci peuvent interfrer la capacit de dtecter des anticorps de cel-lules dlot. Dans ces cas-ci, la titration du srum peut permettre la visualisation desanticorps de cellules lots. Dans dautres cas leur titre peut tre infrieur quANA oudautres anticorps et par consquent ne peut tre dtecte.Lessai danticorps de cellules lots ne devrait pas tre ralis dessus les chantillonshmolyss excessivement, par microbes souills ou lipmiques. Cette mthode devraittre employe pour examiner les chantillons humains de srum seulement.

VALEURS ATTENDUESApproximativement 50-80% de diabtiques de nouveau-dbut sont positif pour desanticorps de cellules lots. On a rapport que la prdominance des ICAb dans les parentsnon-diabtiques de premier-degr et dans les sujets normaux non-diabtiques est 2-5%et 0.25-1.7%, respectivement 5-16. Approximativement 11% de parents positifs de premier-degr danticorps de cellules dlot dveloppent le diabte tous les ans.Des intervallesaussi de longtemps que 8 ans entre la dtection des anticorps de cellules dlot et le dbutdu diabte ont t rapports. Voir lincidence dICAb dans le tableau 1 la fin de cedocument.

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Test de deteccin de inmunofluorescencia indirecta para la deteccin y semicuantificacinde los anticuerpos por las clulas de los islotes de Langerhans (ICAb) en el suero humano,para la diagnosis de la diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM).

RESUMEN Y EXPLICACIN

La diabetes es una enfermedad metablica crnica y compleja influenciada por los variosfactores hereditarios y ambientales que dan lugar a la inhabilidad del cuerpo de mantenerel uso de carbohidratos, de grasas y de protenas. La condicin, caracterizada por losaltos niveles de la glucosa de la sangre, es causada por una deficiencia en la produccinde la insulina o una debilitacin de la utilizacin de la insulina. La mayora de los casos dela diabetes bajan en dos categoras clnicas: IDDM (diabete tipo I) y NIDDM (diabete tipoII).La gerencia del pronstico, del tratamiento y de la enfermedad es diferente para cada tipo.Se acepta bien que IDDM es una enfermedad autoinmune que apunta clulas de losislotes de Langerhans en el pncreas. La respuesta autoinmune a los antgenos clulasislotes saca respuestas del anticuerpo a los antgenos tales como glutamic acid decar-boxylase (GAD), ICA-512 e insulina. Se han encontrado para ser marcadores altamenteprofticos, particularmente si es presente en el alto ttulo 1-15. La deteccin de estos ICAbpor inmunofluorescencia indirecta (IF) en el substrato del pncreas se considera el patrnoro para la diagnosis de IDDM 16.17. Estos ICAb citoplsmicos se utilizan actualmente parala prediccin del diabete tipo I18-20.ICAb se detectan en el hasta 90% de pacientes diabticos nuevamente diagnosticados.En el estudio de la familia de Barts-Windsor, 100% de los primeros parientes del gradode los pacientes de IDDM con ICAb > 80 unidades de JDF progres a IDDM en el plazode 10 aos. El nivel de ICAb aparece ser el ms alto antes del inicio del tipo diabetes deI y disminuye progresivamente despus de eso 12.18. ICAb tienen varias especificidadesdistintas y demuestran dos patrones importantes de la reactividad 4. El primer patrn serestringe predominante a los clulas. El segundo mancha todas las clulas dentro delislote, y es el patrn que se mancha clsico para ICAb citoplsmico.

PRINCIPIO DEL PROCEDIMIENTO

Para la realizacin del mtodo de inmunofluorescencia indirecta de este equipo tiene queincubarse el suero de los pacientes en secciones del primate pncreas y, de este modo,permitir que los anticuerpos puedan unirse al substrato. Cualquier anticuerpo no unido seelimina mediante lavado del portaobjetos. Los anticuerpos unidos de la clase IgG se detectanmediante incubacin del substrato con un conjugado marcado con fluorescena. Las reaccionesse visualizan en un microscopio de fluorescencia equipado con filtros adecuados. La presenciade ICAb se demuestra mediante la presencia de fluorescencia de color verde en las clulasde los islotes de Langerhans. Posteriormente se determina el ttulo (valor recproco de lamayor dilucin que origina una reaccin positiva) mediante diluciones seriadas14.

1123 40 Determinations

ImmuGlo

Anti-Clula Islote (ICAb) Test

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INFORMACIN DEL PRODUCTO

Almacenamiento y preparacin

Almacenar todos los reactivos a una temperatura de 2-8C. Los reactivos pueden emplearsedespus de haber sido equilibrados a temperatura ambiente.

Materiales Suministrados

ImmuGlo ICAb IFA 1123

El kit contiene los suficientes reactivo para realizar 40 determinaciones.

10x SORB SLD 4 Portaobjetos de 4 pocillos consubstrato del primate pncreas.

1 x 0,5 ml CONTROL + ICA * Control positivo de ICAb, suerohumano. Contiene ICAb,estandardizado en unidades de JDF.

1 x 0,5 ml CONTROL - * Control negativo, suero humano

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * Conjugado isotiocianato defluorescena (FITC)-IgG con BSA.Proteger de la luz

1 x 5 ml CONJ B * Conjugado B con BSA. Proteger dela luz

1 x 60 ml BUF * Diluyente de la muestra con BSA

2 viales BUF WASH Fosfato salino tamponado (PBS).Disolver cada vial en 1 litro

1 x 5,0 ml MOUNTING MEDIUM * Medio de preparacin. Nocongelar

1 x 1,0 ml EVANS Colorante de contraste azul deEvans

1 x 12 COVER SLD Cubreobjetos

* PRECAUCIN - Contiene < 0.1% NaN3

Material necesario, pero no suministradoMicroscopio de fluorescenciaMicropipetas o pipeta PasteurPipetas serolgicasPlaca de tincin (por ejemplo, frasco de Coplin)Tubos de ensayo pequeos (por ejemplo, 13 x 75 mm) y gradilla de tubos de ensayoAgua destilada o desionizadaEnvase de 1 litroFrasco de lavadoToallas de papelCmara de incubacin

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONESPara uso diagnstico in vitro. Todos los componentes de derivados sanguneos humanoshan sido ensayados respecto a la presencia de HbsAg, VHC, VIH-1 y 2 y el virus linfotropode clulas T humanas (VLTH-I), siendo negativos en los ensayos necesarios segn la FDA

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(Administracin de Frmacos y Alimentos de Estados Unidos). Todas las muestras de sueroy los derivados sanguneos humanos deben tratarse como un material potencialmentepeligroso, independientemente de su origen. En consecuencia, deben seguirse unas prcticasde laboratorio adecuadas durante el almacenamiento, dispensacin y eliminacin de dichomaterial 14.PRECAUCIN - La azida sdica (NaN3) puede reaccionar con el plomo y el cobre de lastuberas y formar azidas metlicas muy explosivas. Despus y desechar los lquidos, esnecesario lavar con un volumen grande de agua para evitar la acumulacin de azida. Laazida sdica puede ser txica si se ingiere. En caso de ingestin, notificarlo inmediatamenteal director del laboratorio o al centro toxicolgico.Para poder garantizar la obtencin de resultados vlidos, deben seguirse de forma exactalas instrucciones indicadas en este prospecto. No intercambiar componentes del equipo porotros diferentes que no tengan el mismo nmero de catlogo de IMMCO. No utilizar esteequipo despus de la fecha de caducidad.

OBTENCIN Y PREPARACIN DE LA MUESTRAPara la realizacin de esta determinacin slo debe utilizarse suero. Las muestras conhemlisis macroscpica, lipmicas o contaminadas por microorganismos pueden interferiren el funcionamiento del ensayo y, por tanto, no deben ser utilizadas. Almacenar las muestrasa una temperatura de 2-8C durante un perodo no superior a una semana. Cuando se deseeun almacenamiento ms prolongado, el suero debe congelarse a una temperatura de -20C.Evitar la congelacin y descongelacin repetida de las muestras.

PROCEDIMIENTO

Mtodo de ensayo

A. Deteccin sistemtica1. Diluir 1:5 el suero de cada paciente con el diluyente de la muestra suministrado (0,1 ml

de suero + 0,4 ml del diluyente). No diluir los Controles Positivo o Negativo. Guardar elsuero no diluido para la determinacin del ttulo de anticuerpos si los resultados sonpositivos.

2. Permitir que los pocillos de los portaobjetos que contienen el substrato se equilibren atemperatura ambiente durante 10-15 minutos. Extraer con cuidado los portaobjetos sintocar el substrato.

3. Etiquetar los portaobjetos y colocarlos en una cmara de incubacin cubierta contoallas de papel humedecidas con agua para evitar la desecacin.

4. Invertir el vial cuentagotas y presionar suavemente para aplicar 1 gota (aproximadamente50 l) del Control Negativo en el pocillo n 1. De forma similar, aplicar una gota delControl Positivo en el pocillo n 2. Evitar llenar demasiado los pocillos.

5. Con el empleo de una micropipeta o una pipeta Pasteur, colocar 1 gota del suero diluidodel paciente (aproximadamente 50 l) en los restantes pocillos. Evitar llenar demasiadolos pocillos.

6. Tapar la cmara de incubacin e incubar los portaobjetos durante 18 - 24 horas atemperatura ambiente.

7. Quitar la tapa de la cmara de incubacin. Coger el portaobjetos por el extremo y lavarsuavemente con 10 ml de PBS mediante el empleo de una pipeta o lavar el portaobjetosen un vaso de precipitado lleno de PBS. No emplear un frasco de lavado. Transferirinmediatamente el portaobjetos al frasco de Coplin y dejarlo durante 10 minutos. Repetirel proceso con todos los portaobjetos restantes.

8. Extraer el portaobjetos del frasco de Coplin. Secar el extremo del portaobjetos con unatoalla de papel para eliminar el exceso de PBS. Colocar el portaobjetos en la cmara deincubacin, Invertir inmediatamente el vial cuentagotas del Conjugado FITC y apretarsuavemente para aplicar 1 gota (aproximadamente 50 l) en cada pocillo. Repetir lasetapas 7 y 8 con cada portaobjetos.

9. Tapar la cmara de incubacin. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

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10. Repetir las etapas 7 - 9 con Conjugado B en lugar de Conjugado FITC.11. Extraer el portaobjetos del incubador. Sumergir el portaobjetos en un vaso de precipitado

con PBS para eliminar el exceso de conjugado. Colocar el portaobjetos en una cubeta detincin llena con PBS durante 10 minutos. Al final del lavado puede aadirse, si se desea,2-3 gotas de colorante de contraste azul de Evans. Repetir el proceso con los portaobjetosrestantes. NOTA: un lavado inadecuado puede aumentar fluorescencia del fondo.

12. Extraer el portaobjetos de la cubeta de tincin. Secar el portaobjetos con una toalla depapel para eliminar el exceso de PBS. Para evitar que se seque el portaobjetos, realizarinmediatamente, mientras el portaobjetos todava est hmedo, el proceso descrito enel apartado 13.

13. Aadir 3 gota del Medio de Preparacin uniformemente en cubreobjetos y colocar elcubreobjetos sobre el portaobjetos. Evitar la aplicacin de una presin excesiva y elmovimiento lateral del cubreobjetos.

14. Repetir las etapas 12 y 13 con cada portaobjetos.15. Examinar el desarrollo de fluorescencia especfica en un microscopio de fluorescencia

a 200x o ms aumentos.

Los portaobjetos pueden leerse al terminar su preparacin. Sin embargo, debido a que elmedio de preparacin contiene un agente antidesteimiento, puede retrasarse la lecturadurante un perodo de hasta 48 horas sin que se produzca una prdida significativa de laintensidad de la tincin. Los portaobjetos deben almacenarse en la oscuridad a unatemperatura de 2-8C.

B. Determinacin del punto de valoracin (titulacin)Los sueros positivos durante el ensayo pueden valorarse de forma adicional, etapas 5- 13,para determinar su titulacin. Cada ensayo debe incluir un control positivo y negativo.Realizar diluciones seriadas dobles a partir de 1:5. El ttulo es el valor recproco de la dilucinms elevada que produzca una reaccin positiva.Si el ttulo del control positivo est dentro de los lmites definidos por las especificacionesincluidas de QC, los niveles del anticuerpo en suero paciente se pueden entonces divulgaren las unidades de JDF16. El valor de unidad JDF del control positivo se imprime en laetiqueta del frasco. Para calcular el valor de unidad de JDF del suero desconocido, dividirsimplemente el ttulo del desconocido por el ttulo del control positivo y para multiplicar estopor las unidades JDF en la etiqueta del control positivo.Ejemplo:Control Positivo titer: 1:4. Muestra titer 1:10. Etiqueta control positivo: 160 unidades JDF.Calculacin:

10Concentracin ICAb: X 160 = 400 JDF Units

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Preparacin de las diluciones seriadasNumerar cuatro tubos del 1 al 4. Aadir 0,4 ml del diluyente de la muestra en el tubo 1 y 0,2ml en los tubos 2 a 4. Pipetear 0,1 ml del suero no diluido en el tubo 1 y mezclar minuciosamente.Transferir 0,2 ml del tubo 1 al tubo 2 y mezclar meticulosamente. Continuar transfiriendo 0,2ml de un tubo al siguiente tras la mezcla y, de este modo, conseguir las diluciones ilustradasen la siguiente tabla:

Tubos 1 2 3 4

Suero 0,1 ml+

Diluyentetamponado 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Transferencia 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlDilucin final 1:5 1:10 1:20 1:40etc.

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CONTROL DE CALIDADEn cada serie de ensayos debe incluirse un control positivo y negativo. El control negativono debe mostrar fluorescencia especfica de la guarnicin endomiso del msculo liso se la;por el contrario, el control positivo debe tener una intensidad de tincin igual o superior a 2+del tubos de estas estructuras.Cuando no se obtienen los resultados esperados, debe repetirse el ensayo. Los resultadosanmalos con los controles pueden producirse por: Turbidez. Desechar y utilizar otro control. Problemas del sistema ptico del microscopio de fluorescencia. Estos problemas pueden

incluir un alineamiento inadecuado, una lmpara con fecha posterior a la esperanza devida til, etc.

Secado del portaobjetos durante el procedimiento.

INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOSLos resultados de las pruebas para los anticuerpos de la clula islota se deben divulgarcomo negativa (< 5) o positivo con el ttulo o las unidades de JDF8.

Ledo para mancharse especfico del citoplasma de las clulas islotas de Langerhans.Los anticuerpos otros del tejido fino tales como anticuerpos antinucleares (ANA),anticuerpos mitochondrial, y anticuerpos lisos del msculo se pueden tambin observaren secciones del pncreas. Los sueros que dan cualesquiera de estas reacciones sedeben divulgar como negativa para los anticuerpos a las clulas islotas. Cualquier sueroque da reacciones que se manchan nucleares se puede probar en las clulas HEp-2 o lassecciones del hgado del ratn. Cualquier suero que da el msculo liso o reacciones quese manchan mitochondrial se puede probar en secciones del ratn rim/estmago. Ver lareaccin positiva de ICAb en la foto 1 en el extremo de este documento.

NOTA: Las reacciones de ICAb estn, al lado de su naturaleza, mucho ms dbil que lasreacciones para ANA o la mayora de las otras reacciones del anticuerpo de lainmunofluorescencia.

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTOLos sueros pueden exhibir de vez en cuando mancharse fuerte para ANA u otrosautoanticuerpos. stos pueden interferir con la capacidad de detectar los anticuerpos dela clula islota. En tales casos, la titulacin del suero puede permitir la visualizacin de losanticuerpos de la clula islota. En otros casos su ttulo puede ser ms bajo que el ANA uotros anticuerpos y por lo tanto puede no ser detectado.La prueba del anticuerpo de la clula del islote no se debe realizar encendido hemolizadasgrueso, microbiano contaminadas o lipmicas las muestras. Este mtodo se debe utilizarpara probar muestras humanas del suero solamente.

VALORES ESPERADOSAproximadamente 50-80% de diabticos del nuevo-inicio es positivo para los anticuerposde la clula del islote. El predominio de los anticuerpos de la clula del islote en parientesno-diabeticos del primero-grado y en temas normales no-diabeticos se ha divulgado paraser 2-5% y 0.25-1.7%, respectivamente 5-16. Los aproximadamente 11% de parientespositivos del primero-grado del anticuerpo de la clula islota desarrollan la diabetes cadaao. Los intervalos mientras 8 aos entre la deteccin de los anticuerpos de la clula delislote y el inicio de la diabetes se han divulgado. Ver la incidencia de ICAb en la tabla 1 enel extremo de este documento.

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Fr den Nachweis und die semiquantitative Bestimmung von der langerhansschenInselzellen Antikrper (ICAb) mit der indirekten Immunfluoreszenz. ICAb dient der Diagnosevon bestimmten der insulinabhngigen Diabetes Mellitus (IDDM).

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLRUNG

Diabetes ist eine chronische und komplizierte metabolische Krankheit, die durchverschiedene erbliche und Klimafaktoren beeinflut wird, die die Unfhigkeit des Krpers,den Gebrauch der Kohlenhydrate, der Fette und der Proteine beizubehalten ergeben. DieBedingung, gekennzeichnet durch hohe Blutglukoseniveaus, wird durch einen Mangel inder Insulinproduktion oder eine Beeintrchtigung der Insulinanwendung verursacht. Diemeisten Flle vom Diabetes fallen in zwei klinische Kategorien: IDDM (Typ-I Diabetes) undNIDDM (Typ-II Diabetes).Prognose-, Behandlung- und Krankheitmanagement sind fr jede Art unterschiedlich. Eswird gut angenommen, da IDDM ein Autoimmunkrankheit ist, das b-zellen von derlangerhansschen Inselzellen im Pankreas zielt. Die autoimmune Antwort zu denInselzellenantikrpern bekommt Antikrperantworten zu den Antigenen wie glutamic aciddecarboxylase (GAD), ICA-512 und Insulin heraus. Sie sind gefunden worden, um inhohem Grade vorbestimmte Markierungen zu sein, besonders wenn anwesend in hohemTiter1-15. Abfragung dieser ICAb durch indirekte Immunofluoreszenz (IF) aufPankreassubstrat gilt als die Goldaktie fr Diagnose von IDDM 16.17. Diese zellplasmatischenICAb werden fr die Vorhersage der Typ-I Diabetes verwendet18-20.ICAb werden in bis 90% von eben bestimmten zuckerkranken Patienten ermittelt. In derBarts-Windsor Familie Studie 100% der ersten Gradverwandten der IDDM Patienten mitkam ICAb > 80 JDF Maeinheiten bis zu IDDM innerhalb 10 Jahre weiter. Das Niveau vonICAb scheint, vor dem Angriff der Typ-I Diabetes am hchsten zu sein und vermindertnach und nach danach 12.18. ICAb haben einige eindeutige Besonderheiten und zeigenzwei Hauptmuster Reaktivitt 4. Das erste Muster wird berwiegend auf die b-zelleneingeschrnkt. Das zweite befleckt alle Zellen innerhalb der kleinen Insel und ist dasklassische befleckende Muster fr zellplasmatisches ICAb.

TESTPRINZIP

Bei dem in diesem Test eingesetzten indirekten Immunfluoreszenzverfahren werdenPatientenseren mit Primatpankreas inkubiert, um die Bindung von in den Seren vorhandenenAutoantikrpern an die Substrat zu ermglichen. Nicht gebundenes Material wird durchWaschen entfernt. Gebundene Antikrper vom Typ IgG werden durch Inkubation der Substratmit Fluorescein-markiertem nachgewiesen. Das Reaktionsmuster wird unter einemFluoreszenzmikroskop bewertet, das mit den entsprechenden Filtern ausgerstet ist. DasVorhandensein von ICAb zeigt sich durch eine apfelgrne vom Langerhans InselzellenFluoreszenz. Anschlieend kann der Titer (der reziproke Wert der hchsten Verdnnung,die eine positive.

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ImmuGlo

Anti-Inselzellen Antikrper (ICAb)System

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PRODUKTINFORMATION

Lagerung und Handhabung

Alle Reagenzien sind bei 2-8C zu lagern. Die Reagenzien sind gebrauchsfertig, nachdemsie auf Raumtemperatur gebracht wurden.

In der Testpackung vorhandenes Material

ImmuGlo ICAb IFA 1123

Installationsstze enthalten gengende Reagenzien, um 40 Ermittlungen jede durchzufhren.

10x SORB SLD 4 Objekttrger zu 4 Auftragstellenbeschichtet mit ICAb.

1 x 0.5 ml CONTROL + ICA * ICAb Positive Kontrolle,Humanserum mit BSA. Enthlt ICAb,standardisiert in den JDFMaeinheiten.

1 x 0.5 ml CONTROL - * Negative Kontrolle, Humanserummit BSA

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * FITC-Konjugat IgG mit BSA.Lichtgeschtzt aufbewahren

1 x 5 ml CONJ B * Konjugat B mit BSA. Lichtgeschtztaufbewahren

1 x 60 ml BUF * Probendiluent mit BSA

2 vials BUF WASH Phosphatgepuffertes Kochsalz(PBS). Inhalt eines Flschchens in 1Liter auflsen

1 x 5.0 ml MOUNTING MEDIUM * Eindeckmittel. Nicht einfrieren

1 x 1.0 ml EVANS Evans Blau Frbemittel

1 x 12 COVER SLD Deckglschen

* enthlt < 0.1% NaN3

Zustzlich bentigtes Material

FluoreszenzmikroskopMikropipetten oder PasteurpipettenKolbenhubpipetteFrbetrog (z.B. nach Coplin)Kleine Reagenzrhrchen (z.B. 12x75 mm) und dazu passende GestelleDestilliertes oder entionisiertes WasserBehlter, 1 LiterPapierhandtcherFeuchte Kammer

WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN

Nur fr In-vitro-Diagnostik. Alle Bestandteile menschlichen Ursprungs wurden auf dasVorhandensein von HBsAg, Anti-HCV, Anti-HIV-1/HIV-2 und Anti-HTLV-1 mit FDA-

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zugelassenen Tests untersucht und fr negativ befunden. Alle Humanseren und Produktemenschlichen Ursprungs sollten ungeachtet ihrer Herkunft als potentiell gefhrlich gehandhabtwerden. Diese Materialien und ihre Behltnisse sind nach geltenden Vorschriften undRichtlinien zu lagern und zu beseitigen 14.ACHTUNG - Natriumazid (NaN3) kann mit Kupfer und Blei in Leitungen und Ltstellen unterBildung hochexplosiver Metallazide reagieren. Um eine Bildung solcher Metallazide zuvermeiden, mssen Ausgsse nach dem Ausgieen azidhaltiger Lsungen mit reichlichWasser gesplt werden. Natriumazid kann beim Verschlucken giftig sein. Flle vonVerschlucken sofort dem Laborleiter oder der Giftzentrale melden.Um die Zuverlssigkeit der Ergebnisse zu gewhrleisten, ist das Testprotokoll unbedingteinzuhalten. Falls Kitreagenzien ersetzt werden mssen, sollten nur Artikel von IMMCO dergleichen Artikelnummer verwendet werden. Keine verfallenen Reagenzien verwenden.

PROBENGEWINNUNG UND HANDHABUNG

Bei diesem Verfahren sollte nur Serum verwendet werden. Deutlich hmolytische, lipmischeoder mikrobiell kontaminierte Proben knnen die Leistung dieses Tests beeintrchtigen undsollten daher nicht verwendet werden. Proben sollten nicht lnger als eine Woche bei 2-8 Cgelagert werden. Bei lngerer Lagerung sollten sie bei -20C eingefroren werden.Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden.

TESTDURCHFHRUNG

TestmethodeA. Screening

1. Jedes Patientenserum mit dem Probendiluent aus dem Kit 1:5 (0.1ml Serum + 0.4 mlDiluent) verdnnen. Die positiven und negativen Kontrollen nicht verdnnen. Dieunverdnnten Nativseren aufbewahren, um bei positivem Suchtestergebnisgegebenenfalls den Antikrpertiter bestimmen zu knnen.

2. Beutel mit den beschichteten Objekttrgern auf Raumtemperatur bringen (10-15 Minuten).Objekttrger vorsichtig entnehmen, ohne die Beschichtung zu berhren.

3. Objekttrger beschriften und, um ein Austrocknen der Beschichtung zu verhindern, ineine feuchte Kammer legen.

4. Von den Tropfflschchen mit der Negativen und Positiven Kontrolle jeweils 1 Tropfen(etwa 50 l) auf die Auftragstellen #1 bzw. #2 ausdrcken. Auftragstellen nichtberfllen.

5. Mit einer Mikro- oder Pasteurpipette 1 Tropfen verdnntes Patientenserum (etwa 50 l)auf die weiteren Auftragstellen geben. Auftragstellen nicht berfllen.

6. Die Objekttrger in der abgedeckten feuchten Kammer 18-24 Stunden beiRaumtemperatur inkubieren.

7. Jeweils einen Objekttrger aus der feuchten Kammer nehmen. Am beschrifteten Endeanfassen und sorgfltig mit ca. 10 ml PBS aus einer Pipette splen; alternativ Objekttrgerin einem Becher mit PBS splen. Keine Spritzflasche verwenden. Objekttrger sofort ineinen Frbetrog mit PBS fr 10 Minuten stellen. Mit den anderen Objekttrgern ebensoverfahren.

8. Objekttrger einzeln aus dem Frbetrog nehmen. Lngsseite des Objekttrgers gegenein Papiertuch halten, um berschu an PBS zu entfernen. Objekttrger in die feuchteKammer legen und sofort vom Tropfflschchen mit FITC Konjugat 1 Tropfen (ca. 50 l)auf jede Auftragstelle ausdrcken. Die Schritte 7 und 8 mit jedem Objekttrger einzelndurchfhren.

9. Feuchte Kammer abdecken und Objekttrger 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.10. Die Schritte 7 - 9 mit Konjugat B anstelle von FITC Konjugat wiederholen.11. Jeweils einen Objekttrger aus der feuchten Kammer nehmen. Am beschrifteten Ende

anfassen und in einen Becher mit PBS eintauchen, um berschu an Konjugat zuentfernen. Objekttrger 10 Minuten in einen Frbetrog mit PBS stellen. Falls Gegenfrbung

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gewnscht ist, knnen 2-3 Tropfen Evans Blau Frbemittel pro Trog hinzugefgt werden.Mit den anderen Objekttrgern ebenso verfahren. HINWEIS: Unsachgemes Waschenkann Hintergrundfluoreszenz erhhen.

12. Objekttrger einzeln aus dem Frbetrog nehmen. Lngsseite des Objekttrgers gegenein Papiertuch halten, um berschu an PBS zu entfernen. Um ein Austrocknen derBeschichtung zu vermeiden, sofort mit Schritt 13 fortfahren.

13. 3 Tropfen des Eindeckmittels sorgfltig auf Deckglschen gleichmig geben und einDeckglschen auflegen. Leicht andrcken und seitliche Bewegung desDeckglschens vermeiden.

14. Die Schritte 12 und 13 mit jedem Objekttrger einzeln durchfhren.15. Auf spezifische Fluoreszenz hin unter einem Fluoreszenzmikroskop bei mindestens

200facher Vergrerung auswerten.

Die Objekttrger knnen sofort nachdem sie angefertigt wurden ausgewertet werden. Weildas Eindeckmittel einen Stoff enthlt, der einem Ausbleichen entgegenwirkt, knnen dieObjekttrger jedoch bis 48 Std. spter ausgewertet werden, ohne da die Intensitt derFluoreszenz signifikant abklingt. Die Objekttrger sollten im Dunkeln bei 2-8C gelagert werden.

B. Titerbestimmung

Bei einem im Suchtest positiven Serum kann nach Durchfhrung der Schritte 5 bis 13 derTiter bestimmt werden. Zu diesem Zweck ist ausgehend von einer 1:5-Verdnnung eineReihenverdnnung zu erstellen.Bei jedem Testlauf sollten die positive und negative Kontrolle mitgefhrt werden. Der Titerergibt sich aus dem reziproken Wert der hchsten Verdnnung, die ein positives Ergebniszeigt.Wenn der positive Steuertiter innerhalb der Begrenzungen ist-, die durch die beiliegendenQC Spezifikationen definiert werden, knnen die Niveaus desAntikrperanstaltspatientserums in JDF Maeinheiten dann berichtet werden16. Der JDFMaeinheit Wert der Positive Kontrolle wird auf dem Phioleaufkleber gedruckt. Den JDFMaeinheit Wert des unbekannten Serums errechnen, den Titer des Unbekannten durchden Titer der Positiven Kontrolle einfach teilen und dieses mit den JDF Maeinheiten aufdem Positive Kontrolleaufkleber zu multiplizieren.

Beispiel:Positive Kontrolle Titer: 1:4. Probe titer 1:10. Positive Kontrolleaufkleber: 160 JDFMaeinheiten.

Rechnung:10

ICAb Konzentration: X 160 = 400 JDF Maeinheiten4

Herstellung einer Reihenverdnnung

Vier Rhrchen mit 1 bis 4 beschriften. Vom Probendiluent 0,4 ml in Rhrchen 1 und jeweils0,2 ml in Rhrchen 2 bis 4 geben. 0,1 ml unverdnntes Serum in Rhrchen 1 pipettieren undgrndlich durchmischen. Aus Rhrchen 1 0,2 ml ins Rhrchen 2 berfhren und grndlichdurchmischen. Die Verdnnungsreihe wie in der folgenden Tabelle dargestellt fortfhren,indem nach Durchmischen jeweils 0,2 ml von einem Rhrchen in das nchste berfhrtwerden.

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Rhrchen 1 2 3 4Serum 0,1 ml

+Probendiluent 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Zu berfhren 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlEndverdnnung 1:5 1:10 1:20 1:40 etc.

QUALITTSKONTROLLEBei jedem Testlauf sollten sowohl eine positive wie eine negative Kontrolle mitgefhrt werden.Die negative Kontrolle sollte keine spezifische Fluoreszenz der endomysium Futter derglatten Muskelbndel zeigen. Sollte die positive Kontrolle eine Fluoreszenzintensitt vonmindestens 2+ im Schluche der Strukturen zeigen. Werden die erwarteten Ergebnissenicht erhalten, sollte der Testlauf wiederholt werden. Sind die Ergebnisse mit den Kontrollenauch dann nicht wie erwartet, kann dies folgende Ursachen haben: Trbungen. Kontrolle(n) verwerfen und eine neue verwenden. Probleme mit der Optik des Mikroskops, wie z.B.: unsachgeme Ausrichtung, Lampe

zu alt, usw. Objekttrgerbeschichtung whrend Testdurchfhrung ausgetrocknet.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSEDie Resultate der Tests fr Inselzelle Antikrper sollten als Negativ berichtet werden (< 5)oder Positiv mit Titer oder JDF Maeinheiten 8.

Gelesen fr das spezifische Beflecken des Zytoplasmas der langerhansschen Inselzellen.Viele Gewebeantikrper wie AntinuklearAntikrper (ANA), mitochondrische Antikrperund glatte Muskelantikrper knnen auf Pankreasabschnitten auch beobachtet werden.Die Seren, die irgendwelche dieser Reaktionen geben, sollten als Negativ fr AntikrperInselzellen berichtet werden. Alle mgliche Seren, die befleckende Kernreaktionen geben,knnen auf Zellen HEp-2 oder Museleberabschnitten geprft werden. Alle mglicheSeren, die glatten Muskel oder mitochondrische befleckende Reaktionen geben, knnenauf Abschnitten der Maus Niere/Magen geprft werden. ICAb positive Reaktion in Foto 1am Ende dieses Dokumentes sehen.

ANMERKUNG: ICAb Reaktionen sind, durch ihre Natur, viel schwcher als Reaktionen frANA oder die meisten anderen Immunofluoreszenzantikrperreaktionen.

GRENZEN DES VERFAHRENSGelegentlich knnen Seren das starke Beflecken fr ANA oder andere Antikrpernausstellen. Diese knnen die Fhigkeit behinderen, Inselzelle Antikrper zu ermitteln. Insolchen Fllen kann das Titrieren des Serums die Sichtbarmachung der Inselzelle Antikrperermglichen. In anderen Fllen kann ihr Titer als niedriger sein, der ANA oder andereAntikrper und mglicherweise nicht folglich ermittelt werden knnen.Der Inselzelle Antikrpertest sollte nicht an durchgefhrt werden grob hmolytische,durch Mikroben verschmutzte oder lipmische Proben. Diese Methode sollte fr diePrfung nur der menschlichen Serumproben verwendet werden.

ERWARTETE WERTEUngefhr 50-80% von Neu angriff Diabetikern sind fr Inselzelle Antikrper positiv. DasVorherrschen der Inselzelle Antikrper in den nicht-zuckerkranken Erstgrad Verwandtenund in den nicht-zuckerkranken normalen Themen ist berichtet worden, um 2-5% und0.25-1.7%, zu sein beziehungsweise5-16. Ungefhr 11% von Inselzelle Antikrper positivenErstgrad Verwandten entwickeln Diabetes jedes Jahr. Abstnde von so lang wie 8 Jahrezwischen Abfragung der Inselzelle Antikrper und dem Angriff von Diabetes sind berichtetworden. ICAb Ausdehnung in Tabelle 1 am Ende dieses Dokumentes sehen.

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Dosaggio in immunofluorescenza indiretta per lindividuazione e la determinazione semi-quantitativa degli anticorpi di cellule delle isolette di Langerhans (ICAb) nel siero umano. Glianticorpi sono presenti nel siero dei pazienti con di diabete melito insulina dipendenti (IDDM).

CARATTERISTICHE GENERALI

Il diabete una malattia metabolica cronica e complessa influenzata dai vari fattori ereditaried ambientali che provocano lincapacit del corpo di effettuare luso dei carboidrati, deigrassi e delle proteine. La circostanza, caratterizzata dai livelli elevati del glucosio dianima, causata da una mancanza nella produzione dellinsulina o da un danno diutilizzazione dellinsulina. La maggior parte dei casi del diabete entrano in due categoriecliniche: IDDM (diabete tipo I) e NIDDM (diabete tipo II).Lamministrazione di prognosi, di trattamento e di malattia differente per ogni tipo. accettato bene che IDDM una malattia autoimmune che designa gli cellule delle isolettedi Langerhans come bersaglio nel pancreas. La risposta autoimmune ai antigeni celluliisoletti trae le risposte fuori dellanticorpo agli antigeni quali il glutamic acid decarboxylase(GAD), ICA-512 ed insulina. Sono stati trovati per essere indicatori altamente preventivi,specialmente se presente nell alto titolo 1-15. La ri levazione di questi ICAbdallimmunofluorescenza indiretta (IF) sul substrato del pancreas considerata la paritaurea per la diagnosi di IDDM 16.17. Questi ICAb citoplasmici attualmente sono usati per laprevisione di diabete tipo I 18-20.ICAb sono rilevati in fino a 90% dei pazienti diabetici recentemente diagnosticati. Nellostudio della famiglia di Barts-Windsor, 100% dei primi parenti di grado dei pazienti diIDDM con ICAb > 80 unit di JDF ha diventare IDDM in 10 anni. Il livello elevato di ICAbsembra essere prima dellinizio di tipo il diabete di I e diminue progressivamente da allorain poi 12.18. ICAb hanno parecchie specificit distinte e mostrano due modelli importantidella reattivit 4. Il primo modello si limita principalmente agli -celluli. Il secondo macchiatutte le cellule allinterno dellisolotto ed il modello di macchiatura classico per ICAbcitoplasmico.

PRINCIPIO DEL METODO

Nella metodica in immunofluorescenza indiretta utilizzata in questo kit, i sieri dei pazientivengono incubati su sezioni del primate pancreas per consentire il legame degli anticorpi alsubstrato. Tutti gli anticorpi non legati vengono eliminati sciacquando il vetrino, mentre glianticorpi legati del tipo IgG vengono individuati mediante incubazione del substrato conconiugato, marcato con fluoresceina. Per osservare le reazioni si utilizza un microscopio afluorescenza dotato di filtri adatti. Una fluorescenza verde mela rivestimento di cellule delleisolette di Langerhans conferma la presenza di ICAb. Mediante lanalisi di diluizioni seriali sidetermina quindi il titolo (il reciproco della diluizione pi elevata che causa una reazionepositiva).14

ImmuGloANTI-Cellule Isolette (ICAb) Sistema

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CARATTERISTICHE DEL PRODOTTO

Conservazione e preparazioneConservare tutti i reagenti a una temperatura di 2-8C. I reagenti sono pronti per luso dopoaverli portati a temperatura ambiente.

Materiali forniti

ImmuGlo ICAb IFA 1123

I corredi contengono i reagenti sufficienti per realizzare 40 determinazioni ciascuno.

10 x SORB SLD 4 Vetrini-substrato di sezioni delprimate pancreas con 4 pozzetti

1 x 0,5 ml CONTROL + ICA * Controllo positivo ICAb, sieroumano. Contiene ICAb,standardizzato nelle unit di JDF.

1 x 0,5 ml CONTROL - * Controllo negativo, siero umano

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * Coniugato FITC IgG. Tenere lontanodalla luce.

1 x 5 ml CONJ B * Coniugato B. Tenere lontano dallaluce.

1 x 60 ml BUF * Diluente per campioni

2 flaconcini BUF WASH Tampone fosfato-salino (PBS).Ricostituire ciascun flaconcino con 1litro dacqua

1 x 5,0 ml MOUNTING MEDIUM * Mezzo Montante. Non congelare.

1 x 1,0 ml EVANS Blu di Evans

1 x 12 COVER SLD Vetrini coprioggetto

* Contiene < 0.1% NaN3

Materiali necessari ma non forniti

Microscopio a fluorescenzaMicropipetta o pipetta PasteurPipette sierologichePiastra di colorazione (ad esempio vaschetta di Coplin)Piccole provette (ad es. 13 x 75 mm) e porta provetteAcqua distillata o deionizzataContenitore da 1 litroBottiglia di lavaggioCarta assorbenteIncubatore

AVVERTENZE E PRECAUZIONI

Per uso diagnostico in vitro. Il materiale di origine umana utilizzato nella preparazione deireagenti stato controllato ed risultato negativo ai test richiesti dalla FDA per la presenzadellHBsAg, HCV, HIV-1 e 2 e HTLV-I. Tuttavia, maneggiare tutti i campioni di siero umano e

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i prodotti di origine umana come fonte potenziale di infezione, indipendentemente dalla loroorigine, seguendo le normali pratiche di laboratorio per la conservazione, la dispensazionee leliminazione di questi materiali14. ATTENZIONE - La sodio azide (NaN3) pu dar luogo areazioni chimiche pericolose. Per lo smaltimento dei residui delle analisi attenersiscrupolosamente alle norme CDC e alle norme di legge in materia. La sodio azide tossica,se ingerita; in questo caso, informare immediatamente il responsabile del laboratorio o uncentro per casi di avvelenamento.Al fine di assicurare risultati validi, si raccomanda di attenersi alle istruzioni riportate inquesto inserto. Non scambiare i componenti del kit se non con quelli aventi lo stesso numerodi catalogo della IMMCO. Non utilizzare oltre la data di scadenza.

PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL CAMPIONE

Per questa procedura utilizzare soltanto campioni di siero. Campioni fortemente emolizzati,lipemici o contaminati possono influenzare i risultati del test e vanno scartati. Conservare icampioni a una temperatura di 2-8C per non oltre una settimana. Per periodi di conservazionepi lunghi, congelare il siero a 20C, evitando di congelare i campioni pi volte.

PROCEDURA

Metodica danalisi

A. Screening

1. Diluire ciascun siero di paziente 1:5 con il Diluente per Campioni fornito (0,1 ml di siero+ 0,4 ml di Diluente). Non diluire i Controlli Positivi o Negativi. Conservare i sieri nondiluiti per determinare i titoli anticorpali se i test di screening risultano positivi.

2. Lasciare che i sacchetti contenenti i vetrini-substrato raggiungano la temperaturaambiente per 10-15 minuti, quindi estrarre i vetrini facendo attenzione a non toccare ilsubstrato.

3. Marcare i vetrini e porli in una camera umida.4. Capovolgere il flaconcino contagocce e versare delicatamente 1 goccia (circa 50 l)

del Controllo Negativo nel pozzetto no. 1. Allo stesso modo versare 1 goccia delControllo Positivo nel pozzetto no. 2, evitando di riempire eccessivamente i pozzetti.

5. Con una micropipetta o con la pipetta Pasteur, versare 1 goccia del siero diluito delpaziente (circa 50 l) negli altri pozzetti, evitando di riempirli eccessivamente.

6. Mettere il coperchio sulla camera umida ed incubare i vetrini per 18-24 ore a temperaturaambiente.

7. Togliere un vetrino dalla camera umida. Tenendo il vetrino per lestremit della linguetta,sciacquarlo delicatamente con circa 10 ml di PBS utilizzando una pipetta o sciacquarloin un becher pieno di PBS. Non utilizzare la bottiglia di lavaggio. Trasferire il vetrinoimmediatamente nella vaschetta di Coplin e lavare per 10 minuti. Ripetere la proceduraper tutti gli altri vetrini.

8. Togliere il/i vetrino/i dalla vaschetta di Coplin. Asciugare il bordo del vetrino su dellacarta assorbente per togliere la PBS in eccesso. Porre il vetrino nella camera umida.Capovolgere immediatamente il flaconcino contagocce del Coniugato FITC e versarnedelicatamente 1 goccia (circa 50 l) in ciascun pozzetto. Ripetere i punti 7 e 8 perciascun vetrino.

9. Riporre il coperchio sulla camera umida ed incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.10. Ripetere i punti 7-9 con il Coniugato B al posto di Coniugato FITC.11. Togliere un vetrino dalla camera umida e tenendolo per lestremit della linguetta,

immergerlo in un becher pieno di PBS per togliere il coniugato in eccesso. Porre il/ivetrino/i in una piastra di colorazione piena di PBS per 10 minuti. Se si desidera, sipossono aggiungere 2-3 gocce di Blu di Evans al lavaggio finale. Ripetere per gli altrivetrini. NOTA: Un lavaggio scorretto pu aumentare la fluorescenza della priorit bassa.

12. Togliere un vetrino dalla piastra di colorazione. Asciugare il bordo del vetrino su della

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carta assorbente per togliere la PBS in eccesso. Per evitare che il vetrino si secchi,passare immediatamente al punto 13 mentre ancora bagnato.

13. Montare il vetrino coprioggetto versando delicatamente 3 goccia uniformemente diTerreno di allestimento su vetrino coprioggetto, quindi porre il coprioggetto sul vetrino.Non applicare eccessiva pressione ed evitare che il coprioggetto si sposti lateralmente.

14. Ripetere i punti 12 e 13 per ciascun vetrino.15. Esaminare la fluorescenza specifica con un microscopio a fluorescenza a un

ingrandimento di almeno 200x.

I vetrini si possono leggere appena vengono preparati. Tuttavia, grazie a un agente antievanescenza presente nel liquido di montaggio, non si verifica alcuna perdita significativa diintensit di colorazione, se la lettura viene posticipata fino a 48 ore. I vetrini devono essereconservati al buio a una temperatura di 2-8C.

B. Determinazione dellendpoint (Titolazione)

Un siero positivo al test di screening pu essere ulteriormente analizzato seguendo i puntida 5 a 13 per determinarne il titolo. Ciascuna sessione analitica deve includere i ControlliPositivi e Negativi. Effettuare diluizioni seriali doppie partendo da 1:5. Il reciproco delladiluizione pi elevata che produce una reazione positiva il titolo.Se il titolo di controllo positivo entro i limiti definiti dalle specifiche incluse di QC, i livelli delsiero del ricoverato dellanticorpo possono allora essere segnalati nelle unit di JDF16. Ilvalore unit JDF del controllo positivo stampato sulletichetta della fiala. Per calcolare ilvalore unit JDF del siero sconosciuto, dividere semplicemente il titolo dello sconosciutodal titolo del controllo positivo e per moltiplicare questo per le unit di JDF sulletichetta dicontrollo positivo.

Esempio:Controllo Positivo titolo: 1:4. Esemplare titolo 1:10. Etichetta Controllo Positivo: 160 unitJDF.

Calcolo:10

Concentrazione ICAb: X 160 = 400 unit JDF4

Preparazione delle Diluizioni Seriali

Numerare quattro provette da 1 a 4. Aggiungere 0,4 ml di Diluente per Campioni alla provetta1 e 0,2 ml alle provette da 2 a 4. Pipettare 0,05 ml di siero non diluito nella provetta 1 emescolare accuratamente. Trasferire 0,2 ml dalla provetta 1 alla provetta 2 e mescolareaccuratamente. Continuare a trasferire 0,2 ml da una provetta allaltra dopo aver mescolatoper ottenere le diluizioni indicate nella tabella seguente:

Provette 1 2 3 4

Siero 0,1 ml+

Diluentetamponato 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Trasferimento 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlDiluizione finale 1:5 1:10 1:20 1:40 etc.

CONTROLLO DI QUALITA

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Ciascuna sessione analitica deve comprendere sia un Controllo Positivo che uno Negativo.Il Controllo Negativo non deve mostrare alcuna fluorescenza specifica dei rivestimentoendomysio dei pacchi lisci del muscolo, mentre il Controllo Positivo deve avere unintensit dicolorazione dei tubi di queste strutture di almeno 2+ con il controllo positivo EMA.Se non si ottengono i risultati attesi, bisogner ripetere lanalisi. Se continuano a verificarsirisultati inadeguati con i controlli, le cause possono essere: Torbidit. Scartare e utilizzare un altro controllo. Problemi al sistema ottico del microscopio a fluorescenza, quali allineamento non corretto,

bulbo scaduto, ecc. Essiccamento del vetrino durante la procedura.

RISULTATII risultati delle prove per gli anticorpi delle cellule dellisolotto dovrebbero essere segnalaticome negativo (< 5) o positivo con il titolo o le unit di JDF8.Colto per la macchiatura specifica del citoplasma dei cellule delle isolette di Langerhans. Ivari anticorpi del tessuto quali gli anticorpi antinucleari (ANA), gli anticorpi mitocondriali egli anticorpi del muscolo lisco possono anche essere osservati sulle sezioni del pancreas.I sieri che danno c ne di queste reazioni dovrebbero essere segnalati come negazioneper gli anticorpi alle cellule dellisolotto. Tutti i sieri che danno le reazioni di macchiaturanucleari possono essere esaminati sulle cellule HEp-2 o sulle sezioni del fegato del mouse.Tutti i sieri che danno il muscolo liscio o le reazioni di macchiatura mitocondriali possonoessere esaminati sulle sezioni del topo rene/stomaco. Vedere la reazione positiva di ICAbin foto 1 allestremit di questo documento.NOTA: Le reazioni di ICAb sono, per la loro natura, molto pi debole delle reazioni per ANAo la maggior parte delle altre reazioni dellanticorpo di immunofluorescenza.

LIMITI DELLA PROCEDURA

I sieri possono esibire occasionalmente la macchiatura forte per ANA o altri autoanticorpi.Questi possono interferire con la capacit di rilevare gli anticorpi delle cellule dellisolotto.In tali casi, titolare il siero pu consentire la visualizzazione degli anticorpi delle celluledellisolotto. In altri casi il loro titolo pu essere pi basso di il ANA o altri anticorpi e quindinon pu essere rilevato.La prova dellanticorpo delle cellule dellisolotto non dovrebbe essere effettuata sopragrossolanamente emolizzati, campioni da microbi contaminati o lipemici. Questo metododovrebbe essere usato per la prova dei campioni umani del siero soltanto.

VALORI ATTESI

Circa 50-80% dei diabetici di nuovo-inizio positivo per gli anticorpi delle cellule dellisolotto.La prevalenza degli anticorpi delle cellule dellisolotto nei parenti non-diabetici di primo-grado e negli oggetti normali non-diabetici stata segnalata per essere 2-5% e 0.25-1.7%,rispettivamente 5-16. Circa 11% dei parenti positivi di primo-grado dell ICAb sviluppano ognianno il diabete. Gli intervalli di finch 8 anni fra rilevazione degli ICAb e linizio del diabetesono stati segnalati. Vedere lincidenza di ICAb in tabella 1 allestremit di questo documento.

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Teste de anticorpos de imunofluorescncia indirecta para a deteco e semi-quantificaode anticorpos anti-celas ilhotas (ICAb) no soro humano. ICAb ajuda no diagnstico dediabetes insulina dependente (IDDM).

RESUMO E EXPLICAO

O diabetes uma doena metablica crnica e complexa influenciada pelos vrios fatoreshereditrios e ambientais que resultam na inabilidade do corpo manter o uso dos hidratosde carbono, das gorduras e das protenas. A circunstncia, caracterizada por nveiselevados do glicose do sangue, causada por uma deficincia na produo do insulina oupor um debilitamento da utilizao do insulina. A maioria de casos do diabetes caem emduas categorias clnicas: IDDM (tipo I diabetes) e NIDDM (tipo II diabetes).A gerncia do prognstico, do tratamento e da doena diferente para cada tipo. Aceita-se bem que IDDM uma doena autoimune que alveja -celas do celas ilhotas de Langer-hans no pancreas. A resposta autoimune aos celas ilhotas antgenos elica respostas doanticorpos aos antgenos tais como o glutamic acid decarboxylase (GAD), o ICA-512 e oinsulina. Foram encontrados para ser marcadores altamente prognstico, particularmentese atual no titulaco elevado 1-15. A deteo destes ICAb pelo imunofluorescenco indireto(IF) na carcaa do pncreas considerada o padro de ouro para o diagnstico de IDDM16.17. Estes ICAb citoplasmtico so usados atualmente para a predio do tipo I diabetes 18-20.ICAb so detectados em at 90% de pacientes diabticos recentementediagnosticados. No estudo da famlia de Barts-Windsor, 100% dos primeiros parentesdo grau de pacientes de IDDM com ICAb > 80 unidades de JDF progrediu a IDDM dentrode 10 anos. O nvel de ICAb parece ser o mais elevado antes do incio do diabetes tipo Ie diminui progressivamente depois disso 12.18. ICAb tm diversos especificaosdistintos e mostram dois testes padres principais do reatividade4. O primeiro testepadro restringido predominanto aos -celas. O segundo mancha todas as pilhasdentro do ilhotas, e o teste padro manchando clssico para ICAb citoplasmtico.

PRINCPIOS DO MTODO

No mtodo de imunofluorescncia indirecto usado neste kit, o soro dos pacientes incubadoem sees do primata pncreas para permitir a ligao de anticorpos ao substrato. Quaisqueranticorpos livres so removidos atravs da lavagem da lmina. Os anticorpos ligados daclasse IgG so detectados atravs da incubao do substrato com conjugado fluorescenico.As reaces so observadas ao microscpio fluorescente equipado com filtros apropriados.A presena de ICAb demonstrada por uma fluorescncia verde ma os celas ilhotas. Atitulao (o recproca da maior diluo com reaco positiva) ento determinado atravsda testagem de vrias dilues 14.

1123 40 Determinations

ImmuGlo

Anti-Cela Ilhota (ICAb) Teste

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INFORMAO SOBRE O PRODUTO

Armazenamento e preparao

Guardar todos os reagentes a 2-8C. Os reagentes esto prontos a usar aps ficarem temperatura ambiente.

Material fornecido

ImmuGlo ICAb IFA 1123

Os jogos contm reagentes suficientes para executar 40 determinaes cada uma.

10x SORB SLD 4 Lminas de substrato ICAb de 4poos

1 x 0,5 ml CONTROL + ICA * Controlo positivo ICAb, soro humano.Contem ICAb, estandardizado emunidades de JDF.

1 x 0,5 ml CONTROL - * Controlo negativo, soro humano.

1 x 5 ml IgG-CONJ FITC * Conjugado ITCF IgG. Proteger da luz.

1 x 5 ml CONJ B * Conjugado B. Proteger da luz.

1 x 60 ml BUF * Diluente de amostras com BSA

2 vials BUF WASH Tampo fosfato alcalino (PBS). Dissolvercada frasco num litro.

1 x 5,0 ml MOUNTING MEDIUM * Meio de suporte. No congelar.

1 x 1,0 ml EVANS Contra corante Azul de Evans.

1 x 12 COVER SLD Tampas

* Contem < 0.1% NaN3

Material necessrio mas no fornecidoMicroscpio de fluorescnciaMicropipeta ou pipeta PasteurPipetas serolgicasPrato de colorao (ex: Coplin)Tubos pequenos (ex: 13 x 75 mm) e suportes de tubosgua destilada ou desionizadaContentor de 1 litroGarrafa de lavagemToalhetesCmara de incubao

AVISOS E PRECAUESPara o diagnstico in vitro. Todos os componentes derivados dos humanos utilizados foramtestados para HbsAg, VHC, HIV-1 e 2 e HTLV-I e deram negativos nos testes FDA. Todos osespcimens de soro humano e produtos derivados dos humanos devem ser tratados comosendo potencialmente perigosos, independentemente da sua origem. Devem-se respistar asboas prcticas laboratoriais na armazenagem, distribuo e manuseamento destes materiais14.AVISO: A azida sdica (NaN3) pode reagir com as canalizaes de cobre ou chumbo e formarazidas metlicas altamente explosivas. Quando eliminar os lquidos deve deitar grandesquantidades de gua para evitar a formao de tais azidas. A azida sdica pode ser txica se

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ingerida. Se ingerida, contacte imediatamente o director de laboratrio ou um centro deenvenenamento.As instrues devem ser seguidas risca de forma a assegurar resultados vlidos. Notrocar componentes dos kits com outros de outras origens. Todos devem ser do mesmo n daIMMCO. No utilizar se estiverem fora do prazo.

RECOLHA DE AMOSTRAS E PREPARAOS os espcimens sricos devem ser utilizados para este teste. Os espciemens hemolizados,lipmicos ou contaminados microbianamente podem interferir com a performance do teste eno devem ser usados. Armazenar a 2-8C durante apenas uma semana. Paraarmazenamento mais longo devem ser congelados a 20C. Evitar repetidas congelaes edescongelaes.

MODO OPERATRIO

Mtodo do teste

A. Despistagem1. Diluir cada soro 1:5 com o Diluente de amostras fornecido (0,1 ml soro + 0,4 ml

Diluente). No diluir os Controlos Negativo e Positivo. Guardar o soro no diludopara determinar a titulao de anticorpos, se os testes de despistagem forempositivos.

2. Deixar as bolsas com as lminas de substrato temperatura ambiente 10-15 minutos.Retirar as lminas sem tocar no substrato.

3. Etiquetar as lminas e colocar na incubadora com toalhetes hmidos para nosecarem.

4. Inverter o frasco conta-gotas e apertar para aplicar 1 gota (cerca de 50 l) deControlo negativo no poo #1. Coloque 1 gota de Controlo Positivo no poo #2. Noencher demais.

5. Com uma micropipeta ou pipeta Pasteur, colocar 1 gota do soro diludo do paciente(cerca de 50 l) nos outros poos. Evite encher demais os poos.

6. Colocar a tampa na incubadora e incubar 18-24 horas temperatura ambiente.7. Retirar a lmina da incubadora. Segurar pela extremidade e lavar com 10 ml de PBS

com uma pipeta, ou lavar com recipiente cheio de PBS. No usar a garrafa delavagem. Colocar a lmina no recipiente Coplin e lavar 10 minutos. Repetir aoperao para todas as lminas.

8. Retirar a lmina do recipiente Coplin. Limpar as extremidades da lmina num toalhetepara retirar o excesso do PBS. Colocar a lmina na incubadora. Inverterimediatamente o frasco conta-gotas do Conjugado FITC e deitar 1 gota (cerca de 50l) em cada poo. Repetir passos 7 e 8 para cada lmina.

9. Colocar a tampa da incubadora. Incubar 30 minutos temperatura ambiente.10. Repetir passos 7 - 9 com o Conjugado B no lugar de Conjugado FITC.11. Retirar uma lmina da incubadora. Segurar na lmina e mergulh-la num recipiente

com PBS para remover o excesso de conjugado. Colocar a lmina num disco decolorao com PBS durante 10 minutos. Pode colocar 2-3 gotas de contracoranteazul de Evans lavagem final. NOTA: Uma lavagem deficiente pode alterar amorfologia dos neutrfilos e levar a um aumento da fluorescncia.

12. Retirar a lmina do prato de colorao. Limpar o excesso de PBS. Para evitar que almina seque deve passar para o ponto 13 enquanto a lmina ainda est molhada.

13. Colocar a tampa e aplicar 3 gota de Meio de Suporte uniformente em tampas ecolocar a tampa. No faa muita presso e evite deslizamento lateral da tampa.

14. Repetir passos 12 e 1315. Examinar a fluorescncia especfica com microscpis fluorescente com aumento de

200x ou mais.As lminas devem ser lidas quando esto prontas. Contudo, devido presena de umagente anti-desaparecimento no meio de suporte, no h perdas significativas de intensidade

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de colorao, se a leitura for adiada at 48 horas. As lminas devem ser guardadas sescuras a 2-8C.

B. Determinao (titulao)Um soro positivo na despistagem pode ser ainda mais testado com os passos 5 ao 13. Paradeterminara a titulao. Cada teste deve incluir os Controlos Positivo e Negativo. Fazerduas dilues comeando com 1:5. O recproco da diluo mais elevada a produzir umareaco positiva a titulao.Se o titulao do controle positivo estiver dentro dos limites definidos pelas especificaesincluidas de QC, os nveis do anticorpo no soro paciente podem ento ser relatados nasunidades de JDF16. O valor de unidade JDF do controle positivo imprimido na etiqueta dofrasco. Para calcular o valor de unidade JDF do soro desconhecido, para dividirsimplesmente o titulao do desconhecido pelo titulao do controle positivo e paramultiplicar isto pelas unidades JDF na etiqueta positiva do controle.

Exemplo:Controle Positivo titulao: 1:4. Sample titulao: 1:10. Rtulo Controle Positivo: 160 unidadesJDF.

Clculo:10

Concentrao ICAb: X 160 = 400 unidades JDF4

Preparao de dilues em srieNumerar 4 tubos de 1 a 4. Juntar 0,4 ml de diluente ao tubo 1 e 0,2 ml aos tubos 2 a 4. Pipetar0,1 ml de soro no diludo para o tubo 1 e mexer bem. Transferir 0,2 ml do tubo 1 para o tubo2 e mexer bem. Continuar a transferir 0,2 ml de um tubo para o outro aps mexer.

Tubos 1 2 3 4Soro 0,1 ml

+Diluentetamponado 0,4 ml 0,2 ml 0,2 ml 0,2 ml

Transferncia 0,2 ml 0,2 ml 0,2 mlDiluo final 1:5 1:10 1:20 1:40 etc.

CONTROLO DA QUALIDADEO Controlo Positivo e o Negativo devem ser includos em cada teste. O Controlo Negativo nodeve ter fluorescncia especfica do forro endomysial dos pacotes lisos do msculo,enquanto que o Controlo Positivo deve ter 2+ ou maior intensidade de colorao do tubosdestas estruturas.Se no se obtiverem os resultados esperados, o teste deve ser repetido. Se resultadosinadequados continuarem a ocorrer com os controlos, pode deverse a: Turbos. Usar outro controlo. Problemas no sistema ptico do microscpio de fluorescncia: alinhamento incorrecto,lmpada a precisar de ser mudada, etc. Lmina seca durante o processo.

INTERPRETAO DOS RESULTADOSOs resultados dos testes para ICAb devem ser relatados como o negativo (< 5) oupositivo com titulao ou unidades de JDF8.Lido para manchar especfico do citoplasma dos celas ilhotas. Vrio outros anticorpos dotecido tais como os anticorpos antinuclear (ANA), anticorpos mitochondrial, e anticorposdo msculo liso podem tambm ser observados em sees do pncreas. Os soro que doalgumas destas reaes devem ser relatados como o negativo para anticorpos s celas

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ilhotas. Todos os soro que do reaes manchando nucleares podem ser testados nascelas HEp-2 ou nas sees do fgado do rato. Todos os soro que do o msculo liso oureaes manchando mitochondrial podem ser testados em sees do rato rim/ estmago.Ver a reao positiva de ICAb na foto 1 na extremidade deste original.NOTA: As reaes de ICAb so, por sua natureza, muito mais fraca do que reaes paraANA ou a maioria outras de reaes imunofluorescncias do anticorpos.

LIMITAES DO MODO OPERATRIOOcasionalmente os soro podem exibir manchar forte para ANA ou outros autoanticorpos.Estes podem interferir com a abilidade de detectar anticorpos da celas ilhotas. Nessescasos, titulao o soro pode permitir o visualizao dos ICAb. Em outros casos seutitulao pode ser mais baixo do que o ANA ou outros anticorpos e daqui no podem serdetectados. O teste do ICAb no deve ser executado sobre hemolyzidas bruta, amostrasmicrobial contaminadas ou lipemicas. Este mtodo deve ser usado testando amostrashumanas do soro somente.

VALORES ESPERADOSAproximadamente 50-80% de diabetics do novo-incio so positivos para ICAb. Oprevalncia de ICAb em parentes non-diabetic do primeiro-grau e em assuntos normaisnon-diabetic foi relatado para ser 2-5% e 0.25-1.7%, respectivamente 5-16.Aproximadamente 11% de parentes positivos do primeiro-grau do ICAb desenvolvem odiabetes cada ano. Os intervalos de to por muito tempo quanto 8 anos entre a deteode ICAb e o incio do diabetes foram relatados. Ver a incidncia de ICAb na tabela 1 naextremidade deste original.

REFERENCES REFERENCIAS LITERATUR RIFERIMENTI1. Riley WJ, Maclaren NK, Krischer J et al. N. A prospective study of the development of diabetes in relatives of patients with insulin

dependent diabetes. New Engl J Med; 1990, 323:1167-1172.2. Neufeld M, Maclaren NK, Riley WJ et al. Islet cell and other organ-specific antibodies in U.S. Caucasians and Blacks with insulin-dependent

diabetes mellitus. Diabetes; 1980, 29:589-592.3. Gianani R, Pugliese A, Bonner-Weir S et al. Prognostically significant heterogeneity of cytoplasmic islet cell antibodies in

relatives of patients with type I diabetes. Diabetes; 1992, 41:347-353.4. Ziegler AG, Herskowitz RD, Jackson RA et al. Predicting Type I Diabetes. Diabetes Care; 1990, 13:762-775.5. Gale EAM and Bottazzo GF. Can we predict type I (insulin dependent) diabetes? In World Book of Diabetes in Practice; 1986,

Vol 2, Krall L, Ed, Elsevier, New York, 25-29.6. Gorsuch AN, Spencer KM, Lister J et al. Evidence for a long pre-diabetic period in Type I (insulin dependent) diabetes mellitus.

Lancet; 1981, 2:1363-1365.7. Tarn AC, Bonifacio E, Dean BM et al. Predicting insulin-dependent diabetes (Letter). Lancet; 1988, 2:627-628.8. Jackson RA, Soeldner JS and Eisenbarth GS. Predicting insulin-dependent diabetes (Letter). Lancet; 1988, 2:627-628.9. Srikanta S, Ganda OP, Gleason RE et al. Pre-type I diabetes: linear loss of beta cell response to intraveneous glucose. Diabetes;

1984, 33:717-720.10. Srikanta S, Ganda OP, Rabizadeh A et al. First degree relatives of patients with type I diabetes mellitus: islet cell antibodies and

abnormal insulin secretion. N Engl J Med; 1985, 313:461-464.11. Srikanta S, Ganda OP, Jackson RA et al. Pre-type I diabetes: common endocrinologic course despite immunologic and immunogenetic

heterogeneity. Diabetologia; 1984, 27:146-149.12. Riley WJ, Spillar RP, Waltz J and Brody B. Predictive value of islet cell antibodies (ICA) - 6 years experience (Abstract). Diabetes,

1983, 33 (Supp 1):44A.13. Riley W, Maclaren N, Spillar RP et al. Predictive value of ICA for IDD and insulinopenia to iv glucose (Abstract): Diabetes 37

1988, (Issue 5 Suppl): 5A.14. Maclaren NK, Horne G, Spillar RP et al. Islet cell antibodies (ICA) in U.S. school children (Abstract). Diabetes; 1985, 34 (Suppl

1):84A.15. Spencer KM, Tarn A, Dean BM et al. Fluctuating islet cell autoimmunity in unaffected relatives of patients with insulin dependent

diabetes. Lancet; 1984, 1:764- 766.16. Greenbaum J, Palmer JP, Nagataki S et al. Improved specificity of ICA assays in the fourth international immunology of diabetes

serum exchange workshop. Diabetes; 1992, 41:1570-1574.17. Bonifacio E, Lernmark , Dawkins RL et al. Serum exchange and use of dilutions have improved precision of measurement of islet cell

antibodies. J Immunol Methods; 1988, 106:83-88.18. Kolb H, Dannehl K, Grueneklee D et al. Prospective analysis of islet cell antibodies in children with type I (insulin dependent)

diabetes; 1988, Diabetologia;1988, 31:189-194.19. Srikanta S, Ganda OP, Jackson RA et al. Type I diabetes mellitus in monozygotic twins: chronic progressive cell destruction.

Ann Intern Med; 1983, 99:320-326.20. Betterle C, Presotto F, Pedini B et al. Islet cell and insulin autoantibodies in organ specific autoimmune patients: their behavior

and predictive value for the development of type I diabetes mellitus: a 10 year follow-up study. Diabetologia; 1987, 30:292-297.21. Beutner EH, Kumar V, Krasny SA and Chorzelski TP. Defined immunofluorescence in immunodermatology. In Immunopathology

of the Skin, Beutner EH, Chorzelski TP and Kumar V, Eds, John Wiley and Sons, New York; 1987, 3rd Ed, 3-40.22. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control, National Institutes of Health. [HHS Pub.

No. (CDC) 1993, 93-8395].

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Photo 1. ICAb Staining ReactionNote specific staining of the cytoplasm of the islet of Langerhans.

Table 1. Incidence of Anti-Islet Cell Antibodies

Disease Group Age No. Patients % Positive(years) examined

Type I Diabetes (IDDM)at onset

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