DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Nhóm thực hành:………………………..Học kỳ:……………………Năm học:……………………………………

Họ tên SV:………………………………………………………….MSSV:……………………………Lớp:………………

……………………………………………………………………….MSSV:…………………………….Lớp:………………

MỤC LỤC

Bài 1. Tách chiết ADN

Phần I. Thao tác với Micropipette

Phần II. Tách chiết ADN từ máu heo

Bài 2. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Phần I. Pha loãng nồng độ ADN

Phần II. Chạy phản ứng PCR

Bài 3. Điện di kết quả

Phần I. Điện di

Phần II. Phân tích kết quả

Bài tập tổng hợp

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Bài 1: TÁCH CHIẾT ADN

Phần 1: Thao tác với micropipette

Micropipette là thiết bị dùng để thao tác thể tích ở cấp độ micro lit (µl). Trong bài thực

hành này, các bạn sẽ tập làm quen với cách sử dụng micropipette: cách cầm, điều chỉnh

thể tích, hút và nhả dung dịch sao cho chính xác.

A. Cách sử dụng: Mỗi 1 micropipette có thể tích đo lường khác nhau. Biên độ đo thể tích này được ghi rõ trên pipette. Khi điều chỉnh hút dung dịch phải chú ý chọn pipette phù hợp và điều chỉnh thể tích nằm trong biên độ cho phép. Tuyệt đối không được điều chỉnh thể tích vượt ngoài biên độ.

a. Cái móc: cầm Pipet nghiêng về một phía hơi cách lỏng lẻo trên sống bàn tay khi không sử dụng, như vậy sẽ làm cơ tay ít bị quá sức.

b. Cầm chặt bằng cả bàn tay. Tránh cầm pipet quá chặt để giảm mỏi cơ tay và cơ vai sau khi sử dụng pipet lâu.

c. Để lộ phần ghi số thể tích: có thể nhìn trong suốt thời gian để có thể kiểm soát thể tích lấy ngay cả khi đang sử dụng.

d. Nút nhấn lớn: nhấn để đẩy đầu tip ra khỏi pipette.

e. Vặn điều chỉnh thể tích; nhấn/thả để hút/đẩy dung dịch.

e

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

B. Cách lấy mẫu

Mỗi micropipette có biên độ đo thể tích khác nhau sẽ sử dụng đầu tip khác nhau.

- Chọn đúng loại đầu tip cho pipette tương ứng. Ấn pipette vào đầu tip kết hợp

xoay nhẹ. Nếu không xoay có thể có khe hở giữa đầu tip và pipette dẫn đến thể

tích hút thực bị sai và pipette bị nhỏ giọt.

Cầm pipet ở tư thế

thắng đứng.

Ấn tới nấc dừng thứ

nhất. Nhúng đầu pipet tip khoảng 3 – 4 mm vào dung

dịch.

Thả pittông ra từ từ.

Để cho mẫu, ấn tới nấc dừng thứ

nhất

Chuyển tất cả phần còn lại của chất lỏng ở đầu pipet tip ra, ấn tới nấc dừng thứ hai (để phụt hết dung dịch ra khỏi pipet tip).

Dung tích đo lường của

từng loại đầu tip:

Tip trắng: 0 – 10 µl

Tip vàng: 10 – 200 µl

Tip xanh: 100 – 1000 µl

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Dưới đây là 1 số kích thước pipette thường sử dụng

Pipette Biên độ đo lường (µl)

Lưu ý

P10 0.0 – 10.0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 0 hoặc trên 10

P20 2,0 – 20,0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 2 hoặc trên 20

P40 5,0 – 40,0 Không được điều chỉnh thể tích dưới 5 hoặc trên 40

P100 10 - 100 Không được điều chỉnh thể tích dưới 10 hoặc trên 100

P200 20 - 200 Không được điều chỉnh thể tích dưới 20 hoặc trên 200

P1000 100 - 1000 Không được điều chỉnh thể tích dưới 100 hoặc trên 1000

a. Dựa vào bảng trên và pipette thực tế của nhóm, hãy chọn pipette và đầu tip cho

phù hợp để đo lường các thể tích sau đây:

Thể tích Loại pipette Biên độ đo lường Màu sắc tip tương ứng

2.3 µl

154.6 µl

783 µl

36,2 µl

19.0 µl

C. Thực hành thao tác với micropipette:

Mỗi 4 sinh viên sẽ được cung cấp 1 bộ dụng cụ gồm 3 pipette kích cỡ khác nhau, 3 đĩa

petrie có lót sẵn giấy thấm kích thước khác nhau, màu nhuộm.

2 sinh viên sẽ là 1 nhóm nhỏ, làm chung mẫu.

Mỗi nhóm nhỏ hãy hút dung dịch và nhỏ vào 1 bên của đĩa petrie theo các kích thước

cho bên dưới và quan sát dung dịch trong cùng đĩa petrie của nhóm đối diện.

Đĩa petrie A: 250 µl Đĩa petrie B: 90 µl Đĩa petrie C: 5µl

b. Quan sát và ghi nhận vòng thấm lan trên giấy của 2 nhóm?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Phần 2. Tách chiết ADN từ máu heo

A. Tách lọc bạch cầu

Thông thường khi lấy mẫu về, trước khi tách chiết ADN, thường có các bước đầu thao

tác nhằm loại bỏ các thành phần tạp chất hay thành phần không có chứa ADN, nhằm

góp phần giúp thu được ADN tinh sạch sau khi hoàn tất quy trình tách chiết.

Trong phần thực hành này, sinh viên sẽ thao tác tách chiết các thành phần không có

chứa ADN trong máu động vật hữu nhũ (heo)

Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)

2 SV làm chung 1 mẫu

Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác

Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, Ống nghiệm chứa 15ml chứa mẫu, micropippete các loại,

đầu tip các loại, lọ chứa dung dịch bỏ

Hóa chất: dung dịch NaCl 0,2%

Thao tác:

1. Hút 8ml NaCl 0,2% vào ống nghiệm có chứa sẵn 1ml máu heo, trộn đều, ly tâm

với vận tốc 3000 vòng/phút trong 3 phút

2. Hút bỏ phần nổi. Tiếp tục cho vào 8ml NaCl 0.2%, trộn đều, ly tâm 3000

vòng/phút trong 3 phút.

3. Lập lại thao tác 1 và 2 bốn lần.

a. Thành phần của máu bao gồm những gì?

b. Với mẫu là máu heo, ADN nằm ở đâu trong các thành phần kể trên?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

B. Tách chiết ADN

Lưu ý: mặc áo blue và đeo găng tay khi thao tác (tự chuẩn bị)

2 SV làm chung 1 mẫu

Rửa các ống nghiệm dơ sau khi thao tác

Dụng cụ, thiết bị: Máy ly tâm, ống nghiệm chứa mẫu, micropippete các loại, đầu tip các

loại, lọ chứa dung dịch bỏ.

Hóa chất: Lysis Buffer, Proteinase K, Phenol, CIAA (Chloroform/Isoamyl Alcohol), Ethanol

95%, Ethanol 70%, TE 1X

Thao tác:

1. Cho 3ml Lysis Buffer + 30 µl Proteinase K vào ống mẫu ở trên, trộn đều, ủ 550C

qua đêm ( tối thiểu 8 tiếng)

c. Proteinase K (PK) là gì? Tác dụng của PK?

2. Cho vào 3ml Phenol, trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.

d. Ở bước này xuất hiện hiện tượng kết tủa? Kết tủa này là gì? Tại sao xuất hiện kết

tủa?

3. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml Phenol/CIAA,

trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.

e. ADN sẽ nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

4. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm mới, sau đó thêm vào 3ml CIAA

(Chloroform/Isoamyl Alcohol), trộn đều, ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.

f. ADN lúc này nằm ở đâu? Phần loại bỏ bao gồm những gì?

5. Hút phần nổi chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 5ml Ethanol 95% lạnh.

g. Hiện tượng kết tủa sẽ xuất hiện. Chất kết tủa đó là gì?

6. Ly tâm 6000 vòng/phút trong 3 phút. Hút cạn phần dung dịch bỏ đi. Lưu ý đừng

loại bỏ ADN.

7. Cho vào 3ml Ethanol 70%. Trộn đều. Ly tâm 3000 vòng/phút trong 3 phút.

h. Tác dụng của EtOH 70% trong bước này là gì?

8. Hút cạn phần dung dịch bỏ đi. Làm ráo mẫu

9. Cho vào 200 µl TE 1X. Ủ 370C qua đêm.

i. Tác dụng của dung dịch TE 1X?

10. Chuyển dung dịch ADN vào eppendorf 1.5ml.

11. Trữ mẫu ở 40C

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Bài 2: POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Phần I. Pha loãng nồng độ ADN

Tùy theo lượng mẫu và thao tác, nồng độ ADN thu được sẽ không giống nhau sau khi

tách chiết (thường nồng độ này rất đậm đặc). Và trong mỗi một phản ứng PCR, lượng

ADN mẫu đưa vào cũng sẽ có sự khác biệt. Vì vậy chúng ta cần phải pha loãng ADN theo

một nồng độ phù hợp trước khi thực hiện PCR nhằm đơn giản thao tác và phản ứng sẽ

xảy ra chính xác hơn.

Chuẩn bị: ống eppendorf, micropipette, nước cất hoặc TE 1X

Thao tác:

1. Ghi nhận kết quả đo nồng độ mẫu ADN của nhóm vào cột C. (Giáo viên sẽ cung

cấp số liệu cho bạn)

2. Hãy tính toán lượng ADN và lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có được

tổng thể tích mẫu là 200µl với nồng độ 100ng ADN/µl theo công thức sau:

Nồng độ ban đầu x thể tích mẫu gốc = nồng độ cần pha loãng x thể tích mẫu cần

pha

Hay ta có D = (A x B)/C

Lượng nước/TE 1X bạn cần thêm vào để có tổng thể tích 200µl với nồng độ 10ng

ADN/µl? E = B – D

Mẫu A B C D E

Nồng độ cần pha loãng

Thể tích mẫu cần pha

Nồng độ gốc ban đầu

Thể tích mẫu gốc cần thêm vào

Thể tích nước/TE 1X cần thêm vào

100ng/ µl 200 µl

3. Trộn đều lượng nước tính được từ cột E với lượng ADN từ cột D vào ống

eppendorf.

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Phần II. Chạy phản ứng PCR

Để phản ứng PCR xảy ra tốt hoặc có thể dễ dàng dự đoán điều chỉnh thành phần

để kết quả thu được rõ ràng hơn, chúng ta cần phải tính toán và trộn lượng hỗn hợp

tổng cho chính xác. Hỗn hợp tổng được chuẩn bị sẽ bao gồm luôn cả mẫu đối chứng

(N).

1. Chuẩn bị 1 ống eppendorf 1,5ml để trộn hỗn hợp tổng. Ghi số nhóm thực hiện

lên trên nắp ống.

2. Tính toán các thành phần để chạy 4 phản ứng + 1 phản ứng đối chứng (N).

a. Tính toán thể tích từng thành phần cho 1 phản ứng. Điền kết quả vào cột C

Sử dụng các công thức sau để tính thể tích từng thành phần :

- Công thức tam suất

- C = B x V∑/A

- H2O = V∑ - Các thành phần đã biết

-

b. Tính toán và điền kết quả từng thành phần tổng vào cột D

Thành phần A (Nồng độ gốc) B (Nồng độ phản ứng)

C (Thể tích cho 1 phản ứng)

D (Thể tích cho 4 phản ứng +1)

ADN 100ng/ µl 50ng (**)

Nước cất

Dung dịch đệm 10X 1X

dNTPs 1.0mM 150µM

Mồi xuôi F 10pmol/µl 50pmol

Mồi ngược R 10pmol/µl 50pmol

MgCl2 25mM 2,25mM

Enzyme (Taq DNA polymerase)*

5UI/ µl 1UI

Tổng (V∑) 25 µl(**)

*: đưa vào hỗn hợp cuối cùng; **: số liệu có thể thay đổi tùy theo nhóm thực hành

3. Hút các thành phần đã tính vào ống eppendorf 1,5ml. Trộn nhẹ nhàng cho

đều.

4. Chuẩn bị 5 ống eppendorf 200 µl. Đánh số từ 1->4 và 1 eppendorf ghi chữ N

5. Dùng micropipette hút ……. µl hỗn hợp vào từng eppendorf 200 µl

6. Thêm ……… µl ADN vào mỗi eppendorf. Không cho ADN vào ống N

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

7. Phản ứng PCR sẽ được chạy theo quy trình sau:

Bước 1: tiền biến tính 940C, 10phút

Bước 2: Biến tính 940C, 30 giây

Bước 3: Ủ bắt cặp 550C, 45 giây Lặp lại 35 lần

Bước 4: Kéo dài 720C, 45 giây

Bước 5: Bù thêm 720C, 5phút

Bước 6: Giữ mẫu 40C

a. Tổng thời gian chạy phản ứng PCR ở trên kéo dài ít nhất bao lâu?

b. Tại sao cần phải có mẫu đối chứng N? Mẫu đối chứng này có thành phần

gì khác so với các mẫu thí xét nghiệm?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

Bài 3: ĐIỆN DI KẾT QUẢ

Phần I. Điện di

A. Pha agarose nồng độ 1%

1. Cân 1g agarose + 100ml dd TAE 1X

Nếu muốn pha 100ml dd agarose có nồng độ 1,5%, cần bao nhiêu gram agarose?

2. Microwave cho agarose tan đều, sôi khoảng 3 lần.

3. Đợi dd agarose nguội, khoảng 500C, thêm 6 µl ETBR vào. Chú ý lắc nhẹ bình

chứa agarose trên đá bào theo cùng chiều kim đồng hồ rồi lắc ngược lại để ETBR tan

đều trong gel và tránh bọt khí.

a. ETBR là gì? Tác dụng của ETBR?

b. Tại sao phải tránh tạo bọt khí trong quá trình đổ gel?

4. Đổ gel vào khuôn đã gắn lược, chờ gel đông đặc.

B. Load mẫu:

1. Hút 5 µl Ladder 100 (ABM) cho vào giếng giữa

c. Ladder là gì? Tác dụng của ladder? Ý nghĩa của con số 100?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

d. Theo hình, Ladder 100 là giếng:…………………………………………………

e. Xem hình bên dưới và hãy điền kích thước tương ứng với các band của ladder

2. Hút 5 µl mỗi mẫu cho vào các giếng khác nhau

- Điện di ở 100 V trong 30 phút.

Phần II. Phân tích kết quả

Mỗi nhóm sẽ được nhận 1 kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm xác định vật nuôi có

nhiễm 1 trong 2 bệnh sau: PRRS và PED

f. PRRS là viết tắt của:……………………………………………………………………………………………….

PRRS là bệnh: …………………………………………………………………………………………………………….

Có tên gọi khác là……………………………………………………………………………………………………… .

xảy ra trên…………… ……………………………………………………………………..do virus………………………

……… ……gây ra.

g. PED là viết tắt của…………………………………………………………………………………………………

PED là bệnh: ……………………………………………………………………… xảy ra trên……………………...

………………………………………………………………………………..do virus……………………………………….

……………………..gây ra.

Primer Trình tự (5’ – 3’) Đối tượng phát hiện

Vùng gen khuếch đại

Kích thước sản phẩm

ORF6-F GTGGCAACCCCTATAACCAGAG PRRSV ORF6 780 bp

ORF6-R ACGACAGACACAATTGCCGCTCAC

E pro-F CGCAGTTTACACACCTATAGGG Coronavirus E&M 412 bp

M pro-R CCTGCGCCACAACCGAATGCTATT

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

h. F là viết tắt của………………………………….R là viết tắt của…………………………………

i. Hãy tìm và gạch dưới trình tự Nucleotid quy định mồi xuôi và mồi ngược trong

đoạn gien được giải mã dưới dây:

(Lưu ý: Khi xác định trình tự mồi ngược, trước tiên các nhóm phải viết lại trình tự

Nucleotid bắt cặp theo chiều 3’.)

LOCUS AY612613

14281 GCAAAGTTGA GGTCGAAGGT CATCTGATCG ACCTCAAAAG AGTTGTGCTT GATGGTTCCG

14341 TGGCAACCCC TATAACCAGA GTTTCAGCGG AACAATGGGG TCGTCCTTAG ATGACTTCTG

14401 TCATGATAGC ACGGCTCCAC AAAAGGTGCT TTTGGCGTTT TCTATTACCT ACACGCCAGT

14461 GATGATATAT GCCCTAAAGG TGAGTCGCGG CCGACTGCTA GGGCTTCTGC ACCTTTTGAT

14521 CTTCCTGAAT TGTGCTTTCA CCTTCGGGTA CATGACTTTC GCGCACTTTC AGAGTACAAA

14581 TAAGGTCGCG CTCACTATGG GAGCAGTAGT TGCACTCCTT TGGGGGGTGT ACTCAGCCAT

14641 AGAAACCTGG AAATTCATCA CCTCCAGATG CCGTTTGTGC TTGCTAGGCC GCAAGTACAT

14701 TCTGGCCCCT GCCCACCACG TTGAAAGTGC CGCAGGCTTT CATCCGATTG CGGCAAATGA

14761 TAACCACGCA TTTGTCGTCC GGCGTCCCGG CTCCACTACG GTCAACGGCA CATTGGTGCC

14821 CGGGTTAAAA AGCCTCGTGT TGGGTGGCAG AAAAGCTGTT AAACAGGGAG TGGTAAACCT

14881 TGTCAAATAT GCCAAATAAC AACGGCAAGC AGCAGAAGAG AAAGAAGGGG GATGGCCAGC

14941 CAGTCAATCA GCTGTGCCAG ATGCTGGGTA AGATCATCGC TCAGCAAAAC CAGTCCAGAG

15001 GCAAGGGACC GGGAAAGAAA AATAAGAAGA AAAACCCGGA GAAGCCCCAT TTTCCTCTAG

15061 CGACTGAAGA TGATGTCAGA CATCACTTTA CCCCTAGTGA GCGGCAATTG TGTCTGTCGT

15121 CAATCCAGAC CGCCTTTAAT

//

Mồi xuôi:………………………………………………………………………………………………………………………………….

Mồi ngược:………………………………………………………………………………………………………………………………….

Kích thước sản phẩm PCR:……………………………………………………………………..

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

LOCUS JQ282909

25561 GCTTCACTTG TCACCGGTTG TGTAATAGCG CAGTTTACAC ACCTATAGGG CGTTTGTATA

25621 GAGTTTATAA GTCTTACATG CAAATAGACC CCCTCCCTAG TACTGTTATT GACGTATAAA

25681 CGAAATATGT CTAACGGTTC TATTCCCGTT GATGAGGTGA TTCAACACCT TAGAAACTGG

25741 AATTTCACAT GGAATATCAT ACTGACGATA CTACTTGTAG TGCTTCAGTA TGGCCATTAC

25801 AAGTACTCTG CGTTCTTGTA TGGTGTCAAG ATGGCTATTC TATGGATACT TTGGCCTCTT

25861 GTGTTAGCAC TGTCACTTTT TGATGCATGG GCTAGCTTTC AGGTCAATTG GGTCTTTTTT

25921 GCTTTCAGCA TCCTTATGGC TTGCATCACT CTTATGCTGT GGATAATGTA CTTTGTCAAT

25981 AGCATTCGGT TGTGGCGCAG GACACATTCT TGGTGGTCTT

//

Mồi xuôi:………………………………………………………………………………………………………………………………….

Mồi ngược:………………………………………………………………………………………………………………………………….

Kích thước sản phẩm PCR:……………………………………………………………………..

j. Sau khi khuếch đại đoạn gien bằng cặp mồi đã cho ở trên, kích thước sản phẩm

PCR phát hiện PRRSv là…………………….bp và PEDv là………………………………..bp.

Dựa theo kết quả nhận được, mẫu xét nghiệm*………………….:

Dương tính hay âm tính:………………………………………………………………

Kích thước sản phẩm:…………………………bp

Dương tính với bệnh:……………………………………………………………………………………………………….

(*: các nhóm sẽ nhận kết quả từ giáo viên)

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

k. Nếu có 1 hoặc nhiều kích thước trong giếng đối chứng âm tính, điều đó có ý nghĩa

như thế nào?

l. Nếu có nhiều hơn 1 kích thước ở mẫu xét nghiệm PRRS/ PED điều đó có ý nghĩa

như thế nào?

BÀI TẬP TỔNG HỢP

Dựa vào bài báo (Giáo viên cung cấp), hãy trả lời và điền thông tin (bằng tiếng Việt) vào

các nội dung sau:

1. Tên bài báo, tên tác giả

2. Mục đích của nghiên cứu?

DI TRUYỀN HỌC ĐẠI CƯƠNGHướng dẫn và thực hành

3. Đối tượng lấy mẫu và số lượng mẫu được thực hiện trong nghiên cứu?

4. Điền các thành phần/thông tin cần thiết để thực hiện phản ứng PCR vào bảng

sau:

Thành phần tham gia phản ứng

Nồng độ/thể tích phản ứng

Quy trình chạy

phản ứng Nhiệt độ Thời gian

ADN Tiền biến tính

Nước cất Biến tính

Dung dịch đệm Ủ bắt cặp

dNTPs Kéo dài

Mồi xuôi F Bù thêm

Mồi ngược R Số chu kỳ

MgCl2 Tổng thời gian chạy hết phản ứng: …………giờ……………phút…………giây……………

Enzyme (Taq DNA polymerase)*

Tổng (V∑)

5. Kích thước sản phẩm được khuếch đại:…………………………..bp

6. Kết luận của tác giả về nghiên cứu: