High Performance Liquid Chromatography

HPLCSkript zur Vorlesung „Grundlagen der Analytik“

im MSc-Studiengang „Analytik“

Prof. C. Vogt, Leibniz Universität Hannover 3.2.2007

Gliederung

Kurzportrait der Methode

Stationäre Phasen

Mobile Phasen

RetentionsmechanismenNormalphasen-Chromatographie (NP)Umkehrphasen-Chromatographie (RP)

GeräteaufbauVorbereitung des EluentenPumpenInjektorSäuleDetektoren

HPLC heute

kurze Säulen, 2 - 5 mm ID, Stationäre Phase mit sehr kleinem Teilchendurchmesser (3 - 10µm) große Auswahl an stationären Phasenrelativ hohe Eingangsdrücke (bis 400 bar) reproduzierbare Injektion geringer Probemengengeeignete Durchfluss-Detektoren mit sehr kleinen Detektorzellvoluminahoher Automatisierungsgradhohe Auflösung

Moderne Flüssigchromatographie ist gekennzeichnet durch

Partikelgröße 5-10 µmInnendurchmesser 1-5 mmLänge 5-25 cm

Moleküle der mobilen Phase können sowohl mit der stationären Phase, als auch mit den Probemolekülen in Wechselwirkung treten – nicht inert !, kann als variable Einflussgröße für den Trennprozess genutzt werden

Vergleich HPLC - GC

Probenmoleküle haben in Flüssigkeiten kleinere Diffusionskoeffizienten als in Gasen (Nachteil, weil Austausch der Probenmoleküle zwischen mobiler und stationärer Phase in LC viel langsamer erfolgt)

Viskosität von Flüssigkeiten ist größer als die von Gasen (Nachteil –nur kleinere Fließgeschwindigkeiten möglich).

Flüssigkeiten lassen sich im Gegensatz zu Gasen praktisch nicht komprimieren (Vorteil – Kontrollparameter entfällt)

Signale der Analyten sind in LC breiter → Trennstufenzahlen und Auflösung sind geringer (Ursachen siehe van Deemter Gleichung)

Stationäre Phasen

Bei Verwendung als Trägermaterial wird durch chemische Reaktionen die Oberfläche des Silikagels modifiziert → Hydroxy-Gruppen werden durch Alkyl-, Phenyl-, Amino-, Cyano-Gruppen u.s.w. ersetzt→ dadurch gezielte Einstellung chromatographischer Eigenschaften möglich

Sehr feines Silikagel oder anderes Trägermaterial mit möglichst einheitlicher Korngröße entweder direkt als adsorbierende stationäre Phase (Adsorbtions-chromatographie) oder als Trägermaterial (Verteilungschromatographie)

Säulen mit kleinerem Durchmesser benötigen bei gleicher Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase weniger Lösungsmittel → Mikro-HPLC

Höhere Trennstufenzahl erreichbar durch kleinere Teilchen der stationären PhaseKleinere Teilchen lassen mehr Austauschschritte zwischen stationärer und mobiler Phase zu

Stationäre Phasen

Irregulär geformteSilica-Partikel

SiO2 (Kieselgel, Kieselgur)Al2O3ZrO2TiO2PolymereGraphitierter KohlenstoffMagnesiumsilikat (Florisil)

Organischer Polymermonolith UNO SspherischeSilica-Partikel

Organischer Polymermonolith CIM DiskMonolith auf Silica-Basis (Chromolith)

Stationäre PhasenEinteilung nach Polarität der stationären PhaseA stationäre Phase ist polarer als die mobile Phase

→ Normalphase NP (normal-phase), -OH, -NH2

B stationäre Phase ist unpolarer als die mobile Phase→ Umkehrphase RP (reversed-phase), C8, C18, Phenyl

70 - 80% aller flüssigkeitschromato-graphischen Trennungen werden heute in "reversed-phase" Technik ausgeführt

OH

OH

OH

OH

OH

OHOH

OHOH

OH

OH

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

Normal-Phasen-Chromatographie

Umkehr-Phasen-Chromatographie

Polare stationäre Phase Unpolare stationäre Phase

UnpolarerEluent

PolarerEluent

Stationäre Phasen – Bonded phase

C-18

C8

C1

PFP

Oxy-Phenyl

C18, C8, C5, C1, Phenyl, CN, NH2

Schirmen polare Silica-OF vom Analyt-molekül ab

Starke polare WW an der Silica-OFwerden durch schwache Dispersions-kräfte ersetzt

ca. 21 Å Längeall-trans-KonformationMolekülvolumen ca.700 Å3

max. Bindungsdichte2.5 Ketten/nm2

Oder 4.1 µmol/m2 aufflacher OF

Stationäre Phasen – end-capping

nicht umgesetzte Silanolgruppen

mit TMS umgesetzte Silanolgruppen

Sekundäre Umsetzung der verbliebenen Silanolgruppen (end-capping) mit Trimethylchlorosilan

Stationäre Phasen – SchichtdickeAnordnung der gebundenen Phase auf der

Silica-Oberfläche

Idealfall

Realfall

Anzahl Kohlenstoffatome in Kette

Experimentell ermitteltTheoretisches Maximum

Dic

ke [Å

]

Stationäre Phasen

Trennung hängt von Menge und Typ der Adsorptionsplätze bzw. WW-Plätze an der Oberfläche der stationären Phase ab → große Oberfläche wichtig

Parameter des Phasenmaterials, die Retention entscheidend beeinflussen

Partikelgröße → 3 – 10 µm

Partikelgrößenverteilung → so gering wie möglich, meist ≤ d ± 10%

Porendurchmesser → 70 – 300 Å

Oberfläche → 50 – 250 m2/g

Dichte der gebundenen Phase (Anzahl Adsorptionsplätze je Einheitsfläche) → 1 – 5 Plätze je nm2

Retentionsmechanismen

sterischer Anspruch eines Analyten und seine Fähigkeit, mit den Hydroxylfunktio-nen des Kieselgels oder des Al2O3 Wasserstoffbrückenbindungen einzugehen, sind zusätzlich entscheidend für das Maß der Adsorption auf der stationären Phase

NP-Phasen → polare Dipol-Dipol-WW und sterische Effekte dominieren

Competition-Modell → gesamte Oberfläche der stationären Phase ist mit einer Monoschicht aus Solvensmolekülen belegt → Retention der Analytenerfolgt durch kompetitive Verdrängung der LM-Moleküle von der Adsorbens-oberfläche

Zwei Modelle für Mechanismus

Solvent-Interaction-Modell → Bildung einer primären und einer sekundären Schicht aus Eluensmolekülen → ZSS dieser Doppelschicht hängt vom Anteil der polaren Komponente in der mobilen Phase ab → Retentionsvorgang erfolgt durch Wechselwirkung der Analyten (Assoziation oder Verdrängung) mit der zweiten Schicht der Solvensmoleküle → Substanzmoleküle haben somit keinen Kontakt mit der Oberfläche der stationären Phase

RetentionsmechanismenRP-PhasenTrennmechanismus nicht allein durch einfache polare WW beschreibbar, da Kräfte, die zwischen den Analytmolekülen und der unpolaren stationären Phase auftreten nicht ausreichen, um das Maß der Retention auf RP-Materialien zu erklären → Kombination aus Adsorption und Verteilung

Solvophobe Theorie → unpolare stationäre Phase verhält sich wie Feststoff →Retention der Analyten aufgrund Adsorption über solvophobe Effekte an der OF der Umkehrphase → Adsorption steigt mit zunehmender OF-Spannung des Eluenten → hierdurch vermindern die Moleküle ihre Kontaktfläche mit der mobilen Phase → Retention erfolgt deshalb primär aufgrund solvophober WW mit der mobilen Phase und nicht aufgrund polarer WW mit der stationären Phase

Verteilungsmodell → chemisch modifizierte OF des Trägermaterials ähneltflüssiger stationärer Phase, in der Analyte vollständig von den an die Hydroxyl-gruppen gebundenen Alkylketten umgeben sind → keine Isotropie - durchAnbindung an die Kieselgeloberfläche ist eindeutige Vorzugsrichtung gegeben

mit zunehmender Alkylkettenlänge des RP-Materials steigt Verteilungscharakter der Trennung, mit abnehmender Kettenlänge dominiert ein Adsorptionsmechanismus

Zwei Modelle für Mechanismus

Eigenschaften der mobilen Phase

MischbarkeitEinphasiges System muss sich bildenPolare und unpolare Lösungsmittel lassen sich gar nicht, oder nur in bestimmten Verhältnissen mischen (Bsp. Methanol und Hexan)

SiedepunktSiedepunkte < 100°C, damit leichter durch Destillation reinigbarSiedepunkte < 40°C ungünstig, da beim Ansaugen durch die Pumpe Verdampfen auftreten kann (Gasblasenbildung).

Detektor-Kompatibilität (z.B. UV-Transparenz für UV-Detektor oder elektrochemische Inertheit für Amperometrischen Detektor)

PolaritätLöslichkeit der Probenbestandteile

Reinheit, Viskosität, Preis, …

Mobile Phase

LM MW Siede-punkt

Brechungs-index RI

UV Viskosität µ

[°C] [nm] [cP] [Debye]

Acetonitril 41 82 1.341 195 0.358 3.37Dioxan 88 101 1.421 215 1.26 0.45Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68Methanol 32 65 1.326 205 0.584 1.66Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70Wasser 18 100 1.333 185 1.00 1.84

NP-Chromatographie → nicht-polare mobile PhasenRP-Chromatographie → polare Eluenten (Gemische aus Wasser und polaren

organischen LM)

Mobile Phase

Normalphasen-Chromatographie

Pentan/Hexan < Cyclohexan < Toluen < Trichlormethan < Dichlormethan< Tetrahydrofuran < Dioxan < Acetonitril < Ethanol < Methanol << Wasser

gesättigte Kohlenwasserstoffe < Olefine < aromatische Kohlenwasserstoffe = halogenierte Kohlenwasserstoffe < organische Sulfide < Ether < Nitroverbin-dungen < Ester = Aldehyde = Ketone < Alkohole = Amine < Sulfone < Amide< Carbonsäuren

Stationäre Phasenporöse anorganische Adsorbenzien, wie Kieselgel SiO2 oder Al2O3mit polaren Hydroxylgruppen an der OberflächeMobile PhasenPentan, Hexan, Tetrahydrofuren, Dichlormethan, Methanol, Acetonitril

Elutrope Reihe → Lösungsmittel werden nach steigender Elutionskraft geordnetJe größer die Elutionskraft ist desto kleiner wird der Verteilungskoeffizient und desto schneller wandern die Analyten durch das chromatographische Bett Reihe jeweils abhängig von Polarität der stationären Phase

NP-Chromatographie besonders geeignet für Analyte, die sich in unpolarenLM sehr gut lösen → Trennung von Isomeren und von Substanzklassen, deren Elutionsreihenfolge wie folgt ist (geordnet nach steigender Retentionszeit)

Umkehrphasen-Chromatographie

elutrope Reihe und Elutionsreihenfolge der getrennten Verbindungsklassen zeigen bei Umkehrphasen inversen Verlauf verglichen mit NP-Chromatographie

Methode zur Trennung neutraler Verbindungen, die sich in Wasser oder anderen polaren LM (z.B.Acetonitril oder Methanol) lösen

Pharmazeutische IndustrieSteroide, Vitamine, Beta-Blocker und viele andere Wirkstoffe

UmweltanalytikPestiziden

BiochemieBiopolymere, wie Proteine, Peptide, Nukleinsäuren oder Oligosaccharide

Stationäre Phasenporöse anorganische Adsorbenzien auf Kieselgelbasis SiO2 mit chemisch modifizierten Hydroxylgruppen → Alkylketten unterschiedlicher LängeMobile PhasenWasser, Methanol, Acetonitril, Tetrahydrofuran

Elutionstechniken

Gradienten Elutionzwei Elutionsmittel werden stufenlos gemischtAnwendung, wenn Verbindungen der Probe große Unterschiede in derPolarität aufweisen

Isokratische Elutioneine Verbindung oder konstante Mischung mehrerer Verbindungen als mobile Phase genutzt

Elutionskraft der mobilen Phase wird so gesteigert, dass die Konzentration der stärkeren Eluentien während der chromatographischen Trennung erhöht wird

Änderung der Elutionskraft der mobilen Phase während der Laufzeit des Chromatogramms → schärfere peaks und kürzere Laufzeiten v.a. bei komplexen Gemischen von stark unterschiedlich polaren Substanzen

Gradientenerzeugunghochdruckseitig (nach Pumpe) oder niederdruckseitig (vor Pumpe)

Aufbau einer HPLCEntgaste, filtrierte mobile Phase

Förderung durch PumpenPulsationsdämpfung

Mischung der Eluentkomponenten

Injektion der Probe (in mit mobiler Phase mischbarem LM)

Reinigung auf Vorsäule

Trennung auf chromatographischer Säule(eventuell themostatierbar)

Derivatisierung

Detektion

Fraktionssammlung

Datenverarbeitung

Vorbereitung des Eluenten

Filtrieren zum Entfernen feinster Partikel → verbleiben auf stationärer Phaseund ändern deren Eigenschaften mit der Zeit

Ausgasen gelöster Gase (N2, O2) im Bereich der Pumpe oder der Mischkammer bei Kompression möglich → Flussschwankungen → Verschlechterung derReproduzierbarkeit

Ausgasen gelöster Gase (N2, O2) im Bereich des Detektors beim Entspannen→ Gasblasen in Detektorzelle → unruhige Grundlinien oder Spikes

Bei Einsatz eines Fluoreszenzsdetektors kann Sauerstoff als Quencher wirken→ Unkontrollierte Verringerung des Analytsignals

EntgasungstechnikenUltraschall off-lineVakuum-Entgasung on-lineHelium-Entgasung on-line

Pumpen für die Förderung des Eluenten

große Flusskonstanzgroßer Bereich an Flussratenschneller Eluentwechselbeständig gegenüber mobiler Phasewartungsfreundlich

Anforderungen

Schädigungen durchhohe Chloridkonzentrationenstark komplexierende Puffer-SubstanzenChlorierte KW + UV → HClstarke AlkalienHohe Salzfrachten

Pumpen für die Förderung des Eluenten

Pumpenköpfe → korrosionsbeständige EdelstähleKolben → SaphirEin- und Auslassventile → Rubin- oder Saphirkugeln

Korrosionsbeständig(er) → Polyetheretherketon PEEK, Teflon oder Titan

direkt nach Benutzung (vor Abschalten) gründlich mit inertemLösungsmittel spülen !

In Praxis Einsatz von Doppelkolbenpumpe → nockenwellengesteuertePumpenköpfe pumpen zeitversetzt, dadurch nahezu vollkommene Pulsationsdämpfung und sehr konstante Fließgeschwindigkeit

Maximaldruck 400 bar

Fließgeschwindigkeiten 0.1 – 10 mL/min

Einfluss der Fließrate

0.3 mL/min 1.2 mL/min 3.6 mL/min

Trennung von Phenylthiohydanthoin-Derivaten der Aminosäuren Asn, Asp, Glu, Ala, His, Pro, Ile und Phe

Säule: 3.2 mm x 25 cm, Stationäre Phase: LiChrosorb SI 60, 5 µmMobile Phase: tert. Butylmethylether, Detektion: UV 254 nm

Injektionssysteme

Überführung der Probe aus Probenschleife mit definiertem Volumen in den EluentflussSchleifenvolumen 10 – 100 µL, Beladung erfolgt druckfrei mittels SpritzeProgrammierbare Probenaufgabe über Autosampler (zusätzliche Arbeitsschritte möglich, wie Verdünnung, Derivatisierung, Mischen), oft variable Probenvolumina

Trennsäule

Druck- und korrosionsbeständiger Chrom-Nickel-Molybdän-StahlL = 125 – 300 mmiD = 2 – 5 mm für analytische TrennungeniD = 10 – 25 mm für semipräparative Trennungen

Trockenpack- oder Druckfiltrationsmethode (engl. dry-fill procedure, wet-fillprocedure oder slurry-packing procedure)

kleine Teilchen haben großen Oberflächenenergie-Masse-Verhältnisse→ neigen zur Zusammenballung → nur mit Lm wird kompakteschromatographisches Bett in der Säule erhalten

Detektionssysteme

Wichtig in der HPLCVolumen der Messzelle muss so klein als irgend möglich gehalten werden, damit keine Rückvermischung schon getrennter Substanzen erfolgen kann (Peakverbreiterung)

Universelle und selektive DetektorenDetektoren, die die Änderung einer physikalischen Größe der gesamten mobilen Phase mit Analyt messen (Brechungsindex) oder die selektiv nur die Eigenschaften der gelösten Stoffe messen

Wichtigste Detektionssysteme für HPLCUV/Vis, Fluoreszenz, RI, MS, EC (Leitfähigkeit), Lichtstreuung

Wichtigste Kriterien zur Beurteilung eines DetektorsNachweisgrenze, Linearer Messbereich, Selektivität, Empfindlichkeit, Robustheit, Preis

Detektionssysteme

Detektor NWG (ng) (mol/L)

UV-Absorption 0.1 – 1 10-6 – 10-7

Brechungsindex 100 – 1000 10-4 – 10-5

Elektrochemie 0.01 – 1 10-6 – 10-9

Fluoreszenz 0.001 - 0.01 10-6 - 10-8

Leitfähigkeit 0.5 – 1 10-5 – 10-9

Massenspektrometrie 0.1 – 1 10-6 – 10-8

UV-Vis-Detektor

Quecksilber- oder Deuteriumlampen als Strahlungsquellen

Quecksilberdampflampe erzeugtLinienspektrum - 254 nm Deuteriumlampe erzeugt kontinuierliches Spektrum zwischen 190 und 380 nm

Im UV-Detektor durchstrahlt die Strahlungs-quelle eine Quarzzelle, die vom Eluentenpermanent durchströmt wird → dabei wird die Änderung der Absorption von einer Photozelle gemessen und aufgezeichnet

Festwellenlängendetektor

am häufigsten eingesetztbreites Einsatzgebiet, da die meisten organischen Verbindungen UV-Licht absorbierenDetektor außerdem relativ unempfindlich gegen Fluss-und TemperaturschwankungenFlächen abh. von Konzentration und Extinktionskoeffizienten

UV-Vis-Detektor

1 Deuterium-Lampe2 Spiegel3 Probenzelle4 Gitter5 Diodenarray6 Verstärker

Detektorzelle

Absorption wird mit Reihe von Photodioden, von denen jede bei einer anderen Wellenlänge misst, in größerem Bereich gemessen (Spektrum)Polychromatisches Licht von der UV-Strahlenquelle durch Messzelle → einzelne Wellenlängen werden unterschiedlich absorbiert → Licht in Polychromator →spektrale ZerlegungInformationen zur Peakreinheit, Identifizierung von Substanzen, Spektren-Subtraktion, Spektrenbibliotheken

Fluoreszenz-Detektor

1 Xenon-Lampe oder Laser2 Monochromator (Filter oder

Gitter)3 Fließzelle

hohe Selektivität und ausgezeichnete Nachweisempfindlichkeit

Anwendung aber beschränkt auf fluoreszierende Verbindungen (Alternative → Derivatisierung)

UV-Strahlungsquelle → Filter oder Monochromatoren → eine Wellenlänge als Anregungswellenlänge auswählenEnergieabgabe im Bereich längerer Wellenlängen als LichtPhotomultiplier rechtwinklig zur Strahlenquelle angeordnet → nur durchFluoreszenz ausgestrahltes Licht erreicht den Photomultiplier

Intensität abhängig von Konzentration, Extinktionskoeffizient und Quanten-ausbeute des Fluorophors

Fluoreszenzdetektion

Beispiel: Trennung von (+)-FLEC-D/L-Carnitin-Diastereomeren

RP 18/Ultraspere ODS240 mm x 4.6 mm20 µL Injektionsvolumen

Fluoreszenzdetektionλex 260 nm / λem 310 nm

Eluent: 50 mM Triethanol-Aminophosphat / ACNpH 2.60

A 71.5 : 28.5B 75.0 : 25.0

Brechungsindex-Detektor

Brechungsindex (RI)-Detektor Deflektion eines Lichtstrahls ändert sich, wenn sich ZSS der Probe inMesszelle relativ zu der in der Ver-gleichszelle ändert

DeflektionstypDetektor

Vorteilerobust, wenig anfällig gegen Ver-Schmutzungen, Messung über voll-Ständigen RI-BereichNachteilrelativ geringe Empfindlichkeit

ReflektionstypFresnel-Prinzip – Lichtstrahl wird Von Flüssigkeits-Glas-Interface in dieMesszelle hinein reflektiertVorteile – sehr empfindlich, geeignetfür Miniaturisierung, preiswertNachteil – extrem empfindlich Gegenüber ∆p und ∆T

GliederungBeispiel: Trennung physiologisch relevanter γ-Betaine

ohne Derivatisierung

Säule: LiChrosper 100 NH2250 mm x 4 mm, 5µm PartikelEluent: 50 mM NaH2PO4,0.5 mL/min25°C, 20 µL Injektionsvolumen

A RI-Detektion von je 1 µg Substanz je Komponente

B UV-Detektion bei 205 nm von 0.1 µg Substanz je Komponente

C RI-Detektion von je 0.1 µg Substanz je Komponente

Lichtstreudetektor

System besteht aus drei Teilen: Zerstäuber, Drift-Röhre und Lichtstreu-Zelle

(1) Probe aus Trennstrecke wird mit Zerstäuber (N2) in Aerosol umgewandelt

(2) LM wird verdampft (∆T) in Driftröhre

(3) Gebildete Tröpfchen streuenLaserlicht am Ende der Driftröhre

(4) Gestreutes Licht wird im 90°-Winkel oder bei mehreren Winkelndetektiert

LichtstreudetektorProbleme

a) Verdampfung in der Driftröhre für größere Tröpfchen schwieriger – nicht verdampftes LM erhöht das Basislinienrauschen

b) Flüchtige Verbindungen im Aerosol verdampfen in der Driftröhre und werden nicht mehr detektiert.

c) Intensität des Signals erhöht sich mit 6. Potenz der Molekülgröße – ein Teilchen mit der 10fachen Größe in Bezug auf ein anderes erzeugt ein Signal, das 106 Mio mal größer ist (Gefahr von Fehlinter-pretationen hoch)Nachweisgrenze bei Partikeldurchmessern von ca. 1/20 der verwendeten Lichtwellenlänge Detektion von Partikeln mit wenigen nm Größe (1-10 nm) – entspricht MW von wenigen Tausend Dalton

d) Staub kann erheblich störenf) optimale Gasflussrate muss für jede Trennmethode ermittelt werden, bei der das beste S/N-Verhältnis vorliegt

Beispiel 1

Trennung von Alkylphenolpolyethoxylaten in technischen GemischenSäule: NH2 (250 x 4 mm); Detektion: UV 277 nm; Fluß: 1 ml/min;

Eluent: Gradiententechnik von 100 % n-Hexan/2-Propanol 9:1 zu 100 % 2-Propanol/Wasser 9:1 (1 % pro min)

Probe: Präwozell N - Produkte, n: mittlere Anzahl der Ethoxylatgruppen

n = 2-100

0 20 40 60 80

0,00,20,40,60,81,0

Präwozell N20n=20

Nonylphenolpolyethoxylate

Beispiel 2Summarische Bestimmung (A) und Oligomerentrennung (B)

von Triton X-100 in Impfstoff(A) Säule: RP-8 (250 x 4 mm); Eluent: Acetonitril/Wasser 70:30;Fluß: 1 ml/min; Detektion: 200 n ; (B) Säule: NH2 (250 x 4 mm); Eluent: n-Hexan/2-Propanol 9:1

in 100 min zu 2-Propanol/Wasser 9:1; Fluß: 1 ml/min; Detektion: 277 nm

0 5 10 150

20

40

60

80

100

t (min)

mAU

Triton X-100

A

n = 9 - 10

5

2,5

0

10 20 30 40

B

t (min)

A

B