High-content imaging per lo studio di farmaci anti ... · High-content imaging per lo studio di...
Transcript of High-content imaging per lo studio di farmaci anti ... · High-content imaging per lo studio di...
High-content imaging per lo studio di farmaci anti-tumorali e di nuovi bersagli terapeutici
Italia Anna Asteriti1,2, Annalisa Verrico1, Valeria Colicchia3, Giuseppe Giannini3, Pietro Cirigliano4, Giulia Guarguaglini1,2, Patrizia Lavia1,2, Francesca Degrassi1
1. Istituto di Biologia e Patologia Molecolari, Consiglio Nazionale delle Ricerche, c/o Sapienza Università di Roma, Via degli Apuli 4; 2. Nikon Reference Center for Central-Southern Italy @IBPM; 3. Dipartimento di Medicina Molecolare, Sapienza Università di Roma; 4. Nikon Instruments S.p.A., Campi Bisenzio, IT
• Le metodiche di imaging in campo biomedico hanno conosciuto uno sviluppo impressionante, che ha trasformato la microscopia da approccio descrittivo a disciplina quantitativa (“high content”) che consente di ottenere informazioni spazio-temporali accurate e ad alta risoluzione. • Le metodiche di video-registrazione in time-lapse aggiungono un livello di informazione dinamica, essenziale per la comprensione di processi quali la divisione cellulare, il differenziamento, la senescenza, il signalling intracellulare, la comunicazione tra cellule, la migrazione, la risposta ad infezioni, l’induzione di morte cellulare.
INTRODUZIONE
SCOPO DEL LAVORO
RISULTATI
Le metodologie di imaging “high content” permettono un aumentato livello di informatività sulla risposta cellulare a farmaci o altre strategie terapeutiche, e sulla eterogeneità intercellulare, non ottenibile con tecniche classiche che analizzano popolazioni cellulari in toto. Tali metodologie consentono una valutazione anche quantitativa della complessità della risposta cellulare, essenziale per un approccio di medicina personalizzata.
RINGRAZIAMENTI
Condizioni costanti di T°C, CO2, umidità per diversi giorni
Il microscopio Nikon Eclipse Ti presso il Nikon reference center - IBPM-CNR
Ø supporti per acquisizione simultanea di diverse condizioni sperimentali
a. xy multipoint b. Z-stack c. multicanali (fluorescenza)
d. tempo
Ø NIS-Elements HC (High Content Analysis) Ø Completa motorizzazione
Ø Acquisizione multidimensionale
http://bbcd.bio.uniroma1.it/bbcd/archivionotizie/cnr-microscopy-platform-nikon-reference-center-ibpm
L’imaging permette di correlare, al livello della singola cellula, specifici eventi molecolari con cambiamenti globali nell’organizzazione della cellula e nelle strutture subcellulari; misura quantitativamente specifiche risposte (ad es. l’internalizzazione di segnali); rivela eventi “stocastici”, che non sarebbero apprezzati altrimenti (ad es., l’eterogeneità del comportamento di singole cellule in una popolazione tumorale). Pertanto si sta affermando come strumento di indagine fondamentale nel campo della scoperta e valutazione biologica di nuovi farmaci e terapie biologiche.
Scopo del lavoro è stato lo sviluppo di metodologie e protocolli di imaging avanzato per la caratterizzazione di molecole
con potenziale anti-tumorale e la validazione di nuovi bersagli terapeutici
1. VIDEO-REGISTRAZIONE DEGLI EFFETTI DI MOLECOLE DI INTERESSE TERAPEUTICO: DAGLI STUDI IN VITRO AL LIVELLO PRE-CLINICO
2. IDENTIFICAZIONE DI NUOVI BERSAGLI TERAPEUTICI
Mediante videoregistrazione si è voluto seguire l’effetto di Alisertib sul destino di cellule di osteosarcoma trattate. La video-registrazione ha rivelato - inibizione della proliferazione dose-
dipendente, - senza induzione significativa di morte
in mitosi, né nella successiva interfase (fino a 44 ore dal trattamento);
- generazione di cellule geneticamente sbilanciate che possono dar luogo a cloni resistenti e di aumentata aggressività.
1A. Video-registrazione in modalità high-throughput ed analisi automatizzata mediante “machine learning” per seguire, nel tempo, il destino di cellule trattate con l’inibitore della chinasi mitotica Aurora-A Alisertib
FLUORESCENZA TRANSILLUMINAZIONE
Asteriti et al., 2014, Oncotarget; collaborazione con Beate Neumann e Volker Hilsenstein, Advanced Light Microscopy Facility, EMBL, Hidelberg, DE)
1B. SAR (structure-activity relationship)-based drug design: video-registrazione nel tempo della eterogeneità nelle risposte cellulari a nuovi inibitori dell’apparato mitotico
La progettazione di farmaci anti-mitotici è un campo molto attivo, perché inducono morte mitotica indipendente dallo status di p53.
Di Cesare et al., 2017, Oncotarget; collaborazione Prof. R. Silvestri (Drug Design and Synthesis Center, Sapienza)
1C. Attivazione di nuovi checkpoints: inibitori degli enzimi PARP causano catastrofe mitotica in linee di neuroblastoma in maniera dipendente da MYCN
Collaborazione Prof. G. Giannini (Dip. Medicina Molecolare, Sapienza) Colicchia et al., 2017, Oncogene
ESEMPI DI MITOSI ANOMALE VIDEO-REGISTRATE IN COLTURE TRATTATE CON ATI divisione sbilanciata divisione normale morte mitotica
ARIL-TIOINDOLI (ATIs): INIBITORI PROGETTATI IN BASE ALLA STRUTTURA DELLA TUBULINA
La video-registrazione ha visualizzato diversi destini cellulari in colture trattate con 3 inibitori della famiglia ATI. Nei grafici: ogni linea rappresenta il destino di una singola cellula, videoregistrata da 24 a 48 h post-trattamento: - piccole modifiche strutturali (in alto a sin) possono influenzare in maniera significativa la risposta cellulare, e quindi l’efficacia di induzione di morte mitotica; - in tutti i casi, le colture mostrano eterogeneità nella risposta a ciascuna molecola. - la video-registrazione è quindi essenziale per valutare la frequenza di cellule “escaper” in risposta a nuovi trattamenti.
Acquisizione
Segmentazione
Misure ed analisi
- Serie completa di immagini (campi multipli)
- Generazione automatica di maschere di segmentazione
- Misure simultanee dell’intensità del segnale nelle selezioni
Griglia di acquisizione pre-definita
Acquisizione lungo asse z
z-ax
is
λ-acquisizione
File multidimensionale (xyzλ)
Maximum Intensity Projection (xyλ)
nuclei (DAPI) cromosomi (DAPI) cromosomi (pH3Ser10) fuso (alfa-tub)
Rappresentazione schematica del protocollo di acquisizione
Segmentazione: mitosi vs. interfasi
macro ad hoc
2B. Sviluppo di metodologie di imaging in situ (Proximity Ligation Assay, PLA) in modalità automatizzata
Validazione di nuove interazioni tra fattori pro-tumorigenici mediante PLA automatizzata
Imp beta/RAN PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub
cont
rollo
IP
Z
Inte
nsità
di P
LA (a
.u.)
8x106
6x106
4x106
2x106
0
CTR IPZ
****
Interazione di Importina beta con un partner noto (validazione)
Interazione di Importina beta con un nuovo target: Bub3, fattore del checkpoint mitotico
Imp beta/BUB3 PLA PLA/DAPI PLA/alfa-tub
cont
rollo
IP
Z
Gli inibitori delle PARP (tra cui Olaparib) sono in fase di studio preclinico e clinico per diversi tumori. La video-registrazione in time-lapse di cellule di neuroblastoma trattate con Olaparib ha mostrato una modalità inattesa di morte: le cellule entrano in mitosi anche in presenza di danno al DNA e vanno incontro a catastrofe mitotica. Questo destino è specifico delle cellule di neuroblastoma con amplificazione di MYCN, condizione caratteristica dei neuroblastomi più aggressivi.
Per facilitare lo screening di interazioni proteina-proteina (o proteine/inibitore) abbiamo sviluppato ed automatizzato protocolli per in situ Proximity Ligation Assay, per visualizzare velocemente, in condizioni native, interazioni tra proteine in singole cellule nella loro dinamica spazio-temporale.
Affiancando la PLA a screening proteomici abbiamo identificato l’interazione tra Importina beta, una proteina sovraespressa in molti tumori, e il fattore di checkpoint Bub3. L’interazione è specifica ed è inibita dall’inibitore importazolo (IPZ). Le misure di intensità di fluorescenza per i segnali di PLA sono mostrate in unità arbitrarie (a.u.)
2.0x106
1.5x106
1.0x106
5.0x105
0
CTR IPZ
****
Inte
nsità
di P
LA (a
.u.)
2A. La proteina cinetocorica Hec1 e le interazioni tra microtubuli e cinetocori rappresentano un bersaglio efficace nella terapia del cancro
Abbiamo indotto l’espressione (+doxy) della proteina Hec1 mutata nella regione di interazione con i microtubuli (EGFP-Hec1) allo scopo di promuovere una forte malsegregazione dei cromosomi e aneuploidia.
La video-registrazione di una cellula che esprime la proteina Hec1 mutata (verde) e α-tubulina (rosso) identifica la formazione di fusi multipolari (frecce)
minuti
L’espressione di EGFP-Hec1 produce mitosi multipolari con massiccia malsegregazione dei cromosomi e morte da mitosi (pannello B). L’efficienza dell’induzione di catastrofe mitotica è più alta di quella ottenuta con classici veleni del fuso (nocodazolo o taxolo). L’interazione tra microtubuli e cinetocori è quindi un buon bersaglio per lo sviluppo di terapie antitumorali: EGFP-Hec1 inibisce la crescita tumorale in xenotrapianti in topo promuovendo la formazioni di fusi multipolari anche in vivo. E’ in corso lo sviluppo di piccole molecole che inibiscono l’interazione.
Orticello et al., 2015, Oncogene
Interfase
Morte in interfase
Mitosi normale
Mitosi anomala
Morte dopo mitosi anomala
Entrata in mitosi e riadesione senza divisione
Morte dopo riadesione senza divisione
Arresto in mitosi
“Blebbing” durante l’arresto in mitosi
Morte in mitosi
sing
ole
cellu
le
ore
cont
rollo
O
lapa
rib m
orte
(% c
ellu
le)
Morte in interfase
Catastrofe mitotica
Alisertib
cellule poliploidi cellule morte
cellule mitotiche cellule multinucleate
% c
ellu
le
% c
ellu
le
% c
ellu
le
% c
ellu
le
interfase mitosi multinucleata poliploide morte
CONCLUSIONI
Serie di immagini nel tempo
Osservazione fenotipi
Elaborazione quantitativa
modificato da Neumann et al., 2010
Aurora-A è una chinasi pro-oncogenica Sono in corso 57 trial clinici con l’inibitore Alisertib (inbitore competitivo per sito ATP) (ClinicalTrials.gov)
CELLULE U2OS-H2B-GFP
mod da Gascoigne and Taylor, Cancer Cell,2008
ATI Scaffold
R1 R2
H
6,7-‐Cl2
6-‐MeO
MycN -‐
MycN amplificato
Nocodazolo Taxolo
Tempo (x1000min)
Riconoscimento automatico di cellule positive per l’espressione di marker di interesse, in questo caso mitotici
sonde fluorescenti rivelano l’interazione proteina A proteina B
Amplificazione “rolling cycle”
Ab secondari con sonde a DNA
Ab primari contro: Ligation A B
in situ PLA