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13 th LACCEI Annual International Conference : Engineering Education Facing the Grand Challenges,July 29-31, 2015, Santo Domingo, Dominican Republic

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Evaluacin del Mtodo de Extraccin de la Lutena

Obtenida a Partir de la Ruptura Celular de laMicroalga H aematococcus Pluviali sLaura Romero a, Roberto Parra b Ana Karen Martnez c

aDepartamento de Qumica, ITESM, Monterrey, N.L b , c Centro del Agua para Amrica Latina y el Caribe y Centro de CalidadAmbiental, ITESM, Monterrey, N.L

A B S T R A C T

La degeneracin macular asociada a la edad (AMD, por sus siglas en ingls) es la causa principal de la prdida irreversible de la vista

en Norteamrica y Europa; AMD destruye la mcula ltea, la cual es la zona de la retina que provee la visin central necesaria para ver

claramente. Existen diversos estudios epidemiolgicos que reportan una correlacin entre AMD y los bajos niveles de lutena en la

mcula. La lutena es un carotenoide encontrado en la mcula ltea; caracterizado por su potente poder antioxidante y su capacidad

para filtrar la luz azul, protegiendo de esta manera, de los efectos perjudiciales que pueden causar los radicales libres. [3,4] La lutena

no puede ser sintetizada dentro del cuerpo, por lo que solamente puede ser proporcionada mediante la ingesta alimentaria. [2] Las

microalgas representan una fuente no explotada que ofrece posibilidades para el aislamiento de sustancias de inters y alto valor para la

salud, alimentos, cosmticos y aplicaciones biotecnolgicas. La microalga Haematococcus pluvialis se caracteriza por la formacin de

una pared celular sumamente rgida y resistente a ataques tanto mecnicos, como qumicos; disminuyendo considerablemente la

biodisponibilidad de los carotenoides y Luteina acumulados dentro de las clulas; por esta razn existe la necesidad de llevar a cabo su

ruptura celular para poder optimizar la eficiencia de extraccin de compuestos intracelulares. En este estudio se evalu mediante

Microscopa Electrnica de Barrido distintos procesos para promover la ruptura celular de la biomasa; la eficiencia de stos fue

evaluada en trminos de la recuperacin de carotenoides totales, la cual fue estimada mediante Espectrofotometra UV-Vis.

Age-related macular degeneration (AMD) is the leading cause of irreversible vision loss in North America and Europe; AMD destroys

(macula luteal), which is the area of the retina that provides central vision needed to see clearly. Once the disease is in an advanced

stage, treatment options are very limited. Several epidemiological studies report a correlation between AMD and low levels of lutein in

(macula). Lutein is a carotenoid found in the ( macula luteal ); characterized by its powerful antioxidant effect and its capacity to filter

blue light, thereby protecting from the harmful effects caused by free radicals. [3,4] Lutein cannot be synthesized within the body;

therefore it can only be obtained by food intake. [2] The fact that this molecule is considered an active agent in the prevention of chronic

diseases [3] caused the search of alternative sources for the obtaining of this high value compound.

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Microalgae represent an untapped source that offers possibilities for isolation of substances of interest with high value for health, food,

cosmetic and biotechnological applications.

Haematococcus pluvialis microalga is characterized by the formation of a cell wall which is extremely rigid and resistant to mechanical

and chemical treatments. These results in a significant reduce of carotenoid and Lutein bioavailability, accumulated within the cells.

For this reason there is a need to perform cell rupture to optimize the efficiency of extraction from intracellular compounds. This study

was evaluated by scanning electron microscopy and different methods to promote cell rupture of biomass. The efficiency of these

methods was evaluated in terms of total carotenoid recovery, which was estimated by UV-Vis spectrophotometry.

1. I NTRODUCCIN La degeneracin macular asociada a la edad (AMD) es la

causa principal de la prdida irreversible de la vista en Norteamrica y Europa; esta enfermedad destruye la mculaltea, la cual es la zona de la retina que provee la visincentral necesaria para ver claramente. Una vez que laenfermedad est avanzada las opciones de tratamiento sonmuy limitadas. Existen diversos estudios epidemiolgicos quereportan una correlacin entre AMD y los bajos niveles delutena en la mcula. [1,2].

La lutena es un carotenoide, perteneciente a la familia delas xantofilas, la cual est compuesta de 40 tomos de carbonoy presenta en su estructura dobles enlaces conjugados y

enlaces simples a lo largo de una cadena polinica con anillosque contienen grupos hidroxilo en ambos lados, como semuestra en la Fig.1

Fig. 1 . Estructura qumica de la Lutena

Esta molcula es un carotenoide encontrado en la

mcula ltea, caracterizado por su potente poder antioxidantey su capacidad para filtrar la luz azul, protegiendo as de losefectos perjudiciales que pueden causar los radicales libres.[3,4]. La lutena no es sintetizada dentro del cuerpo, por lo quesolamente puede ser proporcionada mediante la ingesta

alimentaria; el hecho de que esta molcula sea consideradaagente activo en la prevencin de enfermedades crniaumenta el inters por buscar fuentes alternativas paraobtencin de este compuesto de alto valor.

Actualmente, los ptalos de la flor marigold (Tageteserecta L ) son utilizados para la produccin comercial lutena [5], sin embargo el contenido de esta xantofila en es extremadamente bajo, pues representa el 0.03% de su pseco, [4] lo que hace que nuevas fuentes enriquecidas lutena sean una alternativa interesante.

Recientemente, las microalgas

2. MATERIALES Y MTODOS

2.1 Condiciones de Cultivo Microalgal

La cepa de la microalga Haematococcus pluvialis(Biomex) utilizada en este estudio fue cultivada a temperatambiente en el medio de cultivo estril BG-11, con fotoperiodo 24:0, aireacin constante y agitacin en shak150 rpm. El cultivo fue realizado en batch y escalado a 10El crecimiento de la microalga fue monitoreado con

microscopio ptico. La biomasa microalgal centrifugadacongel durante 24 horas, para posteriormente ser liofilizad-85C, 0.120 mBar durante 1 da. La biomasa liofilizadaalmacen en oscuridad y bajo ambiente de N2 en unultracongelador a -86C para futuro uso.

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2.2 Ruptura Celular

En este trabajo se utilizaron 4 tratamientos diferentes pararomper la pared celular de las clulas microalgales: autoclave, bao de ultrasonido, tip sonicator y beadbeater. En cadaexperimento se utiliz 100 mg de biomasa previamenteliofilizada, a la cual se le agreg 10 mL de agua desionizada(Milli-Q) para la obtencin de una solucin microalgal.

En el tratamiento de autoclave (Yamato SQ500) seexpuso la solucin a una temperatura de 121C y una presinde 1 atm por 30 minutos.

Para el tratamiento de beadbeater (Precellys 24) lasolucin se agreg a una matriz de lisado con 1 esfera devidrio de 4 mm y esferas de cermica de 1.4 mm (MP

Biomedicals), el tratamiento se llev a cabo por 3 ciclos deduracin de 30 segundos cada uno, a una velocidad de 6500rpm y un tiempo de espera entre ciclos de 5 segundos.

En el tratamiento de bao de ultrasonido (UltrasonicCleaner AS7240AT) la solucin fue expuesta a las ondas de presin de ultrasonido durante 30 minutos a temperaturaambiente.

El ltimo tratamiento evaluado fue mediante un TipSonicator (Branson 250), en el cual la muestra se encuentra en

contacto directo con el ultrasonido al utilizar una micropuntacon una amplitud en la seal de 50% durante 2 minutos, con pulsos cada 20 segundos y tiempos de espera de 15 segundosentre cada uno.

Para mantener una temperatura baja y evitar que lamuestra se degradara, se utiliz un bao de hielo. Una vezefectuada cada una de las pruebas de ruptura celular, secentrifugaron las muestras y se desech el sobrenadante,debido a que los carotenoides son hidrofbicos.

2.3 Microscopa Electrnica de Barrido

Las muestras de biomasa procesada fueron secadasdespus de cada uno de los tratamientos, posteriormente sellev a cabo un recubrimiento con cobre (Denton Vaccum

Desk V) y fueron analizadas utilizando un voltaje de 5 kVel microscopio electrnico de barrido (Phenom ProX) modo de electrones retrodispersivos.

2.4 Extraccin Solvente Orgnico

Se le agreg a la biomasa 5 mL de hexano comsolvente orgnico de extraccin. Se agit en vortex duranminutos y se volvi a centrifugar para recuperar el extracto partculas microalgales. Cada uno de los extractos concentrado a una temperatura de 50C y flujo de 2(ThermoScientific) y fueron analizados posteriormente enespectrofotmetro de placas.

2.5 Carotenoides Totales

Se realizaron barridos dentro de un rango de =350 -600 nm en el espectrofotmetro de placas (FLUOstar Omede los extractos concentrados y de diluciones 1/10 y 1/1utilizando hexano como solvente de aforacin. Para cuantificacin de carotenoides totales se tom la max=450 y elhexano= 0.2592

Concentracin (ppm)

2.6 Hidrlisis Alcalina

La hidrlisis alcalina se lleva a cabo con el objetide eliminar las clorofilas y los lpidos que interfieren enevaluacin espectrofotomtrica de carotenoides y xantfiadems de hidrolizar los steres de lutena para la obtencde su forma libre. En este estudio, se optimizaron condiciones de saponificacin, al evaluar en una muestralutena esterificada (Solanum/Lut-SEN-021111) 3 diferencondiciones de hidrlisis.

En la hidrlisis Sarkar se pesaron 100 mg de luteesterificada, se le agreg 1 mL de metanol y 1 mL de usolucin 0.5 M KOH metanlica, a una temperatura de 50 por 30 minutos, despus se diluye la muestra con 10 mL

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agua desionizada (Milli-Q) y se extrae con 10 mL de hexano,se toma el extracto con una pipeta pasteur y se lava con 10 mLde agua desionizada. El extracto obtenido se lleva a sequedadcon flujo de N2 y posterior a ello se afora a 1 mL con unasolucin hexano-acetona (80:20).

El mismo procedimiento se repiti, cambiandonicamente la solucin de hidrlisis; en la hidrlisisWeissenberg se utiliz 1 mL de una solucin al 5% de KOHen MeOH y se dej en oscuridad a temperatura ambiente,durante toda la noche. La tercera hidrlisis (Mndez) consistidel uso de 1 mL de una solucin al 10% de KOH en metanol.

2.7 Condiciones Cromatogrficas

Los extractos saponificados se pasaron a viales mbar para HPLC, utilizando como blanco la solucin de hexano-acetona (80:20). La separacin y cuantificacin de cadamuestra se llev a cabo mediante fase normal utilizando undetectorr UV a =476 nm (Agilent Technologies 1200), se us

una columna de 3 m de slica (Phenomenex-Luna). La fasemvil binaria consisti n-hexano:acetona 82:18 (v/v) con unaelucin isocrtica a una velocidad de flujo de 1.2 mL/min. Seutiliz como detector UV a una =476 nm. El volumen de

muestra inyectado fue de 20 L. Para la cuantificacin delutena en la muestra se utiliz un estndar de lutena SigmaAldrich (CAS 127-40-2).

3. R ESULTADOS Y DISCUSIN Se logr obtener un cultivo purificado de la microalga

Haematococcus pluvialis despus de 45 das. El crecimientomicroalgal se monitore utilizando un microscopio ptico,donde se puede distinguir la divisin celular y formacin de

nuevas clulas. Se obtuvieron micrografas de la biomasatratada con cada uno de los tratamientos de ruptura celular. Enla muestra control (sin tratamiento) se observa que lamorfologa de las clulas, es esfrica y que existe unatendencia a aglomerarse unas con otras (Fig. 1).

En cuanto a las clulas tratadas con bao dultrasonido (Fig. 2), se puede observar que algunas clulaencuentran rotas, debido a la presin efectuada por cavitac

Fig. 1. Micrografa electrnica de barrido de las clulas de la microalga Haematococcus pluvialis (control), tomada a 20 m

sin embargo la mayora se encuentran intactas; debido a qu bao de ultrasonido fue eficiente en algunas clulas.

Fig. 2. Micrografa electrnica de barrido de las clulas de la microalga Haematococcus pluvialis despus de tratamiento de bao de ultrasonido,

tomada a 8 m

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Se prob el efecto que tendra un sonicador de punta,(Fig. 3) el cual se encuentra en contacto directo con lamuestra, sin embargo la micrografa de este tratamientomuestra degradacin en la superficie y no hay presencia deruptura celular.

Fig. 3. Micrografa electrnica de barrido de las clulas de la microalga Haematococcus pluvialis despus de tratamiento de Tiop Sonicator de punta,

tomada a 4 m

En el caso del homogenizador celular (Fig. 4)utilizando como matriz de lisado perlas de cermica y 1a devidrio se pueden observar perlas de cermica y alrededor elvidrio roto, lo que muestra un tratamiento mecnico muyintenso, adems de que a diferencia de las otras micrografases la nica donde no hay presencia de clulas microalgales.

Fig. 4. Micrografa electrnica de barrido de las clulas de la microalga Haematococcus pluvialis despus de tratamiento de homogenizador celula

tomada a 10 m.

En las clulas expuestas a 121C en el autocla(Fig. 5) se observ, al igual que en el sonicador de punta degradacin en la superficie, sin embargo no hubo ruptura

Fig. 5. Micrografa electrnica de barrido de las clulas de la microalga Haematococcus pluvialis autoclavadas a T= 121C, P= 1 atm, tomada a 4

Los espectros de absorcin de los extractos obtenid(Fig. 6) concuerdan con lo visto en las micrografas, donddetermin que el mejor tratamiento fue el homogenizacelular, seguido del bao de ultrasonido al presentar mayores valores de absorbancia.

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Fig. 6. Espectros de Absorcin de Extractos de Haematococcus pluvialis despus de distintos tratamientos de ruptura celular

Una comparacin del contenido total de carotenoidesobtenidos entre los diferentes procesos se muestra en laFigura 7.

Fig. 7. Comparacin del contenido de carotenoides totales en extractos condiferentes tratamientos de ruptura celular

Las diferentes metodologas de hidrlisis realizadas(Sakar, Weissenberg y Mndez) se muestran en loscromatogramas de las figuras 8, 9 y 10,

Como se puede observar en el cromatograma defgura 9, la hidrlisis ms eficiente es la del proceWeissenberg que se llev a cabo con KOH, dejando reaccin por 12 horas (Fig. 10)

Fig. 8. Cromatograma de la lutena hidrolizada mediante la metodologSarkar

Fig. 9. Cromatograma de la lutena hidrolizada mediante la metodologWeissenberg

Fig. 10. Cromatograma de la lutena hidrolizada mediante la metodologMndez

La Tabla 1 nos presenta un resumen de la estimacide Carotenoides totales en Extracto de la microalga.

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Tabla 1

Estimacin de Carotenoides Totales en Extractos de Haematococcus pluvialis

4. CONCLUSIONES Se determin que el homogenizador celular fue el tratamientoms eficiente para la ruptura celular de la microalgaHaematococcus pluvialis, permitiendo una extraccin de msde 2 veces con respecto a la muestra control.Los tratamientos de sonicador de punta y autoclave degradanla pared celular y la mayora de los carotenoides presentes enella, debido a temperaturas altas alcanzadas.La hidrlisis ms eficiente en la muestra fue la hidrlisis deWeissenberg,

AGRADECIMIENTOS

Este proyecto de investigacin fue financiado porBiotecnologa Mexicana de Microalgas (Biomex)

R EFERENCIAS

[1] Krinsky, N; Landrum, J; Bone, R Biological Mechanisms of the

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