Guias de Laboratorio Farmacognosia y Fitoquímica 2015-1

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Un acercamiento a la qumica de productos naturales con un

enfoque farmacutico

Universidad Icesi, Calle 18 No. 122-135

Pance, Cali - Colombia

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Guillermo Len Montoya Pelez Q.F. PhD. Departamento de Ciencias Qumicas Facultad de Ciencias Naturales Universidad ICESI 2015 Cali-Colombia

Las sesiones de laboratorio 2,3 y 5 fueron tomadas del Manual de laboratorio de Farmacognosia y Fitoqumica de la Universidad de Antioquia (Profesores Alejandro Martinez PhD., Gabriel J. Arango PhD., Elkin Galeano PhD.) y adaptadas a las condiciones de nuestros laboratorios. http://www.icesi.edu.co Calle 18 No. 122-135 Pance, Cali - Colombia | Telfono: +57 (2) 555 2334 | Fax: +57 (2) 555 1441

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Contenido

Laboratorio 1: COLECCIN DE ESPECMENES VEGETALES Y VISITA HERBARIO UNIVERSIDAD ICESI .. 5

Laboratorio 2: RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS .............................................. 10

Laboratorio 3: TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN DE

COMPUESTOS BIOACTIVOS A PARTIR DE FUENTES NATURALES ...................................................... 18

Laboratorio 4. RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN

COLOMBIA (TLC) ................................................................................................................................ 29

Laboratorio 5. ACEITES ESENCIALES .................................................................................................. 40

Laboratorio 6. VALORACIN DE CAPSAICINOIDES EN MUESTRAS DE FRUTO FRESCO DE AJ, SALSAS

PICANTES, PASTA Y OLEORESINA POR HPLC-DAD ............................................................................. 46

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Laboratorio 1: COLECCIN DE ESPECMENES VEGETALES Y VISITA HERBARIO UNIVERSIDAD ICESI

Esta prctica de laboratorio no tendr seccin experimental en laboratorio, se realizar posteriormente a las indicaciones del profesor quien evaluar su preparacin y lectura antes de proceder con la visita al herbario. MARCO TERICO Coleccin de material vegetal para herbario Un herbario es una coleccin cientfica de plantas secas, debidamente preparadas para garantizar su conservacin de manera indefinida. Sobre el material depositado en los herbarios se basa una parte importante de la investigacin botnica, sobre todo en taxonoma, aunque tambin es til para estudios florsticos, biogeogrficos, qumicos e incluso moleculares. El material del herbario es el testimonio de las citas de plantas, de las descripciones de las mismas y de los materiales utilizados para proponer nuevos txones. El tipo de una planta (el material sobre el que se basa un nombre nuevo) es, en la mayora de los casos, una planta seca, depositada y conservada en un herbario. Coleccin de ejemplares Una vez en el lugar de colecta, se procede a la recoleccin de los especmenes. Es conveniente seleccionar materiales vigorosos, evitando que estn enfermos, daados por insectos o comidos por otros animales. Los especmenes deben ser tpicos, es decir representativos de la especie, pero tambin deben colectarse plantas que exhiban todo el rango de variacin de la poblacin. Races, bulbos o cualquier parte subterrnea de la planta deben ser cuidadosamente extradas, tratando de remover la tierra que queda adherida. Es preferible colectar especmenes con flores y en frutos, dado que usualmente son necesarios para la futura determinacin del ejemplar. Es siempre conveniente colectar duplicados del material (por ejemplo, si es un arbusto se colectan varias ramas), excepto en el caso de plantas raras o protegidas, para que luego se pueda realizar intercambio de ejemplares con otros herbarios o para enviar el ejemplar como donacin a algn especialista que lo identifique. Documentacin Una vez coleccionadas las plantas en el campo, se confecciona una etiqueta, donde se consigna la mayor cantidad de datos posibles del ejemplar y del sitio de recoleccin, tales como: nombre cientfico, nombre vulgar, familia a la que pertenece, localidad de recoleccin (pas, provincia,

OBJETIVOS:

Identificar las etapas involucradas en la elaboracin de una coleccin de herbario

Reconocer las etapas del proceso de creacin de una coleccin de herbario desde el secado, tratamiento y procesado para almacenaje.

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departamento, lugar exacto), latitud, longitud, fecha, colector, datos de la vegetacin circundante, datos del lugar en el que crece, color de la planta, flor y fruto, olor, insectos relacionados con la planta. Adems, se registra todo otro dato que el coleccionista considere de relevancia y que no pueden ser observados con posterioridad, como por ejemplo, el tamao y aspecto de la planta entera (si se cogi slo un trozo), el hbito (si es rastrera, trepadora, bulbosa), su abundancia relativa, el estado fenolgico (si tiene hojas para las plantas de hoja caduca, estado de la floracin, fructificacin, etc.), datos de uso y nombres vulgares obtenidos de la gente del lugar Prensado Para preparar una planta colectada a campo y destinada al herbario es necesario secarla y deshidratarla bajo presin lo ms rpidamente posible. Este proceso se lleva a cabo mediante el prensado. Una prensa de campo sencilla consta de dos tableros slidos unidos por tornillos o correas, entre los que se introducen los pliegos de papel que contienen las plantas, separados por almohadillas absorbentes. Las plantas se estiran y acomodan sobre la hoja de papel en el que se van a prensar, procurando que sus rganos tengan una disposicin semejante a la que tenan en vivo. Si el ejemplar es grande se puede doblar sobre el pliego mientras est fresco. Se empieza por colocar la parte superior de la planta en paralelo al eje mayor del rectngulo de papel. Llegando a la base de ste se dobla el tallo de la planta, en un ngulo agudo, de modo de llegar arriba del papel otra vez con el tallo, y se repite de nuevo el dobles, cuantas veces sea necesario. Este plegado en zigzag es el ms conveniente para que las plantas no se rompan, se ajusten al tamao del papel y no sobresalgan por los bordes. Las hojas de las plantas deben estar siempre estiradas, unas mostrando el haz y otras el envs, para apreciar los caracteres del indumento y de la nerviacin por ambas caras. Las hojas de papel que contengan los ejemplares dispuestos, se separan sobre el papel con almohadillas absorbentes, o bien un grupo de hojas de peridicos (ver figura 1). De este modo, no es necesario sacar las plantas de los pliegos donde tan cuidadosamente se han colocado, sino que se reemplazan las almohadillas hmedas por otras secas cuando sea necesario.

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Figura 1. Prensado de material vegeta. En orden prensa, lmina de aluminio corrugada que permita el flujo de los vapores de agua y aire caliente, cartn, peridico y finalmente el material vegetal a ser prensado Etiquetado Una vez que las plantas estn prensadas, secas y determinadas se procede a guardarlas en el herbario. Cada ejemplar debe llevar una leyenda en una etiqueta en la que consten los siguientes datos: nombre de la especie, datos sobre las preferencias ecolgicas del espcimen, lugar donde se recogi, especificando sus caractersticas topogrficas, altitud, coordenadas UTM, ciudad o pueblo ms cercano, y provincia; fecha de la herborizacin; nombre del recolector precedido de legit (se abrevia leg.) y nmero de orden de la planta en su inventario; nombre del responsable de la identificacin de la especie (se antepone determinavit (se abrevia det.) al nombre del botnico que hizo la identificacin. Conservacin y montaje Uno de los mtodos para conservar los ejemplares de herbario es el de congelar los especmenes secos durante 4 das a -32 C de modo tal de matar todos los insectos, larvas y depredadores que pudiesen destruirlas. El montaje consiste en fijar el ejemplar o ejemplares en un soporte definitivo junto con su etiqueta. Hay diversos mtodos. El ms sencillo consiste en fijar las plantas mediante tiritas de adhesivo de tela (esparadrapo o similar), sobre una cartulina o papel grueso, de color blanco y de tamao estndar internacional (23,5cm x 39cm). En primer lugar se pega la etiqueta en el ngulo inferior derecho del pliego. Luego se dispone la planta (o las plantas) en una posicin lo ms natural posible y se sujetan por aquellas partes que no importe tapar, nunca por la base de las hojas o tocando las flores, salvo que stas sean muy grandes, sino por el centro de los entrenudos, pedicelos y pednculos. Cuando las plantas son muy pequeas se montan una o dos y el resto se mete en un sobre de papel, que se fijar con cola cerca del centro de la cartulina. Las partes que se hayan desprendido o se puedan desprender, como flores sueltas, hojas o semillas, se meten tambin en un sobre de papel que se pegar preferentemente cerca del ngulo superior derecho del pliego. El ejemplar as montado se guarda en un pliego doble de papel fino (denominado camisa), en cuyo borde inferior se anotar a lpiz la familia y la especie (ver figura 2) Los grandes herbarios tienen miles de ejemplares guardados convenientemente en cajas y armarios.

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Figura 2. Coleccin depositada en l herbario del Jardn botnico de Missouri. Almacenamiento y disposicin Los pliegos deben resguardarse del polvo, de la humedad, de la luz directa y de los insectos. A los ejemplares se les otorga un nmero de ingreso en la coleccin, se protege cada pliego con una camisa de papel consistente, y todos los pliegos de una misma subespecie, especie, seccin o gnero, se guardan entre dos fuertes cartones que se atan con una cinta. Uno o varios paquetes de pliegos, dependiendo de su volumen, se guardan en cajas de cartn con el contenido debidamente identificado en lugar accesible y fcil de leer. stas a su vez se colocan en un armario metlico de cierre hermtico que permiten almacenarlas en gran cantidad, en un mnimo espacio

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y a humedad constante. Asimismo, el cierre hermtico impide la infestacin de los materiales del herbario por insectos, los que podran acabar en poco tiempo con todos los ejemplares. Esta seccin ser discutida con el profesor en la visita guiada al herbario ICESI. BIBLIOGRAFIA

Gattuso, M.A., Gattuso, S.J. Manual de Procedimientos para el Anlisis de Drogas en polvo, UNR Editora, Rosario, 1999..

Bruneton J. Farmacognosia. Ed. Acribia S.A. 2a edicin. Zaragoza (Espaa). 2001

Trease and Evans.Farmacognosia. 13 Edicin.Bailliere Tindall.Mexico.1989.

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Laboratorio 2: RECONOCIMIENTO DE METABOLITOS SECUNDARIOS

MARCO TERICO Los metabolitos secundarios de las plantas constituyen aquellos compuestos qumicos que

cumplen funciones no esenciales en ellas, debido a que no intervienen en el metabolismo primario

de las mismas.

Los metabolitos secundarios cumplen una funcin especfica para cada planta, algunos son responsables de olores y colores caractersticos, otros son utilizados como mecanismo de defensa, otros son poseedores de propiedades medicinales o txicas. Por mucho tiempo el valor cientfico de los metabolitos secundarios fue desconocido, se reconocan simplemente como productos finales de procesos metablicos, sin funcin especfica, o directamente como productos de desecho de las plantas. En general fueron percibidos como insignificantes por los bilogos por lo que histricamente han recibido poca atencin por parte de los botnicos. Muchas de las funciones de los metabolitos secundarios an son desconocidas. El estudio de estas sustancias fue iniciado por qumicos orgnicos del siglo XIX y de principios del siglo XX, que estaban interesados en estas sustancias por su importancia como drogas medicinales, venenos, saborizantes, pegamentos, aceites, ceras, y otros materiales utilizados en la industria. De hecho, el estudio de los metabolitos secundarios de las plantas estimul el desarrollo de las tcnicas de separacin, la espectroscopia para dilucidar su estructura, y metodologas de sntesis que hoy constituyen el fundamento de la qumica orgnica contempornea. Los metabolitos secundarios de las plantas pueden dividirse en tres grandes grupos sin tener en cuenta en el origen biosinttico y son: terpenoides, compuestos fenlicos y sus derivados y compuestos nitrogenados alcaloides. Sobre el extracto de algunas plantas seleccionadas, realizaremos pruebas qumicas cualitativas de coloracin y/o precipitacin, para determinar la presencia de los siguientes metabolitos secundarios:

# METABOLITO A IDENTIFICAR MATERIAL VEGETAL

1 Alcaloides Flores de vinca rosea, hojas de coca (material fresco)

2 Esteroides y/o Triterpenos Semillas de soya, aceite de oliva, races de diente de len.

3 Saponinas Fruto de lulo.

4 Taninos Hojas de llantn, hojas de guayabo.

5 Flavonoides Naranjo, sauco.

6 Antocianinas Hojas de repollo morado

7 Lactonas (,-insaturadas) Hojas de azuceno, semillas de guanbana

OBJETIVO:

Identificar y clasificar diversos metabolitos secundarios presentes en especies vegetales,

mediante pruebas qumicas de coloracin y/o precipitacin.

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8 Quinonas Rizomas de ruibarbo, cscara sagrada

9. Cumarinas Races de Francesino, Castao de indias.

SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

METODOLOGIA MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

ITEM Cantidad Unidades

Mortero con pistilo 1

Beackers de 100 mL 3

Beackers de 250 mL 3

Erlenmeyers de 150 mL 3

Varilla de vidrio 1

Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

Equipos de proteccin personal

Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad

Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su

intercambio con los dems compaeros de laboratorio.

Manejo de Residuos qumicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los

residuos generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el

estudiante debe:

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los

cuales estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.

Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo

de la prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del

laboratorio, quien le indicar la forma correcta de hacerlo

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Soporte universal 2

Pinza medina con nuez 2

Erlenmeyer con desprendimiento lateral de 250

mL con tapn plstico

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Tubos de ensayo 15 mL 8

Gradilla 1

Papel de filtro 10 cm dimetro 3

Pipetas paster plsticas 5

Probeta de 50 mL 1

Pipetas de 1,2 y 5 mL 1

Esptula cuchara 1

Placas cromatografcas de silica-gel 2

Capilares para cromatografa 3

Cmara para cromatografa 1

Pinzas para tubos de ensayo 2

Frasco lavador 1

Cinta de enmascarar 1

Algodn 1 bolsa

Papel craft 2 m

Tijeras 1

REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Reactivos Cantidad Unidades

HCl 100 mL

Tiocinato de Cobalto 1 G

HgCl2 7 G

cido 3,5-dinitrobenzoico 1 G

Etanol 400 mL

NaOH 50 G

Diclorometano 200 mL

Cloroformo 50 mL

Sulfato de Sodio Anhidro 50 G

Anhdrido actico 10 mL

cido sulfrico 100 mL

Cloruro frrico 3 G

gelatina-sal 10 G

acetato de plomo 6 G

cido actico glacial 100 mL

Magnesio en limaduras 0.02 G

Acetato de etilo 400 mL

Agua oxigenada 50 mL

Tolueno 20 mL

Amoniaco 100 mL

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cido mineral 100 mL

Subnitrato de bismuto 1 G

Yoduro de potasio 1 G

MATERIAL VEGETAL

Tabla 3. Listado de material vegetal necesario para el desarrollo de la prctica por pareja.

Reactivos Cantidad unidades

Flores de vinca rosea, Hojas de coca 5 G

Semillas de soya, aceite de oliva, races de diente de len. 5 G

Pencas de sbila, fruto de lulo. 5 G

Hojas de llantn, hojas de guayabo. 5 G

Naranjo, sauco. 5 G

Hojas de repollo morado 5 G

Hojas de azceno, semillas de guanbana 5 G

Rizomas de ruibarbo, cascara sagrada 5 G

Races de Francesino, Catao de indias. 5 G

EQUIPOS

Tabla 4. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Equipos Cantidad

Bao Mara 1

Plancha de calentamiento 1

Cmara UV 1

Balanza semi-analtica 1

Ultrasonido de 120 mHz 1

Cmara de elucin vertical TLC 1

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL IDENTIFICACION DE ALCALOIDES: Los alcaloides son bases nitrogenadas, las cuales pueden convertirse en sus respectivas sales mediante la adicin de un cido diluido y formar precipitados al adicionar los llamados reactivos para alcaloides. En esta prctica utilizaremos los reactivos de: Scott, Mayer y Dragendorff, entre otros reactivos existentes para realizar esta prueba. Tome aproximadamente 5 g del material vegetal fresco depostelos en un mortero y triture. Coloque el material triturado en a un beacker o erlenmeyer. Adicione un volumen suficiente de cido clorhdrico al 5% que cubra la muestra. Lleve al ultrasonido (temperatura de 40C) durante 5 minutos, enfri y filtre. Adicione en 4 tubos de ensayo (previamente rotulados con el nombre de cada reactivo a adicionar) 1 ml del filtrado. Agregue a cada tubo, 2 gotas de los reactivos de: Dragendorff, Mayer y

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Scott. Si se observa turbidez o precipitado se considera que la muestra contiene alcaloides (Prueba presuntiva), la prueba de Scott da coloracin azul y es exclusiva para alcaloides tropnicos. Realice el ensayo con un estndar de boldina en solucin cida antes de realizarlo sobre la muestra problema. RECONOCIMIENTO DE ESTEROIDES Y/O TRITERPENOIDES (Lieberman burchard): Tome 5 g de la muestra vegetal seca y molida, colquela en un beacker limpio y seco y adicione diclorometano en cantidad suficiente que cubra la muestra, lleve al ultrasonido por 5 minutos (NOTA: para asistir la extraccin con diclorometano, el bao del ultrasonido debe estar a temperatura ambiente). Adicione una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro, para retirar la humedad que pueda existir y filtre. En un tubo de ensayo limpio y seco tome 1 ml del filtrado orgnico y agregue por la pared del tubo 1 ml de anhdrido actico y con precaucin 1-2 gotas de cido sulfrico concentrado. La aparicin de coloraciones: verdes, azules, rojas o violeta es prueba positiva (+) para esteroides y/o triterpenos en la muestra. RECONOCIMIENTO DE SAPONINAS: Las saponinas corresponden a un grupo de glicsidos solubles en agua que tiene la propiedad de disminuir la tensin superficial del agua formando espuma y de hemolizar la sangre. Las saponinas se hidrolizan en carbohidratos y en sapogeninas. Tome aproximadamente 1 g del material vegetal fresco y macere en un mortero, adicione suficiente cantidad de agua que cubra la muestra. Filtre a travs de gasa. Adicione 4 ml del filtrado a un tubo de ensayo y agite vigorosamente durante un minuto. La presencia de abundante espuma, estable aproximadamente 5 minutos es prueba presuntiva de la presencia de saponinas en la muestra. RECONOCIMIENTO DE TANINOS: Los taninos constituyen sustancias de defensa contra los parsitos, se localizan en hojas, ramas y debajo de la corteza. Tome aproximadamente 5 g del material vegetal fresco, macere en un mortero hidratando la muestra para facilitar el rompimiento de los tejidos. Coloque la muestra completamente macerada en un beaker adicione cantidad suficiente de agua para cubrir la muestra y sonique por 5 minutos a 40C. Filtre en caliente y coloque 1 ml del filtrado en un tubo de ensayo. Adicione dos (2) gotas de solucin de tricloruro frrico (FeCL3 al 1%). La aparicin de un color verde, azul o negro es prueba positiva (+) para compuestos fenlicos. En un segundo tubo de ensayo adicione 1 mL del filtrado y agregue unas gotas del reactivo gelatina-sal. La presencia de turbidez o formacin de precipitado es prueba positiva para taninos en la muestra. Las dos pruebas son necesarias para comprobar la presencia de taninos. RECONOCIMIENTO DE FLAVONOIDES, ANTOCIANINAS Y LACTONAS (CARDIOTNICOS): Los flavonoides son compuestos polifenlicos los cuales tienen 15 carbonos representados en 2 anillos bencnicos unidos por una cadena lineal de tres carbonos. Macere en un mortero aproximadamente 5 g del material vegetal finamente picado, depostelo un beaker o erlenmeyer y adicione suficiente cantidad de etanol para cubrir la muestra. Sonique a 40C durante cinco minutos, enfri y filtre. Si hay presencia de clorofilas, aada al filtrado un volumen igual de solucin de acetato de plomo/cido actico, agite, deje en reposo por 15 minutos y filtre.

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Realice con el filtrado las tres pruebas siguientes, especificas para reconocer: flavonoides, antocianidinas y cardiotnicos (lactonas). ENSAYO PARA FLAVONOIDES Adicione un 1 ml del filtrado etanlico en un tubo de ensayo, agregue varias limaduras de magnesio y por la pared del tubo deje caer lentamente HCl concentrado (37%). La aparicin de colores: naranja, rojo, violeta rosado, indican que la prueba es positiva (+) para flavonoides. (Puede emplearse un estndar como la rutina para observar el viraje de coloracin) ENSAYO PARA ANTOCIANINAS En un tubo de ensayo coloque 2 ml del filtrado y adicione 1 mL de HCl conc (37%). Caliente en bao mara por 15 minutos. La aparicin de una coloracin roja es indicativa de la presencia de antocianinas en la muestra. ENSAYO PARA LACTONAS (CARDIOTNICOS) Con la ayuda de un capilar siembre en una placa cromatogrfica el extracto obtenido. Deje secar e introduzca luego la placa en la cmara cromatogrfica previamente activada con la fase mvil acetato de etilo: Diclorometano, en proporcin (3:2). Deje correr y retire la placa 1cm antes de alcanzar el final. Seale con un lpiz el frete hasta donde corri la fase mvil. Deje secar y realice el revelado utilizando el reactivo de Kedde, para ello introduzca la placa en la campana extractora y asperja sobre ella el reactivo. Deje secar y observe la coloracin de las bandas formadas. La aparicin de bandas de color violeta o prpura son prueba positiva para la existencia de lactonas en la muestra. Hay que tener presente que la prueba de kedde permite la visualizacin de lactonas ,-insaturadas, las cuales estan presentes en estructuras de compuestos cardiotnicos como los glicsidos de digitalis, oleander y thevethia. Pero tambin estn presentes en compuestos policetdicos como las acetogeninas de semillas de guanbana sesquiterpenlactonas de algunas asterceas. RECONOCIMIENTO DE QUINONAS (Naftoquinonas y/o Antraquinonas) Las naftoquinonas y las antraquinonas, corresponden al grupo de quinonas que se encuentran frecuentemente en las plantas superiores, aun cuando tambin se han aislado de microorganismos y lquenes. Las quinonas naturales, se forman en la planta a travs de la ruta biosinttica del acetato y qumicamente corresponde a orto-quinonas y para-quinonas, son de color amarillo, caf o anaranjado pero cuando existen como sales de hidroquinonas, son de color verde, azul o purpura. Pese aproximadamente 0,5 g de material vegetal en polvo en un beacker de 100 ml, adicione 20 ml de etanol al 95% y lleve al sonicador a 45C por 5 minutos, filtre en caliente, tome 5ml del filtrado y adicione aproximadamente 3 mL de H2SO4 al 20% y 2 mL de agua oxigenada de 20 volmenes; caliente en bao mara durante 15 minutos hasta ebullicin para producir la hidrlisis; deje enfriar la muestra y realice la extraccin de las quinonas con 5 ml de tolueno (usar el tolueno bajo campana extractora). Agite suavemente sin emulsionar. Tome 2 ml de la fase orgnica en un segundo tubo de ensayo, adicione aproximadamente 1 ml de NaOH al 5% en amonaco al 2%.

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Luego de agitar se obtiene un color rojo cereza en la capa acuosa, lo que indica presencia de quinonas en la muestra. RECONOCIMIENTO DE CUMARINAS Macere 0.5 g de material vegetal fresco y colquelo en un tubo de ensayo grande, agregue cantidad suficiente de etanol al 70% que cubra el material vegetal. Observe bajo la luz UV a 365 nm la aparicin de una coloracin fluorescente que puede ser amarilla, verde o roja. PREPARACIN DE SOLUCIONES PARA ASPERSIN Y PRECIPITACIN

Dragendorff: Solucin A: Disuelva 0.85 gramos de subnitrato de bismuto en 10 mL cido actico

glacial y 40 mL de agua con agitacin y bajo un leve calentamiento (50C). filtre de ser necesario.

Solucin B: disuelva 8 g de yoduro de potasio en 30 mL de agua. Prueba: mezclar 0.5 mL de

Solucin A con 0.5 mL de Solucin B y adicionar 2 mL de cido actico glacial y 20 mL de agua.

Scott: Solucin 1: disuelva 0.5 g de tiocianato de cobalto en 25 mL de agua y adicione 25 mL de

glicerina. Solucin 2: cido clorhdrico concentrado. Solucin 3: Cloroformo. Prueba: Adicione dos

gota de la solucin 1 (hay aparicin de precipitado color azul) con 1 gota de la solucin 2 y agite

vigorosamente. Finalmente adicione la solucin 3 y agite hasta recuperar la coloracin azul en la

capa orgnica.

Mayer: Solucin 1: disuelva 1,36 g de cloruro HgCl2 en 60 ml de agua. Solucin 2: disuelva 5 g de KI

en 10 ml de agua. Prueba: a 6 mL de la solucin 1 se le adiciona 1mL de la solucin 2 y lleve a un

volumen de 10 mL en una probeta. Se utiliza sobre soluciones aciduladas. Las soluciones no deben

contener cido actico etanol, porque disuelven el precipitado. Se deben agregar solo unas

cuantas gotas del reactivo, porque algunos alcaloides son solubles en el exceso de reactivo.

Kedde: Solucin 1: a 3 g de cido 1,3-dinitrobenzico se disuelven en 100 mL de etanol grado

reactivo. Solucin 2: solubilizar 8 gramos de NaOH en 100 mL de agua. Prueba: para precipitacin

agregue dos gotas de cada solucin. Para aspersin primero asperge la solucin 1 y dos minutos

despus la solucin 2.

PREGUNTAS

Con base en la bsqueda bibliogrfica indique la utilidad teraputica de los metabolitos

identificados en cada una de las especies vegetales utilizadas. Debe referenciar las fuentes

consultadas.

Investigue los nombres cientficos de las especies vegetales utilizadas y la familia a la que

pertenecen segn la clasificacin taxonmica.

Escriba la estructura base de los metabolitos identificados.

Escriba la bibliografa que consult

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BIBLIOGRAFIA

Wagner, H., Bladt, S., Zgainski, E. M., Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography

Atlas, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York Tokyo, 2004.


Trease and Evans. Farmacognosia. 17 Edicin. Bailliere Tindall.Mexico.2003.

Sanabria Galindo A. Anlisis Fitoquimico Preliminar. Universidad Nacional de Colombia.

1983.

Bioactive compounds from natural sources. Second edition. 2012.

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Laboratorio 3: TCNICAS GENERALES DE AISLAMIENTO, SEPARACIN Y PURIFICACIN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS A PARTIR DE FUENTES

NATURALES

MARCO TERICO Los mtodos cromatogrficos son los procedimientos separativos ms utilizados en la investigacin de productos naturales. Se emplean para separar y purificar los componentes presentes en los extractos de origen vegetal o animal. La tcnica se fundamenta en la interaccin entre dos fases, una fase fija o estacionaria (lquido o solido) y una fase mvil (gas o lquido). La fase estacionaria corresponde a la fase adsorbente, puede ser un slido, un lquido o un gel. Si es un lquido este puede estar soportado en un slido que pude o no participar en el proceso de separacin. El lquido puede estar qumicamente unido al solido como fase ligada o inmovilizado sobre l. Los adsorbentes ms utilizados son:

oxido de aluminio o almina

celulosa

slica gel

poliamidas. Cromatografa planar La cromatografa de capa fina o cromatografa planar, es uno de los mtodos ms ampliamente utilizados para separar, identificar los componentes de una mezcla proveniente de extractos naturales o activos obtenidos mediante reacciones de sntesis. En la cromatografa de capa fina, la fase estacionaria est constituida por una capa uniforme de adsorbente solido (slica gel o almina) sostenida en una placa de vidrio o de aluminio, sobre la cual se aplica con un capilar la muestra de el compuesto o mezcla a separar. La fase mvil (eluente) est constituida por un disolvente o mezcla de disolventes adecuados. La separacin se da por interaccin entre la fase mvil y la fase estacionaria. El eluente asciende por capilaridad sobre la fase estacionaria, permitiendo la separacin de los componentes por afinidad con la fase estacionaria y la fase mvil. A continuacin se presenta una foto de un resultado cromatogrfico:

OBJETIVO:

Separar e identificar los Carotenoides presentes en el material vegetal asignado, utilizando tcnicas cromatografcas de columna y capa fina.

Seleccionar el los eluentes adecuados, con el fin de aislar compuestos puros y caracterizarlos por mtodos de coloracin, cromatogrficos y espectrofotomtricos.

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Los compuestos separados se localizan en la placa directamente, en el caso de ser derivatizados o con ayuda de un revelador UV o de un reactivo de coloracin especfico. Los componentes ascienden por la capa de adsorbente a diferentes velocidades. La movilidad relativa se conoce como Rf el cual puede ser definido por la siguiente ecuacin:

=

( )

Donde Zi, Zf y Z0 son:

La cromatografa en capa fina como mtodo cualitativo o cuantitativo, se requiere un estndar de referencia para comparar su valor de Rf con el de la muestra. Cromatografa en columna (CC) Es una tcnica de separacin en la que la fase estacionaria (slica gel o almina) se encuentra soportada en una columna de vidrio. La muestra es aplicada en forma lquida sobre la parte superior de la columna. En la CC clsica el sistema ms empleado es la adsorcin, teniendo en cuenta que las fuerzas de atraccin son diferentes para los distintos componentes, estos fluyen de arriba hacia abajo con velocidades diferentes. Esta separacin depender en gran medida de las caractersticas fisicoqumicas de material de empaque. Parmetros fsicos del material de empaque como tamao de partcula, tamao de poro, distribucin promedio de tamao de partcula harn grandes modificaciones a los tiempos de retencin y resolucin de las separaciones. Convencionalmente el tamao de la columna depende de la cantidad de muestra

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que se va a separar, se acostumbra usar en proporcin 30:1 de peso de adsorbente: peso de muestra. En la columna se introduce un pequeo pedazo de algodn o lana de vidrio. Posteriormente se empaca el adsorbente de manera uniforme sin que queden orificios o grietas (se golpea la columna con un lpiz o un pedazo de manguera). Luego de llenarse se coloca en el tope un pedacito de algodn o de papel de filtro. Se adiciona el disolvente y una vez alcance el borde superior de la fase con la ayuda de un gotero de punta larga y fina. Se adiciona luego disolvente con el fin de que la muestra penetre por lo menos 0,5 cm en el adsorbente. Como la mayora de los componentes son incoloros, se colectan fracciones sucesivas, cada una con un volumen aproximado del 5% al 10% del volumen total de la columna. Las fracciones separadas se analizan por cromatografa planar, las fracciones iguales se unen, el solvente se evapora quedado los componentes separados. Carotenoides El grupo de Carotenoides estn conformados por cientos de molculas tetraterpnicas conformadas por la unin en cadena de ocho unidades isoprnicas. Los Carotenoides son los responsables de la gran mayora de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en las especies vegetales, esto se explica por la presencia en sus estructuras de grupos cromforos caractersticos (por lo menos diez dobles enlaces conjugados) y de un buen nmero de ramificaciones de grupos metilo, situados en posiciones constantes. Se habla de caroteno cuando la estructura de la molcula est constituida solamente por carbono e hidrogeno (por ejemplo el -caroteno, el licopeno, etc.). Cuando existen grupos hidroxilo se habla de Xantofila (por ejemplo la lutena). A los Carotenoides generalmente se les denomina con nombres comunes que incluyen las variaciones estructurales de los anillos laterales, en especial la posicin del enlace doble. El -caroteno, hoy es denominado ,-caroteno, para indicar que los dos anillos de los extremos tienen el enlace doble en la misma posicin relativa. El -caroteno, ahora se denomina ,-caroteno. En general para los carotenos se usa el sufijo caroteno, y para las xantofilas el sufijo ina. Es conocido que los Carotenoides de las frutas y verduras de la dieta son la principal fuente de vitamina A. La molcula de -caroteno se parte en dos molculas de vitamina A (retinol), en un proceso que ocurre en el intestino y en el que participa un complejo enzimtico dioxigenasa. Cualquiera de los Carotenoides que posean el anillo no sustituido, caracterstico del -caroteno, es precursor de la vitamina A, por ejemplo -caroteno, ,- caroteno-5,6-epxido y -criptoxantina. El uso biomdico de los carotenoides est fundamentalmente dirigido a la produccin de Vitamina A, sin embargo actualmente se investiga el potencial del licopeno, la lutena y la Zeaxantina, en la prevencin de enfermedades como el cncer y la enfermedad coronaria. Estructuras de algunos carotenos de mayor ocurrencia en plantas y alimentos

21

Absorcin de luz El sistema de enlaces dobles conjugados constituye el cromforo que absorbe luz que caracteriza a los colores atractivos de los carotenoides y le provee de un espectro de absorcin visible que es usado con frecuencia para su identificacin. Normalmente la prdida o los cambios de coloracin durante sus anlisis son una indicacin inmediata de su degradacin o modificacin estructural. Estos colores permiten fcilmente su seguimiento a travs de cromatografa planar o en columna y por este motivo fueron seleccionados en esta prctica de laboratorio. La mayora de los carotenoides absorben mximo a tres longitudes de onda (ver espectro de licopeno obtenido del tomate).

Espectro visible del Licopeno en hexano obtenido del tomate rojo

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A mayor nmero de enlaces dobles mayor es el nmero de mximos de absorcin, es por esta razn que los 11 enlaces dobles intermedios del licopeno hacen que tenga tres mximos de absorcin. Un nmero mnimo de siete enlaces dobles son necesarios para que el compuesto tenga un color perceptible (ver tabla siguiente).

Carotenoide Solvente max

Anteraxantina

Cloroformo 430 - 456 - 484

Etanol 422 - 444 - 472

Hexano, ter de petrleo 422 - 445 - 472

Astaxantina

Acetona 480

Benceno, cloroformo 485

Etanol 478

ter de petrleo 468

Auroxantina

Acetona 381 - 402 - 427

Cloroformo 385 - 413 - 438

Etanol, ter de petrleo 380 - 400 - 425

Bixina

Cloroformo 433 - 470 - 502

Etanol 429 - 457 - 484

ter de petrleo 432 - 456 - 490

Cantaxantina

Cloroformo 482

Etanol 474

ter de petrleo 466

Capsantina Etanol 476

ter de petrleo (450) - 475 - 505

Capsorubina ter de petrleo (455) - 479 - 510

-Caroteno

Acetona 424 - 448 - 476

Cloroformo 433 - 457 - 484

Etanol 423 - 444 - 473


-Caroteno

Acetona (429) - 452 - 478

Cloroformo (435) - 461 - 485

Etanol (425) - 450 - 478

Hexano, ter de petrleo (425) - 450 - 477

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-Caroteno- 5,6-epxido Etanol 423 - 445 - 474

-Caroteno- 5,8-epxido Etanol 407 - 428 - 452

-Caroteno- 5,6,5',6'-diepxido Etanol 417 - 440 - 468

-Caroteno- 5,8,5',8'-diepxido Etanol 388 - 400 - 425

-Caroteno Cloroformo 440 - 470 - 503


-Caroteno

Acetona 439 - 461 - 491

Cloroformo 446 - 475 - 509

Etanol 440 - 460 - 489


-Caroteno Etanol 377 - 399 - 425


Crocetina

Cloroformo 413 - 435 - 462

Etanol 401 - 423 - 447


-Criptoxantina

Cloroformo (435) - 459 - 485

Etanol (428) - 450 - 478

ter de petrleo (425) - 449 - 476

Equinenona

Acetona 460

Cloroformo 471

Etanol 461

ter de petrleo 458 - (482)

Luteina

Cloroformo 435 - 458 - 485

Etanol 422 - 445 - 474


Luteina-5,6-epxido

Cloroformo 433 - 453 - 483

Etanol 420 - 441 - 470


Licopeno Acetona 448 - 474 - 505

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Cloroformo 458 - 484 - 518

Etanol 446 - 472 - 503


Mutatoxantina

Cloroformo 437 - 468

Etanol 409 - 427 - 457


Neoxantina

Acetona 416 - 440 - 470

Cloroformo 423 - 448 - 476

Etanol 415 - 439 - 467


Neurosporeno

Cloroformo 424 - 451 - 480

Etanol, hexano 416 - 440 - 470


Fitoeno Hexano, ter de petrleo (276) - 286 - (297)

Fitoflueno Hexano, ter de petrleo 331 - 348 - 367

Rubixantina

Cloroformo 439 - 474 - 509

Etanol 433 - 463 - 496


Violaxantina

Cloroformo 426 - 449 - 478

Etanol 419 - 440 - 470


-Zeacaroteno Hexano 398 - 421 - 449

-Zeacaroteno Etanol, hexano, ter de petrleo 406 - 428 - 454

Zeaxantina

Acetona (430) - 452 - 479

Cloroformo (433) - 462 - 493

Etanol (428) - 450 - 478

ter de petrleo 8424) - 449 - 476

SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

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ITEM Cantidad

Erlenmeyer de 250 mL 1

Columna cromatogrfica 1

Papel de filtro X

Capilares de punta fina X

Tubos de ensayo 5

Cmara cromatogrfca 1


Algodn o gasa X

Embudo de caa corta 1

Normas de seguridad




Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad






estudiante debe:








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Soporte universal 1

Pinza y nuez para sostener la columna 2

Gradilla para tubos de ensayo 1

Beacker de 100 mL 1

Embudo de separacin 125 mL 1

Aro para embudo de separacin 1

Gotero largo para aplicar muestra 1

REACTIVOS


Reactivos Cantidad Unidad

Etanol 100 mL

Diclorometano 60 mL

NaCl 50 G

Sulfato Sodio Anhidro 50 G

n- hexano 150 mL

Acetato etilo 150 mL

ter 25 mL

Silica gel para columna 100 G

Placas silica 1 lmina

Cloroformo 50 mL

Metanol 50 mL

MATERIAL VEGETAL


Reactivos Cantidad

Zanahoria

Pimentn verde-rojo

Hojas de espinaca

Pimentn rojo

Tomate rojo

Pasta de tomate

Salsa de tomate

EQUIPOS


Equipos Cantidad

Bao Mara 1

Rota evaporador 1

Licuadora 1

Espectrofotmetro UV-VIS 1

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Cmara reveladora UV 1

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Deshidratacin Triture la muestra del material vegetal fresco seleccionado. Coloque 30 g de este material en un erlenmeyer de 250 mL, aada un volumen suficiente de etanol al 95%, de tal forma que cubra el material vegetal. Caliente a ebullicin en un bao mara por un tiempo de 5 minutos. Filtre en caliente utilizando un algodn de tal manera que la masa semislida quede libre de solvente. Deseche el filtrado. Extraccin Al semislido separado adicione un volumen de Diclorometano o cloroformo (aproximadamente 15 mL), de tal manera que lo cubra para ello utilice la campana de extraccin, agite con una varilla de vidrio con el fin de ayudar a la extraccin de los compuestos Carotenoides. Filtre el extracto. Repita la adicin de solvente al residuo dos veces ms con el fin de obtener mayor rendimiento. Junte los extractos filtrados y trasvselos a un embudo de separacin, si es necesario adicione unos mililitros de una solucin saturada de cloruro de sodio, separe la fase orgnica, squela con una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro y filtre. Concentre el filtrado hasta un volumen aproximado de 5 mL utilizando el rota evaporador. Tape el extracto obtenido y gurdelo para protegerlo de la luz. Seleccin de fase mvil y desarrollo de la cromatografa en CCF Analice el extracto de Carotenoides utilizando la cromatografa de capa fina, utilizando la siguiente serie alotrpica:

n-hexano

n-hexano:acetato de etilo 4:1




Acetato de etilo Revelado Para el revelado de las bandas utilice los siguientes reveladores en el orden establecido y dibuje

todas las observaciones:

A simple vista

Luz UV 254 nm

Luz UV 366 nm

Fraccionamiento cromatogrfico y anlisis espectrofotomtrico.

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Luego de seleccionar el mejor eluente, realice la separacin utilizando la cromatografa en columna (CC), para lo cual debe utilizar mayor cantidad del extracto. Adicione la fase mvil y recoja las fracciones coloreadas (en el caso de la CCF, raspe las bandas), enumrelas y determine su espectro visible en un rango de 350 nm a 500 nm. PREGUNTAS

Investigue el nombre cientfico de cada una de las especies vegetales utilizadas durante la prctica. Analice cada uno de los valores de Rf obtenidos y comprelos con los reportados en la literatura, adicionalmente haga una relacin de los mximos de absorcin de sus compuestos contra los datos expuestos en la tabla de absorcin ultravioleta de los carotenoides ms comunes. BIBLIOGRAFIA


Trease and Evans.Farmacognosia. 13 Edicin.Bailliere Tindall.Mexico.1989.

Salama, A., Anlisis microscpico y uso de plantas medicinales. Universidad Nacional de

Colombia, 1990.

Martnez A., Valencia G., Jimnez N., Mesa M., Galeano E. Manual de prcticas de

laboratorio Farmacognosia y Fitoquimica. Universidad de Antioquia. 2008.

Domnguez X.A. Mtodos de investigacin Fitoqumica. Ed.Limusa. Mxico. 1.973.

29

Laboratorio 4. RECONOCIMIENTO CROMATOGRFICO DE PLANTAS MEDICINALES APROBADAS EN COLOMBIA (TLC)

MARCO TERICO La cromatografa en capa fina permite la separacin de componentes qumicos, los cuales contribuyen a la identificacin de un material vegetal. Estas sustancias se encuentran en mayor o menor proporcin dependiendo de la parte vegetal (droga) que se analiza. Realizaremos procesos extractivos, mediante los cuales podremos obtener fracciones en las cuales se encontraran las sustancias caractersticas para cada especie, posterior a ello realizaremos la separacin e identificacin comparando los Rf obtenidos con los reportados en la literatura. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

OBJETIVO:

Realizar el reconocimiento de diferentes especies vegetales aprobadas en Colombia, mediante la utilizacin de la cromatografa planar.

Lograr la caracterizacin de sustancias propias de cada especie analizada.

Normas de seguridad




Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad




Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos

generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales

estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.



No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo de la

prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio, quien le

indicar la forma correcta de hacerlo

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ITEM Cantidad

Balones para rotaevaporacin de 100 mL 2

Columna cromatografa en columna pequea 1


Erlenmeyer de 250 mL con desprendimiento lateral y tapn de plstico perforado 1

Probeta de 100 ml 1


Beaker de 200 mL 3

Embudo de filtracin 1

Erlenmeyer de 50 ml 4

capilares 10

Equipo de destilacin con arrastre de vapor 1

Embudo de separacin de 250 ml 1

Aro metlico 1

Soporte Universal 2

Pinzas medianas con nuez 2

Algodn y papel craft

REACTIVOS



Metanol 200 mL

Plato slica gel GF 254 2

Anhdrido actico 50 mL

Silica gel 60 para cromatografa en columna de 40-60 m 30 g

Cloroformo 200 mL

cido sulfrico 40 mL

cido frmico 20 mL

cido actico 20 mL

Agua tipo 3 3 L


Aminoetil difenil borico 1 G

Polietilenglicol 4000 10 G


tolueno 100 mL

Vainillina 3 G

NaCl 5 g

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KOH 10 mL

Anisaldehido 5 mL

HCl 20 mL

MATERIAL VEGETAL



Hojas de albahaca (Ocimum basilicum) 20 G

Flores de manzanilla (Matricaria chamolilla) 20 G

Hojas de romero (Rosmarinus officinalis) 20 G

Races de valeriana (Valeriana officinalis) 20 G

Hojas de Ginkgo (Ginkgo biloba) 20 G

Raices de Ginseng (Panax ginseng) 20 G

Raz de Castao de Indias (Aesculus hippocastanum) 20 G

EQUIPOS


Equipos Cantidad

Lmpara ultravioleta 1

Ultrasonido de 120 mHz 1

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Reconocimiento de Albahaca, Ocimum basilicum , Lamiaceae. La droga la constituyen las hojas, las cuales contienen 0,1 - 0,45% de aceite esencial. El aceite esencial contiene principalmente metilchavicol hasta 55% y linalool. Extraccin Realice la extraccin por arrastre con vapor de agua. por aparte pese 1 g de droga

pulverizada y adicinele 10 mL de diclorometano, agite durante 15 minutos. Filtre

y evapore le filtrado obtenido a sequedad. El residuo disulvalo en 1 ml de

Tolueno, y se aplica 10 -50 L en la placa cromatogrfica.

Sistema cromatogrfico Fase estacionaria: Silica gel 60 Fase mvil: Tolueno: Acetato de Etilo 93: 7 Revelador: Vainillina- cido sulfrico

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Rf de las bandas observadas

Rf SUSTANCIA COLOR

0,3 Linalool Azul intenso

0,9 Metilchavicol Rojo violeta

Cromatoplaca de Ocimum basilicum tomada de: Plant Drug Analysis, 2009.

Reconocimiento de Manzanilla Matricaria, chamomilla , Asteraceae La droga la constituyen las flores, las cuales contienen 0.5 -1.5% de aceite esencial. El aceite esencial a su vez contiene chamazuleno 0 -15%, bisabolol 10 -25%, bisabolol xidos A y B (ambos 10 -25%), polinas 1 -40%, farneseno 15%. Extraccin Realice destilacin por arrastre con vapor de agua, segn mtodo oficial de la F. Eur. III pg. 62

con: 50 g de muestra, 500 ml de agua destilada de una solucin de cloruro de sodio al 1%, 4 horas

de destilacin a 3 -4 ml/minuto. Por aparte pese 1 g de droga pulverizada y adicinele 10 mL de

diclorometano, agite durante 15 minutos. Filtre y evapore le filtrado obtenido a sequedad. El

residuo disulvalo en 1 ml de Tolueno, y se aplica 10 -50 L en la placa cromatogrfica.

Sistema cromatogrfico Fase estacionaria: Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno: Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina -cido sulfrico Rf de compuestos a observar

Rf SUSTANCIA COLOR

0,2 I Oxidos A y B bidabolol Amarillo/verde

0,25 II Alcohol terpenoide Violeta

0,35 III Bisabolol Violeta

0,5 -0,6 IV Poliinas Pardo

0,95 V Azuleno Rojo-violeta

0,99 VI Farneseno Azul-violeta

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Cromatoplaca de flores de manzanilla tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. T1 es el xido A de bisabolol, T2 es bisabolol (Rf 0.35) y azuleno (Rf 0.85) y T3 es el xido A de bisabolol y bisabolol Reconocimiento del Romero, Rosmarinus officinalis , Lamiaceae Las hojas contienen 1 -2% de aceite esencial, el cual contiene principalmente 1,8 cineol 15-30%, borneol 10-20%, acetato de bornilo, camfeno 5 -10%, alfa- y beta-pineno. Extraccin Realice la extraccin por arrastre con vapor de agua. Por parte pese 1 g de droga pulverizada y

adicinele 10 mL de diclorometano, agite durante 15 minutos. Filtre y evapore le filtrado obtenido

a sequedad. El residuo disulvalo en 1 ml de Tolueno, y se aplica 10 -50 L en la placa

cromatogrfica.

Sistema cromatogrfico Fase estacionaria : Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno : Acetato de Etilo 93 : 7 Revelador: Vainillina - cido sulfrico Rf de compuestos a observar

Rf SUSTANCIA COLOR

0,25 Borneol Azul oscuro

0,45 Cineol Azul intenso

0,7 Acetato de bornilo Azul intenso

0,99 Alfa beta-pineno Violeta

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Cromatoplaca de Rosmarinus oficinalis. Tomada de Plant Drug analysis 2009. T1 y T2 son Cineol y borneol respectivamente. Reconocimiento de races de Valeriana, Valeriana officinalis , Valerianaceae La droga la constituyen las races o rizomas que contienen los valepotriatos como: valtrato, isovaltrato, IVDH_Valtrato, didrovaltrato y acevaltrato, cuya concentracin cambia de una variedad a otra. Adems contiene 0.25% de aceite esencial en los rizomas frescos, el cual contiene valerenal, valeranona y cido valernico. Extraccin Realice la extraccin con 0.2 g de droga pulverizada con 5 ml de diclorometano durante 5 minutos a asistiendo con ultrasonido (Nota: el bao del ultrasonido debe operarse sin aplicacin de temperatura). Filtre el extracto y lvelo con otros 2 ml de diclorometano. Evapore los extractos combinados a sequedad, y el residuo disulvalo en 0.2 ml de acetato de etilo. Es necesario no excederse en el volumen y cantidad de siembra en la placa. Sistema cromatogrfico Fase estacionaria : Slica gel 60 Fase mvil: Tolueno : Acetato de etilo 75 : 25 Revelador: HCl concentrado: cido actico glacial 2:8 Rf de compuestos a observar

Rf SUSTANCIA COLOR

0,73 Valtrato/Isovaltrato Azul

0, 65 Dihidrovaltrato Pardo

0,55 Acelvaltrato Azul

0,4 IVDH_Valtrato Azul

< 0,4 Valtrahidrinas Azul

Origen Productos de degradacion

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Cromatoplaca de races de valeriana de diferentes procedencias. Tomada de Plant Drug analysis, 2009. T1, T2, y T3 son valtrato, acevaltrato y dihidrovaltrato respectivamente. La caracterstica principal de un buen material vegetal de races de valeriana son las altas cantidades de valtrato Reconocimiento de Ginkgo, Ginkgo biloba. La droga la constituyen principalmente los flavonoides que estn presentes en las hojas entre 0.5 y 1% (alrededor de unos 20 compuestos) principalmente glicsidos de quercetina, kaempferol e isoramnetina. Tambin contiene biflavonoides como amentoflavona y bilobetina. No obstante, los principales marcadores quimiotaxonmicos son los diterpenos lactnicos llamados ginkglidos cuyo porcentaje est entre 0.01 y 0.04% representados principalmente por biloblido y Ginkglido B, A, C. Extraccin Extraccin de flavonoides

1 g de hojas secas y molidas son extradas con 20 mL de metanol asistiendo con sonicacin y sin temperatura. Realice filtracin del material y lleve a sequedad a travs del rotaevaporador. Redisuspenda el contenido en 2 mL de metanol y siembre de 10 a 20 L en la placa de TLC. Extraccin de Ginkglidos

A partir de 50 g de material vegetal en un erlenmeyer de 250 mL. Adicione la suficiente cantidad

de agua para cubrirla y sumergr el erlenmeyer a un bao maria en ebullicin por 20 minutos,

retirarla y todava con el erlenmeyer en ebullicin someterlo a sonicacin por 5 minutos (realizar

este procedimiento 2 veces). Filtrar en caliente y el filtrado llevarlo a una columna cromatogrfica

que tenga silica gel 60 de 40-60 m (aproximadamente 30g). Permita que el agua pase en su

totalidad y tratar de secar con vacio. Adicionarle a la columna 100 mL de acetato de etilo y dejarlos

pasar a travs de la columna, una vez recuperados transfiralos a un baln de rotaevaporacin y

lleve a sequedad. Redisuspenda en 1 mL de acetato de etilo y siembre alrededor de 10-20 L en la

placa cromatogrfica.

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Sistema cromatogrfico Fase estacionaria: Silica gel 60 Fase mvil flavonoides: Acetato de etilo: cido actico glacial: cido frmico: agua (100:11:11:26) Fase mvil Ginkglidos: Tolueno: acetona (70:30) Revelador Flavonoides: Productos naturales (aminoetil difenil brico y polietilenglicol 4000) Revelador ginkgolidos: Reactivo de anhdrido actico Rf de las bandas observadas Ginkglidos

Rf SUSTANCIA COLOR

0.5 Biloblide Verde

0.45 Ginkgolido A Azul

0.4 Ginkgolido B Verde

0.3 Ginkgolido C Azul verdoso

Flavonoides

Rf SUSTANCIA COLOR

0.75 Isoquercitrina, astragalin, dihidrokaempferol-7-o-glicsido Verde amarillo

0.6 Quercitrina Naranja amarillo

0.5 Kaempferol y quercetin ramnsido Azul claro (celeste)

0.45 Narcissina e isoramnetina rutinsido Verde amarillo

0.4 Rutina, quercetina y kaempferol isoramnetin glucopiranosido Amarillo y naranja verde

0.25 Flavonoides con tres azcares Amarillo verde y naranja

Cromatoplaca de hojas de Gingko. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Para anlisis refirase a las tablas

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Reconocimiento de Ginseng, Panax ginseng, Araliaceae La droga la constituye los rizomas de Panax ginseng cuyos principales metabolitos son los triterpenos tetracclicos glicosilados denominados ginsensidos. Derivados de 20-S-proto-panaxadiol y 20-S-proto-panaxatriol. Extraccin Realizar extraccin a 2 gramos con 10 mL de etanol al 90%. Concentrar en rotaevaporador hasta

unos 5 mL. A los 5 mL anteriores extraerlos con 5mL con n-butanol. La fase de n-butanol es

separada y concentrada alrededor de 1 mL con el cual se hace la siembra en la cromatoplaca de

TLC.

Sistema cromatogrfico Fase estacionaria: Slica gel 60F -254 Fase mvil: Cloroformo : Metanol : Agua (70 : 30 : 4) Revelador: vainillina cido sulfrico Rf de compuestos a observar

Rf SUSTANCIA COLOR

0.05 0.15 Ginsendio Rc Rojo claro

0.05 0.15 Ginsendio Rb2 Rojo claro

0.05 0.15 Ginsendio Rb1 Rojo claro

0.25 Ginsendio Rd Rojo claro

0.25 Ginsendio Re Rojo claro

0.4 Ginsendio Rg1 Rojo claro

0.55 Ginsendio Rh1 Rojo claro

Cromatoplaca de hojas de Ginseng. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Los compuestos 1 a 7

son Rc, Rb2, Rb1, Rd, Re, Rg1, y Rh1 respectivamente

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Reconocimiento de Castao de Indias, Aesculus hippocastanum, Hippocastanaceae La droga la constituyen las semillas, las cuales contienen 3 al 6% de glicsidos de triterpenos pentacclicos. El principal metabolito (alrededor del 15% total de glicsidos) son las aescinas, una mezcla compleja de disteres de la -amirina penta y hexahidroxilada. Los azcares principales son el cido glucurnico y glucosa Extraccin Realizar extraccin a 2 gramos con 10 mL de etanol al 70%. Concentrar en rotaevaporador hasta

unos 5 mL. los 5 mL anteriores son extrados con 5mL con n-butanol. La fase de n-butanol es

separada y concentrada alrededor de 1 mL con el cual se hace la siembra en la cromatoplaca de

TLC.

Sistema cromatogrfico Fase estacionaria: Slica gel 60 Fase mvil: Cloroformo: cido actico glacial: Metanol: Agua (60:32:12:8) Revelador: Anisaldehido-cido sulfrico

Rf de las bandas observadas

Rf SUSTANCIA COLOR

0.2 a 0.45 Aescinas Negro-violeta

0.45 Aescin Negro-violeta

Cromatoplaca de hojas de Castao de Indias. Tomada de: Plant Drug Analysis, 2009. Los compuestos T1 y T2 son Aescina y cido primula resxpectivamente. Los carriles 1,2 y 3 son tintura, y dos variedades de races de Aesculus. BIBLIOGRAFIA

39

British Pharmacopoeia, 2012.

USP 35, 2012.

Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998

Plant Drug Analysis. Hildebert Wagner and Sabine Bladt. 2009

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Laboratorio 5. ACEITES ESENCIALES

MARCO TERICO Los aceites esenciales o esencias son productos constituidos por mezclas de sustancias orgnicas voltiles y olorosas provenientes de vegetales. Dadas sus caractersticas aromticas estas sustancias han sido utilizadas como fuentes naturales de fragancias y perfumes. Entre los componentes de los aceites esenciales, encontramos hidrocarburos alicclicos y aromticos, alcoholes, esteres, aldehdos, cetonas, derivados oxigenados, sustancias nitrogenadas y azufradas. Los componentes ms frecuentes derivan del cido mevalnico y corresponde a Monoterpenoides (C10) y sesquiterpenoides (C15). Un aceite esencial puede localizarse un rgano determinado del vegetal: flores, hojas, frutos y races o en toda la planta. La composicin puede ser igual o diferente. La composicin de una esencia puede cambiar con la poca de recoleccin, el lugar geogrfico, o por pequeas alteraciones genticas. Las principales especies que contienen aceites esenciales se encuentran en gimnospermas y angiospermas distribuyndose en unas 60 familias aproximadamente. Son particularmente ricas en esencias las pinceas, laurceas, mirtceas, labiceas, umbelferas, rutceas, y compuestas. El ms antiguo y sencillo mtodo para obtener aceites esenciales es la destilacin con arrastre con vapor, para lo cual se utiliza material vegetal lo ms fresco posible. Las modernas plantas industriales poseen muchas ventajas sobre las antiguas destileras, en las que con frecuencia se produca la carbonizacin y descomposicin de la esencia. En la moderna destilera de aceites esenciales, la materia prima est contenida en cestos o bandejas perforados. El destilador contiene agua en el fondo, la cual se calienta mediante serpentines por los que circula vapor, o tambin haciendo pasar a su travs vapor de agua a presin. Las esencias utilizadas en perfumera, se pueden extraer por arrastre con vapor, pero algunos requieren de otro tipo de tratamiento, como son el enflorado, digestin en grasas calientes, mtodos neumticos o por medio de disolventes. En la prctica realizaremos la extraccin de aceites esenciales en especies vegetales tales como: clavos de olor, corteza de canela, eucalipto, ans y cardamomo. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

OBJETIVOS:

Utilizar la destilacin con arrastre de vapor, para la obtencin de aceites esenciales presentes en diferentes especies vegetales tales como: clavos de olor, corteza de canela, eucalipto, ans, cardamomo etc.

Caracterizar los constituyentes de los aceites extrados, mediante los mtodos cromatografcos (cromatografa en capa fina) y mtodos espectrofotomtricos (ultravioleta y visible).

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ITEM Cantidad

Equipo para destilacin con arrastre de vapor 1

Mangueras 2

Ncleos de ebullicin X

Embudo de separacin de 250 mL 1

Embudo de filtracin (caa corta) 1

Erlenmeyer de 125 mL 2

Placas de cromatografa en capa fina X

Capilares para cromatografa 5

Erlenmeyer de 250mL 2

Normas de seguridad




Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad






estudiante debe:








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Soportes 3

Aros 2

Vidrio de reloj 1


Esptula 1

REACTIVOS




Xileno 20 mL

H2O 1 L

Sulfato de sodio anhidro 20 G

Tolueno 10 mL


HCl 20 mL

2,4-dinitrofenilhidrazina 3 G

cido sulfrico 5 mL

Vainillina 3 G

MATERIAL VEGETAL

Tabla 3. Listado de material vegetal necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Reactivos Cantidad

Cardamomo (semillas)

Ans estrellado

Ans comn (semillas)

Clavos de olor (flores)

Canela (corteza)

Jengibre (rizomas)

Canela (polvo)

EQUIPOS


Equipos Cantidad

Plancha de calentamiento 1

Lmpara ultravioleta 1

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Destilacin con Arrastre de Vapor

Coloque aproximadamente 500mL de agua en el matraz nmero 1 (generador de vapor) y agregue

ncleos de ebullicin. En el matraz #2 coloque 50 g del material vegetal asignado, cortados en

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trozos pequeos. Coloque la plancha de calentamiento en el matraz # 1 y caliente hasta ebullicin,

con el fin de generar vapor el cual pasar al matraz #2, el vapor realizar la extraccin de los

aceites esenciales, que inmediatamente sern arrastrados con el agua en un proceso de

codestilacin.

Figura 1. Montaje del equipo de destilacin por arrastre con vapor

Suspenda el calentamiento cuando el volumen del destilado sea de 200 mL aprox. De ste

destilado extraiga totalmente el aceite esencial: adicione en el embudo de separacin la mitad del

destilado y realice 2 extracciones con 50 mL de diclorometano cada una. Agregue una solucin

saturada de NaCl si se forma emulsin.

Las fases acuosas se desechan y los extractos orgnicos se colectan en un Erlenmeyer de 250 mL.

Adicione una pequea cantidad de sulfato de sodio anhidro para eliminar el agua remanente.

Decante el extracto seco y colquelo en un baln de 250mL para rotaevaporar Evapore hasta un

volumen de 5 mL. Con esta muestra siembre 6 placas cromatogrficas de 5 cm x7,5 cm.

Metodologas farmacopicas para cuantificacin de aceites esenciales El contenido de aceites esenciales se realizar empleando ambos equipos de la figura 2. El profesor dividir los grupos para que algunos realicen un montaje con el equipo A y el resto para realizar el montaje con el equipo B. Los procedimientos se ajustarn a lo estipulado en la Farmacopea Japonesa. Una cantidad estipulada en la respectiva monografa ser pesada y llevada a los balones de 1 litro, posteriormente se adicionar agua en una proporcin de 5 a 10 veces mayor al volumen de muestra seca. Realice el montaje de aceites esenciales de ambos equipos con ayuda de su profesor monitor de la prctica, asegrese de ensamblar el condensador y tenerlo alimentado con solucin refrigerante para evitar prdidas significativas. Los montajes deben realizarse con mucha precaucin con el fin de evitar sobresaturacin de vapores, los equipos tienen un

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dispositivo de liberacin de presin para evitar que se estallen, por lo tanto nunca realizar estos procedimientos sin los respectivos implementos de seguridad. Los balones con la muestra sern puestos sobre las mantas de calentamiento a una temperatura entre 130 y 150 C. El tubo graduado del equipo debe estar previamente lleno con agua hasta la lnea de preparacin, el resto debe de llenarse con 2 ml Xileno, diclorometano solucin saturada de cloruro de sodio hasta la lnea estndar. Deje permanecer en ebullicin por 2 horas y deje llevar a temperatura ambiente. Retire lentamente el contenido de agua hasta que la superficie de la capa de aceite llegue a la lnea de preparacin y deje as el montaje por 30 minutos ms. Posteriormente permita bajar el nivel del aceite hasta el valor de 0 de la porcin graduada y lea el volumen del contenido (mL) y rstele el volumen inicial de xileno diclorometano empleado. Figura 2. Equipos para cuantificacin de aceites esenciales recomendado por Farmacopea Japonesa (A) y por la OMS (B)

(A) (B)

Anlisis por Cromatografa de Capa Fina (CCF) Disuelva los Aceites esenciales obtenidos por los dos mtodos en unos mL de diclorometano y realice el anlisis por CCF, utilizando los siguientes eluentes:

Diclorometano

Tolueno: acetato de etilo (93:7)

Revele cada una de las cromatoplacas obtenidas con los siguientes reveladores:

Luz ultravioleta (254 nm y 375 nm)

Vapores de Yodo

2,4-dinitrofenilhidrazina (0,4 g en 100 mL HCl 2N)

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Vainillina/cido sulfrico Con base en los resultados obtenidos, escoja el eluente donde se observe mejor la separacin del componente principal de los dems componentes. Fraccionamiento por Cromatografa en Capa Fina (CCF) Aplique el aceite esencial disuelto en el eluente que presento mejor separacin y aplquelo en una placa cromatogrfica de silica gel, eluya con eluente escogido. Los componentes principales se observan con la utilizacin de la luz ultravioleta de 254 nm Extraccin de los componentes por Cromatografa de Capa Fina (CCF) Raspe los componentes mayoritarios de las cromatoplacas con la ayuda de una esptula y la luz ultravioleta o el revelador. Depostelos en un erlenmeyer o beacker y adicione 6 mL de metanol Anlisis del componente puro Realcelo por el siguiente mtodo: Anlisis espectral: al componente puro determnele los espectros ultravioleta. BIBLIOGRAFIA

British Pharmacopoeia, 2012.

USP 35, 2012.

Quality control methods for medicinal plant materials, WHO Geneva, 1998

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Laboratorio 6. VALORACIN DE CAPSAICINOIDES EN MUESTRAS DE FRUTO FRESCO DE AJ, SALSAS PICANTES, PASTA Y OLEORESINA POR HPLC-DAD

1. MARCO TERICO

Capsicum Spp. es un gnero originario de Amrica del sur y es conocido ampliamente por su propiedad organolptica de pungencia atribuida a los capsaicinoides. La Capsaicina y la Dihidrocapsaicina son las molculas ms representativas de este grupo y son responsables de ms del 90% del estmulo del Receptor de Potencial Transitorio Tipo 1 (TPRV1) el cual es tambin estimulado por el calor.

2. NORMAS DE SEGURIDAD

OBJETIVO:

Aplicar las tcnicas para la extraccin de metabolitos secundarios y emplear una metodologa oficial AOAC para la determinacin de Capsaicinoides en muestras vegetales y alimentos procesados.

Normas de seguridad




Bata de laboratorio

Guantes de nitrilo

Gafas de seguridad




Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos

generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el estudiante debe:

Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales

estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.



No arrojar por el desage los desechos o residuos qumicos obtenidos durante el desarrollo de la

prctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comunquela al responsable del laboratorio, quien le

indicar la forma correcta de hacerlo

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3. METODOLOGA

Cada grupo deber aportar para la prctica uno de los siguientes materiales.

A. 50 g de Fruto fresco de aj, sin importar el grado de maduracin.

B. Una unidad de Pimentn Rojo.

C. Salsa picante de venta comercial.

D. Una unidad de Parche Len.

E. Pasta de aj (suministrada por el Profesor).

F. Oleoresina de Capsicum (suministrada por el Profesor).

-Un grupo seleccionado aleatoriamente debe realizar la preparacin del estndar siguiendo las

indicaciones del punto C.

-Un grupo Seleccionado aleatoriamente debe preparar la fase mvil y el solvente de lavado de

acuerdo con el punto D.

4. MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la sesin experimental por tres personas

ITEM Cantidad

Probeta graduada de 20 mL 1

Erlenmeyer 25 mL 1

Beaker 25 mL 5

Erlenmeyer con desprendimiento lateral de 250 mL 1

Algodn csp

Embudo con tapn de neopreno 1

Puntas micropipeta 1000L 10

Jeringas plsticas de 5 mL 2

Filtros de jeringa de 0.22 m 3

Micropipeta de 1000 L 2

Viales de HPLC (Waters) 5 5. REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la sesin experimental por tres personas

Reactivos Cantidad

Metanol HPLC 1000 mL (para todo el grupo)

Acetonitrilo HPLC 400 mL (para todo el grupo)

Agua tipo 1 (HPLC) 2000 mL (para todo el grupo)

cido Actico (HPLC) 10 mL (para todo el grupo)

6. EQUIPOS

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Tabla 4. Listado de equipos necesarios para el desarrollo de la sesin experimental

Equipos Cantidad

Ultrasonido 120 MHz 1

Columna Kinetex 2.6 m C18 100 Tamao=100 x 4,60 mm

1

HPLC-PDA 1

Rapid Vap 1

7. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

a. Extraccin a partir de fruto fresco, pasta de aj o Parche Len.

Macerar 5 g de muestra en un

mortero (para el parche Len

cortarlo con tijeras)

Adicionar 10 mL de metanol y llevar a

un beaker de 25 mL

Llevar la muestra al ultrasonido a 60C

por 10 minutos

Filtrar la mezcla empleando algodn

(ver figura 1.0)

Tomar 5 mL del filtrado y llevar a un tubo de ensayo apto para el rapidvap (15

mL)

Secar completamente el

solvente (180 mbar a 50C por 25 min)

en RapidVap

Una vez seco, adicional 2 mL de metanol HPLC,

apoyarse del ultrasonido hasta solubilizacin

completa

Filtrar la solucin empleando filtros de jeringa (nylon) de 0,22

um sobre un vial de HPLC

Figura 1.0 Montaje de filtracin empleando algodn sobre embudo.

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b. Extraccin a partir de resina.

Pesar 50 mg de resina en un beaker

de 25 mL y adicionar 5 mL de

metanol

Llevar la mezcla al ultrasonido a 40C durante 5 minutos

Llevar el contenido del beaker a un

tubo de ensayo de 15 mL.

Llevar el tubo de ensayo a secado

completo al rapidVap a 180

mbar y 50 C por 30 minutos

Redisolver el contenido en 2mL de metanol HPLC,

pasar por filtros de jeringa (Nylon) de 2

um en un vial de HPLC.

c. Preparacin de Estndar para HPLC.

1. Informacin general:

Frmula molecular Masa Molar Pureza relativa

Dihidrocapsaicina C18H29NO3 307,43 g/mol 90%

Capsaicina C18H27NO3 305,43 g/mol 95%

2. Preparacin: a partir de la informacin anterior, el grupo asignado deber preparar 20 mL de

Solucin Metanlica que contenga ambos Estndares a una concentracin de 500 ppm (partes por

milln) y filtrarla por 0,22 m.

Nota: Recuerde utilizar material volumtrico y una balanza con una sensibilidad mnima de 10 mg, adems

debe considerar la pureza relativa de cada uno y calcular la correccin en peso necesaria.

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d. Parmetros cromatogrficos

HPLC System LaChrom Elite

Tipo de separacin Fase reversa isocrtico

Columna Kinetex 2.6 m C18 100 Tamao=100 x 4,60 mm

Fase mvil 40% ACN al 1% con cido actico (1L)

Solvente de lavado Solucin acuosa de Metanol al 30% (500mL)

Deteccin PDA @ =280nm

Flujo 2,0 mL/min

Volumen de inyeccin 10 L

Tiempo de corrido 15 minutos

e. Orden de elucin: Capsaicina 6,4 minutos y luego dihidrocapsaicina a 10,4 minutos. Antes de

capsaicina se encuentra la nordihidro-capsaicina pero no ser tenida en cuenta para la

valoracin. Adjunto se encuentra el espectro de absorcin UV de la capsaicina.

f. Clculo de unidades Scoville (SHU)

Esta medida es un parmetro internacional aceptado para comparar el grado de pungencia de

cada especie diferente de aj. Para calcular el valor Scoville Heat Units se tomar la siguiente

relacin: 1 ppm de capsaicinoides totales= 225 SHU. Por tanto, para conocer el valor ppm de las

muestras deber relacionar las unidades de absorbancia de cada una con el valor en ppm del

estndar.

Guias de Laboratorio Farmacognosia y Fitoquímica 2015-1

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