Guia de Laboratorio de Ingenieria Molecular (1)

8/17/2019 Guia de Laboratorio de Ingenieria Molecular (1)

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UNIDAD PROFESIONAL

INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

Elaborado por: M. en C. Aida Zamora Contreras Dra. Margarita Ivonne Garrido

Gutiérrez M. en C. Carmen Calixto Mosqueda

Abril !"#$.

Gu%a delaboratorio de

Ingenier%aMole&ularIngenier%a Ambiental


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REGLAMENTO DE LABORATORIO

Uno de los objetivos del trabajo de laboratorio es que a través de los experimentos y

procedimientos aplicados, se adquieran habilidades y destrezas en el manejo de técnicas, de

datos, de equipos e instrumentos de laboratorio.

El trabajo en laboratorio requiere disciplina y orden, es necesario que lea cuidadosamente cada

una de las prácticas antes de cada sesión. Durante el desarrollo de cada práctica atienda las

instrucciones del proesor, ya que de ésto depende la obtención de buenos resultados.

!as normas m"nimas de se#uridad que debe se#uir son las si#uientes$

%. &l in#resar al laboratorio, el alumno deberá portar bata blanca debidamente abotonada.

'. (ara aprobar el curso de laboratorio deberá cubrir, al menos, el )* + de asistencia a las

sesiones prácticas, as" como el )* + de las prácticas aprobadas.

. !a asistencia con puntualidad al laboratorio es imprescindible, no habrá retardos y tendrá alta

quien no lle#ue a la hora establecida. !a lista de asistencia se pasará %- min después de haber

iniciado la sesión.

. En caso de lle#ar después de la hora de tolerancia, ya no se le permitirá la entrada y se

considerará como inasistencia.

-. !as altas al laboratorio se caliicarán con cero . /stas se justiicarán exclusivamente a través

de un memorandum debidamente irmado y sellado por la 0ubdirección &cadémica. (ara laevaluación sólo se tomará en cuenta la caliicación del reporte de la práctica.

1. En el laboratorio se debe #uardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, puesto

que es un lu#ar de trabajo donde se manejan aparatos, equipos delicados, costosos y, en

al#unas ocasiones, sustancias peli#rosas.

2. (or razones de se#uridad, queda estrictamente prohibido comer o umar dentro del

laboratorio.


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). 0e debe tener cuidado con el manejo de sustancias y3o microor#anismos, por lo tanto, es

necesario tomar las debidas precauciones, ase#urándose de lavarse las manos al inicio y al inal

de la sesión de laboratorio.

.

4. Durante la sesión de laboratorio, queda prohibida la entrada a personas ajenas al #rupo. De

i#ual orma, se proh"be cualquier interrupción durante la misma.

%*. El alumno deberá llenar un ormato para solicitar el material de laboratorio, teniendo cuidado

de revisar que el material recibido esté en buen estado y en caso contrario, deberá reportarlo al

5a la6 técnico docente, al momento de entre#ar el ormato con su credencial.

%%. &l iniciar la práctica deberá limpiar su mesa de laboratorio con una ranela. En caso de

trabajar con cepas microbianas, deberá limpiar la mesa con benzal al inicio y término.

%'. Una vez terminada la práctica, el material utilizado durante su desarrollo, deberá entre#arse

limpio y seco.

%. El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o

equipo de personas responsables de él, a más tardar dos semanas antes de inalizar el semestre

lectivo.

%. El alumno no deberá abandonar el laboratorio por nin#7n motivo, antes de que concluya la

práctica, a menos que el proesor lo autorice, en caso contrario se le cancelará su asistencia.

%-. 8in#7n alumno podrá permanecer el laboratorio después de concluida la sesión práctica.

%1. !a entrada de los alumnos al laboratorio en horas que no correspondan a la sesión, estará

condicionada a la autorización y tiempo libre del proesor responsable del #rupo.

%2. Es obli#atorio el uso del 9anual de (rácticas de !aboratorio en cada sesión.

%). El reporte de la práctica deberá entre#arse una semana después de la discusión.


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%4. El re#istro de datos y observaciones de cada práctica deberá hacerse en una bitácora o en el

manual de prácticas, si as" lo desea el alumno.


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Práctica 1

EXTRACCION DE ADN DE CULTIVOS PUROS

:E&;?0

1. Solució !"uili#ra$a $! %!ol& '()

@enol undido a 1)A; -** mlBidroxiquinolina %* ml


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(reparada el d"a de su uso

8. Prot!ia6a 9 al *4(roteinasa F '*,* m#dB'? estéril %,* ml

&lmacenar a C'* A;

). RNA6a al 14:nasa %*, m#dB'? estéril %,* mlBervir durante - min y almacenar a C'*A ;

(rocedimiento%. ;entriu#ar a -*** rpm durante - min, - ml de cultivo en ase exponencial, con D.?. a 1*

nm de *,-.'. !avar la pastilla en % ml de


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:eactivo HGué esI &plicación en latécnica

0e puederemplazar con$

HGué sucede sise omiteI

!=0?0=9&ED?U SON LOS =AS

SEGN (ASEGA=A EL AL *+++3. >?U SE RECOMIENDA ADICIONAR EN LUGAR DE

ENIMAS >K POR ?U>DE ?U MANERA EXTRAER EL ADN DE LOS =AS K >CFMO LA IDENTI;ICANMENCIONE LOS RESULTADOS DE LA IDENTI;ICACIFN K DE LA EXTRACCIFN>?U CEPA EXTRAIDA K ?UE PRODUCE UNA PROTEASA TERMOESTABLE


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Práctica *

EXTRACCIFN DE ADN EN MUESTRAS DE SITIOS CONTAMINADOS

O#!tio.

;onocer y entender los principios básicos para poder extraer &D8 de muestras de sitioscontaminados.

=ntroducción(ara extraer &D8 en muestras se requiere de tres pasos undamentales que son$

• !isis celular, para liberar sus componentes• (uriicación del &D8.• ;oncentración de la solución de &D8.!isis celular.

!as células bacterianas están envueltas por una membrana citoplasmática y rodeada por unapared celular, para liberar los componentes celulares es necesario romper estas barreras, paraello se pueden utilizar métodos "sicos, qu"micos y enzimáticos.!a ruptura "sica comprende técnicas basadas en uerzas mecánicas, las más utilizadas soncon#elamientoCdescon#elamiento, trituración con molino de perlas, ultrasonicación y molido ennitró#eno l"quido, siendo las más empeladas el molino de perlas y el con#elamientoCdescon#elamiento. 0e ha encontrado que con el molino de perlas se obtiene mayor cantidad e&D8 pero, también se contamina más con ácido h7micos.!a lisis qu"mica consiste en exponer a las células a a#entes qu"micos que aectan la inte#ridadde las barreras celulares, este tipo de técnicas emplean mezclas que contienen deter#entes,otras emplean 8a;l y otras que contienen varios buers. & estas técnicas se le pueden hacermodiicaciones como incremento de temperatura, incubaciones, extracción con enol y

cloroormo y la incorporación de a#entes quelantes.@inalmente la lisis enzimática consiste en utilizar enzimas que di#ieren compuestos que aectanla ri#idez de la pered celular. 0e han empleado enzimas como la lisosima, la proteinasa F, laacromopeptinasa y la proteinasa E, siendo la más empleada la lisosima.

!a extracción de &D8 de sitios contaminados se puede realizar ya sea aislando primeramentelas células de la matriz antes de lisar las células o bien lisar las células sin sepáralas de lamatriz. 0e ha observado que con la lisis directa se obtiene mayor cantidad de &D8

(uriicación de &D8.

&l romper las células bacterianas se liberan &D8, prote"nas y :8& principalmente. ;uando sequiere puriicar &D8 se dice que los otros componentes son contaminantes. Existen variosmétodos para puriicar el &D8. !a técnica más com7n para precipitar prote"nas en un extractocelular es la adición de enol o bien una mezcla de enol y cloroormo.

;oncentración de la solución de &D8.

El método más com7n para concentrar la solución es la precipitación con etanol. ?tras ormas deprecipitar ácidos nucleicos poliméricos es con sales 5espec"icamente cationes6 y unatemperatura menor a C'*A;.

9/


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:E&;?0$&. U@@E: DE EJ


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%2. Extraer dos veces con enolCcloroormoCalcohol isoam"lico 5'$'.%6%). Extraer una vez con un volumen de cloroormoCalcohol isoam"lico 5'$%6%4. (recipitar el &D8 a#re#ando % parte de 8a;l -9 por cada '- partes del volumen

obtenido de la solución y ',- vol7menes de etanol absoluto.'*. 9ezclar perectamente, incubar % h a C'* A; y centriu#ar a %',*** rpm a A; durante '*

min.'%. !avar con %ml de etanol al 2*+ 5r"o6 y centriu#ar durante % min a %',*** rpm a A;.''. :esuspender el pellet ormado con -** Nl de


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Discusión

Gue dierencias existen entre las dos técnicas empleadas.9encione al#unas ventajas y desventajas del empleo de estas técnicas

Gué técnica considera que ue la mejor y Hpor quéIDe acuerdo al articulo de Peates et al. HGué modiicaciones se le hicieron a la prácticaI HDequé manera pueden repercutir a los resultados inalesI

iblio#ra"a$

c

0tean :. and &tlas :.Q D8& &mpliication to Enhance Detection o Lenetically en#ineeredacteria in Enviromental 0amplesQ &pplied and Environmental 9icrobiolo#y, v.-546$'%)-C'%4%.

Peates ;., Lilin#s 9., Davison &., &ltavilla 8. and >eal D. %44)Q 9ethods or 9icrobial D8&Extraction rom 0oil or (;: &mpliicationQ iolo#ical procedures online, tools to discover. %$ *C2.

roRn


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Práctica ,

EXTRACCION DE PROTEINAS DE SUELO

%.C


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'.C (oner a ebullición durante - min y enriar

(rocedimiento para #el de 0D0C(&LE

%.C limpiar con etanol al 2*+ las placas de vidrio

'.C ;olocar el jue#o de placas de vidrio y separadores en la base para preparar el #el.C(reparar el #el separador, al inal se le a#re#a el aciar el #el separador evitando la ormación de burbujas hastadejar un espacio de cm a partir del borde superior de los vidrios..C Dejar polimerizar entre '* y * min.-.C (reparar el #el concentrador y vaciarlo en la parte superior del #el.1.C colocar el peine con cuidado de no ormar burbujas y dejar polimerizar por '*min2.C (reparar la muestra y el marcador de peso de molecular).Cmontar las placas de vidrio en su base y están en la cámara de electrooresis4.C preparar el amorti#uador de corrida al %J%*.C !lenar la cámara interna con amorti#uador de corrida hasta el l"mite y la parte externa hasta

cubrir los electrodos%%.C ;ar#ar el #el con las muestras y el peso molecular.%'.C hasta que las muestras pasen del #el concentrador,posteriormente aumentar a %** > hasta que el rente alcance la parte inerior del #el.%. apa#ar de la uente de poder y recuperar el amorti#uador de corrida%-.C desmontar la cámara y extraer con cuidado el #el. ;olocar el #el en un recipiente adecuadoy teirlo con la solución correspondiente. ;olocar en a#itación orbital durante % hora aproximada.:etirar el #el y sumer#irlo en la solución desteidota hasta desteir bien el #el.

;UE0


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. !a si#uiente ormula describe la composición 'J de un buer que se usa para desnaturalizarprote"nas para la electrooresis. !as descripciones de la ormula v3v o R3v están reeridas se#7nel estado sólido 5R6 o l"quido 5v6 del compuesto.

-*+ 5v3v6 del buer concentrador de 0D0C(&LE, pB.

.1+ 5R3v6 0D0.

'*+ 5v3v6 #licerol.

%1* m9 :eactivo ;leland.

*.*%+ azul de bromoenol

-. HGué cantidad de cada uno de los reactivos se requieren para preparar %** ml del buer 'Jpara desnaturalizar las prote"nasI considere que el reactivo de ;leland tiene un peso ormula de%- #r3mol.

1. H;uántos ml puede preparar a partir de esta solución 'JI

2. !lene la si#uiente tabla

@unción

Lel concentrador

Lel separador

0D0


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Debido a que no hubo sesión de discusión, desarrolla en dia#rama de bloque la unción quetiene cada paso del procedimiento para la técnica de 0D0C(&LE,

;omo conclusiones menciona$

H;ómo te parecieron las técnicas de extracción de prote"nas de suelo y la de 0D0C(&LEI

H(or qué crees que solo obtuvieron una prote"na y por que la mismaI

HGué propones para mejorar estas prácticasI

(:E(&:&;=?8 DE !& 0?!U;=?8E0

%. &crilamida*+ bisacrilamida*,)+

(esar con #uantes y cubrebocas, disolver en a#ua desionizada y aorar, iltrar la solución antesde almacenar.almacenar en rascos ambar o en rasco cubierto con papel alumnio. reri#erar

'. uer de #el separador J pB).)

(ara -* ml


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(ara '-* ml


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9etanol %1,-+ %1,-ml

ua desionizada 2),-ml

%*. 0olución para secado de #eles

%**ml

Llicerol + ,*ml

Etanol %*+ %*,**ml

ua desinizada )1+ )1,ml

:emojar el celoan en la solución y secarlo. Extender el celoan sobre un vidrio, colocar el #el ytapar con otro pedazo de celoan

%%. uer de muestra nativa 'J

%*ml


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Escherichia, co es la especie coli , : corresponde a la cepa :> % y = es la primera endonucleasaaislada de esta cepa.!as enzimas de restricción se clasiican en tres #rupos, =, == y ===. !as enzimas de tipo = y === estánmetiladas y requieren de &


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Unidad de la enzima de restricción 5una Unidad de enzima es deinida como la cantidad de éstanecesaria para di#erir % Y# de D8& en una hora, en la solución amorti#uadora y temperaturarecomendada para la misma, en '* Y! de reacción6.

O#!tio

Bacer la di#estión enzimática de D8& de suelo para analizar su patrón de restricción.

M!to$olo:a Mat!rial!6 'or !"ui'oD8& de suelo obtenido en la práctica %Una ampolleta de a#ua inyectable de % m! o a#ua #rado miliG estéril y libre de nucleasasEco:=Hind==Eco:>

Xho=9icropipetas de ', %* y '* Y!

(untas blancas y amarilla para micropipetas, estérilesórtex:ecipiente con a#ua y extrán para desechar las puntas empleadas

M@to$o%. Etiquetar con marcador indeleble cada uno de los tubos de %.- m! con la enzimacorrespondiente. Etiquetar dos tubos adicionales para hacer la di#estión con las enzimas derestricción juntas que ten#an las condiciones iónicas similares.'. ;olocar % Y# de D8& en cada uno de los tubos de %.- m!.. &dicionar a cada tubo ' Y! del amorti#uador de la enzima.. re#ar a cada tubo una Unidad de enzima de restricción, % Y!.-. ;ompletar el volumen inal de la reacción a '* Y! con el a#ua.-. =ncubar a 2 Z; en el termomixer por % h.1. =nactivar la reacción con Y! de re#ulador de car#a.2. Bacer un #el de a#arosa al %.- + en hasta que el colorante del rente de corrimiento ha#a recorrido tres cuartas partes del #el.;ar#ar % Y! del marcador de peso molecular en el carril % o en los primeros carriles.

). ?bservar di#italizar la ima#en del #el en un transiluminador.R!6ulta$o6;on la ima#en de los patrones de restricción obtenidos, calcular los tamaos moleculares de lasbandas y hacer una tabla con los mismos.=dentiicar los ra#mentos de restricción en los carriles en donde se hizo la di#estión con variasendonucleasas e identiicarlas en el #el.:edactar la obtención de resultados y citar tus resultados 5tabla y i#uras6 en tu redacción.

Di6cu6ióBacer la discusión explicando la razón por la cual obtuviste los ra#mentos de restricción de las

dierentes enzimas en tu #el y los tamaos moleculares. Explicar la di#estión hecha con laenzimas de restricción juntas.


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Cu!6tioario%. =nvesti#ar las enzimas de restricción de tipo == más utilizadas en biolo#"a molecular y elaborarun cuadro con los si#uientes datos$ nombre de la enzima, secuencia que reconoce, sitio de corte,tipo de corte, temperatura de incubación y cantidad de sal o tipo de solución amorti#uadora.

'. =nvesti#ar la cantidad de sales que contiene los amorti#uadores de alta, mediana y baja uerzaiónica empleados para las enzimas de restricción

Bi#lio:ra%a 9aniatis


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Práctica -

DNA 'oli2ór%ico a2'li%ica$o al a7ar RAPD3

Itro$ucció

!a técnica de :&(D 5:andom &mpliied (olymorphism D8&, por sus si#las en in#lés6 ha sido la

tecnolo#"a más ampliamente usada en la (;: para dierentes propósitos, usa oli#onucleótidos

pequeos de secuencias aleatorias que tienen un contenido de L; mayor a -* +. Estos oli#os

se pe#an a distintos sitios en un #enoma, si es que existen dierentes sitios blanco para ellos. !a

unión es reconocida por la D8& (olimerasa que inicia el alar#amiento del iniciador a partir del

extremo W. El producto de la ampliicación se acumula en un #ran n7mero de copias 5\%* 16 y

puede ser visualizado por electrooresis. Una ampliicación es exitosa, sólo si el sitio blanco para

el iniciador está localizado en ambas cadenas del D8& molde en polaridad opuesta y a una

distancia de -* 1 *** pares de bases 5pb6 en promedio.

El procedimiento de :&(Ds es relativamente rápido, sólo se requieren pequeas cantidades de

D8&, mismo que no necesita estar extremadamente puro, además no involucra radiactividad ni

requiere de transerencia tipo Southern. !a técnica #enera marcadores dominantes, ya que los

polimorismos se detectan por la presencia o ausencia de bandas. /stas resultan de inserciones

o deleciones en las re#iones ampliicadas, o a partir de cambios de bases con lo que se altera la

unión del iniciador.

(ara la reproducibilidad de la técnica de :&(D, es absolutamente necesario optimizar las

cantidades de D8&, 9#;l', iniciadores y d8


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M!to$olo:a

Encender el termociclador. (reparar la mezcla maestra para el n7mero de reacciones

correspondiente al total de los equipos y considerando a los controles positivos y ne#ativos,

como se muestra en la si#uiente tabla %. El volumen total por reacción será de '- Y!. olumen para ]]]]]

reacciones 5Y!6ua miliG .2

9ezcla de d8


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Práctica 5

PER;ILES ELECTRO;ORTICOS

OBETIVO

?btener los periles electrooréticos de las prote"nas y el &D8 por medio de #eles de a#arosa y

poliacrilamida, respectivamente.

M!to$olo:a

Solucio!6 'ara !l :!l $! a:aro6a

Solución de TBE _*.*)4 9 5*.22 #6 de


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Solución de corrimiento 5*.2- 9 de


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causarle quemaduras. Es recomendable que use #uantes de asbesto durante el procedimiento.

!a a#arosa está completamente undida cuando no se observen hilos cómo de jarabe en la

solución al momento de a#itarla.

. ;oloque la charola para ormar el #el en posición opuesta al corrimiento en la cámara de

electrooresis horizontal 5si#a las indicaciones del proesor6. re#ue la a#arosa undida a la

charola y acomode el peine para ormar los pozos. (ermita que polimerice por * min por lo

menos. El #el se observará blanco transl7cido.

. :etire el peine del #el y coloque la charola en posición de corrimiento.

-. !lene la cámara de electrooresis horizontal hasta la marca, indicada en la misma, con


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Proc!$i2i!to 'ara la !l!ctro%or!6i6 ! :!l!6 $! 'oliacrila2i$a

%. !ave las placas de vidrio con a#ua jabonosa y una esponja suave, al#odón o #asa para evitar

que se rayen. Enjuá#uelas primero con a#ua de la llave y lue#o dos veces con a#ua destilada.

'. Use #uantes de látex después del lavado de las placas hasta inalizar el procedimiento.

. (ara eliminar la #rasa de las placas, enjuá#uelas con etanol. (ermita que se sequen por

evaporación a temperatura ambiente o con un pao que no suelte pelusas que pudieran quedar

atrapadas en el #el e interirieran con la separación de las prote"nas 5dado el tamao del #rosor

del #el de poliacrilamida6.

. Ensamble las placas para obtener una cámara sellada, en donde verterá las soluciones para

obtener el #el de poliacrilamida, con los accesorios de la cámara de electrooresis vertical. 0i#a

las instrucciones del proesor ya que con cada modelo de cámara las especiicaciones son

dierentes.

-. >eriique que no haya u#as en las placas de vidrio a#re#ando a#ua destilada a la cámara

ormada por ellas. :etire el a#ua destilada invirtiendo la 7ltima y secando el remanente con

ra#mentos de papel iltro y3o absorbente.

1. 9arque, con un bol"#rao indeleble, *.- cm debajo del nivel que abarcará el peine, colocando

éste dentro de las placas de vidrio.

2. (repare el #el separador mezclando cuidadosamente y en el orden las soluciones de la tabla

%. !a acrilamida es neurotóxica y se absorbe rápidamente por la piel.

). >ierta la mezcla a las placas de vidrio ensambladas hasta la marca hecha previamente. Evite

la ormación de burbujas.

4. ;on extremo cuidado, a#re#ue los m! necesarios de a#ua saturada de nCbutanol evitando que

se mezcle con la solución del #el separador. !a polimerización de los monómeros de la

acrilamida y bisCacrilamida debe de completarse después de %- min de haber hecho la mezcla.

/sta se determina en las placas porque se observan dos ases en la parte superior $ una del #ely otra del nCbutanol. &simismo, se puede veriicar en el vaso de precipitado en donde se hizo la

mezcla para el #el separador.

%*. Elimine por inversión el a#ua saturada de nCbutanol de la supericie del #el. !ave dos veces

con a#ua bidestilada y seque el remanente de ésta 7ltima con ayuda de papel iltro.

%%. 9ezcle las soluciones en el orden indicado en la tabla para obtener el #el concentrador y

colóquelo encima del #el separador polimerizado. &comode el peine inmediatamente después y

evite la ormación de burbujas. >eriique la polimeración del #el concentrador en el vaso de


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precipitado en donde se preparó éste o en los l"mites de los dientes de los peines en donde se

observa una densidad dierencial.

Ta#la 1. (reparación del #el separador y concentrador.

Coc!tració %ial $!l :!l 6!'ara$or 4 T3Solucio!6 - 4 8.- 4 1+ 4 1*.- 4 1- 40olución de monómeros 5m!6 - 2..- %* %'.- %-0olución J de


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%). ;oloque la tapa de la cámara de electrooresis vertical y conéctela a la uente de poder por

medio de sus cables. Encienda la uente de poder y aplique * m& por cada #el colocado en la

cámara.

%4. !a separación electroorética de las prote"nas se termina cuando el colorante del rente de

corrimiento lle#a hasta el ondo del #el. &pa#ue la uente de poder, quite la tapa de la cámara y

saque el #el.

'*. ;on la ayuda de una espátula muy ina, separar las dos placas del vidrio muy lentamente y

cuidando que no se rompa el #el. /ste se quedará en la placa de mayor tamao, por lo que se

deberá retirar la de menor tamao.

'%. :etire el #el de la placa mayor y colóquelo en la solución de


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Práctica 8

AISLAMIENTO DE PLSMIDOS ?UE CONTIENEN GENES DEGRADADORES DE ;ENOL A

PARTIR DE MICROORGANISMOS COMUNES DE AGUAS RESIDUALES K LODOS

ACTIVADOS

O#!tio

&islar plásmidos que conieren la capacidad de de#radar enol a partir de microor#anismos

obtenidos de a#uas residuales y3o lodos activados.

M!to$olo:a

Proc!$i2i!to 'ara cultio $! 2icroor:ai62o6 ! 2!$io 2i!ral "u! cot!:a %!ol.

%. ?btener de una planta de tratamientos de a#ua una muestra suiciente de a#uas residuales o

lodos activados y mantenerlos en reri#eración 5Z;6 hasta su uso.

'. (reparar medio mineral que conten#a una concentración de %-* m#3! de enol de acuerdo a la

si#uiente tabla$

Ta#la 1. Co2'o6ició $! M!$io Mi!ral

Co2'u!6to Cati$a$ :L38B0?' #FB'(? *.1 #F'B(? '. #9#0? %.- #@e0? *.* #

. Esterilizar el medio en autoclave.

. =nocular el medio con el %*+ de su volumen utilizando las a#uas residuales o lodos activados

obtenidos anteriormente.

-. Dejar en a#itación media, ')Z; durante ) d"as y tomar muestras cada ' horas.


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Mu!6tra 'ara $!t!r2iar #io2a6aJ

% !eer cada muestra a 1-*nm de absorbancia utilizando como blanco a#ua y anotar cada valor

de absorbancia obtenido. 8?


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1. Dejar reposar durante %* minutos sobre hielo o en su deecto dentro de un reri#erador a Z;.

2. &dicionar 2.-m! de solución ( y mezclar con la ayuda de una pipeta cuidadosamente. 8?

UK:


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'. =nvesti#a en qué microor#anismos se han encontrado este tipo de plásmidos y en qué tipo de

ambiente prolieran.

Bi#lio:ra%a

Larc"a, =nés., et.al. 9anual de (rácticas iotecnolo#"a &mbiental. '*%%. U(==, =(8.

(oRloRs[i, Mustin S 0hin#ler, >ictoria. Lenetics and biochemistry o phenol de#radation by

Pseudomonas sp# ;@1**Q iode#radation, -$'%4C'1, %44.

G=&LE8 (lasmid (uriication Bandboo[. '**. 'a. ed.


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A!o

Pr!'aració $! 6olucio!6

9&asos de precipitado9icropipeta matraces aorados9atraces Erlenmeyer

:eactivos&crilamida *+C isCacrilamida *,)+&morti#uador del #el separador pB ),)&morti#uador del #el concentrador pB 1,)&morti#uador de corrida -J 30D0&morti#uador de muestra pB1,)(ersulato de amonio al %*+0olución teidora0olución desteidora0olución de azul de bromoenol%* m#3ml

Desarrollo experimental


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%.C iniciar con un voltaje de -*> hasta que las muestras pasen del #el concentrador,posteriormente aumentar a %** > hasta que el rente alcance la parte inerior del #el.%. apa#ar de la uente de poder y recuperar el amorti#uador de corrida%.C desmontar la cámara y extraer con cuidado el #el. ;olocar el #el en un recipiente adecuadoy teirlo con la solución correspondiente. ;olocar en a#itación orbital durante % hora aproximada.

:etirar el #el y sumer#irlo en la solución desteidota hasta desteir bien el #el

!a si#uiente ormula describe la composición de un buer 'x, que se usa para desnaturalizarprote"nas para la electrooresis. !as descripciones de la ormula v3v o R3R pudiera no estarenlistada en una sección de los métodos debido a que al#unos componentes son l"quidos osólidos.

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