• Bakterijska ćelija - ćelijski rast uključuje:

- veliki broj raznorodnih hemijskih reakcija,

- transformacija energije i biosinteza u najširem smislu

RAST MIKROORGANIZAMA

mali molekuli

neophodni za sintezu

makromolekula

kofaktori i koenzimi

neophodni za

enzimatske reakcije

polimerizacija sastavljanje struktura

za nove ćelije

Binarna deoba (fisija)

• U bakteriologiji rast - povećanje broja ćelija (binarna

deoba = 2 ćelije od 1).

• Rast individue prethodi podeli na dve ćerke ćelije (E. coli

se izdužuje 2 puta pre deobe).

• Formiranje septe - rast citoplazmatične mebrane i

ćelijskog zida sa suprotnih strana ka unutrašnjosti, sve

dok se ćelije ne razdvoje

• Jedna ćelija se podeli na dve = 1 generacija

• Vreme potrebno za to = vreme generacije

Binarna deoba (fisija)

Svaka ćerka ćelija dobija:

- kompletan hromozom, ribozome,

- dovoljnu količinu svih makromolekula,

- flagele, inkluziona tela, itd.

Nakon replikacije jedna kopija ori na istoj poziciji a drugi migrira na drugi kraj u blizinu terminusa, nakon čega se terminus replikacije pomera ka centru ćelije .

Nakon kompletiranja replikacije terminus se nalazi dupliciran u centru ćelije.

Septa se formira na sredini ćelije tako da nastaju ćerke ćelije koje poseduju terminus lokalizovan na suprotnim stranama od oridžina.

Lokalizacija oridžina i terminusa

u toku deobe Model raspodele ćelijskog

hromozoma

E. coli

ori ter

Fts proteini i ćelijska deoba

• Fts proteini (filamentous temperature sensitive)

• FtsZ – ključni protein grupe, dobro proučen kod E. coli

• univerzalnan kod prokariota, čak i u hloroplastima i

mitohondrijama

• strukturna sličnost sa tubulinom eukariota

• "divisom" - "aparat za deobu"

• FtsZ definiše ravan deobe

• divizom – aparat za deobu

• Fts prsten se formira TAČNO na sredini ćelije

• privlači FtsA (srodan aktinu) i ZipA (vezuje Fts prsten za membranu)

• FtsI – penicilin vezujući protein (sinteza peptidoglikana)

• FtsK (separacija hromozoma)

Fts proteini i ćelijska deoba

Replikacija DNK i ćelijska deoba

• replikacija DNK i elongacija ćelije pre

formiranja FtsZ prstena

• prsten se formira u prostoru između

repliciranih hromozoma dejstvom Min

proteina (C, D i E)

• kad ćelija započne konstrikciju, FtsZ

prsten se depolimerizuje okidajući

urastanje ćelijskog zida ka unutra i

formiranje septuma

Determinante oblika ćelije

• prokariotske ćelije IMAJU citoskelet

• MreB - homolog eukariotskom aktinu

• protein koji definiše oblik prokariotske ćelije

• pomaže u segregaciji hromozoma u deobi

• lokalizuje sintezu elemenata ćelijskog zida

• koke nemaju ove proteine – "default" oblik

• Par proteini – analogna uloga mitotičkom

aparatu eukariotske ćelije – segregacija

hromozoma

• krescentin kod Caulobacter crescentus

određuje zakrivljeni izgled ćelije

• srodan keratinu

• MreB = aktin (mikrofilamenti eukariota – citoskelet, citokineza)

• FtsZ = tubulin (mikrotubule eukariota – mitoza)

• krescetin = keratin (intermedijarni filamenti eukariota – citoskelet)

Evolucioni koreni citoskeleta eukariota

Sinteza ćelijskog zida i ćelijska deoba

• Autolizini - formiraju otvore u zidu raskidajući β-1,4 glikozidne veze

• Kontrolisano isecanje delova starog zida i simultano "krpljenje" rupa prekursorima peptidoglikana

• Baktoprenol - hidrofobni nosač dodaje disaharid pentapeptid (prekursori ćelijskog zida) kroz membranu

• Transglikozilaze povezuju prekursore sa ostatkom zida na odgovarajućem mestu formiranjem glikozidne veze

• Transpeptidacija – finalni korak u sintezi zida

Transpeptidacija

• formiranje unakrsnih veza peptida

susednih lanaca glikana

• penicilin -inhibira transpeptidaciju

• FtsI vrši transpeptidaciju na septumu

• Gram - (E. coli) unakrsne veze

između diaminopimelinske kiseline

(DAP) jednog pp lanca i D-alanina

drugog pp lanca

• Gram + - preko pentaglicinskog

među-mosta, između L-lizina jednog i

D-alanina drugog pp lanca

Veze između novog i starog peptidoglikana obrazuju nabor kod gram-pozitivnih koka

Sinteza ćelijskog zida i ćelijska deoba

Rast bakterijske populacije

• Rast - povećanje broja ćelija m.o. u populaciji

• Može se meriti i kao povećanje mase mikroorganizama

• Brzina rasta - promena u broju ili masi ćelija u jedinici vremena

• Generacija - interval za koji se formiraju dve ćelije od jedne

• Vreme generacije – vremenski period za koji se duplira ćelijska populacija (0.5 - 6h)

• Različito u lab uslovima i u prirodi

Rast bakterijske populacije

• Populacije mikroorganizama pokazuju

eksponencijalni rast

• Povećanje broja ćelija u funkciji vremena

• Vreme neophodno za kompletan životni ciklus

bakterija je veoma varijabilno i zavisi od uslova

spoljašnje sredine i genotipa

• U optimalnim uslovima životni ciklus E. coli se

odvija za 20 minuta

• Praktične implikacije eksponencijalnog rasta

Određivanje vremena generacije

• Tipična kriva = četiri faze

Kriva rasta bakterija

• Lag faza se uočava:

- ako se ćelije iz stare kulture (stacionarna faza) prenesu u istu vrstu medijuma pod istim uslovima, iako sve ćelije u inokulumu mogu biti vijabilne

- ako nedostaju esencijalni faktori (neophodno vreme za sintezu)

- ako su ćelije oštećene različitim tretmanima (temperatura, zračenje ili toksični agensi) potrebno je vreme da se isprave oštećenja

• Nema lag faze ukoliko se eksponencijalna kultura inokulira u istu vrstu medijuma pod istim fizičkim uslovima.

Lag faza

Log faza

• Faza intenzivnih deoba ćelija

• Brzina rasta zavisi od:

- genetičkih karakteristika

samog organizma,

- uslova spoljašnje sredine

(temperatura, pH, osmotski

pritisak, količina kiseonika,

sastav hranljivog medijuma)

Vreme generacije

• Izračunava se iz dela krive sa

eksponencijalnim rastom

• Pokazatelj fiziološkog stanja

populacije

Eksponencijalna faza (log) i vreme generacije

• Stacionarna faza - nema promene u broju ćelija.

• U zatvorenom sistemu (kulturi) rast nije neograničen, utrošene

su neophodne hranljive materije a neki produkti metabolizma

mogu inhibirati rast.

• Neke ćelije se dele, neke umiru.

• Faza smrti – nastavljanjem inkubacije ćelija u stacionarnoj

fazi može doći do smrti većine ćelija.

Kontinualna kultura - hemostat

• Održavanje ćelija u eksponencijalnoj fazi rasta u dužem vremenskom periodu

• Otvoren sistem

• Hemostat

- najjedostavniji aparat za dobijanje kontinualne kulture

- kontrola gustine populacije i brzine rasta kulture nezavisno i simultano

- protočni sistem konstantnog volumena

- medijum se dodaje kontinualno a odvodi se medijum sa mikroorganizmima

Elementi u kontroli rasta kulture u hemostatu

• Kontrola brzine rasta i prinosa je

nezavisna:

- brzina rasta - podešavanjem razređenja

- prinos - variranjem koncentracija

hranljivih materija prisutnih u limitirajućoj

količini

• Koncentracija hranljivih materija (izvori

ugljenika i azota)

• Ukoliko se ove materije nalaze u niskoj

koncentraciji rast je redukovan

Fermentori

Sinhroni rast

• kultura u kojoj se sve ćelije nalaze u

istoj fazi rasta

• sinhronizacija - separacijom malih

ćelija odmah nakon deobe

• filtriranje, ćelije se “zalepe” za filter

papir pa spiranjem okrenutog filtera

hranljivim medijumom odvajaju samo

novopodeljene ćelije (ista faza)

• deobe će biti sinhronizovane samo

nekoliko generacija, zatim se sinhroni

rast gubi

Merenje rasta mikroorganizama

• Merenje rasta populacije:

- praćenje broja ili mase ćelija

• Veći broj metoda za određivanje broja ili mase ćelija

prilagođenih za različite organizme

• Direktne i indirektne metode

Direktno brojanje pod mikroskopom

• Suv (po Breed-u) ili vlažni preparat

• Komora za brojanje - stakleni useci koji okružuju kvadrate poznatih dimenzija i volumena

• Broj ćelija po jedinici površine određen pod mikroskopom i množenje faktorom konverzije koji zavisi od volumena komorice

Direktno brojanje pod mikroskopom

• prednost – brzo se dobijaju rezultati

• mane – broje se i mrtve ćelije; male ćelije je teško videti; teško je postići preciznost; kad uzorak nije obojen potreban je fazno-kontrasni mikroskop; nije pogodan za uzorke male brojnosti (ispod milion po ml); pokretne ćelije se moraju prethodno imobilizovati

• DNK-specifično bojenje = ukupni broj u mikrobijalnoj ekologiji (fluorescentni mikroskop)

• filogenetsko bojenje

• hemocitometri

Indirektno - određivanje broja vijabilnih bakterija

• Ćelije sposobne da se dele (vijabilne) formiraju kolonije na čvrstoj hranljivoj podlozi

1. Metoda utrljavanja

- nakon inkubacije broje se kolonije i određuje broj vijabilnih ćelija

2. Metoda izlivanja

- 0.1-1 ml kulture se pipetom prenese u sterilnu petri šolju, doda se rastopljeni hranljivi agar (45C), dobro se izmeša i inkubira.

Indirektno - određivanje broja vijabilnih bakterija

• Da bi se dobio odgovarajući broj kolonija uzorak skoro uvek mora biti razređen (napravljena dilucija).

• Retko se zna približan broj vijabilnih ćelija u uzorku pa je neophodno napraviti veći broj različitih razređenja.

• Koriste se decimalna razređenja

• Najčešće je neophodan serija decimalnih razređenja.

Razređenja (dilucije)

10 x = 10-1

0.5 ml uzorka i 4.5 ml fr ili

1 ml uzorka i 9 ml fr

100 x = 10-2

0.05ml uzorka i 4.95 fr ili

0.1 ml i 9.9 ml fr

Milion x = 10-6

3 sukcesivna 10-2 ili

6 sukcesivnih 10-1

Razređenja (dilucije)

Optimalan broj

kolonija po petri šolji

između 30-300

• bez obzira na sve teškoće pri određivanju broja vijabilnih ćelija ova

procedura daje najbolju informaciju i široko se koristi

• Colony Forming Unit CFU/ml umesto ćelija/ml

• metod je veoma senzitivan pa se u uzorcima sa nekoliko ćelija može

odrediti broj (detekcija mikroorganizama koji kontaminiraju različite

produkte)

• na visoko selektivnim medijumima i specifičnim uslovima rasta mogu

se iz mešovite kulture izolovati (precizno prebrojati) određene vrste

• Velika anomalija -potcenjivanje broja ćelija u prirodnim uzorcima

(vrlo različite potrebe za resursima)

• totalni broj ćelija vs. ciljani broj ćelija

Indirektno - određivanje broja vijabilnih bakterija

Merenje ćelijske mase

• Masa ćelija proporcionalna broju, određivanje jednog

parametra koristi se za procenu drugog.

• Masa ćelija može biti određena koncentrovanjem (npr.

centrifugiranjem) poznatog volumena i merenjem dobijenog

taloga.

• Uobičajeno se određuje suva težina nakon sušenja taloga na

90-110C preko noći (10-20% od vlažne mase).

Indirektna metoda –merenje zamućenje

• metod za dobijanje podataka o broju i masi

ćelija je određivanje turbiditeta

• ćelije rasipaju svetlo koje prolazi kroz

suspenziju, više ćelija više svetlosti se

odbije, veći je turbiditet suspenzije

• spektrofotometar – aparat koji određuje

koja količina emitovane svetlosti je

propuštena kroz suspenziju

• izlazna vrednost – OD (optička gustina)

• OD je, u određenim granicama,

proporcinalna broju ćelija

•merenje zamućenosti može

zameniti određivanje ukupnog

broja AKO se konstruiše

kalibraciona kriva

Indirektna metoda –merenje zamućenje

Ključni faktori sredine koji utiču na rast svih

mikroorganizama

• temperatura

• pH

• dostupnost vode

• kiseonik

Efekat temperature na rast

• jedan od najvažnijih faktora, veliki uticaj na rast i preživljavanje

• svaki organizam ima:

- temperaturni minimum (ispod koga nema rasta)

- temperaturni optimum (rast najbrži, uvek bliži maksimumu)

- temperturni maksimum (iznad koga rast nije moguć, posledica inaktivacije proteina, nukleinskih kiseline i drugih komponenti koje mogu biti ireverzibilno oštećene)

Psihrofili ispod 0-20C; optimum 13-15C;

Psihrotoleranti, rastu na 0C ali optimum 20-40 C

Mezofili, 10-50C, optimum 39C;

Termofili, 40-70C, optimum 60C;

Hipertermofili, 70-100C (80-110C), optimum 88C (105C).

Temperaturne preference

Psihrofili

• ispod 0-20C, optimum 13-15C

• okean, glečeri, hladna jezera, permafrost

• uslov – tečna voda

• Polaromonas 4-12C

• Psychromonas -12C

• minimum -20C?

• Psihrotolerantni mikroorganizmi - rasprostranjeniji od psihrofila (u umerenom pojasu, hrana u frižideru (4C).

Chlamydomonas nivalis

Polaromonas

zelene alge i dijatomeje

jezero u Suvoj dolini na

Antarktiku

Adaptacije psihrofila

• Enzimi funkcionalni na niskim temperaturama

- više α- heliksa = fleksibilnost (- ploče formiraju rigidnije strukture)

- više polarnih i manje hidrofobnih AK = fleksibilnost

- manje slabih veza i manje interakcija između domena

• Citoplazmatična membrana - semifluidna na niskim temperaturama

- visok % nezasićenih masnih kiselina (polinezasićenih) kraćeg lanca

• „cold-shock“ proteini i krioprotektanti

• Psihrotolerantni mikroorganizmi - rasprostranjeniji od psihrofila (u umerenom pojasu, hrana u frižideru (4C)

Termofili i hipertermofili

• termofili (optimum ˃45C) i hipertermofili (optimum ˃80C)

• zemljišta izložena neprekidno sunčevoj svetlosti zagreju se u toku dana do 50C - 70C

• temperatura fermentirajućeg materijala 60-65C

• topli izvori - 150-500C

- najveća koncentracija toplih izvora na jednom mestu - Yellowstone sa izvorima 92-93C ili 99-100C

• hidrotermalni izvori na dnu okeana 350C i više

• iznad 65C žive samo prokarioti a iznad 95ºC samo Archaea

• Methanopyrus na 122ºC

• nefototrofni organizmi mogu da rastu na višim temperaturama od fototrofnih

Hipertermofili,

(Yellowstone 97-99C)

Termofilnih cijanobakterija

(Yellowstone 70-74C)

Hidrotermalni ventili

Adaptacije termofila

• Enzimi

- zamena jedne ili nekoliko amino kiselina

- povećan broj jonskih veza između pozitivnih i negativnih naelektrisanja različitih AK

- gusto spakovana hidrofobna unutrašnjost proteina

• Citoplazmatična membrana

- bogata zasićenim masnim kiselinama (mnogo jače hidrofobne veze), membrana stabilna na visokim temperaturama.

• Hipertermofilne Archaea

- ne sadrže uopšte MK

- fitanil povezan etarskom vezom sa glicerofosfatom

- membrana u monosloju

• Stabilnost DNK („stabilizujuća jedinjenja“, reverzna DNK giraza, histoni)

• Enzimi termofila i hipertermofila katalizuju reakcije na visokim

temperaturama.

• DNK polimeraza Thermus aquaticus (Taq) koristi se za PCR,

amplifikaciju sekvenca DNK

• industrijski procesi

Značaj termofila i hipertermofila

Temperaturni maksimumi

• Neutrofili - optimalni pH 6-8, (najčešća staništa u prirodi pH 5-9).

• Acidofili – ispod pH 5.5 (gljive i obligatni acidofili); ispod pH 3 (Acidithiobacillus): ispod pH 2

- stabilnost citoplazmatične membrane

• Alkalifili - optimalni rast pH 10-11 (visokobazne sredine, slana jezera i zemljišta bogata karbonatima)

- aerobne bakterije slatkih voda, Bacillus firmus, Archaea

- enzimi u deterdžentima

• Intracelularni pH može varirati samo za 1- 1.5 pH jedinica od neutralne.

• Izuzeci: Picrophilus oshimae (pH 4.6) i ekstremni alkalifili (pH 9.5)

Efekat pH na rast

Puferi

• U toku rasta mikroorganizama u medijumu dolazi do promene

vrednosti pH usled metaboličkih reakcija

• Puferi se dodaju radi održanja konstantne pH

• Većina mikroorganizama ne može da preživi uslove sa niskom vodenom aktivnošću, dehidriraju, prelaze u dormantno stanje ili umiru (plazmoliza), sredina analogu suvom staništu.

• Halofili

– morski organizmi 1-4 % NaCl

- organizmi u hiperslanim sredinama 3-12 % NaCl

• Ekstremni halofili, 15-30 % NaCl za optimalni rast

• Halotoleranti tolerišu donekle redukciju dostupnosti vode

• Osmofili – staništa sa visokom koncentracijom šećera

• Kserofili – zaista suva staništa

Efekat osmotskog pritiska na rast

Efekat osmotskog pritiska na rast

Kompatibilni rastvorci

• omogućavaju rast na supstratima sa niskom vodenom aktivnošću

• šećeri, alkoholi ili derivati aminokiselina, KCl

• Prolin

– Gram + koke, Staphylococcus

• Derivat prolina – Ektoin

- ekstremno halofilna fototrofna bakterija Ectothiorhodospira (slana i alkalna jezera)

• Derivat glicina - Glicin betain

- halofilne Bacteria i cijanobakterije

• Kalijum

- ekstremno halofilne Archaea i Bacteria

Efekat O2 na rast

• Aerobi - 21% O2, mogu tolerisati i povećanu koncentraciju (hiperbarični kiseonik).

• Fakultativni anaerobi - u aerobnim i anaerobnim uslovima

• Mikroaerofili - O2 u koncentraciji manjoj od 21%, (limitirani kapacitet za respiraciju ili enzimi osetljivi na O2)

• Anaerobi - ne koriste O2 kao terminalni akceptor elektrona

- aerotolerantni anaerobi - rastu u prisustvu O2

- obligatni (striktni) anaerobi - O2 je toksičan, nemaju enzime za uklanjanje toksičnih produkata kiseonika

- bakterije, arhee i nekoliko vrsta gljiva i protozoa

Grupa O2 Metabolizam Vrsta Stanište

Aerobi

Obligatni

Fakultativni

Mikroaerofili

neophodan

bolji rast

< 21%

Aerobna respiracija

Aerobna i anaerobna

respiracija, fermentacija

Aerobna respiracija

Micrococcus

E. coli

Spirillum

koža,

debelo crevo

jezera

Anaerobi

Aerotolerantni

Obligatni

bez efekta

štetan ili

letalan

Fermentacija

Fermentacija ili anaerobna

respiracija

Streptococcus

Methano-

bacterium

respiratorni

trakt

sedimenti

Efekat O2 na rast

Efekat O2 na rast

• enzimi za uklanjanje toksičnih

produkata aerobne respiracije

• Katalaza - H2O2

• Peroksidaza - H2O2 (zahteva

reduktanta NADH)

• Superoksid dismutaza - od 2

molekula superoksid O2- formira se

H2O2 i jedan molekul kiseonika

• superoksid dizmutaza i katalaza

deluju zajedno

• Superoksid reduktaza – ne nastaje

O2 kao nusprodukt

- Pyrococcus furiosus- obligatni anaerob

Efekat O2 na rast

Anaerobni mikroorganizmi

• obligatni anaerobni: prokarioti, neke gljive i protozoe

• anaerobne bakterije Clostridium, grupa Gram + štapićastih bakterija koje formiraju endospore

• nalaze se u zemljištu, sedimentima jezera, intestinalnom traktu, odgovorne za kvarenje konzervirane hrane

• metanogeni (Archaea), sulfat-redukujuće i homoacetogene bakterije, bakterije rumena, creva